JP4802309B2

JP4802309B2 - 支持体に対する金属微粒子膜の形成方法及び局在プラズモン共鳴センサ

Info

Publication number: JP4802309B2
Application number: JP2006066735A
Authority: JP
Inventors: 雅広若尾; 泰生隅田; 智央小川
Original assignee: 国立大学法人鹿児島大学
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2026-03-10
Also published as: JP2007240463A

Description

本発明は抗原、抗体、DNA、酵素などの生体分子及びウィルス、細菌などを検出するセンサに用いられる、支持体表面に形成された金等の金属微粒子膜に関し、より詳しくは、金属微粒子を支持体の表面に強固に固定化した金属微粒子膜を形成する方法並びに支持体表面に形成された金等の金属微粒子膜による局在プラズモン共鳴センサに関するものである。

抗原抗体反応などのアフィニティセンサとして、金属微粒子の局在プラズモン共鳴現象を利用したセンサが知られている。

例えば特許文献１には、ガラス製の基板に、金属微粒子として、直径10〜20ｎｍの金微粒子を、凝集させずに互いに離隔した状態にある単層膜として固定された構成を有するセンサが記載されており、この単層膜の形成方法としては、前記ガラス製の基板を３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅの１０％メタノール溶液に１０分間浸けた後洗浄し、直径約２０ｎｍの金コロイド溶液に２時間浸けるという方法が記載されている。

また特許文献２には、光ファイバの端面に、局在プラズモン共鳴が励起される寸法の金属微粒子層が固定された構成を有するセンサが記載されており、この金属微粒子層の形成方法としては、光ファイバの端面を、Ｎ−（２−アミノエチル）３−アミノプロピル−トリメタオキシシランのエタノール溶液に５ｖｏｌ％酢酸を添加した溶液中に室温で１０分保持され、そして１２０℃オーブン中でシランカップリング剤を付着された後、ＮａＡｕＣｌ4の還元により合成された金微粒子水溶液中に浸漬するという方法が記載されている。

また特許文献３には、アミノ基を固定化官能基として生体物質を固定化する固定化層と、基板との間に表面活性層を形成することにより、基板から析出されるアルカリ物質を遮断して、基板と固定化官能基との結合力を向上させた生体物質固定用基板が記載されており、シランカップリング剤としてはアミノ基を持ったものが酸性副産物を生成せずに比較的高い官能基密度を有する分子層を形成する点が記載されている。

また特許文献４には、基板にシランカップリング剤を付着させた後、該基板をマトリクス材中に金属微粒子を分散させた高分子複合物の融解もしくは溶液中に浸漬することで金属微粒子を包囲したマトリクス材を介して基板に固定する方法が記載されている。

さらに非特許文献１には、自己組織化金属単分子層の形成において、金属コロイドと親和性を持つ官能基として、シアノ基、アミノ基及びチオール基が記載されている。
特許第３４５２８３７号公報特開２００５−１８１２９６号公報特開２００３−１７７１２９号公報特許第３２７６９２２号公報Ｒ．ＧｒｉｆｆｉｔｈＦｒｅｅｍａｎら、ＳＣＩＥＮＣＥ、２６７、１６２９（１９９５）

上述した特許文献１、２又は４に示す方法のように、シランカップリング剤末端のアミノ基と金属微粒子との静電的相互作用によって基板に金属微粒子を固定化する方法では、金属微粒子の表面とアミノ基は共有結合を作っておらずその結合力は弱い。

また、特許文献４に示す方法のように、金属微粒子を、それを包囲したマトリクス材を介して基板に固定する方法では、金属微粒子と、それに吸着させる測定対象物質との距離が大きくなり、金属微粒子の局在プラズモン効果をバイオセンサに応用するには望ましくない。

金属微粒子膜をセンサとして使用する場合には、基板に固定化された金属微粒子の表面にチオール等を用いてリガンドを修飾するが、その際、金属微粒子と基板との結合力が弱いと、水溶性の高い糖鎖等をリガンドとして用いた場合、センサ部分を水溶液に対して出し入れする通常の使用形態において、金微粒子が基板から剥がれたり、基板上で凝集を起こす等が生じ、この場合には、得られる検出信号が変化して、安定した測定が出来ない。

また自己組織化金属単分子層の形成において、金属コロイドと親和性を持つ官能基として、上記非特許文献１に示されているチオール基は、金と共有結合を作ることが知られており、このチオール基を用いれば、基板に対する金属微粒子の固定化が強固に行える可能性があるが、チオール系のカップリング剤は、カップリング剤自体の安定性が悪く、固定化される金属微粒子膜の再現性が悪い等、条件の設定が難しい。

本発明は、以上の課題に鑑みて創案されたものであり、即ち、局在プラズモン共鳴を利用したセンサを構成するための金属微粒子膜を、基板等の支持体の表面に強固に固定することができる金属微粒子膜の形成方法を提供することを目的とするものである。

以上の課題を解決するために、本発明では、支持体の表面をシランカップリング剤で処理した後、シランカップリング剤の有機官能基と、金属微粒子の夫々に結合性の官能基を有する反応物質を反応させ、その後、金属微粒子に結合性の官能基に金属微粒子を結合させる金属微粒子膜の形成方法を提案する。

また本発明では、シランカップリング剤による処理で支持体の表面に形成された有機官能基に結合させた反応物質の官能基に金属微粒子が結合されている構成の局在プラズモン共鳴センサ、そして結合された金属微粒子にリガンドを固定した局在プラズモン共鳴センサを提案する。

そして本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、シランカップリング剤が、有機官能基としてアミノ基を有するものであり、反応物質が、アミノ基と結合性の官能基と、金属微粒子に結合性のチオール基を有するものであることを提案する。

そして本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、シランカップリング剤が、下記の化学式１を有するものとすることを提案する。
［化学式１］
ＮＨ2−(Ｒ１)−Ｓｉ(Ｒ2)3
上記化学式１において、Ｒ１はカルボキシル基、イミノ基、フェニル基及びアルキレン基｛(ＣＨ₂)ｎ (ｎは１〜１２の整数)｝から成る群から選択され、Ｓｉ(Ｒ2)₃は支持体表面の作用基と反応し得る加水分解基で、Ｒ2がアルコキシ、ハロゲン化合物、及びアルデヒドから成る群から選択されるものである。

また本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、反応物質が、下記の化学式２を有するものとすることを提案する。
［化学式２］
Ｒ３−Ｓ−(Ｒ５)−Ｒ4
上記化学式２において、R3はSと共にチオール基、チオエステル基、スルフィド基、及びジスルフィド基を構成する炭化水素基（炭素鎖：０〜１２の整数）から成る群から選択されるもので、R４はアミノ基と結合性の官能基で、R５は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：１〜１２の整数）から成る群から選択されるものである。

また本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、反応物質が、下記の化学式３を有するものとすることを提案する。
［化学式３］

上記化学式３において、R6は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：３〜８の整数）から成る群から選択されるもので、R３は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：１〜１２の整数）から成る群から選択されるもので、R４はアミノ基と結合性の官能基である。

また本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、反応物質が、下記の化学式４を有するものとすることを提案する。
［化学式４］

上記化学式４において、R６は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：３〜８の整数）から成る群から選択されるものである。

また本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、化学式１のシランカップリング剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、N−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、及びこれらの混合物から成る群から選択されるものとすることを提案する。

また本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、化学式２の反応物質が、メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、及びこれらの混合物から成る群から選択されるものとすることを提案する。

また本発明では、、上記の方法及びセンサにおいて化学式３の反応物質を、チオクト酸とすることを提案する。

また本発明では、上記の方法及びセンサにおいて、化学式４の反応物質を、γーチオブチロラクトンとすることを提案する。

基板等の支持体の表面をシランカップリング剤で処理して、その表面に有機官能基を形成した後、シランカップリング剤の有機官能基と、金属微粒子の夫々に結合性の官能基を有する反応物質を反応させると、反応物質がシランカップリング剤の有機官能基により支持体の表面に強固に固定化されると共に、反応物質の官能基により金属微粒子が強固に固定化されて金属微粒子膜を形成することができる。

この際、シランカップリング剤が、有機官能基としてアミノ基を有するものとすると共に、反応物質が、アミノ基と結合性の官能基と、金属微粒子に結合性のチオール基を有するものとすれば、金属微粒子は、反応物質のチオール基と共有結合を作るため、非常に強固に固定される。

従って、このようにして強固に結合された金属微粒子にリガンド等を修飾して、局在プラズモン共鳴を利用したセンサを構成した場合に、金属微粒子の剥がれや、凝集を生じることがなく、安定した測定を行うことが可能となる。

次に本発明を実施するための最良の形態を添付図面を参照して説明する。
図１は本発明の方法の流れを示す模式図であり、図中、矢印に示す方向に処理が進行するものである。符号１はガラス等の無機物の支持体を示すものであり、この支持体１は、基板として構成する他、上記特許文献２に示すような光ファイバ等の構成とすることもできる。

本発明では、まず、支持体１の表面をシランカップリング剤２で処理する。
この処理により、シランカップリング剤２は加水分解基により支持体１の表面に固定化され、その表面に有機官能基、即ち、この場合、アミノ基が形成される。
次いで、シランカップリング剤２の有機官能基と、金属微粒子の夫々に結合性の官能基を有する反応物質３を反応させることにより、反応物質３をシランカップリング剤２に固定することができる。
この状態においては、反応物質３の表面に金属微粒子に結合性の官能基が形成されているので、この官能基を持って金属微粒子４を固定し、金属微粒子膜を形成することができる。

本発明では、上述したとおり、シランカップリング剤２が、有機官能基としてアミノ基を有するものとすると共に、反応物質が、アミノ基と結合性の官能基と、金属微粒子に結合性のチオール基を有するものとすることにより、金属微粒子４を、チオール基との共有結合により強固に固定することができるのである。

次に本発明の具体的な実施例を図２を参照して説明する。尚、図３は、図２の模式図における流れの各局面に相当する状態を化学式を用いて模式的に示したものである。

この実施例１では支持体１はガラス基板であり、金属微粒子は金微粒子である。またシランカップリング剤としては、末端にアミノ基を有するものとして、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを１％の濃度でエタノールに溶解した溶液を用いる。
まずガラス基板を、このシランカップリング剤溶液に１０分間浸し、取り出してエタノールで洗浄を行う。その後１２０℃で３０分間空気中で加熱し乾燥させる。

末端にアミノ基を持つシランカップリング剤としては、その他、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等を用いることができる。また、望ましい溶液の濃度は０．１〜１２ｗｔ％である。

このようにシランカップリング剤で表面処理したガラス基板１を、反応物質２として、チオクト酸２５ｍＭ、ジイソプロピルエチルアミン５０ｍＭ、３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール２５ｍＭ、１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド２５ｍＭを溶解したジメチルホルムアミド溶液に浸漬し、室温下で４８時間反応させた後、取り出してエタノールで洗浄する。

以上の処理により、図２の上から３段目の模式図に示すように、金属微粒子４としての金微粒子と共有結合する官能基を有する表面が形成される。

次いで、以上の方法で処理した基板１を、クエン酸により作製、安定化された金コロイド溶液に１〜４８時間浸漬し、これにより基板１上に金微粒子膜が形成される。

図３は形成された金微粒子膜について可視吸収スペクトル測定を行った結果を示すもので、図から分かるように約５３０ｎｍに局在プラズモン共鳴による吸収によるピークが認められ、局在プラズモン共鳴を用いたセンサとして利用し得る金微粒子膜が形成されたことが分かる。

以上のように形成した金微粒子膜をシリカ製の光ファイバー端面に形成して、局在プラズモン共鳴を用いたセンサとして使用した例を次に説明する。尚、この使用例では、上記支持体をシリカ製の光ファイバー端面としているが、この他、ガラスファイバー、シリカ基板、ガラス基板、シリコンウェハー等の適宜の材料、形態に適用可能であることは勿論である。

また、この使用例では、本発明により形成した金微粒子膜を用いたものと、従来の方法により形成した金微粒子膜を利用したものとの差異を検証するために、従来の方法、即ち、シランカップリング剤により光ファイバー端面にアミノ基を形成し、アミノ基との相互作用により金微粒子を固定化した光ファイバーによるセンサも作製し、本発明により作製したセンサと比較した。

即ち、これらの光ファイバー端面の金微粒子に対して、化学式５で示されるＰＥＧユニットを持つチオールの１ｍＭエタノール溶液に１０分間浸け、金微粒子表面に上記チオールを結合させた。
次いで１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド７５ｍＭ、Ｎ−ハイドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩１５ｍＭの水溶液に浸けることによって、チオール末端のカルボキシル基はスクシンイミジルエステルを形成し、活性化されたカルボキシル基を有するようになる。
［化学式５］

このように活性化されたカルボキシル基を有する金微粒子を端面に持つ両方の光ファイバーを、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）を溶解させたりん酸バッファーに漬けることによって、ＢＳＡを金微粒子表面に固定した。

このような状態において、夫々の光ファイバーによるセンサにつき、局在プラズモン共鳴によるＢＳＡの固定化の様子を検出したところ、従来の方法により金微粒子膜を形成したセンサでは、図４に示すように、ＢＳＡの固定化の途中に信号強度の大幅な低下が見られ、局在プラズモン共鳴の測定は不可能であった。このことから、従来の方法で形成した金微粒子膜では、金微粒子が光ファイバー端面から剥離または凝集が起こっていることが予想される。

これに対して本発明の方法により金微粒子膜を形成したセンサでは、図５に示すように、ＢＳＡの固定化の様子を安定して検出することができた。

従って本発明の方法により基板等の支持体の表面に金等の金属微粒子膜を形成する方法では、水溶性の高い糖鎖などの生体物質を、金属微粒子表面に固定化し、センサとして用いる際に特に有効な方法であることが分かった。

本発明は以上のとおりであるので、局在プラズモン共鳴を利用したセンサを構成するための金属微粒子膜を、基板等の支持体の表面に強固に固定することができる金属微粒子膜の形成方法、そして金属微粒子の剥がれや、凝集を生じることがなく、安定した測定を行うことが可能とな局在プラズモン共鳴センサを提供することができ、産業上の利用可能性が大である。

本発明の金属微粒子膜の形成方法の流れを示す模式図である。本発明の金属微粒子膜の形成方法の流れを、一部化学式で示す模式図である。本発明の方法により形成された金微粒子膜について可視吸収スペクトル測定を行った結果を示すものである。従来の方法により光ファイバの端面に形成した金微粒子膜により構成したセンサにおけるウシ血清アルブミン固定の局在プラズモン共鳴による測定結果の例を示すものである。本発明の方法により光ファイバの端面に形成した金微粒子膜により構成したセンサにおけるウシ血清アルブミン固定の局在プラズモン共鳴による測定結果の例を示すものである。

符号の説明

１支持体（基板）
２シランカップリング剤
３反応物質
４金属微粒子（金微粒子）

Claims

支持体の表面をシランカップリング剤で処理した後、シランカップリング剤の有機官能基と、金属微粒子の夫々に結合性の官能基を有する反応物質を反応させ、その後、金属微粒子に結合性の官能基に金属微粒子を結合させることを特徴とする支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
シランカップリング剤が、有機官能基としてアミノ基を有するものであり、反応物質が、アミノ基と結合性の官能基と、金属微粒子に結合性のチオール基を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
シランカップリング剤が、下記の化学式１を有するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
［化学式１］
ＮＨ₂−(Ｒ１)−Ｓｉ(Ｒ2)₃
上記化学式１において、Ｒ１はカルボキシル基、イミノ基、フェニル基及びアルキレン基｛(ＣＨ₂)ｎ (ｎは１〜１２の整数)｝から成る群から選択され、
Ｓｉ(Ｒ2)₃は支持体表面の作用基と反応し得る加水分解基で、Ｒ2がアルコキシ、ハロゲン化合物、及びアルデヒドから成る群から選択されるものである。
反応物質が、下記の化学式２を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
［化学式２］
Ｒ３−Ｓ−(Ｒ５)−Ｒ4
上記化学式２において、R3はSと共にチオール基、チオエステル基、スルフィド基、及びジスルフィド基を構成する炭化水素基（炭素鎖：０〜１２の整数）から成る群から選択されるもので、、R４はアミノ基と結合性の官能基で、R５は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：１〜１２の整数）から成る群から選択されるものである。
反応物質が、下記の化学式３を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
［化学式３］

上記化学式３において、R6は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：３〜８の整数）から成る群から選択されるもので、R３は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：１〜１２の整数）から成る群から選択されるもので、R４はアミノ基と結合性の官能基である。
反応物質が、下記の化学式４を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
［化学式４］

上記化学式４において、R６は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：３〜８の整数）から成る群から選択されるものである。
化学式１のシランカップリング剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、N−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、及びこれらの混合物から成る群から選択されるものであることを特徴とする請求項３に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
化学式２の反応物質が、メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、及びこれらの混合物から成る群から選択されるものであることを特徴とする請求項４に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
化学式３の反応物質が、チオクト酸であることを特徴とする請求項５に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
化学式４の反応物質が、γーチオブチロラクトンであることを特徴とする請求項６に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
金属微粒子が、金、銀、白金から選択されたものであることを特徴とする請求項１〜１０までのいずれか１項に記載の支持体に対する金属微粒子膜の形成方法。
シランカップリング剤による処理で支持体の表面に形成された有機官能基に結合させた反応物質の官能基に金属微粒子が結合されていることを特徴とする局在プラズモン共鳴センサ。
金属微粒子にリガンドを固定したことを特徴とする請求項１２に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
シランカップリング剤が、有機官能基としてアミノ基を有するものであり、反応物質が、アミノ基と結合性の官能基と、金属微粒子に結合性のチオール基を有するものであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
シランカップリング剤が、下記の化学式１を有するものであることを特徴とする請求項１４に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
［化学式１］
ＮＨ₂−(Ｒ１)−Ｓｉ(Ｒ2)₃
上記化学式１において、Ｒ１はカルボキシル基、イミノ基、フェニル基及びアルキレン基｛(ＣＨ₂)ｎ (ｎは１〜１２の整数)｝から成る群から選択され、
Ｓｉ(Ｒ2)₃は支持体表面の作用基と反応し得る加水分解基で、Ｒ2がアルコキシ、ハロゲン化合物、及びアルデヒドから成る群から選択されるものである。
反応物質が、下記の化学式２を有するものであることを特徴とする請求項１４に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
［化学式２］
Ｒ３−Ｓ−(Ｒ５)−Ｒ4
上記化学式２において、R3はSと共にチオール基、チオエステル基、スルフィド基、及びジスルフィド基を構成する炭化水素基（炭素鎖：０〜１２の整数）から成る群から選択されるもので、、R４はアミノ基と結合性の官能基で、R５は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：１〜１２の整数）から成る群から選択されるものである。
反応物質が、下記の化学式３を有するものであることを特徴とする請求項１４に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
［化学式３］

上記化学式３において、R6は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：３〜８の整数）から成る群から選択されるもので、R３は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：１〜１２の整数）から成る群から選択されるもので、R４はアミノ基と結合性の官能基である。
反応物質が、下記の化学式４を有するものであることを特徴とする請求項１４に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
［化学式４］

上記化学式４において、R６は窒素、酸素、硫黄を含む炭化水素基（炭素鎖：３〜８の整数）から成る群から選択されるものである。
化学式１のシランカップリング剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、N−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、及びこれらの混合物から成る群から選択されるものであることを特徴とする請求項１５に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
化学式２の反応物質が、メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、及びこれらの混合物から成る群から選択されるものであることを特徴とする請求項１６に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
化学式３の反応物質が、チオクト酸であることを特徴とする請求項１７に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
化学式４の反応物質が、γーチオブチロラクトンであることを特徴とする請求項１８に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
金属微粒子が、金、銀、白金から選択されたものであることを特徴とする請求項１２〜２２までのいずれか１項に記載の局在プラズモン共鳴センサ。