CN1284168A - 固相吸头及其相关应用 - Google Patents
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Abstract
固相试验为医学诊断和基础研究中生物分子的分析提供了十分有效的方法。例如,固相核酸杂交方法已应用于遗传多态性分析、遗传性疾病的诊断、癌症诊断、病毒性或微生物性病原体的检测、克隆的筛选、和基因组片段的排序。一种新的固相样品保留吸头使生物分子的合成或检测过程得到改进。这些吸头可用来设计样品保存装置,而这样的装置又可与吸头组合,形成可用于自动过程的固相样品保存装置阵列。吸头可与受弹簧压紧的支持钉相连,还包含包被该吸头并可与生物分子结合的化学层。
Description
技术领域
本发明主要涉及固相技术在核酸分子合成及分析中的应用。特别是，本发明涉及可用于进行各种生物分子操作的改进型固相支持物。
发明背景
核酸杂交为DNA和RNA序列等生物分子的识别提供了特异性，并已成为医学诊断中十分有效的技术。例如，核酸杂交方法已用于分析遗传多态性、诊断遗传病、诊断癌症、检测病毒和微生物病原体、筛选克隆、为基因组片段排序(总见Chetverin ＆ Kramer，生物/技术12：1093，1994)。寡核苷酸探针自动合成技术的开发也促进了基于核酸杂交的快速、简单及经济型诊断试验的发展。DNA探针在分析技术中的应用已由Matthews ＆ Kricka，分析生物化学(Anal.Biochem.)169：1，1988综述(亦参见Keller ＆ Mank(编)，DNA探针，第二版(Stockton Press1993)，Persing等，诊断分子生物学(美国微生物学会1993))。
一般的核酸杂交方法需要将靶核酸固定在固相支持物，如硝酸纤维素滤膜和尼龙膜上，再用可检测的核酸探针杂交。这类方法的缺点是，被固定的核酸通常结合不牢固，导致靶基质从支持物上损失。而且，只有少量核酸分子可进行杂交。
这些问题可用“夹心型”杂交试验解决，试验中将靶核酸与已经共价固定于固相支持物上的“捕获”寡核苷酸杂交。然后将带可检测标记的探针与所捕获靶核酸的另一区杂交，并测量探针的存在。
从大量表达序列标签数据库分析基因表达模式的技术促进了新型治疗靶和诊断标志物的不断发现(Fannon，Trends Biotechnol.，14：294，1996)。这类序列数据来自广泛的cDNA文库，为鉴别用于治疗剂开发的基因提供了大量信息。对正常及疾病组织中表达模式的比较还提供了基因功能方面的参考，并可鉴别出医学相关基因以备治疗性研究及开发项目所用。
固相cDNA合成的更广泛应用以及DNA探针在简单试验中应用的明显障碍是缺乏完全适应于杂交过程的固相支持物及固定化方法。固相支持物在基于DNA探针的杂交反应中的应用已由Meinkoth ＆ Wahl，分析生物化学138：267，1984综述。
聚(乙烯亚胺)(“PEI”)包被在本领域广泛用于结合生物分子。PEI的这种能力十分突出，原因有多种。例如，PEI高度亲水，因而极易与含生物分子的水溶液相容。此外，PEI含有很多胺基，可与生物分子中的酸性基团形成盐。正是由于PEI极易与生物分子的水溶液相容，才使它至今未能应用于各种生物分子阵列的制备。当将生物分子水溶液加在一层PEI上时，该溶液很快分散至整个PEI包被面而不是保持其独立的状态。
弹簧探针因其很早就已用于开发印制电路板工业中而众所周知。这些机械装置是设计用于满足对构建并检验各种电子元件以及将它们装配成有功能电路板时元件之间连接之准确性和可靠性的要求。弹簧探针本质上为电子机械装置，通常由装有压缩弹簧、球及活塞的管状外壳组成。有些探针特别为承载电流而设计，其它则用于将元件经钻孔、卷曲并固定至电路板，还有一些是为进行焊接而设计的。无论弹簧探针的设计或市场销售均未提到它们可以作为机械装置用于将溶液转移并排列在固相支持物上，以应用于微生物学、生物化学或分子生物学领域。
因此，需要能高效、低成本地排布生物分子于固相支持物上的装置。本发明提供这些以及相关的装置，如文中所详述。
发明简述
本发明提供固相样品保存装置，它克服了本领域在此之前所遇到的缺陷。本发明还提供相关便利。
本发明之一个实施方案中提供了可用于生物分子合成或检测过程的一种固相样品保留吸头。此样品保留吸头包括可与支持钉连接的固相支持吸头结构，有化学层包被吸头结构至少一部分。该化学层可与生物分子结合，在吸头结构上形成生物分子固相样品。在一个实施方案中，此吸头结构与支持钉可卸出式连接。吸头结构是带有多个槽的部分圆锥形。这些槽是确保吸头结构在生物分子合成或检测的特定热循环过程中迅速升温和降温的热交换片。
本发明另一个实施方案中提供可用于生物分子合成或检测之固相过程的样品保存装置。该样品保存装置包括支持钉、与支持钉连接的吸头结构、及包被吸头结构至少一部分的化学层。化学层可与生物分子结合而在吸头结构上形成生物分子的固相样品。在一个实施方案中，支持钉为弹簧探针或其它弹簧钉，而吸头结构为与弹簧探针可卸出式连接的尼龙6/6元件。
本发明另一实施方案中提供了固相样品保存装置阵列，其中多个支持钉以特定阵列连接于底座上。每个支持钉有一个远离底座伸向空中的末端，而多个吸头结构连接于这些末端。化学层包被每个吸头结构的至少部分。化学层可与生物分子结合以形成生物分子的固相样品。
在另一实施方案中，固相样品保存装置与微滴板组合。微滴板上有其形状适于容纳一定体积的含生物分子样品的孔。固相样品保存装置的大小适于至少部分伸进孔中。该样品保存装置包括支持钉、与支持钉连接并可脱离而转移至孔中的吸头结构、及包被吸头结构至少一部分的化学层。化学层可与生物分子及溶液结合而形成生物分子的固相样品。
在一个实施方案中，微滴板有多个孔，固相样品保存装置包括以特定阵列排布的多个支持钉，多个吸头结构与支持钉相连，形成固相样品保留吸头的阵列，这些吸头可置于这多个孔中。
本发明另一方面中，固相样品保留吸头与有多个孔的微滴板组合。这些固相样品保留吸头可取出式地置于微滴板的孔中。微滴板和样品保留吸头可作为整体保存，而使样品保留吸头上的固相样品方便地保存至进行合成或分析过程之时。
本发明另一方面提供生产可用于固相分子生物学操作之固相样品保留吸头的方法。该方法包括以下步骤：将基质材料制成可与支持钉附着的吸头结构、用可与选定生物分子结合而形成该生物分子之固相样品的化学层包被基质材料的至少部分、使化学层附着至基质上。在一个实施方案中，化学层为聚(乙烯亚胺)，基质材料为尼龙6/6材料，使化学层附着至基质材料的步骤包括使聚(乙烯亚胺)与尼龙6/6材料共价连接。
本发明另一实施方案提供形成生物分子固相样品的方法。该方法包括使吸头装置的一部分浸没在含生物分子之溶液中的步骤。该吸头装置有基质部分及基质部分上的化学层，该化学层可与生物分子结合。生物分子可结合至化学层而在吸头装置上形成该生物分子的固相样品，当生物分子结合于化学层后从溶液中取出吸头装置。
本发明另一方面中，所述方法包括当生物分子结合至化学层后将固相吸头装置保存在某种保存装置中。在本发明的一个实施方案中，保存装置为带孔微滴板。保存步骤包括当生物分子结合至化学层后将吸头装置放置在孔中，将微滴板和吸头装置作为整体保存。
附图简述
图1为根据本发明实施方案的固相样品保存装置阵列的等比例视图。
图2A为固相样品保存装置基本沿图1的2-2轴线的放大剖视图。
图2B为另一实施方案中固相样品保存装置的剖视图。
图3为将图1中样品保存装置上的吸头结构部分切开放大的视图。
图4为图3中吸头结构基本沿4-4轴线的放大剖视图。
图5为图1中阵列的侧仰视图(上方实线表示具有其中含生物分子液体样品的多个孔的微滴板，下方以虚线表示微滴板上的孔内放置有吸头结构。
图6为图1中阵列的放大的侧仰视图，显示多个吸头结构位于微滴板的孔中。
本发明的这些及其它方面在参考以下详细说明书及附图后将是显而易见的。此外，下文中指出了各种参考文献，它们均全文引用作为参考。
发明详述
1．定义
以下描述中多次用到一些术语。提供下述定义以有助于理解本发明。
“结构基因”是一段核苷酸序列，它可转录为信使RNA(mRNA)，然后翻译成特定多肽的特征性氨基酸序列。
本文所用“核酸”或“核酸分子”指任意脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、经聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、以及经任何连接、断裂、内切核酸酶作用及外切核酸酶作用产生的片段。核酸可由天然核苷酸(如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)单体、或天然核苷酸的类似物(如天然核苷酸的α-对映体)、或这两者的组合构成。修饰的核苷酸可在糖基部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分发生修饰。糖基修饰包括，如一或多个羟基被卤素、烷基、胺基和叠氮基取代，或者可将糖基转化成醚或酯。此外，整个糖基部分可由与之空间构象和荷电性相似的结构，如氮杂-糖基和碳环糖基类似物取代。碱基部分修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它已知的杂环取代物。核酸单体可通过磷酸二酯键或类似键连接。磷酸二酯键的类似键包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、硒代磷酸酯键(phosphoroselenoate)，二硒代磷酸酯键(phosphorodiselenoate)，硫代苯胺磷酸酯键(phosphoroanilothioate)，苯胺磷酸酯键(phosphoranilidate)，氨基磷酸酯键等等。术语“核酸”还包括所谓“肽核酸”，它包含附着于聚酰胺骨架的天然或修饰型核酸碱基。核酸可以是单链或双链。
“分离的核酸分子”是未整合于生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已从哺乳动物细胞基因组DNA中分离的、编码白细胞介素-2的DNA分子就是一种分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一实例是未整合在生物体基因组中的化学合成核酸分子。
本文中术语“生物分子”指核酸分子，或指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物。
本文所用“可检测标签”或“可检测标记”是偶联至核酸分子上以便成为可用于检测方法中的探针的分子或原子。这类标签或标记的实例包括光敏剂或染料、放射性同位素、荧光剂、质谱仪标记、或其它分子和标志物部分。适宜的荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐及草酸酯。可作为这类标记的生物发光化合物包括萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
“互补DNA(cDNA)”是由mRNA模板经逆转录酶形成的单链DNA分子。通常利用与mRNA一部分互补的引物启动逆转录。本领域技术人员还用“cDNA”指由这样的单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，如果是结构基因，则表达涉及结构基因转录为mRNA以及mRNA翻译为一或多种多肽。
“克隆载体”是能在宿主细胞中自主复制的核酸分子，如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常包含一个或少数几个限制性内切酶识别位点，外源核苷酸序列可通过这些位点按预定方式插入而不会使该载体的基本生物功能丧失，克隆载体中还包含编码适于在鉴定和筛选克隆载体所转化的细胞时应用的标记基因的核苷酸序列。标记基因通常包括四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞中表达之基因的核酸分子。通常，基因表达受控于启动子，并任选地受控于至少一个调控元件。称这样的基因为“可操作连接于”启动子。类似地，如果调控元件可调节启动子的活性，则调控元件和启动子可操作连接。
“重组宿主”可以是包含克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。这一术语还包括经基因工程改造而在宿主细胞染色体或基因组中包含所克隆的基因的那些原核或真核细胞。
本文所用“hybotrope”指任何化学物质或化学物质在水相或有机相环境中与缓冲液、螯合剂、盐和/或去污剂的任何混合物，它们可使核酸双链体的焓相比于标准盐溶液(0.165 M NaCl，0.01 M Tris pH 7.2，5mM EDTA和0.1％SDS)中改变至少20％。即，核酸双链体所含能量减少。参照寡核苷酸5’-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’[SEQ ID NO：9]为固定化寡核苷酸，而5’-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’[SEQ ID NO：10]为溶液核苷酸，它通常被荧光染料如Texas Red在5’端标记。寡核苷酸双链体(24个核苷酸长)的螺旋线圈转换(HCT)温度为25℃或更低。HCT是80％和20％双链体为单链时的温度的差异。定义为hybotrope的一种溶液的平均最小斜率是HCT的一级导数，等于2.4，单位是1/摄氏温度((80％单链-20％单链)/25℃)。
本文所用“Tm”是核酸双链体分子中半数为单链的温度。Tm在溶液中测量，Td测的是固定于固相支持物上的双链体，这两个术语均表示半数双链体为单链时的温度。
本文所用“严谨度”是在给定条件下杂交所能耐受的错配碱基对百分率。
本文所用“差异”是完全碱基配对的双链体与包含错配的双链体之间Td的差异。
本文所用“差异温度”是可通过杂交反应检测出完全碱基配对的双链体与包含错配的双链体之间的差异的杂交反应温度。
2．固相支持物
根据本发明的一个实施方案，固相样品保存装置12的阵列10以图示进行说明。如图1所见，阵列10包括附着于底座结构14上的多个样品保存装置12。每个样品保存装置12包括以其一个末端18安全固定于底座14的支持钉16，而样品保留吸头结构20附着于支持钉16的另一末端22。该实施方案中每个吸头结构20为尼龙6/6固相支持结构，尼龙6/6包被了聚(乙烯亚胺)(PEI)层24或其它选定化学层。PEI层24或其它选定化学层适于结合特定生物分子以形成能在一或多种核酸分子的合成或检测过程中应用的固相样品。
所述实施方案的阵列10包括基本平行的8排每排12个样品保存装置12，沿底座结构14形成等距分隔的96个样品保存装置的阵列。每个样品保存装置12长度几乎相同，因而吸头结构20距底座的间距相等，使固相样品保留吸头结构基本在同一个平面上。吸头结构20相互间有一定间隔，以便与传统的96孔Cetus板或微滴板(适于接受并保留生物分子或核酸的所选液体样品)配合使用。此实施方案中样品保存装置12为8×12阵列，其它实施方案中可以有其它阵列，包括1×8阵列、1×12阵列、4×12阵列、以及较大的阵列如16×24阵列。
在该示范性实施方案中，96个吸头结构20适于浸入Cetus板上含有生物分子的孔中，而使生物分子与PEI层24化学结合。当吸头结构20从样品中移出后，生物分子均吸附于PEI层上，因而形成生物分子的固相样品。其上带有固相样品的吸头结构20可随后应用于合成或分析过程，如下文将详述的固相核酸分析和检测过程。
在一个实施方案中，阵列10安装在机器人式或自动式传动装置上，使底座14夹在传动装置中，而样品保存装置12从底座上伸出。传动装置在自动检验时可按照预定检验、合成或分析过程迅速而准确地移动阵列10到选定位点或台面。这类利用阵列10和96个固相样品的自动检验能够实现明显更快速的检验、合成或分析过程。
阵列10非常适于这类自动过程，这部分归因于样品保存装置12的支持钉16。如图2A所示，每个支持钉16均是通常用于构建和检验电子元件的弹簧探针，但已被改造而适于本发明的应用中。弹簧探针一般包括外壳28，其内部装有位移元件30。活塞32伸进外壳28中，使活塞的第一末端34在外壳28中紧邻位移元件，其第二末端36伸出外壳以外。本实施方案中位移元件30为压缩弹簧，将活塞32沿轴向推向底座14。活塞的第一末端34有一个肩角38，它与外壳28内壁向中心放射状伸出的挡块40吻合，从而可限制活塞32相对于外壳的最大延伸。活塞的第二末端36固定在底座14上，活塞32与底座基本垂直地伸出。
在示范性实施方案中，外壳28包括同心的内筒42和外筒44，其中位移元件30和活塞的第一末端34均包含在内筒中。外筒44将内筒42可卸出式嵌套于其中，它们之间靠摩擦力啮合，可拆卸地附着在一起。外筒44终止于远端46，该远端与底座14之间有一定距离而与吸头结构20连接。故外壳的外筒44和吸头结构20可作为整体与内筒42和活塞32(均保持固定于底座14上)拆离。因而外筒44和吸头结构20可作为整体方便并迅速地替换，而无需替换整个弹簧探针。适合的弹簧探针由Everett Charles(Pomona，California)、Interconnect Devices，Inc．(Kansas City，Kansas)、Test Connections，Inc．(Upland California)及其它厂家提供。尽管此示范性实施方案中用弹簧探针作为支持钉16，在本发明的其它实施方案中也可用其它支持钉，包括偏压或未偏压的支持钉。
如图2B可见，本发明另一实施方案包括以弹簧探针作为支持钉16，但该弹簧探针与上述及图2A所述实施方案相比翻转了1800°。例如，外筒44的远末端部分46固定在底座14上，活塞32的第二末端36远离底座而与吸头结构20相连。
弹簧探针可保护阵列10在操作过程中不被损坏。如在加样或分析过程中，需要移动阵列10至所选位置并使吸头结构20浸入Cetus板的孔中等，若支持钉16或吸头结构不经意间与某表面或其它物体相撞，弹簧探针将会沿轴线压缩以吸收撞击力，然后恢复到未压缩时的位置。
如图3可见，该实施方案的吸头结构20是截断的圆锥形结构，上有多条凹槽50。吸头结构可与支持钉连接，或与支持钉成为整体。凹槽50均为V形槽，沿轴向延伸于远端平面48和近端平面54之间。凹槽50有从近端面54向远端面48以一定角度会聚的纹理或脊52。吸头结构20的截断圆锥形选择为与下面Cetus板上样品孔的横截面形状完全相匹配。因而吸头结构20的形状和大小均使其能十分精确地插入Cetus板上的孔中。
吸头结构20包括受钉孔56，它在近端面54有开放性近端58，在吸头结构的近端面54和远端面48的中间部分有封闭的远端60。受钉孔56的形状和大小适于可取出式接受支持钉的远端部分46。因此吸头结构20可与支持钉16可卸出式连接。但吸头结构也可永久性地与钉连接，使钉和吸头结构成为整体结构。
在所例举实施方案中，受钉孔56与吸头结构的纵轴同轴排列。孔的近端部分59通常为漏斗形，以使孔的开放性近端58的直径大于封闭的远端60。漏斗形近端部分59适于使支持钉的远端部分46插入其中。若支持钉在安装过程中相对于孔56略有错位，漏斗形近端部分59将接受并直接使支持钉16入位，以使弹簧探针与吸头结构20同轴排列。
如图4可见，该示范性实施方案中孔56由吸头结构20的轴向内壁61限定，其横截面基本为圆形。而弹簧探针的远端部分46横截面基本为带四个角63的方形。弹簧探针远端部分46的大小使角63摩擦性地与吸头结构内壁61啮合，从而使吸头结构20借助摩擦而保留在支持钉16上。
在本发明另一实施方案中，末端部分的横截面为多边形，有多个角与吸头结构的内壁61吻合。如八角形横截面有8个角与吸头结构的内壁61摩擦吻合。在另一实施方案中，支持钉的远端部分横截面为与受钉孔56的环形横截面基本相当的环形，从而使吸头结构20可按压到弹簧探针远端46并因摩擦而保留在其上。在另一实施方案中，吸头结构20经传统粘合剂粘附至远端部分46，从而使吸头结构永久性地固定在支持钉16上。
如图4所见，槽50和脊52限定了具一般性星形横截面的截断圆锥形吸头结构20。结果，吸头结构20的外表面62增大，从而在形成固相样品的过程中大量生物分子可吸附至PEI层24。在另一实施方案中，吸头结构20的槽50、脊、远端面48和近端面54限定了可与PEI层24共价结合的尼龙6/6固相支持物高表面区。在另一些实施方案中，吸头结构20由固体基质如玻璃或硅制成，PEI层24用硅烷基化学法共价结合至固相基质，如下文详述。
在另一实施方案中，吸头结构20的外表面62沿槽50和脊52起伏，从而为PEI层24的结合提供更大表面积。在一个实施方案中，起伏波纹主要是微观的，而在另一实施方案中，波纹为肉眼可见的。相应地，起伏的吸头结构20提供了更大的反应表面，使合成或分析过程效率更高。
在所选的合成或分析过程中，吸头结构20需经热循环，其中吸头结构20在高温和低温间循环。吸头结构20的脊52形成多个热交换片64，使吸头结构在热循环期间可以进行快速温度变化。从而使热循环可以进行得更快并更有效。
如图5所见，阵列10适于与带有多个孔72的Cetus板或微滴板70结合并一起应用。如上述，孔72之一部分的形状与吸头结构20的截断圆锥形基本匹配。因而脊52与孔72的侧壁74基本吻合，吸头结构的远端平面48可抵孔底76。在一个优选实施方案中，微滴板70具有由基本平行的8排，每排12个孔72形成的96孔构型的孔阵列，该阵列与阵列10的吸头结构相匹配。在另一些实施方案中，微滴板70可以具有1×8、1×12和4×12孔的阵列，以及如16×24孔的更大阵列。
应用阵列10时，该阵列可从如图5中实线所示的较高位置(此时吸头结构20在孔72外)自动或手动移至虚线所示较低位置(此时吸头结构在孔72内)。一实施例中，孔72内有含所选生物分子的液体样品。当阵列10在较低位置且吸头结构20浸在液体样品中时，PEI层24和生物分子之间将发生化学反应以形成生物分子的选定固相样品。在该实施方案中，孔72的深度大于吸头结构20约33％，因此当吸头结构浸入孔中时，液体样品没过了整个吸头结构，从而使尽可能多的生物分子与之结合。
如图6所见，样品保存装置12的阵列10还可通过将吸头结构20置入孔72中并使吸头结构从支持钉16上脱离下来(如实线所示)而将吸头结构留在孔中进行利用。底座14和支持钉16随后作为整体移离微滴板70。结果，孔72中留有或存有96个吸头结构20的微滴板70可整体移动，如置于冷藏室或其它适合的保存部位直至需要用固相样品进行特定合成或分析过程时。
在该示范性实施方案中，孔72将吸头结构20保留在相对于微滴板70十分精确的位置上，使吸头结构可方便并基本同时地安装在支持钉16上。例如，将微滴板70置于已知固定位置，底座14和支持钉16作为整体经自动或手动移至孔72上方特定位置，以使支持钉与吸头结构上的受钉孔56基本同轴排列。然后将底座14和支持钉16向微滴板70移动，使支持钉16压入吸头结构的孔中，从而使吸头结构与支持钉可分离式连接。然后将底座14、支持钉16和吸头结构20作为整体移离微滴板70，从而将吸头结构20从孔72中移出。带固相样品的样品保留吸头装置可移动至预定位置，进行特定的核酸固相分析或合成过程。
本发明的固相支持物可平行使用，并优选制成96孔或384孔形式。固相支持物可附着至96孔或384孔形式的钉、杆或棒上，固相支持物相对于具体构造可为活动式或整体式。固相支持物的具体构造并非进行试验的关键，但会影响对试验进行自动化的方便性。
3．使核酸分子结合至固相支持物的方法
本文所述吸头可用于需要使核酸分子、肽、多肽或蛋白质附着至固相支持物的各种方法中。可用这类吸头进行的固相试验和检测方法实例如下。
可用标准方法使核酸分子附着于吸头上。例如，5’末端经醛或羧酸修饰的核酸分子可附着于带酰肼基的固相支持物上(参见如，Kremsky等，核酸研究15：2891，1987)。或者，寡核苷酸的5’氨己基氨基磷酸酯衍生物可与带羧基的固相支持物经碳化二亚胺介导的偶联反应偶联(参见如Ghosh等，核酸研究15：5353，1987)。
固相支持物优选包被有胺聚合物，如聚乙烯(亚胺)、丙烯酰胺、胺树枝状聚合物(amine-dendrimer)等。聚合物上的胺基用于共价固定核酸。优选地，核酸分子经聚(乙烯亚胺)(PEI)包被层而结合至本文所述固相支持物上。使PEI层与基质粘附所用化学方法主要取决于基质的化学特性。现有技术中有使PEI粘附至固相支持物上的多种适宜化学法实例。例如，当基质为尼龙6/6时，PEI包被可应用Van Ness等，核酸研究19：3345，1991，和国际专利公开文件第WO 94/00600号所述方法进行。使PEI层粘附至玻璃或硅制固相支持物可应用的适宜方法如Wasserman，生物技术和生物工程XXII：271，1980和D'Souza，生物技术通讯8：643：1986所述。
优选地，PEI包被层共价附着至固相基质。若固相基质为玻璃或硅，PEI包被层可应用甲硅烷基化化学法共价结合至该基质上。例如，带反应性甲硅烷氧基末端基团的PEI在Gelest，Inc(Tullytown，PA)有售。可使这类反应性PEI接触玻璃或硅制吸头，经轻轻搅动后，PEI将粘附至基质上。或者，可应用双功能性甲硅烷基化试剂。根据这一方法，玻璃或硅制基质经双功能性甲硅烷基化试剂处理产生带反应性表面的基质。然后使PEI与反应性表面接触，并通过所述双功能试剂共价结合至表面上。
PEI包被层优选用于将核酸固定于尼龙吸头，如本文所述。用PEI包被尼龙6/6的一个适宜方法由Van Ness等，核酸研究19：3345，1991所述。简述为，尼龙基质经三乙基氧鎓四氟硼酸盐乙基化，在尼龙表面形成胺反应性亚胺酯。然后使活化的尼龙与PEI反应形成可提供伸展型胺表面的聚合物包被。带5氨己基末端的寡核苷酸经2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(氰尿酰氯)活化后，可通过三嗪部分共价附着于尼龙表面。
相应地，优选的核酸聚合物为“胺修饰型”，因为它们经修饰已在核酸聚合物5’末端包含伯胺，优选还在此核酸聚合物的伯胺和核酸部分之间有一或多个亚甲基。亚甲基的数目优选为6。
核酸分子可按标准技术添加胺部分而修饰。例如聚合酶链式反应的产物可用5’己胺修饰的引物修饰。核酸双链体可应用氨基烯丙基-dUTP(Sigma，St．Louis，MO)经缺口翻译导入胺而被修饰。也可通过聚合酶如末端转移酶，用氨基烯丙基-dUTP将胺导入核酸，或通过使含胺的短核酸聚合物经连接酶连接于核酸上而将胺导入核酸。
优选地，核酸聚合物在与PEI包被接触之前先活化。这一点可通过将胺官能化核酸聚合物与多功能性胺反应性化学物质如氰尿酰氯混合而方便地完成。例如，可将过量氰尿酰氯加入含核酸聚合物的溶液中。优选地，阵列溶液中氰尿酰氯比核酸聚合物中胺的摩尔数过量10至1000倍。如此可使大部分以胺为末端的核酸聚合物与一分子氰尿酰氯反应，从而使核酸聚合物末端成为二氯三嗪。
本发明的优点之一是，含生物分子的阵列溶液即使包含大量多功能性胺反应性化学物质也可沉积在PEI包被上。这与一些需在阵列过程之前将偶联剂从阵列溶液中除去的方法相比有十分明显的便利。
若核酸聚合物为双链，可以两条链均包含或仅其中一条链包含氨基末端。双链核酸聚合物可通过一个末端氨基与PEI包被层结合而使双链聚合物固定。既然只有两条链中的一条与PEI包被层共价结合，则另一条链可在变性和洗涤条件下除去。该步骤为本发明获得单链核酸聚合物阵列提供了一个方便的方法。双链核酸聚合物可以是如PCR反应的产物。
优选地，阵列溶液用常用缓冲液如磷酸钠、硼酸钠、碳酸钠或Tris-HCl进行缓冲。优选阵列溶液的pH范围为7-9，更优选新鲜配制的pH8.3-pH 8.5的硼酸钠作为缓冲液。
下述各种方法需要应用结合至本发明固相支持物上的寡核苷酸。优选地，合成带有5’胺(一般为己胺，即一个六碳间隔臂和一个远端胺)的寡核苷酸。通常，寡核苷酸长为15-50个核苷酸，均用同双功能或异双功能交联剂如氰尿酰氯活化。活化的寡核苷酸可任选地经排阻层析纯化去除过量交联剂(如氰尿酰氯)。然后将活化的寡核苷酸与固相支持物混合以进行共价附着。寡核苷酸共价附着后，封闭固相支持物上未反应的胺(如用琥珀酸酐)以消除固相支持物的正电荷。
某些方法需要应用生物素化寡核苷酸，这种寡核苷酸与链霉抗生物素蛋白结合，而链霉抗生物素蛋白又与固相支持物结合。产生生物素化核酸分子和支持物结合型链霉抗生物素蛋白的方法为本领域一般技术人员所熟知。例如，Van Ness等，核酸研究19：3345(1991)，描述了使寡核苷酸生物素化的方法，其中寡核苷酸用活化的生物素处理。另一种方法是，通过用生物素标记的dNTP合成寡核苷酸而制备生物素化寡核苷酸(参见如Ausubel等(编)，分子生物学简短方案(Short Protocols inMolecular Biology)第三版，第12-23至12-25页(John Wiley ＆ Sons，Inc．1995))。使核酸生物素化的方法为本领域已知并述于如链霉抗生物素蛋白-生物素化学手册(Pierce Chemical Company 1992)。可用于使链霉抗生物素蛋白结合至本发明吸头上的标准方法已由如，Das ＆ Fox，生物物理和生物工程年鉴8：165，1979和Wilchek ＆ Bayer，生物化学分析(Anal．Biochem)171：1，1983提供。
本文所述吸头还可用于分析肽。使肽、多肽和蛋白质偶联至固相支持物的常用方案已由如，Wong，蛋白质偶联和交联化学(CRC Press，Inc．1991)和Partis等，蛋白质化学杂志2：263(1983)所证实。肽和抗体在固相操作中的应用如Vaughn等，自然生物技术14：309，1996和Huse等，科学246：1275，1989所述。
4．固相支持物在cDNA合成中的应用
如上所述，对在固相支持物上合成cDNA的需要不断增加。这些cDNA分子可用于产生cDNA文库和作为基因表达分析和诊断试验所用探针。所公开的固相支持物的设计在当前依赖cDNA的技术中存在以下问题：所需RNA量大、样品产生量低、用户操作多、需要有机抽提及沉淀、载体对插入序列大小有限制且其适应能力低。固相方法的好处之一是在溶液中进行的cDNA合成步骤很多，其间还需沉淀。
在本文所述专用固相支持物上生产cDNA分子的方法很多。以下一般性方案为其中一例。首先，用标准技术产生RNA。在实施例1所述研究中，总RNA用已知方法(参见如Ausubel等(编)，分子生物学简短方案，第三版，第4-4至4-6页(John Wiley ＆ Sons，Inc．1995)；Wu等，基因生物技术方法，第33-34页，(CRC Press 1997))通过酸-胍-酚抽提制备。然后在如包含带oligo(dT)尾之寡核苷酸的固相支持物上捕获信使RNA。
或者也可采用裂解和mRNA捕获同时进行的方案，其中以离液剂，如硫氰酸胍或盐酸胍进行细胞裂解和杂交。此法可以裂解少量细胞。根据此法，使裂解物通过玻璃纤维滤器除去DNA，mRNA捕获在固相支持物，未结合的污染物和基质均洗涤除去。这避免了标准RNA制备过程中必不可少的有机相抽提和系列乙醇沉淀中造成的损失。
支持物上结合的RNA可作为模板用于经标准方法产生cDNA的第一条链。然后，合成cDNA的第二条链或在第一条cDNA链的远端添加一衔接头。如，可用如末端转移酶在第一链的3’末端添加三个dNG。或者，可将一个衔接头连接至cDNA分子的3’末端。然后使互补引物与衔接头杂交。然后以cDNA的第一链为模板合成cDNA的第二链。
或者，可用聚合酶链式反应(PCR)扩增所结合RNA的随机或特定序列。简言之，PCR是基于专用聚合酶而进行的一种方法，该酶可在含脱氧核糖核苷酸和侧翼于靶序列、各长约20个碱基的两个DNA引物的混合物中合成所选DNA链的互补链。加热混合物使含靶序列的双链DNA解链，然后降温使引物与分离链上它们的互补序列结合。然后聚合酶使引物延伸为新的互补链。重复加热和降温循环可使靶DNA量成指数增长，因为每次新产生的双链分离后可成为下一轮合成的两个模板。约一小时后，20个PCR循环可使靶扩增百万倍。PCR的标准方法已为本领域技术人员众所周知(参见如，Delidow等，聚合酶链式反应：基础方案”在《PCR方案：最新方法和应用》White(编)一书中，第1-29页(Humana Press，Inc．1993)；Ausubel等(编)，分子生物学简短方案，第三版，第15-1至15-40页(John Wiley ＆ Sons，Inc．1995))。
相应地，也可加入与所结合mRNA的已知部分互补的引物。然后可用特定引物以及互补于衔接头的引物扩增。通常5-15轮热循环扩增后，可对所得DNA片段进行克隆和5’端序列测定。然后可合成包含与衔接头和基因5’端互补之序列的新杂交引物。然后从固相支持物上扩增全长cDNA。
一种PCR改良方式——“锚式PCR”可在即使只能得到少量序列信息时也能扩增全长mRNA(Ausubel等(编)，分子生物学简短方案，第三版，第15-27至15-32页(John Wiley ＆ Sons，Inc．1995))。此过程中，若扩增已知序列的下游，则需要互补于成熟mRNApoly(A)尾的oligo(dT)引物，若扩增已知序列的上游，则需要互补于在第一链合成之后添加至cDNA上的人工合成同聚物尾的引物。
在这些一般性cDNA合成方法中至少有两个分支点可与利用了固相支持物方法优势的其它技术相结合。一个分支点在cDNA第一链合成后。此时，所剩RNA模板可用RNA酶H消化，氢氧化钠水解或热变性除去，留下单链DNA模板，其可用于寡核苷酸指导的第二链合成、PCR、随机引发的探针制备、或用标记寡核苷酸进行的基因表达研究。所结合的cDNA还可用于制备多用途的扣除文库或示差探针。
第二cDNA链的合成是固相支持cDNA技术中的第二分支点。此处，可选择将衔接头连接至cDNA，该cDNA可用于如全长单链cDNA探针制备、文库制备、体外转录、和5’RACE的过程。
固相cDNA合成的重要好处是能自动操作。在高效率cDNA文库的产生或基因表达的研究中，使本文所述固相支持物以96孔板形式使用很有意义。可用机械臂将96个支持物转移至96个镀金钉上并在标准96孔Cetus板上指导cDNA合成。
5．基因表达的分析
本文所述固相支持物可应用于在单次测定中检查众多基因(1-2000)表达的高效方法中。这类方法可进行平行测定，每次样品数可超过100。该方法可用于药物筛选、发育生物学、分子医学研究等等。因此，本发明一方面提供用于在特定生物样品中分析基因表达模式的方法，包括以下步骤(a)使生物样品中的核酸暴露，(b)使暴露的核酸与一或多个带特定可检测标记的核酸探针在一定条件下、保证探针与核酸杂交的充足时间内混合，其中可检测标记与特殊核酸探针相关并可通过光谱测定法或电位测定法检测，(c)使杂交探针与未杂交探针分离，(d)通过光谱测定法或电位测定法检测标记，和(e)从中确定该生物样品的基因表达模式。
在本发明的一个特别优选实施方案中，提供了如下进行的试验或方法。将特定来源的RNA通过特异性杂交步骤(如通过附着的oligo(dT)捕获型探针捕获poly(A)mRNA)结合至固相支持物。然后洗涤固相支持物，在固相支持物上用标准方法(即逆转录酶)合成cDNA。然后经水解除去RNA链。结果是产生共价固定于固相支持物的一批DNA，它们反映着合成cDNA之RNA的多样性、丰度和复杂性。然后使固相支持物与互补于目的基因序列的一至数千个探针杂交。每种类型的探针用光谱测定法如质谱法可检测的标签标记。杂交完成后，洗去过剩或未杂交的探针，将固相支持物置于如微滴板的孔中，从固相支持物上裂解下可检测标记。然后将固相支持物移离样品孔，孔中内含物用分光光度计检测。出现特异性标记说明样品中有RNA，也是特定基因在所给生物样品中表达的证据。该方法还可定量。
用可裂解标记快速测量基因表达时所用组合物和方法可如下详述。简之，测定基因表达比较有用的组织、原代或转化细胞系、分离的或纯化的细胞或任何其它来源的生物材料可作为RNA的来源。在优选方法中，生物来源的材料在有离液剂时裂解以抑制核酸酶和蛋白酶，并支持靶核酸与固相支持物的严谨杂交过程。组织、细胞和生物来源可在1-6摩尔浓度离液剂盐溶液(盐酸胍、硫氰酸胍、高氯酸钠等)中有效裂解。
生物来源的样品裂解后，将溶液与固相支持物混合15分钟至数小时，使靶核酸固定。通常，通过靶RNA与固定在固相支持物上的捕获型探针的互补碱基配对可捕获靶核酸。一种改良方法应用大多数真核生物信使RNA上常见的3’poly(A)与固相支持物上附着的oligo(dT)杂交。另一改良方法应用特异性寡核苷酸或长探针(超过50个碱基)捕获含特定序列的RNA。
另一可能是应用可在靶RNA群体中捕获众多相关序列的简并引物(寡核苷酸)。例如，RNA样品可经四套简并性的锚着oligo(dT)引物的每种逆转录，其中oligo(dT)引物具有下式序列5’-T12MN-3’，M可以是G、A或C，N为G、A、T和C(Ausubel等(编)，分子生物学简短方案，第三版，第15-35至15-40页(John Wiley ＆ Sons，Inc．1995))。每套引物由3’碱基确定，并在M位有简并性。
杂交时间取决于RNA群体的序列复杂性和所用捕获探针的类型。杂交温度取决于所用离液剂类型及离液剂终浓度。Van Ness ＆ Chen，核酸研究19：5143，1991提供了一般性指导。裂解物优选与固相支持物一起连续搅动以使靶RNA尽可能分散。捕获了靶核酸后，从固相支持物上洗去裂解物并去除所有离液剂或杂交溶液。固相支持物优选用含离子或非离子去污剂、缓冲液和盐的溶液洗涤。
下一步是合成所捕获RNA的互补DNA，其中上述附着的捕获寡核苷酸可作为逆转录酶的延伸引物。反应通常在25-37℃下进行，聚合反应期间最好搅动。合成了cDNA后，由于是捕获寡核苷酸作延伸引物，故cDNA共价附着于固相支持物上。然后水解cDNA/RNA双链中的RNA。该步骤可通过加热使双链变性或用碱(即0.1N NaOH)化学水解RNA而实现。该步骤的目的是使cDNA可再与特定探针杂交。该固相支持物或一套固相支持物经进一步洗涤去除RNA或RNA片段。此时，固相支持物含有在序列丰度、复杂性和多样性方面代表了RNA群体的cDNA分子近似代表性群体。
下一步是使所选探针与固相支持物杂交以鉴定特异性cDNA序列的存在与否以及相对丰度。探针优选长约15-50个核苷酸的寡核苷酸。探针序列由试验的最终用户指定。例如，如果最终用户希望研究组织中炎性反应中的基因表达，探针应选择与众多细胞因子mRNA、编码脂质调节酶的RNA、编码可调节与炎性反应有关之细胞的因子的RNA等互补。一旦选定了一套用于研究的目的序列，用每个序列设计一个寡核苷酸探针，且使每个探针配有一个特异的可裂解标记。然后使标记附着于相应寡核苷酸上。再使寡核苷酸与固相支持物上的cDNA在适宜杂交条件下杂交。杂交完成后，洗涤固相支持物以去除任何未杂交的探针。然后将固相支持物或支持物阵列置于可裂解下可检测标记的溶液中。mRNA的表达与否(及丰度)可通过测量可检测标记的量确定。例如，用质谱仪检查质谱标记。
上述分析差异性表达的方法还可进行各种修改。例如，可用扣除文库检查差异性表达。任何基因寻找程序均希望能扣除多余信息，以揭示代表活化或发育的具体阶段的基因表达模式。产生扣除cDNA文库的方案很多，但大都需要大量RNA或需要已有的cDNA文库。应用固相支持物捕获mRNA可扣除掉代表背景的信息源。所需mRNA种类被逆转录，RNA模板均用碱破坏。所得“扣除模板”可无限制地重复使用。
为制备扣除文库，使待研究来源的RNA加热变性，再与扣除模板上cDNA的第一链杂交。洗掉未结合的RNA，并在所有结合的被扣除RNA从扣除模板上洗脱下来之后再直接捕获或再次杂交。捕获后，如上述继续cDNA合成。
在一个相关方法中，通过使来自某类型细胞的单链cDNA与另一密切相关类型细胞的固相化mRNA杂交，并分离小部分的未杂交cDNA，由此制备扣除性cDNA探针。经此富集，扣除性cDNA的DNA片段可用于鉴定含差异表达序列的cDNA克隆。扣除性cDNA还可用于制备扣除性cDNA文库。可用PCR扩增扣除性cDNA以作为探针使用或用于克隆(参见如Kuel ＆Battey，“扣除性cDNA之PCR可更新来源的产生”，于《PCR方案：最新方法和应用》一书中，White(编)，第287-304页，(Humana Press，Inc．1993)；Wu等，基因生物技术中的方法，第29-65页，(CRC Press 1997))。
在另一修改方法中，用生物素化oligo(dT)MN分子(上述简并引物)使mRNA结合至固相支持物上，并引导第一链合成(参见如，Rosok等，生物技术21：114，1996)。逆转录后，用固相cDNA作模板，生物素化oligo(dT)MN和含十个核苷酸的任意序列为引物进行PCR。然后将得自两群细胞的PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行比较，从凝胶中将目的PCR带洗出，纯化的PCR产物可作为扩增所选条带的另一轮PCR的模板。第二轮PCR的产物可作为探针使用，或可进一步进行序列分析。
6．固相诊断分析
(A)多态性检测
限制性内切核酸酶可识别短DNA序列并在那些特异性位点切割DNA分子。某些限制酶很少切割DNA，切割后产生少数极大片段(数千至上百万碱基对)。大多数限制酶常切割DNA，因此产生大量小片段(不足100至超过1000个碱基对)。平均而言，识别4碱基位点的限制酶产生长256个碱基的片段，识别6碱基位点的限制酶产生长4000个碱基的片段，识别8碱基位点的限制酶产生长64，000个碱基的片段。由于已鉴别出数百种不同限制酶，故可将DNA切割成很多不同的小片段。
已知的人类DNA多态性有少数源自非重复序列的插入、缺失或其它重排，但大多数是由于单个碱基替换或串联重复数的改变。碱基替换在人类基因组中很常见，平均每200-500个碱基对发生一次。串联重复区的长度变异在基因组中也较常见，有至少几万个散在的多态性位点“loci”。串联重复多态性的重复区长度从(dA)n(dT)n序列中的一个碱基对至α-卫星DNA中的至少170个碱基对不等。串联重复多态性可分为两大类，一类为小卫星/同向重复序列可变数(VNTR)，重复长度一般为数十个碱基对，总重复单元有数十至数千个；另一类为微卫星，重复序列长度最长6个碱基对，最大总长度约70个碱基对。目前鉴别的大多数微卫星多态性基于的是(dC-dA)n或(dG-dT)n二核苷酸重复序列。对微卫星多态性的分析涉及经PCR扩增含有重复区之DNA的小片段，然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳所扩增的DNA。PCR引物与重复区侧翼的特有序列互补。聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶更常规用于微卫星分析，因为等位基因常常只有单个重复区的大小差别。
已开发出多种技术可用于分析DNA多态性。最常用的方法，限制性片段长度多态性(RFLP)法结合了限制酶消化、凝胶电泳、膜印迹以及与克隆的DNA探针的杂交。多态性检测为印迹膜上标记片段长度的变化。RFLP法可用于分析序列变化发生于限制酶位点内的碱基替换、或通过选择在重复单元以外切割的限制酶而分析小卫星/VNTR。琼脂糖凝胶的分辨率较低，不能区别只有一个重复单元差异的小卫星/VNTR等位基因，但很多小卫星/VNTR的差别很大，仍足以获得可提供很多信息的标志(Vos等，核酸研究23：4407，1995)。
固相技术提高了检测多态性的能力。例如，可用生物素化引物及等位基因特异性PCR引物扩增等位基因的一种形式。扩增后，可通过与荧光标记的探针进行溶液杂交，并使杂交物捕获在带链霉抗生物素蛋白的固相支持物上而检测出PCR产物(参见如Syvanen ＆ Landegren，人类突变3：172，1994)。
在另一名为“固相微型测序”的方法中，生物素化扩增产物被链霉抗生物素蛋白包被的支持物固定。然后以扩增产物为模板，在有与待区别之序列变体之一互补的单个核苷三磷酸存在时，进行序列特异性延伸反应(参见如Syvanen ＆ Landegren，人类突变3：172，1994；Syvanen＆ Landegren，临床化学学报226：225，1994；Jarvela等，医学遗传学杂志33：1041，1996)。
在“寡核苷酸连接试验”中，比较两个不同标记的等位基因特异性寡核苷酸与生物素化的下游寡核苷酸连接的能力(参见如，Nickerson等，美国国家科学院学报87：8923，1990；Nickerson等，基因组12：377，1992)。使未标记的寡核苷酸固定于伸入测试孔中的抗生物素蛋白包被之固相支持物上。靶序列的存在通过测定结合的标记寡核苷酸产生的特殊信号而确定。例如，可用不同荧光物质标记等位基因特异性寡核苷酸，通过测定荧光而确定靶的存在。
Nepom等，J． Rhematol．23：5(1996)描述了进行基因型分析的方法，其中所选序列用核酸生物样品和生物素化引物经PCR扩增。将小量扩增产物转移至可进行等位基因特异性杂交和检测的自动化处理仪器上。
DNA指纹图谱测定代表了多态性检测的另一方面。现已有多种DNA指纹图谱测定技术可供利用，其中大部分采用PCR产生片段(参见如Jeffries等，自然314：67，1985；Welsh ＆ McClelland，核酸研究19：861，1991)。选择利用何种指纹图谱测定技术取决于应用类型(如DNA定型、DNA标志物作图)以及受研究的生物(如原核生物、植物、动物、人类)。
通常，可通过在本发明吸头上合成全长cDNA而进行DNA指纹作图。然后用限制性内切核酸酶消化cDNA，未结合的物质从吸头上洗去。然后使衔接头连接至结合的cDNA上，该产物可扩增并进行分析。
近几年来开发了很多指纹作图方法，包括随机扩增多态DNA(RAPD)、DNA扩增指纹作图(DAF)和任意引物PCR(AP-PCR)。这些方法均基于经任意选定的PCR引物对随机基因组DNA片段扩增。可以事先不了解序列有关信息而产生任何DNA的DNA片段模式。所产生的模式取决于PCR引物的序列和模板DNA的特性。PCR的退火温度较低，以使引物与DNA上的多个位点退火。若引物结合点在允许进行扩增的距离之内就可产生DNA片段。原则上，单个引物即足以产生电泳带模式。
DNA指纹作图及多态性检测的较新技术是扩增片段长度多态性(AFLP)技术(参见如，Vos等，核酸研究23：4407，1995；Schreiner等，免疫学方法杂志196：93，1996)。简之，基因组DNA用限制性内切核酸酶消化，与寡核苷酸衔接头连接，经PCR对一系列限制性片段进行选择性扩增，扩增片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后分析。
该方法可方便地适应于应用本发明吸头的固相。此时，使全长基因组DNA共价固定在吸头上。然后用限制性内切核酸酶消化所结合的基因组DNA，未结合物质从吸头上洗去。然后将衔接头连接至结合的基因组DNA片段上，并扩增和分析结合的DNA分子。
AFLP技术还可用于mRNA指纹作图(Habu等，生物化学与生物物理学研究会234：516，1997)。该方法中，双链cDNA以锚着oligo(dT)引物合成、用识别4碱基序列的TaqⅠ消化。然后将TaqⅠ衔接头连接至该cDNA片段末端，用选定引物进行PCR扩增，然后进行常规基于AFLP的基因组指纹作图。最好是用AFLP技术进行mRNA指纹作图，其中可用本文所述固相支持物去锚着oligo(dT)引物。
突变也可因它们使短寡核苷酸探针与靶序列杂交不稳定的作用而进行鉴定(参见如，Wetmur，Crit．Rev．Biochem．Mol．Biol．26：227，1991)。通常，这一等位基因特异性寡核苷酸杂交技术涉及靶序列的扩增和随后与短寡核苷酸探针的杂交。可通过测定扩增产物与固相化寡核苷酸探针阵列杂交的模式而筛选多种可能的序列变体。此方法在实施例6和7中举例说明。
(B)常用诊断方法
DNA探针可用于检测传染因子或病态细胞，如表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的存在。通常，用离子型去污剂或离液剂裂解待检生物样品以释放核酸靶。典型的核酸靶包括mRNA、基因组DNA、质粒DNA或RNA、以及rRNA病毒DNA或RNA。为了完成对靶核酸的检测，需要对靶进行某类固定。例如，将核酸固定在具有一定核酸亲和力的固相支持物或基质上。然后用预定序列的标记寡核苷酸探测固相支持物以鉴定目的靶核酸。未杂交的探针经洗涤去除，将标记分别从它们的相应探针上裂解下来，然后检测(总见Reischl ＆ Kochanowski，分子生物技术3：55，1995)。
一种常见的试验方法是，使代表扩增序列之特征性部分的寡核苷酸附着于固相支持物。附着可以是共价的或通过生物素：链霉抗生物素蛋白等类型的连接。靶核酸作为模板用于产生可检测地标记的PCR产物。使这些PCR产物与捕获寡核苷酸杂交，再通过标记物介导的检测反应确定PCR产物的存在。
在该方法的变异形式中，生物素标记的PCR产物附着在链霉抗生物素蛋白包被的固相支持物上。固相化的PCR产物与互补于扩增产物之内部序列的标记探针杂交。
Wilber，免疫学研究26：9(1997)描述了诊断方法的另一个例子，其中述及基于分支DNA信号扩增方法的固相核酸杂交试验。在该项研究中，通过使多个寡核苷酸与靶杂交(其中10个将靶捕获在表面上，39个介导分支DNA分子与RNA的pol区杂交)而检测血浆中的HIV RNA。可检测地标记的探针结合于分支DNA分子的每个臂上。
其它检测方法为本领域技术人员众所周知。例如，固相检测可用放大比色分析方法如碱性磷酸酶系统、链霉抗生物素系统或辣根过氧化酶系统实现。放射性检测是另一种选择。适于放射性检测的放射性标记包括3H、125I、131I、35S、14C、32P等等。荧光标记分子是另一种选择。
本发明通过这样的一般性描述，再参照以下用来举例说明而非限制本发明的实施例将更容易理解。
实施例
实施例1：在固相支持物上合成cDNA
(A) 捕获RNA
在这些研究中，通过酸-胍-酚抽提用标准技术制备总RNA(参见如，Ausubel等(编)，分子生物学简短方案，第三版，第4-4至4-6页(JohnWiley ＆ Sons，Inc．1995))。先将分离的总RNA混合物加热至70℃，向其中加入高盐杂交溶液，将RNA加样至带有oligo(dT)的吸头固相支持物上，然后将支持物置于可移动平台如旋转混合仪上，从而将多聚腺苷酸化mRNA捕获于吸头上。多种仪器，包括连续涡旋仪、环形摇床、旋转震荡器、和配备了旋转仪的杂交箱均可实现充分混合。
RNA捕获所需时间取决于RNA用量。环境温度下，10μg总RNA足以在约2小时内使吸头90％饱和。在典型的静息细胞中，总RNA的这一用量相当于每吸头结合100ng poly(A)+mRNA。相同来源的总RNA 40μg可在30分钟内达到同样的饱和度。
在另一系列实验中，应用刺激的人类T细胞系作为RNA来源，在相同捕获条件下用10μg RNA可在1小时内达到饱和。对几种其它来源，包括小鼠、仓鼠和人类细胞系的RNA也进行了捕获，每种来源用10μg总RNA均在1-2小时内达到90％捕获，由此限定了最长和最短温育时间。
(B)cDNA第一链合成
捕获了poly(A)+mRNA后，在杂交缓冲液中将吸头洗三次以洗去未结合的RNA。在含MMLV-逆转录酶(MMLV-RT)和优化缓冲系统的30μl溶液中、在杂交箱旋转平台上、42℃进行1-2小时的逆转录。如捕获步骤一样，只有持续混合试剂才能有效合成第一链。
初次实验每个固相支持物得到50-100ng cDNA。逆转录产物间接通过对吸头上裂解下的标记双链cDNA进行放射性自显影和经琼脂糖凝胶电泳进行分子大小分析。在几次实验中，拷贝的mRNA种类的大小与常规方法相当，并常常比常规方法所得更长。cDNA的大小分布从0.5kb-20kb，平均约2.0kb。
(C)cDNA第二链合成
逆转录后，将吸头洗三次以去除反应物和酶。在40μl溶液中用1单位RNA酶H对25单位大肠杆菌DNA聚合酶I进行第二链合成。反应物在室温、旋转震荡器上温育6小时或过夜。
去除第二链反应物，加入T4 DNA聚合酶和dNTP使不平整的末端补平以便进行后续连接。这一过程在杂交箱中旋转平台上37℃温育30分钟。在有32P标记的dNTP存在时进行反应，煮沸第二链产物或经限制酶AscⅠ切割使产物从支持物上切割下来，而使产物直接显色。放射性标记的产物经凝胶电泳并转移至胶片上显色。通常10μg总RNA可收获双链cDNA 50-120ng不等，取决于RNA的类型。
也可在逆转录后使用有RNA酶H活性的热稳定性DNA聚合酶如MMLV-RT。此时，热稳定性聚合酶消化RNA模板，无需通过热变性去除RNA。
一项在第二链合成中比较RNA酶H/DNA聚合酶I与TthⅠ DNA聚合酶的实验证实，AscⅠ切割产物无论数量或含量都没有什么差异，其中该产物通过对特定基因如GAPDH和IL-2的PCR扩增进行了检验。应用TthⅠ可使温育时间从室温6小时降至70℃1小时。TthⅠ聚合酶还显示在有锰离子存在时有逆转录酶活性，但由于高温下有二价阳离子时可能出现RNA水解而不得不将温育时间缩至很短。高温下进行DNA聚合的另一好处是二级结构减少，从而有助于合成具有较高级结构的信息。
(D)衔接头连接-连接至载体中
在30μl溶液中以5-10∶1的衔接头：cDNA末端摩尔比例使半磷酸化的衔接头连接至双链cDNA上。优选连接缓冲液包含10％PEG。衔接头-cDNA混合物与T4 DNA连接酶于室温在旋转仪上共同温育过夜。然后将固相支持物洗三次以除去过量衔接头。连接完成后，衔接头的5’羟基经T4多核苷酸激酶和ATP于37℃杂交箱旋转平台上处理1小时而磷酸化。将吸头在TE缓冲液中洗三次而终止这一反应。如果cDNA另作他用，则磷酸化步骤可能并非必需。
某些应用中，第二链合成由逆转录后迅速加入的衔接头特异性引发。根据该方法，mRNA水解后，用T4 RNA连接酶可连接部分单链型异源双链衔接头。该衔接头的部分双链特点可提供3’羟基用于第二链合成的起始，并将在连接期间防止衔接头多联体化，因为T4 RNA连接酶不能连接双链核酸。
(E)从支持物上裂解下来/再环化
在某些研究中，使载体连接至已在吸头上合成的cDNA上。在40μl溶液中用AscⅠ于37℃杂交箱平台上作用4小时使cDNA或载体：cDNA从固相支持物上裂解下来。然后将切割下的DNA加热至70℃维持20分钟，期间混合或不混合。溶液中加入连接缓冲液和T4 DNA连接酶使体积成为50μl，直接使载体：cDNA重新环化。事先未与载体连接的cDNA被分成数等份以检验连接反应，从而确定载体：插入物达到何种比例时可使随后的转化过程得到最佳结果。此时，由于cDNA总量很少(40μl溶液中共50-120ng)，应转化整个连接产物，因此需采取一定的脱盐步骤。
有可能在4小时内从吸头上切割下超过90％的cDNA。在这些条件下，延长温育时间未显示出任何好处。增加酶浓度可缩短切割所需时间，但温育时间和切割体积之间必须平衡。
(F)转化
将来自连接过程的DNA等分样品经电穿孔转化至大肠杆菌电感受态细胞，使cDNA克隆在其中进行繁殖。转化频率为每μg DNAl09-1010cfu不等。如本领域技术人员所知，此过程中最大限制在于电穿孔对盐的敏感性。每份电感受态细胞只能用1-2μl标准连接产物(总体积的5-10％)电穿孔，否则即超过盐耐受极限，所施加电流在电极之间形成电弧，使细胞蒸发并浪费所用的连接产物。可将细胞分成很多等份进行电穿孔而防止这一现象的发生，但这既费力又造成浪费。较好的方案是，应用目前cDNA方法学中可以添加的脱盐步骤，它在不影响产量的前提下能灵活地适应流水线技术或按比例缩减的技术。
转化体在标准培养基如含抗生素的LB琼脂上培养。只有带抗生素抗性基因的细菌在含该抗生素的培养基上长出菌落。真重组体与只含载体序列的菌落常通过蓝-白颜色的选择区分，这一颜色选择是很多常见质粒载体中跨越多克隆位点的lacZ基因表达的结果。lacZ基因产物的表达因插入序列连接至多克隆位点而被打断，结果产生白色菌落。这时，可将重组体与非重组体通过颜色区分，但必需将重组体从非重组体中挑选出来，或使终产物中非重组体的产量很少，使背景在耐受限度以内。当扩增文库时，即使非重组体的背景相当低也可能出现问题，因为含有无插入物之载体的细菌比含插入物的细菌，尤其含大插入物的重组体生长更快、更稳定。
实施例2：
在固相支持物上按比例缩小cDNA合成的RNA用量
在涉及标准cDNA文库产生的多步操作中将材料的损失减至最小，就有可能使RNA消耗量缩减10-100倍。例如，可用比市售试剂盒所声称的起始材料用量少50倍的RNA，即10μg总RNA在固相支持物上合成约100ng双链cDNA。可在不显著改变上述方案时将这一用量减少10倍，但这可能要求添加扩增的步骤。
另一种方法是用T7启动子-衔接头经衔接头连接进行的cDNA合成。这样将允许经体外转录而不是经PCR进行扩增，从而通过消除PCR扩增中的固有长度偏好性而产生更具代表性的文库。体外合成的转录体可随后作为任意其它来源RNA被捕获并加工。该扩增的成功依赖于为确保全长转录体而对体外转录条件的精心优化。未捕获的转录体可经酵母poly(A)聚合酶而多聚腺苷酸化，然后将它们重新加入同一支持物使之被捕获。尽管再次腺苷酸化的转录体不是全长，但并非其所有信息均从RNA集合中丢失。
在一项研究中，合成了T7启动子-衔接头并与10μg总RNA在吸头上合成的双链cDNA连接。根据厂家建议进行体外转录，产生300 bp-2,000 bp不等的大量转录体。尽管这些并非进行有效扩增的最佳大小，但研究表明在固相支持物上产生体外转录体是可能的。
另一个按比例缩小的策略是，以相同于体外转录的方式利用非对称(线性)PCR扩增并重新捕获产物。由于扩增产物是DNA而非RNA，因此可用DNA聚合酶产生双链cDNA。
实施例3
固相支持物探针
由10μg总RNA产生的poly(A)+mRNA经捕获、逆转录、合成第二链，并将T7启动子-衔接头连接至cDNA。在一项研究中，将固相支持物放置在标准Cetus PCR管(ABI，Foster City，CA)中，用长PCR聚合酶(Ex-Taq，TAKARA)以每5轮循环使70℃延伸步骤延长1分钟的形式进行35轮循环。PCR所用的唯一一个引物与衔接头互补，因而扩增将在所结合cDNA的5’最末端引发，产生多拷贝的(+)链。循环后，将PCR产物加热变性并进行琼脂糖凝胶电泳以显示单链cDNA的长度范围。其大小从约500 bp至超过20 kbp，与平行对照实验中双链cDNA经标记、切割、电泳并经放射性自显影显示的大小非常一致。
为确定单链PCR产物能否代表最初的mRNA群体，针对出现频率较高、较低或根本不出现的基因设计PCR引物。引物的设计原则是使所有产物差不多都是相同长度(400-600 bp)并位于或接近cDNA的5’末端。这一引物设计使第一链合成质量比较统一。由于RNA来源于人类Jurkat T细胞系，因此用IL-2、IL-4、GM-CSF、GAPDH、CTLA4、c-fos和Werner's解旋酶序列作引物。小鼠鸟苷酸激酶作为阴性对照。
所有聚合酶链式反应产生所预料大小的产物，还如预期般不产生CTLA4和小鼠鸟苷酸激酶产物。IL-2的产物经Northern印迹证实，其中该推测的IL-250 ng经32P标记，与含固相化RNA的膜杂交，RNA来自(PMA+离子霉素)刺激的和未刺激的Jurkat。高度严谨条件洗涤后，未受刺激样品的RNA几乎不显示任何信号，而刺激样品显示出与预期IL-2信号大小一致的强信号。
实施例4
应用固相支持物进行cDNA末端的快速扩增
cDNA末端快速扩增技术或RACE也可适应于本文所述固相支持物cDNA技术。无论5’或3’RACE均可在cDNA双链进行衔接头连接之后以捕获寡核苷酸的后末端为锚着(3'-RACE)或适当的5’衔接头寡核苷酸为锚着(5'-RACE)进行。固相支持物RAcE与现有技术相比具有很多优点，因为用于产生cDNA的原料很少，而且产物可重复应用。这一应用依赖于直接在上述固相支持物上进行PCR的能力。最初的实验表明，对具有高拷贝数的持家基因GAPDH可以如此，而且末端产物与所捕获RNA及随后合成之cDNA的量直接成正比。进行3’一RACE和5'-RACE的标准方法为本领域技术人员所熟知(参见如wu等，基因生物技术中的方法，第15-28页，(CRC Press 1997))。
实施例5：
用于基因表达试验的固相支持cDNA合成
(A) 细胞刺激及RNA制备
在一个研究系列中，Jurkat细胞系JRT 3.5细胞以1×106细胞/ml的细胞密度在无血清RPMI培养基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中有10 ng/ml佛波醇-12-豆蔻酸酯-13乙酸酯(calbiochem，SanDiego，CA)和100 ng/ml离子霉素(Calbiochem)时刺激6小时。细胞沉淀成团，在1×PBS(Life Technologies)中洗涤，再次沉淀成团，按每106细胞加入含4M异硫氰酸胍/1％N-月桂基肌氨酸/25 mM柠檬酸钠(pH 7.1)(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)之缓冲液0.5ml进行裂解。加入2M醋酸钠(pH 4.2)(Fisher Scientific)十分之一体积，然后加入1倍体积的水饱和酚(Amresco，solon，0H)。混合后，加入四分之一体积的氯仿∶异戊醇(29∶1)(Fisher Scientific)，使溶液充分混合，然后冰浴10分钟。将裂解物离心，取出水相，用等体积氯仿：异戊醇抽提。将水相汇总，用2倍体积的乙醇(Quantum Chemical Corp，Tuscola，IL)使RNA沉淀。离心后，轻轻倒出乙醇，将RNA稍微风干，然后重新悬浮于无RNA酶的水中至浓度在1-5 mg/ml之间。
(B)捕获及第一链合成
将共价连接有寡核苷酸5’-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’[SEQ ID NO：1](Genset，La Jolla，CA)的固相支持物加入10μg细胞总RNA中，用足够的无RNA酶水稀释，使水没过1.5 ml无菌微量离心管(Fisher Scientific)中的吸头。该寡核苷酸包含一个间隔子和一个位于oligo(dT)序列5’的AscⅠ切割位点。将RNA和吸头在65℃温育5分钟。每管加入等体积的2×mRNA杂交缓冲液，其中含50 mM Tris(pH7.5)、1M NaCl(Fisher Scientific)和20μg/ml乙酰化BSA(New England Biolabs，Beverly，MA)，室温下轻轻摇动试管2小时。弃去上清，然后在1×mRNA杂交缓冲液中将吸头洗3次。最后一次洗涤完成后，每管中加入逆转录混合物，其中包括1×MMLV-逆转录酶缓冲液、1 mM dNTP混合物、2 mM DTT(Life Technologies)、20个单位的RNasin(Promega，Madison，WI)和10μg/ml乙酰化BSA(New England Biolabs)，然后加入600个单位的MMLV逆转录酶(LifeTechnologies)。将反应物在42℃轻轻摇动2小时。再加入1个单位的RNA酶H(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)，继续反应半小时。再次弃去上清，每个吸头在含1 mM EDTA(pH8)(Fisher Scientific)的10 mM Tris(pH8)中洗涤3次。所剩RNA模板通过将吸头在含0.01％SDS(Fisher Scientific)的TE缓冲液中煮沸而除去。
实施例6：
用固相支持物进行高流过量解链操作
将捕获型寡核苷酸(36聚体)经C6胺尾共价连接于聚乙烯亚胺包被的尼龙钉装置上。通过C6胺尾标记了Texas Red的较短寡核苷酸(18聚体)在1.5 M硫氰酸胍溶液中与捕获型寡核苷酸在环境温度下杂交15分钟。然后将钉装置用TEN缓冲液(0.01 M Tris(pH7.5)，1 mM EDTA，100mM NaCl)洗涤两次，再用TENS缓冲液(0.01 M Tris(pH7.5)，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.1％SDS)洗涤一次，然后用TEN缓冲液洗涤两次以除去未杂交的信号寡核苷酸。将检测溶液均等分配至聚碳酸酯热电偶平板(Corning Costar Corp．Cambridge，MA)的孔中，将平板置于MJ热循环仪(MJ Research Company Watertown，MA)中。将钉在平板上各孔之间连续转移。从10℃开始，每5分钟升温5℃，直至85℃终止。将溶液转移至黑96孔微滴板上，测量荧光。
每孔的荧光值相应于从捕获型寡核苷酸上解链下来的信号寡核苷酸的量。“解链”或双链解离在10℃-95℃的温度范围内进行。荧光用市售荧光平板读取仪测量。为计算Td，将每一温度下洗脱的累计计数对温度作图。使50％物质从吸头上解离的温度作为Td。螺旋线圈转换定义为，所给寡核苷酸双链(或核酸双链，双链中任意位置含或不含错配)的α值为0.2时的温度至同一给定寡核苷酸双链(或核酸双链)的α值为0.8时的温度。将数据输出至电子表格，产生每种溶液的解链曲线。从这些解链曲线中可计算出Td，△HCT和△Td。
在一项应用1×12钉装置的研究中，将每种检测溶液分别加在两个热电偶平板(Corning Costar Cambridge，MA)的16个不同孔中，每份溶液100μl，每个温度值一个试管。每次升温前将钉装置转移至新一排孔中。在温度达到50℃之前，将第一块板从热循环仪中取出，代之以第二块板。热循环程序完成后，将溶液转移至两块黑色微荧光板(Dynatech)的孔中。用激发波长584nm和发射波长612nm测量荧光。将数据输出至电子制表程序中进行分析。
在一项应用4×12钉装置的研究中，将8块热电偶板一切为二得到16块4×12孔平板。将每种检测溶液加在每块半平板中，100μl/孔，直至所有孔均含有待检溶液。16块半板的溶液构成相同。每次升温前将钉装置转移至新一块半板中。热循环程序完成后，将溶液转移至8块黑色微滴板(Dynatech)的孔中。用激发波长584nm和发射波长612nm测量荧光。将数据输出至电子制表程序中进行分析。
实施例7：
测定各种基于hybotrope和非hybotrope
杂交溶液中寡核苷酸双链的解链温度
本实施例描述了对野生型和突变寡核苷酸与靶核酸杂交之Td的测定。结果显示，基于hybotrope的杂交溶液可以用最多30个核苷酸长之探针检测出核酸序列靶中的单个碱基对突变。
(A)溶液和试剂
滤膜洗液(Fw)是0.09 M NaCl，540 mM Tris (pH 7.6)，25 mM EDTA。“SDS/FW”是含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的FW。杂交溶液包含文中指定浓度的hybotrope、2％N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌氨酸钠)、50 mM Tris(pH 7.6)和25 mM EDTA。甲酰胺杂交溶液包含30％甲酰胺、0.09 M NaCl、40 mM Tris(pH 7.6)、5 mM EDTA和0.1％SDS。硫氰酸胍购自Kodak(Rochester，NY)。GuCl、氢氧化锂、三氯醋酸、NaSCN、NaClO4和KI购自Sigma(st．Louis，MO)。氢氧化铷购自CFS Chemicals(Columbus，OH)。CsTFA购自Pharmacia(Piscataway，NJ)。
LiTCA和TMATCA，以及TEATCA通过用三氯醋酸(100％w/v，6.1N)分别对LiOH，TEAOH和TMAOH的3N溶液在冰浴并持续搅拌下进行逐滴滴定至pH7.0而制备。盐在真空下蒸发至干燥，用乙醚洗一次，再干燥。
寡核苷酸在市售合成仪上用标准氰乙基-N，N-二异丙基氨基-亚磷酰胺(CED-亚磷酰胺)化学法合成。胺尾用市售N-单甲氧基三苯甲游基氨己-6-基氧-CED-亚磷酰胺掺入5’末端。或者，可购买寡核苷酸(Midland Certified Reagents，Midland，Tx．)。
表1显示用于测量野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之间Td差异的寡核苷酸。野生型寡核苷酸代表全长且完全碱基配对的双链，突变寡核苷酸代表有单个碱基错配(通常在寡核苷酸中部)。
表1
| 寡核苷酸性质 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO. |
| 捕获寡核苷酸 | 5’-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’ | 2 |
| 野生型30聚体 | 5’-CAGATGGGTATCAGCAAGCAGGAGTATGAC-3’ | 3 |
| 突变型30聚体 | 5’-CAGATGGGTATCAGGAAGCAGGAGTATGAC-3’ | 4 |
| 野生型24聚体 | 5’-ATGGGTATCAGCAAGCAGGAGTAT-3’ | 5 |
| 突变型24聚体 | 5’-ATGGGTATCAGGAAGCAGGAGTAT-3’ | 6 |
| 野生型18聚体 | 5’-GGTATCAGCAAGCAGGAG-3’ | 7 |
| 突变型18聚体 | 5’-GGTATCAGGAAGCAGGAG-3’ | 8 |
寡核苷酸结合在本文所述吸头上。在这些研究中，寡核苷酸用VanNess等，核酸研究19：3345，1991所述方法附着于吸头上。每个吸头含有0.1-1.2μg共价固定的寡核苷酸。
(B)固相杂交
为标记探针寡核苷酸，用胺反应性荧光染料处理胺寡核苷酸。将衍生的寡核苷酸制品分为三部分，每部分与(a)20倍摩尔过量的Texas Red磺酰氯(Molecular Probes，Eugene，OR)，(b)20倍摩尔过量的丽丝胺磺酰氯(Molecular Probes，Eugene，OR)，或(c)20倍摩尔过量的异硫氰酸荧光素反应。最终反应条件包括0.15M硼酸钠(pH8.3)室温处理1小时。未反应的荧光染料经G-50 Sephadex层析柱大小排阻层析后除去。
用于测量寡核苷酸双链的热动力学特性的高通过量方法已经得到开发。该方法可以筛选数千个溶液样品对寡核苷酸双链螺旋线圈转换之热动力学参数进行调节的能力。该方法利用了为匹配Cetus平板(或96孔PCR形式的平板上的孔)而设计的固相支持物，并且有约40μl体积需要用溶液完全覆盖。吸头的设计如图1所示。该吸头还设计为可与弹簧探针的方形末端相容，该弹簧探针可作为附着点用于排布1×8、1×12、4×8、4×12或8×12形式的尼龙吸头。这类装置的有关描述示于图2。
如Van Ness和Chen，核酸研究19：5143，1991所述使寡核苷酸双链的一员固定于尼龙吸头上。然后经杂交而在吸头上形成寡核苷酸双链。杂交可在单独的容器内整体进行或在用于PCR的平板孔中单个进行。因此有可能使96吸头阵列的每个吸头带有不同寡核苷酸双链。
杂交后，吸头经洗涤，再置于安装在热循环仪上的PCR平板中。就1×8或1×12形式而言，可随后在一系列孔中转移吸头，每次升温5℃。通常温度每次增加5℃，每个温度下的解链时间为1-5分钟。例如，1×12形式的吸头在10℃时放置在H排。然后热循环仪根据程序以2分钟的间隔运行16个步骤，每步升温5℃。吸头阵列在升温前15秒就从一排移至另一排。在这一形式中，可用两块平板研究12种溶液。在96吸头形式中，整个平板的溶液按设定时间间隔移入和移出热循环仪。
荧光探针常在此形式中应用，且对本文所测Td值几乎没有影响。放射性标记探针或荧光探针的应用使各种各样的溶液都可得到测量，因为对光线清晰度没有要求，与用UV分光光度法(增色性变化)测得的解链曲线形成对比。荧光用微滴板荧光读取仪测量，数据直接输入电子制表软件如Excel，这类软件可计算稳定性、焓、螺旋线圈转换和温度变动范围，然后作图表示结果。通常，可一次测量12种溶液的1×12形式可在1小时内完成测量，包括设置和数据简化。
为从寡核苷酸-吸头测定寡核苷酸/寡核苷酸Td，将荧光标记的寡核苷酸与固定于寡核苷酸-吸头上的互补寡核苷酸在各种杂交溶液中共同温育。5-5000ng寡核苷酸在300-400μl体积中、在各种温度下(19-65℃)杂交5-30分钟。吸头分别用各自杂交溶液1毫升洗三次，然后用各自解链溶液在解链过程的起始温度下洗一次。将没于100μl各自解链溶液中的吸头置于热循环仪的顶端。每隔1-5分钟升温5℃，将吸头转移至微滴板新的孔中。解链，或双链解离在10℃-95℃的温度范围内进行。荧光用市售荧光平板读取仪测量。
为计算Td，将每一温度下洗脱的累计相对荧光单位(RelativeFluorescent Unit，RFU)对温度作图。使50％物质从吸头上解离的温度为Td或Tm。螺旋线圈转换定义为从所给寡核苷酸双链(或核酸双链，双链中任意位置含或不含错配)α值为0.2时的温度至同一给定寡核苷酸双链(或核酸双链)α值为0.8时的温度。
以下Td得自下述杂交：
表Ⅱ
| 溶液类型 | 探针长度 | Td(突变型)(℃) | Td(野生型)(℃) | Δ-Td(℃) | HCT(℃) |
| 2.5m LiTCA | 30-mer | 27 | 33 | 6 | 13/14 |
| 2.5m LiTCA | 24-mer | 25.5 | 32 | 6.5 | 13/14.5 |
| 2.5m LiTCA | 18-mer | 24 | 31 | 7 | 9/14 |
| 2.0m LiTCA | 30-mer | 42 | 47 | 5 | 13.5/16 |
| 2.0m LiTCA | 24-mer | 38 | 44 | 6 | 14/15 |
| 2.0m LiTCA | 18-mer | 37 | 43 | 6 | 14.5/16.5 |
| 3.0 m GuSCN | 30-mer | 37 | 42.5 | 5.5 | 13.5/17.5 |
| 3.0m GuSCN | 24-mer | 34.5 | 41 | 6.6 | 12.5/17 |
| 3.0m GuSCN | 18-mer | 33.5 | 40.5 | 7 | 14.5/15 |
| 3.0m GuHCl | 30-mer | 55.5 | 60 | 4.5 | 16/21 |
| 3.0m GuHCl | 24-mer | 52.5 | 58 | 5.5 | 15/20 |
| 3.0m GuHCl | 18-mer | 50 | 57 | 7 | 18/20 |
| Rapid Hybe | 30-mer | 80 | 80 | 0 | na* |
| Rapid Hybe | 24-mer | 80 | 80 | 0 | na |
| Rapid Hybe | 18-mer | 68 | 70 | 2 | 18/23 |
| 5×SSC | 30-mer | 72.5 | 72.5 | 0 | 18/18 |
| 5×SSC | 24-mer | 69 | 70 | 1 | 18/18 |
| 5×SSC | 18-mer | 67 | 72 | 5 | 16/18 |
| Promega QY | 30-mer | 80 | 80 | 0 | na |
| Promega QY | 24-mer | 80 | 80 | 0 | na |
| Promega QY | 18-mer | 62 | 65 | 3 | 20/23 |
*na表示无法应用或太大而不能精确测定。
数据表明，hybotropic溶液(LiTCA，GuSCN和GuHCl)可检测出24聚体和30聚体探针中的单个碱基对错配，而在标准杂交溶液(Rapid Hybe，Promega QY或5x SSC)中不可能检测出单个破基对错配。
在系列杂交溶液中对上述24聚体进行了类似的实验。
表Ⅲ
| 杂交溶液类型 | 斜率([..],k) | HCT | Δ-Td |
| LiTCA,3 M | 19 | 8C | 7.5C |
| GuSCN,3 M | 13 | 10 | 6.0 |
| NaSCN,3 M | 8.5 | 11 | 5.5 |
| NaClO3,3 M | 7 | 12 | 4.5 |
| KI, 3 M | 5 | 15 | 3.0 |
| NaCl,0.165 M | 4.5 | 17.5 | 1.5 |
| GuCl,3 M | 3.5 | 18 | 1.2 |
| CsTFA,2M | 2.5 | 18 | 1.2 |
| 30％甲酰胺 | ND | 20 | 1.5 |
Td(wt)是完全碱基配对之寡核苷酸双链的，Td，Tm(mt)是含单个错配之寡核苷酸双链的Td。所示值均为上述序列的24聚体双链的值。从表Ⅲ的数据可看出，严谨因子与完全碱基配对双链和含有错配双链之间的差异直接成比例。即，严谨因子预示所给杂交溶液区别错配双链的能力。
尽管上述为具体优选实施方案，但应理解本发明并不限于此。本领域技术人员可对所公开实施方案作各种修改，而且这些修改均包含在本发明范围内。本发明范围由以下权利要求书作出限定。
序列表>Rapigene，Incorporated
Garrison，Lori K.
Tabone，John C.
Van Ness，Jeffrey>固相吸头及其相关应用�.430PC>PCT򗶮-12-29ᡂ>PatentIn Ver.2．0ɭᡟ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于基因表达分析中捕获及第一链合成的寡核苷酸ɭ actactgatc aggcgcgcct tttttttttt ttttttttt 39ɮᡖ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɮ gtcatactcc tgcttgctga tccacatctg 30ɯᡖ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɯ cagatgggta tcagcaagca ggagtatgac 30ɰᡖ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɰ cagatgggta tcaggaagca ggagtatgac 30ɱᡐ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɱ
atgggtatca gcaagcagga gtat 24ɲᡐ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɲ
atgggtatca ggaagcagga gtat 24ɳᡊ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɳ< ggtatcagca agcaggag 18ɴᡊ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
用于测量半数野生型寡核苷酸和突变寡核苷酸之核酸双链分子变
成单链时的温度之差异的寡核苷酸ɴ
ggtatcagga agcaggag 18ɵᡖ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
代表核酸双链的参照寡核苷酸的固相化寡核苷酸ɵ
gtcatactcc tgcttgctga tccacatctg 30ᡂᡐ>DNA>人工序列>>人工序列的描述：
代表核酸双链的参照寡核苷酸的溶液寡核苷酸ᡂ
tgtggatcag caagcaggag tatg 24
Claims (70)
1．可用于核酸合成或检测过程中的固相样品保留吸头，其包括
可与支持钉相连的吸头结构；和
包被吸头结构至少一部分的化学层，该化学层可与生物分子结合而在吸头结构上形成生物分子的固相样品。
2．权利要求1的样品保留吸头，其中该吸头结构能与支持钉可卸出式相连。
3．权利要求1的样品保留吸头，其中该化学层直接附着于吸头结构上。
4．权利要求1的样品保留吸头，其中该吸头结构具有部分圆锥形结构，并在其中形成有多条槽。
5．权利要求1的样品保留吸头，其中该吸头结构上有多个热交换片。
6．权利要求5的样品保留吸头，其中该吸头结构为部分圆锥形。
7．权利要求1的样品保留吸头，其中该吸头结构内有大小可容纳支持钉的孔，此孔有一个封闭性末端部分和一个开放性末端部分，开放性末端部分为常见的漏斗形状，在向封闭性末端部分的方向上横截面面积逐渐缩小。
8．权利要求1的样品保留吸头，其中该吸头结构为尼龙6/6。
9．权利要求1的样品保留吸头，其中该化学层为带有可与生物分子结合之多个胺基的聚合物。
10．权利要求1的样品保留吸头，其中该化学层是聚(乙烯亚胺)层。
11．权利要求1的样品保留吸头，其中所选化学层与吸头结构共价结合。
12．可用于核酸合成或检测之固相方法的固相样品保存装置，其中包含：
支持钉；
与支持钉相连的吸头结构；和
包被吸头结构至少一部分的化学层，该化学层可结合生物分子而在吸头上形成该生物分子的固相样品。
13．权利要求12的装置，其中该支持钉为弹簧钉。
14．权利要求12的装置，其中该吸头结构与支持钉可卸出式相连。
15．权利要求12的装置，其中该吸头结构为尼龙6/6元件。
16．权利要求12的装置，其中该吸头结构具有部分圆锥形结构，并在其中有多条槽。
17．权利要求12的装置，其中该吸头结构上有多个热交换片。
18．权利要求12的装置，其中该化学层为带有可与生物分子结合之多个胺基的聚合物。
19．权利要求12的装置，其中该化学层是聚(乙烯亚胺)层。
20．权利要求12的装置，其中该吸头结构表面凹凸不平，以增加吸头结构的表面积。
21．权利要求12的装置，其中支持钉的第一末端部分带猗角且横截面为常见多边形，该吸头结构内有一个由侧壁限定的孔并具有常见的圆形横截面，猗角部分与侧壁摩擦性地吻合，使吸头结构保留在支持钉上。
22．权利要求12的装置，其中吸头结构内有一个孔，孔内能可卸出式地容纳支持钉的第一末端部分，该孔有一个封闭性末端部分和一个开放性末端部分，其开放性末端部分为常见的漏斗形状，在向封闭性末端部分的方向上横截面面积逐渐缩小。
23．可用于核酸合成或检测过程之固相样品保存装置的阵列，其中包含：
一个底座；
按选定阵列与底座相连的数个支持钉，每个支持钉有一个远离底座的末端部分；
与支持钉末端部分相连的数个吸头结构；和
包被每个吸头结构的至少一部分的化学层，该化学层可结合生物分子，形成该生物分子的固相样品。
24．权利要求23的阵列，其中支持钉为弹簧钉。
25．权利要求23的阵列，其中该吸头结构可卸出式地与支持钉相连。
26．权利要求23的阵列，其中该吸头结构为尼龙6/6元件。
27．权利要求23的阵列，其中每个吸头结构为部分圆锥形，其上有多条槽。
28．权利要求23的阵列，其中每个吸头结构上有多个热交换片。
29．权利要求23的阵列，其中该化学层为具有多个胺基的聚合物。
30．权利要求23的阵列，其中该化学层为聚(乙烯亚胺)层。
31．权利要求23的阵列，其中该吸头结构表面凹凸不平。
32．权利要求23的阵列，其中每个吸头结构内有能够可卸出式地容纳相应支持钉末端部分的孔，该孔有一个封闭性末端部分和一个开放性末端部分，其开放性末端部分为常见的漏斗形状，在向封闭性末端部分的方向上横截面逐渐缩小。
33．可用于核酸合成或检测过程之固相样品保存装置和微滴板的组合，其中包含：
微滴板，其中孔的形状能容纳一定体积的含生物分子样品；和
固相样品保存装置，其大小适于至少部分伸入微滴板的孔中，该固相样品保存装置包括：
支持钉；
与支持钉相连的吸头结构，该吸头结构能可移出式地置入孔中；和
包被吸头结构至少一部分的化学层，该化学层可结合溶液中的生物分子，形成该生物分子的固相样品。
34．权利要求33的组合，其中支持钉是弹簧钉。
35．权利要求33的组合，其中该吸头结构可卸出式地连接于支持钉上，当吸头结构从支持钉上卸下时可置于孔中。
36．权利要求33的组合，其中该吸头结构为尼龙6/6元件。
37．权利要求33的组合，其中该吸头结构的横截面形状基本对应于孔的横截面形状。
38．权利要求33的组合，其中该吸头结构具有部分圆锥形结构并在其中有多条槽。
39．权利要求33的组合，其中该化学层为具有数个胺基的聚合物包被层。
40．权利要求33的组合，其中该化学层为聚(乙烯亚胺)层。
41．权利要求33的组合，其中该吸头结构摩擦性地保留在支持钉上。
42．权利要求33的组合，其中微滴板上带有多个孔，并进一步包含按选定方式排列的多个支持钉，和分别与相应的一个支持钉相连的多个吸头结构，由此形成可置于孔中的固相样品保留吸头阵列。
43．权利要求42的组合，其中还进一步包括与远离吸头结构的支持钉末端连接的底座，各吸头结构基本上共面。
44．可应用于核酸合成或检测过程之固相样品保留吸头和微滴板的组合，其包含：
微滴板，其孔的形状能容纳一定体积的含生物分子样品；和
一个可移出式地置于微滴板之孔中的固相样品保留吸头，该吸头具有当插入孔中时可与支持钉相连的吸头结构，和包被吸头结构至少一部分的化学层，该化学层可与溶液中的生物分子结合，从而在吸头上形成该生物分子的固相样品。
45．权利要求44的组合，其中该吸头结构为尼龙6/6元件。
46．权利要求44的组合，其中该吸头结构的横截面形状基本对应于孔的横截面形状。
47．权利要求44的组合，其中该吸头结构和孔具有部分圆锥形截面形状。
48．权利要求44的组合，其中该吸头结构为部分圆锥形并具有多个槽。
49．权利要求44的组合，其中该化学层为聚(乙烯亚胺)层。
50．生产可用于固相分子生物学方法中的固相样品保留吸头的方法，包括以下步骤：
将基质材料制成可与支持钉附着的吸头结构；
用可结合所选生物分子以形成该生物分子之固相样品的化学层包被基质材料的至少部分；和
使化学层附着于基质材料上。
51．权利要求50的方法，其中使化学层附着于基质材料上的步骤包括使化学层共价附着于基质材料上。
52．权利要求50的方法，其中该化学层为具有可与生物分子结合之多个胺基的聚合物，且附着步骤包括使聚合物共价附着于基质材料上。
53．权利要求50的方法，其中该化学层为聚(乙烯亚胺)，基质材料为尼龙6/6材料，附着步骤包括使聚(乙烯亚胺)共价附着于尼龙6/6上。
54．权利要求50的方法，其中进一步包括使吸头结构附着于支持钉上的步骤。
55．权利要求54的方法，其中附着吸头结构的步骤包括使吸头结构可卸出式地附着于支持钉的一个末端。
56．权利要求50的方法，其中进一步包括以下步骤：提供底座、数个支持钉和数个其上有化学层的吸头结构，使支持钉按阵列附着于底座上，使吸头结构分别附着于数个支持钉中的一个上，从而形成远离底座的固相样品保留吸头阵列。
57．形成生物分子之固相样品的方法，包括以下步骤：
使吸头装置的一部分浸没在含生物分子的溶液中，该吸头装置具有基质部分并在基质部分上有化学层，该化学层可与生物分子结合；
使生物分子结合至化学层上以在吸头装置上形成该生物分子的固相样品；和
待生物分子结合至化学层后将吸头装置从溶液中取出。
58．权利要求57的方法，其中该溶液容纳在微滴板的孔中，浸没步骤包括使吸头装置的一部分置入孔中。
59．权利要求57的方法，其中进一步包括待生物分子结合至化学层后，在吸头装置上进行分子生物学方法的步骤。
60．权利要求57的方法，其中进一步包括待生物分子结合至化学层后，将固相吸头装置存放在保存装置中的步骤。
61．权利要求60的方法，其中保存装置是带孔微滴板，存放步骤包括待生物分子结合至化学层后将吸头装置放置在孔中，并将微滴板和吸头装置作为一个整体保存。
62．权利要求57的方法，其中该生物分子是核酸或氨基酸聚合物。
63．权利要求62的方法，其中该核酸是一端与所述化学层结合而另一端游离的寡核苷酸。
64．权利要求63的方法，其中该寡核苷酸的游离末端包含oligo(dT)序列。
65．权利要求64的方法，其中进一步包括使poly(A+)RNA结合至所述吸头装置的步骤，所述poly(A+)RNA的poly(A+)部分与所述寡核苷酸oligo(dT)序列结合。
66．权利要求65的方法，其中进一步包括从所述结合的poly(A+)RNA合成cDNA的步骤。
67．权利要求57的方法，其中所述生物分子为抗生物素蛋白分子。
68．权利要求67的方法，其中进一步包括使寡核苷酸与所述吸头装置结合的步骤，所述寡核苷酸包含至少一个生物素部分，并且所述生物素化寡核苷酸与所述抗生物素蛋白分子结合。
69．权利要求59的方法，其中所述分子生物学方法选自下组：cDNA合成、聚合酶链式反应、cDNA扣除文库制备、差异探针的合成、固相微量测序、寡核苷酸连接试验和扩增片段长度多态性分析。
70．权利要求62的方法，其中所述氨基酸聚合物为抗体。
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