CN1650030A - 表面修饰、接头附着和聚合方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表面修饰和接头附着。例如，本发明提供有利于生产和使用微阵列(包括核酸和蛋白质微阵列)的表面修饰和接头化学。本发明也涉及通过非水液体的阵列点样。

Description

表面修饰、接头附着和聚合方法

本申请要求2002年2月27日提交的美国临时申请系列号60/361,108和2002年12月23日提交的美国临时申请系列号60/436,199的优先权，这两篇专利均在此引用作为参考。

发明领域

本发明涉及表面修饰、接头附着和聚合方法。例如，本发明提供有利于生产和使用微阵列(包括核酸和蛋白质微阵列)的表面修饰、接头化学和聚合方法。本发明也涉及通过非水液体(如油)点样的方法。

发明背景

可以特异性化学修饰固体材料(例如金、银、硅、二氧化硅、玻璃、聚合物、橡胶等)表面的新方法的发展，代表了生产在不同纳米技术领域使用的微阵列、生物传感器和新材料的最重要的方面之一。尽管事实上已经发展了向目的固体表面上引入特定化学或物理改变的大量方法，但是仍然在继续寻找具有更大合成灵活性和/或新分子结构的构建可使新分子附着于目的固体表面的新合成方法。

发明概述

本发明涉及表面修饰、接头附着和聚合方法。例如，本发明提供有利于生产和使用微阵列(包括核酸和蛋白质微阵列)的表面修饰、接头化学和聚合方法。本发明也提供通过非水液体(如油)点样的方法。

在一些实施方案中，本发明提供含有一表面的组合物，该表面含有一种包被，该包被含有接头，其中该接头具有与表面共价偶联的第一个末端和含有反应基的第二个末端，其中该接头还含有一个疏水部分和一个亲水部分，其中疏水部分的构型使其在水环境中破裂(collapse)，从而提高接头与表面附着的稳定性。

在某些实施方案中，该表面包括玻璃表面。在有些实施方案中，包被包括溶胶-凝胶玻璃。在另外一些实施方案中，接头利用原子转移自由基聚合法合成。在另外一些实施方案中，反应基可使核酸分子附着于接头的第二个末端。在一些实施方案中，组合物还包含附着于接头第二个末端的核酸分子。在某些实施方案中，组合物还包含附着于表面的100个或更多核酸分子。

在具体实施方案中，本发明提供了含有一表面的组合物，该表面含有一种疏水包被，该疏水包被含有多个氧化斑点，这些氧化斑点通过包括下列步骤的一种方法产生：a)用含有二硫键的化合物包被该表面，产生疏水包被；和b)使疏水包被中的多个斑点接触氧化剂，产生多个氧化斑点。

在一些实施方案中，该表面包括玻璃表面。在有些实施方案中，包被包括溶胶-凝胶玻璃。在另外一些实施方案中，氧化剂包括过氧化氢。在另外一些实施方案中，该表面在一个或多个氧化斑点中包含附着于该表面的核酸分子。

在一些实施方案中，本发明提供了包括下列步骤的方法：a)提供：i)含有孔的固体支持体，ii)非水液体，和iii)检测试剂溶液；和b)向孔中加入该非水液体；和c)在可以在孔中形成至少一个微阵列-斑点的条件下，将检测试剂溶液通过非水液体加入孔中。在另外一些实施方案中，该方法还包括下列步骤d)使至少一个微阵列-斑点接触一种测试样品溶液。在另外一些实施方案中，这种接触包括将测试样品溶液通过非水液体加入孔中。

在一些实施方案中，本发明提供包括下列步骤的方法：a)提供：i)含有微阵列-斑点的固体支持体，ii)非水液体；和iii)测试样品溶液；和b)用一层非水液体覆盖微阵列-斑点，和c)使微阵列-斑点通过非水液体层接触测试样品溶液。在其它一些实施方案中，测试样品溶液含有一种靶核酸分子。

在特定实施方案中，非水溶液是油。在其它一些实施方案中，固体支持体包含多个孔，并且用多个孔进行该方法。在另外的实施方案中，同时形成至少两个微阵列-斑点(例如，在多个孔的至少两个孔中)。

在一些实施方案中，测试样品溶液含有靶核酸分子。在优选实施方案中，该靶溶液含有不到800个拷贝的靶核酸分子，或者不到400个拷贝的靶核酸分子，或者不到200个拷贝的靶核酸分子。在特定实施方案中，微阵列-斑点与测试样品溶液接触可以鉴定靶核酸分子中多态性的存在与否。在一些实施方案中，用溶胶-凝胶包被覆盖该孔(例如在微阵列-斑点形成之前)。

在其它一些实施方案中，检测试剂溶液含有用于选自下列的检测的成分：TAQMAN测定，或INVADER测定，聚合酶链反应测定，滚环延伸测定，测序测定，使用与多态性互补的探针的杂交测定，珠阵列测定，引物延伸测定，酶错配切割测定，分支杂交测定，NASBA测定，分子信标(beacon)测定，循环探针测定，连接酶链反应测定，夹心杂交测定。在优选实施方案中，检测试剂溶液含有INVADER寡核苷酸和5′探针寡核苷酸。

在另外一些实施方案中，用SYNQUAD纳米体积(nanovolume)移液系统或其它液体转移系统或装置进行接触。在优选实施方案中，使用可以商品获得的CARTESIAN SYNQUAD纳米体积移液系统。也可以使用类似的装置，包括以下专利所述：美国专利6,063,339和U.S.6,258,103，均在此引用作为参考，以及PCT申请：WO 0157254；WO0049959：WO 0001798；和WO 9942804；均在此引用作为参考。

在特定实施方案中，在孔中形成至少2个微阵列-斑点(或者在每个孔中形成至少3个或4个或5个微阵列-斑点)。

定义

为了便于理解本发明，下面定义了大量术语和短语：

如此处所用的术语“固体支持体”、“固体表面”、“支持体”或“表面”是指提供另外一种材料能够附着的固体或半固体结构的任何材料。这些材料包括光滑的支持体(例如金属、玻璃、塑料、硅和陶瓷表面)以及粗糙和多孔的材料。这些材料也包括但不限于：凝胶、橡胶、聚合物和其它非刚性材料。固体支持体不一定是平的。支持体包括任何形状，包括球形(例如珠或微球)。Stevens等人，Nucleic Acids Research，29(16)：E77，2001；和Stevens等人，Biotechniques，Jan；34(1)：198-203，2002提供了固体支持体(微粒)和使用这些微粒进行INVADER测定的方法的具体例子，在此引用作为参考。与固体支持体附着的材料可以附着于固体支持体的任何部分(例如可以附着于多孔的固体支持材料的内部)。本发明的优选实施方案含有附着于固体支持体的生物分子，如核酸分子和蛋白质。当一种生物材料通过非随机的化学或物理相互作用与固体支持体结合时，该材料“附着”于该固体支持体。在一些优选实施方案中，通过共价键附着。然而，附着不一定是共价的或永久的。在一些实施方案中，材料通过“间隔分子”或“接头基团”附着于固体支持体。这些间隔分子是含有附着于生物材料的第一部分和附着于固体支持体的第二部分的分子。因此，当附着于固体支持体时，间隔分子分隔开固体支持体与生物材料，但是与它们两者都附着。

如此处所用的术语“珠”、“颗粒”和“微球”是指能够在溶液中移动(即大小小于它们存在的空间)的小的固体支持体。在一些优选实施方案中，这些珠是完全或部分球形或圆柱形的。然而，这些珠不限于任何具体的三维形状。

如此处所用的术语“微阵列”是指一种固体支持体，多个分子(例如核苷酸、肽等)与其表面结合。例如，Schena，《微阵列生物芯片技术》，Eaton Publishing，Natick，MA，2000概述了微阵列。另外，术语“模式微阵列”是指有多个分子与其表面非随机结合的微阵列基质。

如此处所用的术语“互补的”或“互补性”用于根据碱基配对原则关联的多核苷酸(即核苷酸如寡核苷酸或靶核酸序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3”与序列“3′-T-C-A-5”互补。互补可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，核酸之间可能是“完全”或“总体”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中特别重要。任一术语也可以用于多种核苷酸，特别是多核苷酸范围内的。例如，与其余寡核苷酸与核酸链之间的互补相反或相比，一种寡核苷酸内的一个具体核苷酸可能与另一种核酸链内的一个核苷酸互补，或者缺乏。如此处所用的互补不限于包括A-T、G-C和A-U碱基对的主要天然碱基对。而是，如此处所用的术语包括备选的、修饰的和非天然的碱基，包括但不限于以修饰的或备选的氢键键合模式配对的碱基(参见，例如，美国专利号5,432,272和6,037,120，均在此引用作为参考)，以及Kool，Current Opinion in Chemical Biology，4：602-608(2000)所述的其它碱基，在此引用作为参考。

术语“同源性”和“同源的”是指同一性程度。可以是部分同源或完全同源。部分同源序列是与另外一种序列不到100％相同的序列。

如此处所用的术语“杂交”用于互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受如下因素影响：核酸之间的互补程度，有关条件的严格性，和形成的杂合体的T_m。“杂交”方法包括一种核酸与另一种互补核酸(即含有互补核苷酸序列的核酸)退火。含有互补序列的两种核酸聚合物彼此发现并通过碱基配对相互作用退火的能力是一个公认的现象。Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：453(1960)和Doty等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：461(1960)最早发现“杂交”方法，之后该方法被改进为现代生物学的一个基本工具。

关于互补性，测定杂交代表完全还是部分互补性对于有些诊断用途至关重要。例如，在只是希望检测是否存在病原体DNA(如来自病毒、细菌、真菌、支原体、原生动物)时，杂交方法确保在存在相关序列时杂交才是重要的；能够选择部分互补探针和完全互补探针都杂交的条件。然而，其它诊断用途可能需要杂交方法能够区别部分和完全互补。检测遗传多态性可能是有意义的。例如，人血红蛋白部分由4条多肽链组成。其中两条链是141个氨基酸的相同链(α链)，两条链是146个氨基酸的相同链(β链)。已知编码β链的基因显示多态性。正常的等位基因编码第6个位点为谷氨酸的β链。突变等位基因编码第6个位点为缬氨酸的β链。这种氨基酸的差异具有深刻的(当个体的突变等位基因纯合时最深刻)生理影响，在临床上称为镰状细胞性贫血。众所周知，氨基酸改变的遗传学基础包括正常等位基因DNA序列与突变等位基因DNA序列之间的单碱基差异。

如此处所用的核酸序列的互补序列是指一种寡核苷酸，当与核酸序列排比使得一种序列的5’端与另外一种序列的3’端配对时，它“反平行结合”。本发明的核酸中可能包含在天然核酸中不常见的某些碱基，包括，例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤，以及其它可以获得的核苷酸和核苷酸类似物。互补不一定是完全互补；稳定的双链体可能含有错配的碱基对或未匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员能够根据经验确定双链体的稳定性，这要考虑许多变量，包括，例如：寡核苷酸长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率。

如此处所用的术语“T_m”是指“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子半解离为单链的温度。本领域公知用来计算核酸T_m的几个方程式。如标准参考文献所述，当核酸在1M NaCl水溶液中时，T_m值的简单估计可以用下列方程式计算：T_m＝81.5+0.41(％G+C)(参见，例如，Anderson和Young，“定量滤膜杂交”，《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)(1985))。其它参考文献(例如Allawi，H.T.和SantaLucia，J.，Jr.DNA中内部G/T错配的热力学和NMR.Biochemistry36，10581-94(1997))包括更复杂的计算，Tm的计算要考虑结构和环境以及序列特征。

如此处所用的术语“严格性”是指温度、离子强度和存在其它化合物的条件，在该条件下进行核酸杂交。在“高严格”条件下，核酸碱基配对只在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，当希望彼此不完全互补的核酸杂交或退火时，通常需要“弱”或“低”严格条件。

“高严格条件”当用于核酸杂交时，包括与下列条件相当的条件：当使用长度约为500个核苷酸的探针时，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调节为7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中结合或杂交，随后在42℃下用包含0.1×SSPE，1.0％SDS的溶液洗涤。

“中严格条件”当用于核酸杂交时，包括与下列条件相当的条件：当使用长度约为500个核苷酸的探针时，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调节为7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中结合或杂交，随后在42℃下用包含1.0×SSPE，1.0％SDS的溶液洗涤。

“低严格条件”包括与下列条件相当的条件：当使用长度约为500个核苷酸的探针时，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/lNaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调节为7.4)，0.1％SDS，5×Denhardt′s试剂[50×Denhardt′s每500ml含有5g Ficoll(Type 400，Pharamcia)，5g BSA(组分V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中结合或杂交，随后在42℃下用包含5×SSPE，0.1％SDS的溶液洗涤。

术语“基因”是指一种DNA序列，其含有产生具有非编码功能(例如核糖体或转移RNA)或编码多肽或前体的RNA所必需的控制和编码序列。RNA或多肽能够由全长编码序列编码，或者由编码序列的任一部分编码，只要其保留希望的活性或功能。

术语“野生型”是指一种基因或基因产物，当从天然存在的来源中分离时，它具有基因或基因产物的特征。野生型基因是在群体中最常见的基因，因此被随意称为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变的”或“多态的”是指一种基因或基因产物，与野生型基因或基因产物相比，它显示序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。应当指出，天然存在的突变体能够分离；它们的鉴定是根据以下事实：与野生型基因或基因产物相比，其特征发生改变。

如此处所用的术语“寡核苷酸”被定义为一种分子，其含有两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，优选地至少5个核苷酸，更优选地至少约10-15个核苷酸，更优选地至少约15-30个或更多核苷酸。其准确大小取决于许多因素，这些因素又取决于该寡核苷酸的最终功能和用途。该寡核苷酸可以用多种方法生产，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合。

因为单核苷酸以一种方式反应生成寡核苷酸，使得一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸通过磷酸二酯键以一个方向附着于其邻居的3′氧，如果其5′磷酸不与单核苷酸戊糖环的3′氧连接，则寡核苷酸的一端被称为“5′端”，如果其3′氧不与其后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸连接，则被称为“3′端”。如此处所用的，一种核酸序列即使位于较大寡核苷酸的内部，也可以被认为具有5′和3′端。当沿核酸的一条链以5’到3’方向移动时，如果沿核酸链的第一个区的3’端位于另一个区的5’端之前，则称第一个区位于第二个区的上游。

当两个不同的非重叠寡核苷酸与同一线性互补核酸序列的不同区退火，且一个寡核苷酸的3’端指向另一个的5’端时，前者可以被称为“上游”寡核苷酸，后者被称为“下游”寡核苷酸。类似地，当两个重叠寡核苷酸与同一线性互补核酸序列杂交，第一个寡核苷酸的位置使其5′端位于第二个寡核苷酸的5′端上游，第一个寡核苷酸的3′端位于第二个寡核苷酸的3′端上游时，第一个寡核苷酸可以被称为“上游”寡核苷酸，第二个寡核苷酸可以被称为“下游”寡核苷酸。

术语“引物”是指一种寡核苷酸，当置于启动引物延伸的条件下时，它能够作为合成的起点。寡核苷酸“引物”可以天然存在，作为纯化的限制酶切消化物，或者可以合成产生。

选择一条与模板特定序列的一条链“基本”互补的引物。引物必须充分互补，才能与模板链杂交，发生引物延伸。引物序列不需要反映模板的准确序列。例如，一条非互补核苷酸片段可以附着于引物的5′端，而引物序列的其余部分与该链基本互补。非互补碱基或较长的序列能够散布在引物内，假如引物序列与模板序列的互补性足以杂交，从而形成模板引物复合物，用于合成引物的延伸产物。

如此处所用的术语“标记”是指能够用来提供可检测(优选地可定量)效应并且能够附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子。标记包括但不限于：染料；放射性标记，如³²P；结合部分，如生物素；半抗原，如洋地黄毒苷；发光、磷光或荧光部分；单独的或与某些部分组合的荧光染料，这些部分通过荧光共振能量转移(FRET)能够抑制或转移发射光谱。标记可产生信号，这些信号可根据荧光、放射性、比色法、比重法、X线衍射或吸收、磁学、酶活性等检测。标记可以是一种带电荷的部分(正或负电荷)或者另外还可以是中性的。标记可能包含或由核酸或蛋白质序列组成，只要含有该标记的序列是可以检测的。

如此处所用的术语“信号”是指任何可检测的效应，如标记或测定反应引起或产生的。

如此处所用的术语“检测器”是指一种系统或系统的组件，例如一种仪器(例如照相机、荧光计、电荷耦合装置、闪烁计数器等)或一种反应介质(X射线或照相机胶片、pH指示剂等)，它们能够将信号或效应的存在传递给使用者或系统的另外一个组件(例如计算机或控制器)。检测器可以是：光度计或分光光度计系统，它们能够检测紫外线、可见光和红外线，包括荧光或化学发光；辐射检测系统；光谱系统，如核磁共振光谱、质谱或表面增强的拉曼光谱；如凝胶或毛细管电泳或凝胶排阻层析的系统；或本领域公知的其它检测系统，或其组合。

如此处所用的术语“切割结构”是指一种结构，它是由至少一种探针寡核苷酸与一种靶核酸相互作用形成的，形成含有双链体的结构，产生的结构可被一种切割剂(包括但不限于酶)切割。该切割结构是该切割工具特异性切割的一种底物，它不同于是切割剂(如磷酸二酯酶)的非特异性切割底物的核酸分子，磷酸二酯酶切割核酸分子与二级结构无关(即不需要形成双链结构)。

如此处所用的术语“折叠的切割结构”是指具有二级结构的单链核酸底物的一个区域，该区可被一种酶切割剂切割。该切割结构是该切割工具特异性切割的底物，它不同于是切割剂(如磷酸二酯酶)的非特异性切割底物的核酸分子，磷酸二酯酶切割核酸分子与二级结构无关(即不需要底物折叠)。

如此处所用的术语“折叠靶标”是指含有二级结构的至少一个区(即至少一个双链区和核酸单链内的至少一个单链区)的核酸链。折叠靶标除了二级结构区之外，还可能含有三级结构区。

如此处所用的术语“切割工具”或“切割剂”是指能够切割一种切割结构的任何试剂，包括但不限于酶。“结构特异性核酸酶”或“结构特异性酶”是能够识别核酸分子的特定二级结构并切割这些结构的酶。本发明的切割剂响应切割结构的形成切割核酸分子；切割剂不一定在切割结构内的任一具体位置切割该切割结构。

术语“热稳定的”当用于一种酶，如5′核酸酶时，是指该酶在升高的温度(即约55℃或更高温度)下具有功能或活性(即能够进行催化)。

如此处所用的术语“切割产物”是指切割剂与切割结构反应(即用切割剂处理切割结构)产生的产物。

术语“靶核酸”是指一种将被检测的核酸分子。在一些实施方案中，靶核酸含有一种序列，该序列与至少一种探针寡核苷酸至少部分互补，也可能与INVADER寡核苷酸(以下描述)至少部分互补。靶核酸可能含有单链或双链DNA或RNA。

术语“探针寡核苷酸”是指一种寡核苷酸，它可以与靶核酸相互作用形成一种检测复合物或切割结构。当与靶核酸退火形成切割结构时，在探针寡核苷酸内发生切割。

如此处所用的术语“信号探针”是指含有可检测部分的探针寡核苷酸。本发明不受可检测部分的性质所限制。

如此处所用的术语“猝灭剂”和“猝灭部分”是指一种分子或材料，当该猝灭剂与可检测部分物理相邻时，它抑制或减少来自可检测部分的可检测信号。例如，在一些实施方案中，猝灭剂是这样的分子：当猝灭剂物理靠近荧光标记时，它抑制含有荧光标记的寡核苷酸发出的可检测荧光信号的量。

术语“非靶切割产物”是指并非来源于靶核酸的切割反应产物。如上所述，在本发明的方法中，切割结构的切割通常在探针寡核苷酸内发生。这种靶核酸依赖的切割产生的探针寡核苷酸的片段是“非靶切割产物”。

术语“INVADER寡核苷酸”是指一种寡核苷酸，它在靠近探针与靶核酸杂交区的位置处与靶核酸杂交，其中INVADER寡核苷酸含有与探针与靶标杂交区重叠的一部分(例如化学部分或核苷酸——与靶标互补或不互补)。在一些实施方案中，INVADER寡核苷酸在其3’端所含的序列与位于探针寡核苷酸5’端的序列基本相同。

术语“基本上单链的”当用于核酸底物时，是指该底物分子主要以单链核酸形式存在，它与双链底物不同，后者是以通过链间碱基配对相互作用结合在一起的两条核酸链的形式存在。

如此处所用的术语“序列变异”是指两种核酸之间核酸序列的差异。例如，野生型结构基因和该野生型结构基因的突变形式由于存在单碱基置换和/或一个或多个核苷酸的缺失或插入而在序列上可能不同。结构基因的这两种形式被认为彼此序列不同。结构基因可能存在第二种突变形式。这第二种突变形式被认为与野生型基因和该基因的第一种突变形式在序列上不同。

如此处所用的术语“释放”是指通过如5′核酸酶的作用，从较大核酸片段，如寡核苷酸上，释放核酸片段，使得释放的片段不再与寡核苷酸的其余部分共价连接。

如此处所用的术语“K_m”是指酶的米氏常数，被定义为一种酶在酶催化反应中达到其最大速度的一半时特异性底物的浓度。

如此处所用的术语“核苷酸类似物”是指修饰或非天然存在的核苷酸，包括但不限于：堆积相互作用改变的类似物，如7-脱氮嘌呤(即7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)；含有另外一种氢键构型的碱基类似物(例如Iso-C和Iso-G，和授予S.Benner的美国专利号6,001,983所述的其它非标准碱基对)；非氢键类似物(例如非极性、芳族核苷类似物，如2，4-二氟甲苯，如B.A.Schweitzer和E.T.Kool，J.Org.Chem.，1994，59，7238-7242，B.A.Schweitzerand E.T.Kool，J.Am.Chem.Soc.，1995，117，1863-1872所述)；“通用”碱基，如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；和通用嘌呤和嘧啶(分别如“K”和“P”核苷酸；P.Kong等人，Nucleic Acids Res.，1989，17，10373-10383，P.Kong等人，Nucleic Acids Res.，1992，20，5149-5152)。核苷酸类似物包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式。

本申请书和权利要求书中使用的术语“样品”最广义地使用。一方面，包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面，包括生物和环境样品。一种样品可包括合成来源的标本。

生物样品可以是动物(包括人)的液体、固体(例如大便)或组织，以及液体和固体食物和饲料产品和成分，如乳制品、蔬菜、肉食和肉类副产品，和废物。生物样品可以获自所有不同科的家畜以及野生动物，包括但不限于如有蹄类动物、熊、鱼、兔类、啮齿类等的动物。

环境样品包括环境物质，如表面物质、土壤、水和工业样品，以及获自食品和奶制品加工设备、装置、仪器、器皿、一次性和非一次性装置的样品。这些例子不应被视为限制适用于本发明的样品类型。

术语“靶核酸的来源”是指含有核酸(RNA或DNA)的任何样品。特别优选的靶核酸来源是生物样品，包括但不限于细胞裂解物、血液、唾液、脑脊液、胸水、乳汁、淋巴、痰和精液。

如果一种寡核苷酸以高于另一种寡核苷酸(或靶核酸序列)的摩尔浓度存在，则称该寡核苷酸相对于另一种寡核苷酸(或靶核酸序列)“过量”存在。当一种寡核苷酸，如探针寡核苷酸，在切割反应中相对于互补靶核酸序列的浓度过量存在时，可以利用该反应显示存在的靶核酸的量。一般而言，当过量存在时，探针寡核苷酸将至少100倍摩尔过量存在；当靶核酸序列以大约10fmol或更低浓度存在时，一般使用至少1pmole的每种探针寡核苷酸。

术语“电荷平衡的”寡核苷酸是指一种修饰的寡核苷酸(反应中的输入寡核苷酸)，使得修饰的寡核苷酸带有电荷，以至在修饰的寡核苷酸被切割(即缩短)或延长时，获得的产物带有不同于输入寡核苷酸(“电荷不平衡的”寡核苷酸)的电荷，从而允许根据电荷分离输入寡核苷酸和反应的寡核苷酸。术语“电荷平衡的”并不意味着修饰的或平衡的寡核苷酸具有净中性电荷(尽管这可能是事实)。电荷平衡是指一种寡核苷酸的设计和修饰，使得这种输入寡核苷酸产生的特异性反应产物根据电荷能够与输入寡核苷酸分离。

术语“净中性电荷”当用于寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸时，是指在希望的反应或分离条件下，存在的电荷总和(即胸苷上的R-NH₃ ⁺基，胞嘧啶的N3氮，磷酸基的存在与否，等等)基本为零。携带净中性电荷的寡核苷酸在电场中不迁移。

术语“净正电荷”当用于寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸时，是指在希望的反应条件下，存在的电荷总和(即胸苷上的R-NH₃ ⁺基，胞嘧啶的N3氮，磷酸基的存在与否，等等)为+1或更高。携带净正电荷的寡核苷酸在电场中向阴极迁移。

术语“净负电荷”当用于寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸时，是指在希望的反应条件下，存在的电荷总和(即胸苷上的R-NH₃ ⁺基，胞嘧啶的N3氮，磷酸基的存在与否，等等)为-1或更低。携带净负电荷的寡核苷酸在电场中向阳极迁移。

术语“聚合工具”或“聚合剂”是指能够有利于向寡核苷酸上添加核苷三磷酸的任何试剂。优选的聚合工具包括DNA和RNA聚合酶。

术语“连接工具”或“连接剂”是指能够有利于连接(即在位于核酸两条链末端的3′-OH与5′P之间形成磷酸二酯键)的任何试剂。优选的连接工具包括DNA连接酶和RNA连接酶。

术语“反应物”在此最广义地使用。反应物可包括，例如，酶反应物、化学反应物或光(例如紫外线，特别是公知可断裂寡核苷酸链的短波长紫外线)。术语“反应物”包括能够与寡核苷酸反应从而缩短(即切割)或延长该寡核苷酸的任何试剂。

术语“加合物”在此最广义地使用，是指能够添加到寡核苷酸上的任何化合物或元件。加合物可能是带电的(正电或负电)，或者可能带中性电荷。加合物可以通过共价或非共价键添加到寡核苷酸上。加合物的例子包括但不限于靛二炭花青染料亚酰胺、氨基取代的核苷酸、溴化乙锭、乙锭同型二聚体、(1，3-丙二氨基)丙锭、(二乙烯三氨基)丙锭、噻唑橙、(N-N′-四甲基-1，3-丙二氨基)丙基噻唑橙、(N-N′-四甲基-1，2-乙二氨基)丙基噻唑橙、噻唑橙-噻唑橙同型二聚体(TOTO)、噻唑橙-噻唑蓝杂二聚体(TOTAB)、噻唑橙-乙锭杂二聚体1(TOED1)、噻唑橙-乙锭杂二聚体2(TOED2)和荧光素-乙锭杂二聚体(FED)、补骨脂素、生物素、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、dabcyl、荧光素等。

如此处所用的术语“纯化的”或“基本纯化的”是指核酸或氨基酸序列分子，它们从其天然环境中提取，分离或分开，优选地至少60％、更优选地75％、最优选地90％不含它们天然结合的其它成分。与其它分子相比相对含量提高(例如通过扩增)的一种分子(例如核酸分子)也可以被认为是纯化的。因此，“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”是一种基本纯化的多核苷酸。

如此处所用的术语“试剂盒”是指用来递送物质的任何递送系统。在反应测定中，这类递送系统包括将反应试剂(例如适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、进行测定的说明书等)贮存、从一个位置转运或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包含一个或多个外壳(例如盒子)，其中包含有关的反应试剂和/或支持材料。如此处所用的术语“分区试剂盒”是指包含两个或多个不同容器的递送系统，每个容器中含有总试剂盒组分的亚部分。这些容器可以一起或分开递送到目标受体。例如，第一个容器可以含有一种在试验中使用的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。术语“分区试剂盒”包括含有“联邦食品、药品和化妆品法案”第520(e)部分规定的分析纯试剂(ASR′s)的试剂盒，但是不限于此。实际上，术语“分区试剂盒”包括包含两个或多个分开容器的任何递送系统，其中每个容器含有总试剂盒组分的亚部分。相反，“组合试剂盒”是指在一个容器中含有反应试验的所有成分的递送系统(例如一个盒子包含所有希望的组分)。术语“试剂盒”包括分区试剂盒和组合试剂盒。

发明详述

本发明涉及表面修饰、接头附着和聚合方法，以及通过非水液体点样的方法。本发明的组合物和方法可用于产生微阵列。优选地，微阵列含有进行核酸检测(例如TAQMAN或INVADER测定)的试剂。

A.微阵列和固体支持体

在一些实施方案中，本发明提供微阵列。微阵列可含有附着于固体表面的测定试剂和/或靶标(即形成微阵列斑点)，因此检测可以在固体表面上进行。如此处所用的术语“微阵列-斑点”是指在固体表面上或在微孔中的非水液体层中形成的分离的区，含有一组检测试剂。例如，当含有检测试剂的试剂样品通过转移工具(例如针式点样工具、喷墨打印机等)加到固体表面上(或在固体表面上形成薄膜)时，可以在固体基质(例如玻璃、TEFLON)上或在固体表面上的非水液体或其它材料层中形成微阵列-斑点。在优选实施方案中，固体基质(例如，如下所述修饰的)含有微孔，微阵列-斑点加于微孔中。在另外一些实施方案中，固体支持体作为打印/产生微孔的平台，向这些微孔中加入必要的试剂，随后的反应完全在溶液中发生。在固体支持体上产生微孔可以用多种方法实现，包括：表面张力和亲水袋的蚀刻(如授予Protogene Corp.的专利公开文本所述)。例如，支持体的表面可以覆盖一种疏水层，然后向支持体上小量印刷能够腐蚀疏水层的化学成分。这种印刷产生亲水微孔阵列。印刷的疏水塔阵列可以用来产生微阵列。载玻片的表面可以覆盖疏水层，然后将溶液印刷到支持体上，在疏水层上面产生亲水层。这种印刷产生亲水塔阵列。机械微孔可以用物理屏障+/-化学屏障产生。例如，微网(如金网)可以固定于一种支持体上，或者可以在支持体上钻出微孔(如通过BML证实的)。也可以用亲水墨水如TEFLON在支持体上印刷微阵列。这些阵列可以通过Precision Lab Products，LLC，Middleton，WI获得。对于另一种变体，用户偏爱的检测阵列形式的数据存储作为本发明的组分使用的数据库中。能够利用该信息，根据用户的最少识别信息，例如名称、帐户或密码，为特定用户自动构建产物。

可以使用多种方法将希望的试剂印刷到微阵列内(例如将微阵列斑点印刷到微孔内)。在一些实施方案中，利用一种针式工具机械加载阵列(例如产生一个微阵列斑点)(参见，例如Shalon，Genome Methods，6：639[1996]，在此引用作为参考)。在另外一些实施方案中，利用喷墨技术向一个固体表面上印刷寡核苷酸(例如，O′Donnelly-Maloney等人，Genetic Analysis：Biomolecular Engineering，13：151[1996]，在此引用作为参考)，以在一个孔内产生一个或多个微阵列斑点。

用于向固体载体内/上印刷(例如微孔阵列)的希望的试剂的例子包括但不限于：用来进行核酸检测的分子试剂，如INVADER反应试剂(例如，SNP检测阵列能够印刷到孔内)；和靶核酸，如人基因组DNA(hgDNA)，产生不同样品的阵列。希望的试剂也可以与蚀刻/包被试剂同时使用，或者印刷到微孔/塔内/上，随后进行蚀刻步骤。对于机械屏障产生的阵列，希望的试剂例如印刷到产生的孔内。在一些实施方案中，希望的试剂可能需要在溶液中印刷，该溶液可充分包被微孔并产生亲水的、反应温和的环境，如高蛋白质溶液(例如BSA，脱脂奶粉)。在某些实施方案中，希望的试剂也可能需要在溶液中印刷，该溶液在该试剂上产生一个“包被”，固定该试剂，这可以通过添加高分子量碳水化合物如FICOLL或葡聚糖来实现。在一些实施方案中，这种包被是油。

向微阵列上添加靶溶液(或者如果靶标已经印刷，则是反应试剂)可以用多种方法实现。例如，固体支持体可以浸入含有靶标的溶液内，或者将支持体置于具有至少两个开口的容器中，然后将靶溶液加到一个开口内，然后用真空吸引溶液通过表面，或者通过毛细管作用使其流过表面。可进行这些方法的装置的例子包括但不限于TECAN-GenePaint系统和AutoGenomics AutoGene系统。在另外一个实施方案中，使用购自Virtek Corp.的点样仪向平板、载玻片等上点样不同的检测样品。

在一些实施方案中，吸引、滚动或辊压溶液(例如反应试剂或靶溶液)支持体表面。可用于这种用途的一类装置是容纳支持体的一种加框容器。在该容器的一端是一个滚筒/橡皮滚子(squeegee)或类似的东西，它在前面有一个用于加载靶溶液的通道。通过表面移动滚筒/橡皮滚子的过程将靶溶液加到微孔上。在该容器的相对末端是一个用于捕获未使用的靶溶液的容器(从而在希望时，可以在另外一个阵列上再使用)。在滚筒/橡皮滚子之后是一个蒸发屏障(例如矿物油、光学上澄清的胶带等)，在滚筒/橡皮滚子通过表面移动时添加。

向微孔阵列上添加靶溶液导致溶液在每一个微孔位置沉积。化学和/或机械屏障可保持阵列的完整性，并且防止成分之间试剂的交叉污染。用靶溶液再水合在每个微孔中印刷的试剂，产生一种超低体积的反应混合物。在一些实施方案中，微孔-微阵列反应体系上覆盖矿物油或其它一些适当的蒸发屏障，以允许高温温育。产生的信号可以利用荧光显微镜、阵列阅读器或标准荧光读板器通过使用的蒸发屏障直接检测。

使用微孔-微阵列进行INVADER测定(例如每孔中的干燥INVADER测定成分)的优点包括但不限于：使用INVADER Squared(Biplex)形式进行DNA检测的能力；直接检测hgDNA的足够的灵敏度；使用“通用”FRET盒的能力；不需要附着化学(意思是能够利用现有的贮存试剂印刷微阵列)，不需要分级分离hgDNA来说明对杂交的表面作用，产生上万个信号所需的hgDNA的量较低，需要低体积(例如100μm微孔的体积为0.28nl，而在每个阵列10⁴个微孔时，2.8μl体积将填充所有孔)，333ng/μl hgDNA溶液将产生每个微孔～100个拷贝(这比在20μl反应体系中使用100ng hgDNA浓缩33倍)，因此10⁴个信号2.8μl×333ng/μl＝670ng hgDNA，或者每个信号0.07ng。可以理解，其它检测也能够以这种形式使用。

B.使用非水液体产生并使用微阵列-斑点

在某些优选实施方案中，本发明提供通过向含有非水液体的孔中添加检测试剂溶液产生微阵列斑点的方法。在其它一些优选实施方案中，本发明提供使微阵列-斑点接触测试样品溶液(例如含有靶核酸)的方法，方法是穿过覆盖微阵列斑点的非水液体层喷射测试样品溶液。在某些实施方案中，固体支持体覆盖溶胶-凝胶薄膜(下文更详细地描述)。

在一些实施方案中，本发明提供包括下列步骤的方法：a)提供：i)含有孔的固体支持体，ii)非水液体，和iii)检测试剂溶液；和b)向孔内添加该非水液体；和c)在可以在孔中形成至少一个微阵列-斑点的条件下，将检测试剂溶液通过非水液体加入孔中。在其它一些实施方案中，该方法还包括步骤d)使至少一个微阵列-斑点接触测试样品溶液。在另外一些实施方案中，这种接触包括使测试样品溶液通过非水液体进入孔中。

在特定实施方案中，这种非水液体是油。在其它一些实施方案中，这种固体支持体含有多个孔，用这多个孔进行该方法。在其它一些实施方案中，同时形成至少两个微阵列-斑点(例如在多个孔的至少两个孔中)。

在一些实施方案中，测试样品溶液含有靶核酸分子。在优选实施方案中，靶溶液含有不到800个拷贝的靶核酸分子，或者不到400个拷贝的靶核酸分子，或者不到200个拷贝的靶核酸分子。在特定实施方案中，微阵列-斑点与测试样品溶液接触可鉴定靶核酸分子中多态性的存在与否。在一些实施方案中，用溶胶-凝胶包被覆盖该孔(例如在形成微阵列-斑点之前)。

在其它一些实施方案中，检测试剂溶液含有用于选自下列的检测的成分：TAQMAN测定，或INVADER测定，聚合酶链反应测定，滚环延伸试验，测序试验，使用与多态性互补的探针的杂交试验，珠阵列测定，引物延伸测定，酶错配切割测定，分支杂交测定，NASBA测定，分子信标测定，循环探针测定，连接酶链反应测定和夹心杂交测定。在优选实施方案中，检测试剂溶液含有INVADER寡核苷酸和5′探针寡核苷酸。

在另外一些实施方案中，这种接触用SYNQUAD纳米体积(nanovolume)移液系统或其它液体转移系统或装置进行。在优选实施方案中，使用可以商品获得的CARTESIAN SYNQUAD纳米体积移液系统。也可以使用类似的装置，包括以下专利所述：美国专利6,063,339和U.S.6,258,103，在此引用作为参考，以及PCT公开文本WO 0157254；WO 0049959；WO 0001798和WO 9942804，均在此引用作为参考。

在特定实施方案中，在孔内形成至少两个微阵列-斑点(或者在每个孔内至少形成3个或4个或5个微阵列-斑点)。对于多孔形式，使用多个微阵列-斑点可增加在一个固体表面上能够进行的反应数(例如，如果在1536孔板的1536个孔的每一个中形成4个微阵列-斑点，则有6144个微阵列-斑点可用于进行检测反应)。在其它一些实施方案中，本发明提供固体支持体，其含有通过上述方法形成的孔。

在一些实施方案中，本发明提供包括下列步骤的方法：a)提供：i)含有微阵列-斑点的固体支持体，ii)非水液体；和iii)测试样品溶液；和b)为微阵列-斑点覆盖一层非水液体，和c)使微阵列-斑点通过非水液体层接触测试样品溶液。在其它一些实施方案中，测试样品溶液含有靶核酸分子。在其它一些实施方案中，这种接触可以鉴定靶核酸分子中至少一种多态性的存在与否。在优选实施方案中，测试样品溶液含有靶核酸分子。在优选实施方案中，该靶溶液含有不到800个拷贝的靶核酸分子，或者不到400个拷贝的靶核酸分子，或者不到200个拷贝的靶核酸分子。

在某些实施方案中，微阵列-斑点含有用于选自下列的检测的成分：TAQMAN测定，或INVADER测定，聚合酶链反应测定，滚环延伸测定，测序测定，使用与多态性互补的探针的杂交测定，珠阵列测定，引物延伸测定，酶错配切割测定，分支杂交测定，NASBA测定，分子信标测定，循环探针测定，连接酶链反应测定，夹心杂交测定。在优选实施方案中，微阵列-斑点含有INVADER寡核苷酸和5′探针寡核苷酸。

在一些实施方案中，固体支持体含有一个孔，微阵列-斑点位于孔内。在某些实施方案中，非水液体是油。在其它一些实施方案中，固体支持体含有多个孔，用多个孔进行该方法。在特定实施方案中，同时形成至少两个微阵列-斑点(或者在每个孔中形成至少3个或4个或5个微阵列-斑点)。在多孔形式中，使用多个微阵列-斑点可以增加在一个固体支持体上能够进行的反应数(例如，如果在1536孔板的1536孔的每一个上形成4个微阵列-斑点，则有6144个微阵列-斑点可用于进行检测反应)。在其它一些实施方案中，本发明提供一种固体支持体，其含有通过上述方法形成的孔。

在一些实施方案中，这种接触包括推动测试样品溶液通过非水液体进入孔中。在其它一些实施方案中，非水液体是矿物油。在另外一些实施方案中，非水液体选自矿物油、种子油和来源于石油的油。

在另外一些实施方案中，用SYNQUAD纳米体积移液系统或其它液体转移系统或装置进行接触。在优选实施方案中，使用可以商品获得的CARTESIAN SYNQUAD纳米体积移液系统。也可以使用类似的装置，包括以下专利所述：美国专利6,063,339和U.S.6,258,103，均在此引用作为参考，以及PCT申请：WO 0157254；WO 0049959：WO0001798；和WO 9942804；均在此引用作为参考。

在一些实施方案中，本发明提供含有下列组件的系统：a)一个纳米体积移液系统(例如SYNQUAD)，和b)一个含有微阵列-斑点的固体支持体，其中该微阵列斑点覆盖一层非水液体。在其它一些实施方案中，该系统还含有一种测试样品溶液。

C.通过矿物油生产及使用微阵列-斑点的实施例

该实施例描述了覆盖矿物油的微阵列-斑点与测试样品接触(方法#1)。该实施例也描述了在微孔中产生微阵列-斑点，方法包括通过一层矿物油印刷，然后使该微阵列斑点通过矿物油层接触测试样品(方法#2)。

方法#1

在该方法中，在被(通过TEFLON印刷)分成1536个孔的玻璃固体表面上产生微阵列-斑点。用CARTESIAN SYNQUAD纳米体积移液系统进行液体转移。该实施例使用的检测试剂溶液由INVADER反应成分组成，组成如下：10mM MOPS，12.5mM MgCl₂，50ng CLEAVASE XI，0.1％HPMC 15K cps，0.2％BSA(组分V)，各0.5μM第一(primary)探针，各0.25μM FRET盒和0.05μM INVADER寡核苷酸。利用SNYQUAD将25、50、100和200nl体积的检测试剂溶液移液到孔内。然后使溶液在载玻片上干燥，在孔内形成微阵列斑点。然后用CYBIO384尖打印头向TEFLON 1536格玻璃固体支持体上涂上一层矿物油(每孔4μl)。然后使用SYNQUAD，通过将测试样品溶液通过矿物油层“喷射”到TEFLON 1536格玻璃板上，将测试样品溶液转移到希望的孔内，其体积等于印刷的检测试剂的体积，并且在玻璃表面上干燥(即25nlINVADER测定试剂接受25nl测试样品)。该方法中的测试样品溶液如下：阴性--50ng/μl tRNA；阳性各0.1pM合成靶标。然后1536格玻璃板在HERAEUS中在63℃以上温育。结果用荧光显微镜和CCD相机分析(结果在图1和图2中显示)。

方法#2

在该方法中，通过一层矿物油在方法#1中使用的同一类型的TEFLON1536格玻璃板上形成微阵列-斑点，然后使形成的微阵列斑点通过矿物油层接触测试样品溶液。首先，使用CYBIO 384尖打印头向TEFLON1536格玻璃板上涂上一层矿物油(每孔4μl)。然后，使用SYNQUAD将25、50、100和200nl的体积的检测试剂溶液移液到孔区内。该检测试剂溶液含有：20mM MOPS，40mM MgCl₂，110ng CLEAVASE XI，5％PEG，各1μM第一探针，各0.5μM FRET盒和0.1μM INVADER寡核苷酸。然后使用SYNQUAD装置，通过将溶液通过矿物油层“喷射”到1536格玻璃板上，将测试样品溶液转移到希望的孔区内，体积等于原始检测溶液的体积。然后，玻璃板在HERAEUS中在63℃以上温育。结果用荧光显微镜和CCD相机分析。结果在图1和图2中显示。

D.表面修饰，接头附着和聚合方法

表面修饰的最具挑战性的方面之一是产生非常明确的区域的能力，该区域具有不同于周围环境的具体特性，例如，在总疏水表面上的高亲水性区，或具有非常明确的化学性质(反应性)的区域。在大多数情况下，通过光化学调节表面特性达到这一目的。然而，已经建立的光刻法既耗时又昂贵。

本发明提供了一种表面修饰的备选方法，提供能够局部改变固体表面特性的化学方法。该化学法也提供其它希望的特征，因为它是快速、有效的，可能是无毒的，能够进行，不产生任何不希望的/损害性的化学副产物。本发明如希望的也提供调节表面特性的方法。

可以使用任何类型的固体表面，包括但不限于：金属、玻璃、塑料、硅和陶瓷表面。在某些实施方案中，固体表面含有微粒，使用这些微粒进行INVADER测定的方法如Stevens等人，Nucleic Acids Research，29(16)：E77，2001和Stevens等人，Biotechniques，Jan；34(1)：198-203，2002所述，均在此引用作为参考。授予Neri等人的美国申请系列号09/732,622提供了另外一些固体表面，特别是在固体表面上进行INVADER测定的方法与组合物，在此全文引用作为参考。

在一些优选实施方案中，本发明提供修饰表面的方法，这种修饰产生反应性疏水表面，从而使希望的分子能够附着于该表面，例如用于产生微阵列。在一些实施方案中如下实现：使用含有二硫键的化合物产生疏水表面，通过氧化将二硫键转化为磺酸基团。

在一些实施方案中，本发明包括表面修饰，这些修饰可提高附着于表面的分子与表面本身(例如玻璃)之间的键(例如二硅氧烷)的水解稳定性。在一些实施方案中，提高的水解稳定性是附着分子的一部分的疏水性的结果。在另外一些实施方案中，附着的分子也含有一个反应基，使它们例如通过被附着寡核苷酸而被进一步修饰。

在一些实施方案中，表面修饰可包含任何有机基团，在适当试剂的影响下，该基团能够经历从疏水向亲水的改变。这些基团的例子包括但不限于下列：

-SH到-SO₃

S2到SO₃

-CC-到-COOH

-CH₂-X到-CH₂-Y，其中X是非极性的，例如I、Br；Y是极性的(例如OH)。

氧化剂的例子包括但不限于下列：过氧化氢，硝酸，高碘酸钠，臭氧和DMSO。任何具体氧化剂的用途受反应中的具体基团控制。例如，将-SH转化为-SO₃通常可以使用硝酸作为氧化剂。

利用本发明的方法修饰的表面使阵列含有希望的表面附着分子，包括但不限于：硫醇；二硫化物；肽；修饰的有机聚合物，如糖；DNA；PNA；LNA(DNA、PNA、LNA都能被修饰)。

本发明的实施方案在下文用载玻片作为固体表面来说明。应当理解，本发明的这些方面也可用于其它表面材料(例如金)和其它玻璃材料(例如溶胶凝胶)。

最初，载玻片用适当的、市售的试剂(购自Sigma)处理。然而，从均一性和稳定性的观点来看，使用这些试剂产生的疏水表面不能令人满意。例如，玻璃表面通常不是充分同质的，能够遇到严重的老化问题。

当使用本发明的方法时获得更好的结果。一种这样的方法使用一种两个步骤的方法，如下图所示。第一步，用氨基硅烷包被载玻片。第二步，氨基修饰的包被的载玻片与希望的试剂(L-C(O)-Y；L＝离去基团(例如，卤素、NHS等，R＝希望的有机基团)反应，该试剂能够与共价结合于玻璃表面的氨基硅烷的氨基反应。

例如，在一些实施方案中，在步骤a)中使用氨丙基三乙氧基硅烷(R＝CH₂CH₂CH₂)，在步骤b)中使用疏水羧酸(油酸，硬脂酸，胆固醇基和全氟脂肪族羧酸)的反应性衍生物。

实验表明，上述方法在载玻片上产生稳定且高度均一的疏水表面。然而，极难向产生的疏水表面引入一些改变——即疏水包被在化学上没有足够的反应性。例如，极难使表面的特性由疏水的局部改变为亲水的。因此，其它材料与这些表面的附着较弱，其它材料的微阵列难以形成。

因此，需要发展一种更好的、更灵活的包被方法。在本发明的一种方法中，使用硫辛酸的NHS酯(化合物1)：

                       化合物1

硫辛酸的NHS酯与氨丙基三乙氧基硅烷反应，产生一种新的硅烷化剂(化合物2)，它能够向载玻片表面引入一种含有二硫键(S-S)的分子。它是特别有用的，因为中性硫的已知的亲脂性，以及二硫键的相对反应性。

                       化合物2

实验表明，用化合物2包被的玻璃表面是均匀、疏水的。因此，达到了设计的合成策略的一个目的。下一步，由化合物2包被的疏水表面用30％过氧化氢溶液局部处理，过氧化氢是一种极具攻击性的试剂，能够破坏和氧化S-S键，形成高度亲水的磺酸基。氧化反应是快速的，另外一个好处是，过量的氧化剂(过氧化氢)分解为氧和水并且蒸发，在局部不留任何化学残基。

使用细玻璃毛细管、微量点样仪等，通过滴加小滴过氧化氢，能够在疏水表面上手工产生亲水斑点阵列。可以采用多种方法将希望的试剂印刷到微阵列中。在一些实施方案中，利用一种针式工具机械排列斑点(参见，例如，Shalon，Genome Methods，6：639[1996]，在此引用作为参考)。在其它一些实施方案中，可以利用喷墨技术将过氧化氢或其它适当试剂的小滴印刷到疏水表面上(例如，O′Donnelly-Maloney等人，Genetic Analysis：Biomolecular Engineering，13：151[1996]，在此引用作为参考)。因此，与在金包被的载玻片上产生疏水阵列的昂贵方法相比，这种包被方法在疏水阵列的生产方面具有显著优势。也不同于以前的方法，上述方法不需要使用攻击性试剂，如硝酸或臭氧，通过SH基的氧化产生疏水斑点。

上述策略提供了在表面上产生希望的化合物的大阵列的能力。因此，本发明提供一种修饰表面特性的“模块化”方法，在这个意义上，上述化学提供显著的灵活性和对附着或排列于表面上的分子身份和位置的控制。下图说明了这种可用于玻璃表面修饰的大批化合物的合成思路：

基团R和R′能够选自多种市售的材料。多种能够衍生化表面的化合物(上述结构说明)能够相对容易地合成。这些化合物中的基团R和R′能够选自：脂肪族、芳族、杂环或聚合化合物，它们可向修饰的表面上引入希望的结构、化学或物理性质。

这些化合物能够单独使用或者与另外一种硅烷化剂联合使用，例如能够作为调节沉积密度的材料，或者作为进一步扩展调节包被玻璃表面特性的能力的其它修饰剂。

硅烷化剂(如化合物2)的最希望的特性之一是它们能够与玻璃表面的羟基相互作用，形成相对稳定的共价硅氧烷键(Si-O-Si)。

然而，在高极性介质(水)中或升高的温度下，该键能够水解裂解。为了稳定包被材料与玻璃表面的附着，在本发明的一些实施方案中，用有机-无机中孔性溶胶-凝胶材料包被载玻片。该溶胶-凝胶法使用化合物如化合物2，它与四烷氧基硅烷(RO)₄Si组合，在适当反应条件(pH)下能够形成杂合有机-无机溶胶-凝胶材料。

在一些实施方案中，使用多孔的硅酸盐凝胶形成溶胶-凝胶薄膜，该薄膜可用于在包被表面(例如微阵列)的生产中包被载玻片。术语“溶胶-凝胶玻璃”和“金属氧化物玻璃”是指通过溶胶-凝胶法制备的玻璃材料，包括无机材料或混合的有机/无机材料。用来生产玻璃的材料可包括但不限于：铝酸盐、铝硅酸盐、钛酸盐、ormosils(有机修饰的硅烷)和其它一些金属氧化物(一般参见Brinker和Scherer，《溶胶-凝胶科学》，Academic Press，San Diego[1995])。在一些实施方案中，微孔性无机-有机杂合硅酸盐气凝胶用于调节在玻璃表面上沉积的薄膜的物理/化学性质。

本发明使用溶胶-凝胶材料进行表面包被和微阵列生产，具有易于生产、成本极低和合成操作范围实际上无限的优点，能够影响合成的薄膜的性质(孔隙率、形态学、光学性质、化学性质)。在一些实施方案中，由无机-有机硅酸盐杂合体制备的多孔薄膜通过旋转包被或浸渍包被在玻璃表面沉积。这两种方法都广泛用于生产基于硅酸盐的新材料。由于薄膜以最终的形式沉积，因此不需要高成本的处理。

溶胶-凝胶处理方法广泛用于制备用于生产微电子装置的陶瓷二氧化硅膜。这些薄膜是一种稳定结构，其形态易于改造。当在溶胶-凝胶过程中形成基于二氧化硅的薄膜时，它们的结构能够图示说明为由硅和氧键形成的凝胶型材料，如下所示：

由这些材料组成的薄膜能够容易地沉积在玻璃表面上，并用多种方法修饰。

最令人感兴趣的硅盐酸溶胶-凝胶薄膜之一是包含有机分子的杂合无机-有机薄膜。生产并研究了由杂合气凝胶形成的多种这样的薄膜。它们的结构用下图说明：

附图中的基团R代表通过与硅原子的共价键引入结构内的适当的有机基。R基团可能是相同或不同的。这提高了设计薄膜特性的灵活性。

在本发明的优选实施方案中，有机基R具有特异性的化学反应性，是在溶胶-凝胶过程中形成的薄膜中连接硅原子的结构的一个组成部分。

仔细选择基团R或者使用不同的基团R能够形成其特性可以被调节的薄膜。例如，引入含有二硫键(-S-S-)或巯基(SH)的化合物能够引入基本疏水的特性和基本的化学反应性。制备硫辛酸包被的载玻片证明了这一概念的原理。

实验证明，载玻片具有基本疏水的特性，通过用35％过氧化氢处理表面，能够生产高度局部化的亲水斑点。

因此，在一些实施方案中，本发明利用含有二硫基-S-S-的有机基R提供微孔性杂合无机-有机凝胶。在一些实施方案中，这些基团是中孔性薄膜的一部分，其厚度能够调节，通过局部使用过氧化氢能够被转化为极性极强的亲水磺基。

该方法的一个优点在于以下事实：许多关键参数，包括薄膜厚度、反应基数量和影响气凝胶特性的其它有机基团的性质，能够容易地调节。在富含二硫键的二氧化硅薄膜表面上局部使用适当的试剂(例如过氧化氢)使结构局部崩解(结构局部破裂)并形成微孔。通过适当选择杂合凝胶中存在的有机基和反应条件，能够调节整个过程。

该方法的优选实施方案提供：

1.覆盖不同厚度的硅酸盐中孔性薄膜的载玻片的制备

2.中孔性薄膜的非共价修饰(无机和有机修饰)

3.中孔性薄膜的共价修饰(无机和有机修饰)

4.利用不同的沉积技术，形成不同厚度的杂合无机-有机中孔性薄膜。

5.中孔性杂合硅酸盐薄膜的形成，其含有含二硫键(-S-S-)或巯基(SH)的分子。

6.中孔性杂合无机-有机硅酸盐薄膜的形成，其含有含任何有机基团的分子，其特性能够用化学方法改变，形成具有不同化学或物理性质(例如疏水-亲水)的高度局部化的区域(例如产生微孔)。

7.薄膜杂合硅酸盐在玻璃以外的材料上的沉积

8.共价或非共价附着有胶态二氧化硅的载玻片的制备

9.胶态二氧化硅的共价和非共价修饰，以及这些胶态材料在固体表面(如玻璃、聚合物、金属、准金属)上的沉积。

本发明也提供提高附着于玻璃表面的有机材料稳定性的方法，也提供与玻璃表面的多个附着点(“Velcro”法)。可以预期，多个附着点可提高包被的水解稳定性。该方法的一个实施方案在下面图示。

多功能材料包括但不限于低分子量材料，或者来自于多种具有希望的化学或物理性质的聚合材料。在高极性、基于水的介质中，在材料通过Si-O键与玻璃基质附着的稳定方面，选择富含疏水基团的多功能聚合材料可能具有显著优点。实施本发明不一定要理解这种机制，本发明也不限于任何具体机制，可以预期，聚合材料的疏水性质通过在水环境中崩解保护聚合物与玻璃基质的附着点。

在本发明发展期间进行的实验中，选择聚苯乙烯-马来酸酐共聚物作为制备疏水多功能包被材料的基质。首先将溶解于有机溶剂(二噁烷)中的该聚合物的游离羧基转化为NHS活性酯，随后与a)6-氨基-1-己醇和b)氨丙基三乙氧基硅烷反应。预计的材料看起来象：

可以预期，附着于聚合物骨架的氨丙基三乙氧基硅烷部分提供与玻璃基质的附着点，而6-氨基-1-己二醇引入一个游离羟基，该羟基可用于进一步的化学操作(例如化学DNA合成)的起点。

在另外一些实施方案中，使用氨乙基氨甲基苯乙基三甲氧基硅烷包被表面。该材料附着于玻璃表面，具有良好的水解稳定性(Chen等人，Nanoletters，2：393(2000)和Arkles等人，《二氧化硅化合物注册与综述》，第五版，United Chemical Technologies；Bristol(1991))。该材料的结构如下：

官能团                            疏水域                      与表面附着

氨乙基氨甲基苯乙基三甲氧基硅烷

该化合物，以及随后的一种化合物，如同用于该目的的所有化合物一样，通常含有下列功能域：

能够附着于表面的末端部分，例如Si(OR)₃，其中R是Me、Et、乙酰基；

疏水性接头，它能够短至C3。

末端官能团，例如-NH₂、-OH、-COOH等。

具有类似特性的另外一种化合物的一个例子如下：

实施本发明不一定要理解这种机制，本发明也不限于任何具体机制，可以预期，与玻璃表面附着的稳定性提高是由于其疏水性提高。因此，该化合物可以作为基质用于合成根据上述“模块化方法”制备的新包被材料。

对于核酸微阵列的设计，为了生产使水解稳定性提高的新包被试剂，并提供作为化学寡核苷酸合成起点的官能团，将这种新鉴定的有机硅烷与DMT保护的16-羟基十六烷酸的NHS酯偶联，如下图所示：

该化合物在载玻片修饰的标准方案中使用。

实验证明，能够在这些载玻片上合成寡核苷酸，合成的材料与玻璃表面的附着具有极强的稳定性。有机分子通过硅氧烷键与玻璃表面附着的稳定性受包被试剂中存在的有机基的疏水性影响。这些化学性质允许用一种模块化方法合成新型包被试剂，包括能够快速合成的、具有不同结构特征(例如亲水或疏水性质、官能团、接头长度等)的多种新型试剂。

试剂氨乙基氨甲基苯乙基三甲氧基硅烷具有以前未曾描述过的其它特性。如以上说明用允许寡核苷酸合成的试剂包被的载玻片表面的图所示，仲氨基受三氟乙酰基(CF₃C(O))保护，以避免参与寡核苷酸合成过程。这种结构特征能够用作为了调节包被表面的性质引入希望的功能性或官能团的另外一种方法。

Y＝例如含有可交联基团(如多个键)的亲脂基团或有机基团

向包被试剂内引入其它官能团可能具有重要用途。一个实施例是，预期导入在适当UV波长影响下经历聚合(或交联)的官能团可形成非常稳定和化学抗性的交联的聚合包被。作为使用亲脂化合物的备选方案，通过紫外线诱导的沉积的有机材料的聚合或交联稳定包被表面，是提高硅氧烷键水解稳定性的一种方法，材料通过该键能够附着于玻璃表面。使附着于玻璃表面的分子具有高水解稳定性的多种试剂也能够用作在陶瓷表面制备中使用的材料，该陶瓷表面具有通过适当单体单元的直接聚合附着的聚合材料(接头)。

在一些实施方案中，准备长(例如基于PEG的)接头(MW～1100和3400)通过水解稳定的硅氧烷键附着于玻璃表面。如上所述，这些接头通常含有一个能够附着于表面的末端部分，一个疏水接头和一个末端官能团。以上描述了提供这些功能的部分。

通过聚合物直接生长的表面修饰方法

本发明还提供化学修饰在生物材料固定方法中有用的固体表面的方法和组合物。例如，该方法在单体单元的聚合过程中有用，导致长线性聚合结构的形成，该结构的一端附着于固体表面，另一端含有反应性官能团。

X＝聚合物表面上的官能团，聚合过程由此开始

Y＝聚合链末端的官能团

单体模块的聚合可能包括任何种类的聚合过程，即阳离子聚合、阴离子聚合或自由基聚合。能够调整这些方法，以形成相对较窄的分子量范围内的聚合物(例如，如在ATRP聚合中)。

在一些优选实施方案中，该方法提供用长聚合接头密集包被的固体表面，该接头终止于在向固体表面上固定生物分子的方案中有用的官能团。根据具体的合成目的和预测的修饰表面的用途，有多种材料可以作为修饰的底物(例如修饰的和未修饰的玻璃表面、修饰的金属表面、聚合表面等)。附着有聚合接头的这种表面能够作为DNA探针化学合成的一种适合的基质，该探针将通过长聚合接头附着于固体表面。在合成寡核苷酸探针之前不需要多次偶联(负面影响终材料的产量)，或者不需要通过希望的聚合材料的附着预先修饰表面。

在本发明的发展过程中，发现最近发现的一种被称为原子转移自由基聚合(ATRP)[综述于Coessens，V.等人，Prog.Polym.Sci.26：337-377(2001)]的聚合方法能够与生物分子一起使用，并且能够用于制备以线性聚合链修饰的表面，该方法允许线性聚合链、分子刷、树突状聚合物(dendrimers)、分子星和热反应性聚合物的受控生长。因此，本发明提供ATRP在生产包被的表面和微阵列中的用途。

下列化学可使用固体表面上的ATRP，通过ATRP法聚合接头将附着于该表面上。

ATRP可使聚合链在其全长上的化学组成改变。例如，最接近表面附着的聚合链的部分可能含有第一种类型的单体单元(例如具有疏水性)，而最远的部分可能含有第二种类型的单体单元(例如具有亲水性)。以下显示了一个典型实施方案：

可以预期，在水(或基于水的缓冲液)环境中，这种排列通过聚合链的疏水部分的崩解，有效保护聚合物与玻璃表面的附着点，如下图所示。

类似地，固体表面可能具有一种或多种ATRP产生的其它聚合结构，包括但不限于聚合刷、树突状聚合物或聚合蘑菇。附着的聚合材料的结构可以是同源的或是异源的，以限制或扩大它们的性质和用途的范围。

利用ATRP，一个表面能够覆盖特定半径的珠或其它附着物，产生不同密度的反应性部位。含有多个反应部位的聚合部分能够用来以不同的密度附着oligos。类似地，也能够利用聚合物增加距载玻片表面的距离，使表面-oligo相互作用最小化。能够使聚合结构带有电荷，以提高杂交率，并且能够用温度或化学方法调节。另外，也能够产生混合的聚合物，涵盖从例如靠近附着表面的完全疏水性单体到游离末端的亲水单体的梯度。

ATRP为多种生物学用途提供了一种有用的方法。例如，可以利用ATRP控制表面上的分子密度。在一个这样的实施方案中，利用ATRP产生附着于目的分子(例如一种核酸分子)的珠。然后在一个表面上覆盖特定半径的珠(或其它附着物)，产生具有希望的密度的反应性部位。更密集的阵列通过选择更小的半径产生。通过ATRP产生的含有多个反应部位的聚合部分能够用来以不同的密度附着希望的分子。类似地，也能够利用ATRP聚合物增加希望的分子距表面的距离，使希望的分子与表面之间的相互作用最小化，和/或为了最佳功能性在物理空间中定位希望的分子。

ATRP也在大量其它生物技术用途方面得到应用。从设计具有一种或多种希望的功能性质的化学接头中受益的任何用途都能够利用通过ATRP设计并产生的接头实现。例如，化学接头能够附着于核酸分子或蛋白质分子，产生有助于分子的纯化、鉴定、分离、分析或应用的官能团(例如通过提供化学基团，该基团可影响含有接头的分子的一种或多种特性，包括但不限于电荷、溶解度、大小、反应性、可检测性、稳定性等)。能够修饰核酸和蛋白质来改善与结合配偶体的结合(例如增强配体-受体结合，增强杂交等)、细胞通透性和反义寡核苷酸技术的治疗益处等。

E.核酸检测

如上所述，进行核酸检测优选地使用本发明的方法和组合物(例如含有修饰表面的微阵列，通过非水液体的点样方法等)及试剂。在优选实施方案中，本发明可用于进行INVADER测定。INVADER测定根据结构特异性酶对特定结构的酶切检测探针与靶标的杂交(参见，INVADER测定，Third Wave Technologies；参见，例如，美国专利号5,846,717；6,090,543；6,001,567；5,985,557；6,090,543；5,994,069；Lyamichev等人，Nat.Biotech.，17：292(1999)，Hall等人，PNAS，USA，97：8272(2000)，WO 97/27214和WO 98/42873，均在此全文引用作为参考)。下面提供了另外一些检测试验(提供了关于INVADER测定的其它一些细节)，来说明能够使用本发明的方法和组合物的代表性核酸检测。

i.PCR测定

在本发明的一些实施方案中，利用基于PCR的测定检测变异序列。在一些实施方案中，PCR测定包括使用只与变异或野生型等位基因(例如与多态性或突变区)杂交的寡核苷酸引物。利用这两组引物扩增DNA样品。如果只有突变引物产生PCR产物，则患者含有突变等位基因。如果只有野生型引物产生PCR产物，则患者含有野生型等位基因。PCR试剂可以与本发明的方法和组合物一起使用，例如，产生微阵列。

ii.片段长度多态性测定

在本发明的一些实施方案中，利用一种片段长度多态性测定检测变异序列。在一种片段长度多态性测定中，利用一种酶(例如一种限制性内切酶或CLEAVASE I[Third Wave Technologies，Madison，WI]酶)产生以在一系列位点处切割DNA为基础的独特DNA带型。来自含有SNP或突变的样品的DNA片段具有不同于野生型的带型。片段长度多态性测定试剂可以与本发明的方法和组合物一起使用，例如，产生微阵列。

a.RFLP测定

在本发明的一些实施方案中，利用一种限制片段长度多态性测定(RFLP)检测变异序列。首先PCR分离目的区。然后用已知对于特定多态性产生独特长度片段的限制性内切酶酶切PCR产物。限制性内切酶消化的PCR产物通常通过凝胶电泳分离，并且可以通过溴化乙锭染色显示。这些片段的长度与分子量标准和野生型和突变对照产生的片段相比较。

b.CFLP测定

在另外一些实施方案中，利用一种CLEAVASE片段长度多态性测定(CFLP；Third Wave Technologies，Madison，WI；参见，例如，美国专利号5,843,654；5,843,669；5,719,208；和5,888,780；均在此引用作为参考)检测变异序列。该测定是基于以下发现：当DNA的单链自身折叠时，采取较高级别的结构，这些结构对于DNA分子的精确序列是非常独特的。这些二级结构包括DNA的部分双链区，使得单链区与双链DNA发夹并列。CLEAVASE I酶是一种结构特异的热稳定的核酸酶，能够识别并切割这些单链区与双链区之间的连接处。

例如，首先利用PCR分离目的区。在优选实施方案中，标记一条链或两条链。然后，通过加热分离DNA链。其次，冷却反应体系，使其形成链内二级结构。然后用CLEAVASE I酶处理PCR产物，产生对于特定SNP或突变独特的一系列片段。分离、检测(例如通过变性凝胶电泳)并显示(例如通过放射自显影、荧光成像或染色)CLEAVASE酶处理的PCR产物。将这些片段的长度与分子量标准和野生型和突变对照产生的片段相比较。

iii.杂交测定

在本发明的优选实施方案中，利用一种杂交测定检测变异序列。在一种杂交测定中，特定SNP或突变的存在与否根据来自样品的DNA与一种互补DNA分子(例如一种寡核苷酸探针)杂交的能力来确定。使用多种杂交和检测技术的多种杂交测定是可用的。下面提供了选择试验的描述。杂交测定试剂可以与本发明的方法和组合物一起使用，例如产生微阵列。

a.杂交的直接检测

在一些实施方案中，探针与目的序列(例如SNP或突变)的杂交通过显示结合的探针直接检测(例如Northern或Southern测定；参见，例如Ausabel等人(编著)，《现代分子生物学方法》，John Wiley & Sons，NY[1991])。在这些试验中，从受试者中分离基因组DNA(Southern)或RNA(Northern)。然后用在基因组很少切割、并且不靠近测定的任何标记的一系列限制性内切酶切割该DNA或RNA。然后分离(例如用琼脂糖凝胶)DNA或RNA，将其转移到膜上。一种标记的(例如掺入一种放射性核素)对于检测的SNP或突变特异的探针在低、中或高严格条件下接触该膜。除去未结合的探针，通过显示标记的探针检测结合的存在。

b.杂交的酶检测

在本发明的一些实施方案中，通过酶切特定结构检测杂交(INVADER试验，Third Wave Technologies；参见，例如，美国专利号5,846,717、6,090,543；6,001,567；5,985,557；和5,994,069；均在此引用作为参考)。INVADER试验通过用结构特异性酶切割重叠寡核苷酸探针杂交形成的复合物，检测特异性DNA和RNA序列。温度升高和探针之一过量使得对于存在的每种靶序列，有多种探针被切割，这不需温度循环。这些切割的探针然后引导第二种标记探针的切割。第二种探针寡核苷酸能够用荧光染料5’端标记，该染料可被第二种染料或其它猝灭部分猝灭。在切割后，可以用标准荧光读板器检测解除猝灭的染料标记的产物，或者用一种用来在反应过程中收集荧光数据的仪器(即一种“实时”荧光检测器，如ABI 7700序列检测系统，Applied Biosystems，FosterCity，CA)检测。

INVADER试验检测未扩增的基因组DNA中的特异突变和SNP。在用来检测基因组DNA中SNP的INVADER试验的一个实施方案中，两种寡核苷酸(对于SNP/突变或野生型序列特异的第一探针，和一种INVADER寡核苷酸)与基因组DNA串联杂交，形成一种重叠结构。一种结构特异性核酸酶识别这种重叠结构，并切割第一探针。在第二个反应中，切割的第一探针与荧光标记的第二探针结合，产生另外一种重叠结构，该结构可被酶切割。第一次和第二次反应能够在同一容器中同时进行。第二探针的切割如上所述用一种荧光检测器检测。测试样品的信号可以与已知的阳性和阴性对照相比较。下面文献中提供了在固体表面上进行INVADER测定的方法和组合物：授予Neri等人的美国申请系列号09/732,622和10/309,584，以及授予Lyamichev的美国临时申请60/374,642，均在此全文引用作为参考。

在一些实施方案中，利用一种TaqMan测定检测结合探针的杂交(PE Biosystems，Foster City，CA；参见，例如美国专利号5,962,233和5,538,848，均在此引用作为参考)。该测定在PCR反应过程中进行。TaqMan测定利用DNA聚合酶(如AMPLITAQ DNA聚合酶)的5′-3′外切核酸酶活性。PCR反应中包含一种探针，它对于给定等位基因或突变是特异的。该探针由含有5’-报道染料(例如荧光染料)和3′-狡灭剂染料的寡核苷酸组成。在PCR过程中，如果该探针与其靶标结合，AMPLITAQ聚合酶的5′-3′核酸水解活性在报道染料与猝灭剂染料之间切割探针。报道染料与猝灭剂染料的分离导致荧光增强。随着每个PCR循环，信号积累，能够用荧光计监测。

在另外一些实施方案中，利用SNP-IT引物延伸测定法检测多态性(Orchid Biosciences，Princeton，NJ；参见，例如美国专利号5,952,174和5,919,626，均在此引用作为参考)。在该测定中，利用特别合成的DNA引物和DNA聚合酶鉴定SNP，以在怀疑的SNP位点使DNA链选择性延伸一个碱基。扩增并变性目的区中的DNA。然后利用被称为微观流控(microfluidics)的小型化系统进行聚合酶反应。向怀疑位于SNP或突变位点的核苷酸上添加一个标记，以此完成检测。向DNA内掺入标记能够用任何适当的方法检测(例如，如果核苷酸含有一种生物素标记，则通过荧光标记的生物素特异的抗体进行检测)。

iv.其它检测试验

使用本发明的系统和方法产生并应用的其它检测试验包括但不限于：酶错配切割法(例如Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，在此全文引用作为参考)；聚合酶链反应；分支杂交法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，在此全文引用作为参考)；滚环复制(例如，美国专利号6,210,884和6,183,960，在此全文引用作为参考)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，在此全文引用作为参考)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，在此全文引用作为参考)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，在此全文引用作为参考)；循环探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，在此全文引用作为参考)；Dade Behring信号扩增方法(例如，美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，在此全文引用作为参考)；连接酶链反应(Barnay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，189-93(1991))和夹心杂交法(例如，美国专利号5,288,609，在此全文引用作为参考)。来自这些核酸检测试验的试剂可以与本发明的方法和组合物一起使用，例如，产生微阵列。

F.反应产物的切割后标记

为了避免研发和生产光活化的含有染料和猝灭剂的亚磷酰胺的高成本，在一些情况下希望使用包括反应后标记的备选方案来检测切割。如下所述，用于INVADER测定的核酸阵列能够在固体表面阵列上产生(例如NimbleGen，Madison WI生产的，和美国专利6,375,903所述的，在此引用作为参考)，并且与以下描述的切割后标记方法一起使用。

在固体表面INVADER测定的一个实施方案中，探针寡核苷酸在其5’端与表面连接。这种形式产生极简单的反应后标记方案，其中一种通用标记寡核苷酸与切割的探针的5’瓣直接连接。探针的靶特异性切割将导致在探针上存在的5’瓣序列的末端形成一个3′-OH。例如，该瓣序列可能是4种不同的瓣序列之一，每种可能的碱基一种，共同作为下游标记附着的一个通用系统。在INVADER反应后，固体表面可以在变性条件下洗涤，然后暴露于一种溶液，该溶液含有CLEAVASE酶(或类似的酶)和与4种瓣序列的任一种互补的4种标记的盒。来自探针寡核苷酸的5’瓣产生一种含有互补盒的重叠结构，导致在标记盒上形成5’-磷酸。同时加入或者连续加入的一种连接酶将标记盒与切割的瓣共价连接。然后从固体表面(阵列)上严格洗下未连接的盒，使标记只与切割的探针连接。

在固体表面INVADER测定的另外一个实施方案中，探针寡核苷酸通过其3’端与表面连接。这种形式使得反应后通用标记方案的应用更加复杂，因为切割的探针仍附着于阵列表面的部分是靶标特异性的，根据试验不同而不同。

在图3概述的一个实施方案中，探针的设计包括两种互补序列，U和A′，位于靶标特异性序列的3′。A′序列与靶标特异性序列的部分“A”互补。探针的靶标特异性切割导致5’-碱基的去除，产生含有5’-磷酸的探针序列(图3A)。在INVADER反应后，固体表面(例如载玻片)在变性条件下洗涤，然后在序列A能与A’退火的温度下温育，形成图3B所示的结构。向溶液中加入连接酶和含有一种标记(例如荧光染料)的通用标记寡核苷酸U′。标记的寡核苷酸U′与U退火导致一种切口结构的形成，该切口结构的连接将一种标记与切割的探针共价连接。

这种标记方案通过组合U和A’序列的长度延长了探针长度。应当认真设计A和A’序列，以确保在标记步骤中形成稳定的双链体，而不干扰INVADER反应中重叠底物的形成。

另外一个实施方案包括一种简并标记寡核苷酸，如图4所示。该寡核苷酸的探针结合区包含一个短简并区。在一个优选实施方案中，该区含有6-8个碱基，所有碱基(例如天然碱基)平均存在于每个位点。该方法允许一步标记阵列上的所有切割探针。T4和T7连接酶都能够连接相邻的六聚体，提示这些双链体足够长(Kaczorowski和Szybalski(1994)，Anal Biochem，221：127-35；Dunn等人(1995)，Anal Biochem，228：91-100)。每个位点都是简并的使简并性为4ⁿ倍，其中n是简并的碱基数，因此，6碱基区导致简并性为4⁶＝4,096倍。因此，标记寡核苷酸的4μM混合物例如含有约1nM每种独特序列(例如，在许多荧光检测器器的灵敏度范围内)。如果这种形式产生基本非特异性的背景，则能够在INVADER反应之前利用另外一个使用非标记简并寡核苷酸的连接步骤阻断非特异性位点。

另外一个实施方案包括一种靶标特异性标记寡核苷酸，产生一种非通用的标记形式。该方法在图5中举例说明。代替使用简并寡核苷酸混合物，为每种靶序列产生特异的标记寡核苷酸。

                     实施例1

       通过3’附着与表面连接的切割探针的标记

该实施例比较了图3-5所示的不同切割后标记形式。如图6所示(例如“23T”或“30T”)，在NimbleGen阵列(获自NimbleGen，Madison，Wisconsin)上用寡核苷酸制备表面。在该图中，“帽子”是指在寡核苷酸合成过程中添加的保护基DMT，用来保护寡核苷酸的5′端。无环是指SEQ ID NO：1(5′-DMT-tttgaggtatacaggtatttgtc-3′)，如图3所示它自身不折叠。对于剩余的寡核苷酸，退火形成自身互补环区的碱基加划线并以黑体表示；与“通用”标记盒互补的碱基用斜体表示；在突变序列中大写字母的碱基被改变为A。“4环”是指含有一个4-bp自身互补区的环结构，例如SEQ ID NO：2(5′-DMT-ttttG aggtatacaggtatttgtc acctcattagattac-3′)；“6环”是指含有一个4-bp自身互补区的环结构，例如SEQ ID NO：3(5′-DMT-ttttGaggtatacaggtatttgtcgt atacctcattagattac-3′)；“8环”是指含有一个4-bp自身互补区的环结构，例如SEQ ID NO：4(5′-DMT-ttttG aggtatacaggtatttgtc gtatacctcattagattac-3′)；“10环”是指含有一个4-bp自身互补区的环结构，例如SEQ ID NO：5(5′-DMT-ttttG aggtatacaggtatttgtc ctgtatacctcattagattac-3′。“切割的无环，phos”是指由SEQ ID NO：1的INVADER测定切割预期的序列，含有SEQ ID NO：6(5′-PO4-aggtatacaggtatttgtc-3′)；“切割的4环，phos”是指由SEQ ID NO：2的INVADER测定切割预期的序列，含有SEQ ID NO：7(5′-PO4-aggtatacaggtatttgtcacctcattagattaccattagattac-3′)；“切割的6环，phos”是指由SEQ ID NO：3的INVADER测定切割预期的序列，含有SEQ ID NO：8(5′-PO4-aggtatacaggtatttgtcatacctcattagattaccattagattac-3′)；“切割的8环，phos”是指由由SEQ ID NO：4的INVADER测定切割预期的序列，含有SEQ ID NO：9(5′-PO4-aggtatacaggtatttgtcgtatacctcattagattaccattagattac-3′)。

产生如图6所示的重复组阵列。一个阵列与8-mer简并或随机盒SEQ ID NO：10(5′-cy3-ttttt(n)8ggcacacgagatttttctcgtgtgcc-3′)温育，一个与6-mer随机盒SEQ ID NO：11(5′-cy3-ttttt(n)6ggcacacgagatttttctcgtgtgcc-3′)温育；一个与如上所述的与环探针一部分互补的“通用”标记SEQ ID NO：12(5′-cy3-tttttgtaatctaatg-3′)温育，一个与序列特异性盒SEQ ID NO：13(5′-cy3-ttttttacctgtatacctggcacacgagatttttctcgtgtgccaggtatacaggtattttgtc-3′)温育。连接反应按照下列程序进行：

成分	序列特异性盒	通用盒	6-mer随机盒	8-mer随机盒
					10×T4连接酶缓冲液	1μl	1μl	1μl	1μl
T4 DNA连接酶	1μl	1μl	1μl	1μl
					SEQ ID NO：13(10μM)	0.5μl	--	--	--
SEQ ID NO：12(10μM)	--	0.5μl	--	--
					SEQ ID NO：10(10μM)	--	--	--	0.5μl
SEQ ID NO：11(10μM)	--	--	0.5μl	--
					水	7μl	7μl	7μl	7μl

向TEFLON模板上的适当区添加2μl等份的适当反应混合物。该芯片与模板附着，在30-33℃下温育1小时。芯片夹心在1％Tween 20的室温浴中解装配，用95℃的0.1％Tween洗涤一次5分钟，然后用95℃水洗涤3次，用氩气干燥。

Cy-3标记用Alpha Array 7000(来自Alpa Innotech，San Leandro，CA)检测，结果在图7中显示。结果表明，该标记以所有4种盒类型掺入，尽管8-mer随机盒水平较低。在所有情况下，没有标记如预期地连接到全长探针分子上(每个阵列前4行)。在每个阵列底部的4种样品含有假切割的探针，用来作为不同连接反应的底物。与寡核苷酸设计相一致，靶标特异性产物不与“通用”标记盒杂交，因为ASR特异的产物中不含“通用”盒的互补序列。其它盒，即两个随机盒和一个靶标特异性盒，与假切割的产物杂交并连接。该实施例表明，能够使用普通的或“通用”方法在固体表面上标记侵入的切割反应产物。

Claims (23)

1.一种含有表面的组合物，该表面含有一种包被，该包被含有接头，其中该接头具有与该表面共价偶联的第一个末端和含有反应基的第二个末端，其中该接头还含有一个疏水部分和一个亲水部分，其中所述疏水部分的构型使其在水环境中破裂，从而提高所述接头与所述表面附着的稳定性。

2.权利要求1的组合物，其中所述表面包括玻璃表面。

3.权利要求2的组合物，其中所述包被包括溶胶-凝胶玻璃。

4.权利要求1的组合物，其中所述接头利用原子转移自由基聚合法合成。

5.权利要求1的组合物，其中所述反应基允许核酸分子附着于该接头的第二个末端。

6.权利要求1的组合物，其还含有附着于所述接头的第二个末端的核酸分子。

7.权利要求1的组合物，其还含有附着于所述表面的100个或更多的核酸分子。

8.一种含有表面的组合物，该表面含有一种疏水性包被，该疏水性包被含有多个氧化斑点，这些氧化斑点通过包括下列步骤的方法产生：

a)用含有二硫键的化合物包被该表面，产生所述疏水性包被；和

b)使所述疏水性包被在多个斑点中接触氧化剂，产生多个氧化斑点。

9.权利要求8的组合物，其中所述表面包括玻璃表面。

10.权利要求8的组合物，其中所述包被包括溶胶-凝胶玻璃。

11.权利要求8的组合物，其中所述氧化剂包括过氧化氢。

12.权利要求8的组合物，其中所述表面在多个氧化斑点的一个或多个中含有附着于该表面的核酸分子。

13.一种方法，其包括：

a)提供：

i)含有孔的固体支持体，

ii)非水液体，和

iii)检测试剂溶液；和

b)向所述孔中加入该非水液体，和

c)于可以在所述孔中形成至少一个微阵列-斑点的条件下，将所述检测试剂溶液通过所述非水液体加入所述孔中。

14.权利要求13的方法，其还包括步骤d)使至少一个微阵列-斑点接触测试样品溶液。

15.权利要求14的方法，其中这种接触包括推动测试样品溶液通过非水液体进入该孔中。

16.权利要求13的方法，其中所述非水液体是油。

17.权利要求13的方法，其中所述固体支持体含有多个孔，且用多个孔进行该方法。

18.权利要求17的方法，其中同时形成至少两个微阵列-斑点。

19.权利要求14的方法，其中所述测试样品溶液含有靶核酸分子。

20.权利要求19的方法，其中所述靶溶液含有不到800个拷贝的靶核酸分子。

21.权利要求19的方法，其中微阵列-斑点与测试样品溶液的接触鉴定靶核酸分子中多态性的存在与否。

22.权利要求13的方法，其中用溶胶-凝胶包被所述孔覆盖。

23.权利要求14的方法，其中用CARTESIAN SYNQUAD纳米体积移液系统进行这种接触。

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