CN1950519A

CN1950519A - 聚合酶群落荧光原位测序珠子

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Publication number: CN1950519A
Application number: CNA2005800135563A
Authority: CN
Inventors: 乔治·M·丘奇; 杰伊·申杜尔; 格雷戈里·J·波雷卡; 朱均
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2007-04-18
Also published as: US20070087362A1; CA2557841A1; EP1718769A4; WO2005082098A2; US7425431B2; WO2005082098A3; JP2007526772A; EP1718769A2; AU2005216549A1

Abstract

提供了小型化、高密度、基于珠子的阵列。还提供了产生和使用克隆珠子以及产生和使用小型化、高密度、基于珠子的阵列的方法。

Description

聚合酶群落荧光原位测序珠子

相关的申请

本申请要求2004年2月27日提交的美国临时专利申请No.60/548,631的优先权，在此为了所有目的通过完全引用将它合并。

政府利益的声明

本发明是在DARPA授予的授权号F30602-01-2-0586以及能源部授予的授权号DE-FG02-02ER63445之下有政府的支持而作出的。在本发明中政府具有某些权利。

发明领域

本发明涉及小型化的、高密度、基于珠子的阵列，生产和使用小型化的、高密度、基于珠子的阵列的方法，和生产和使用它的组分的方法。

发明背景

聚合酶群落(polymerase colony，polony)技术是可以以高度并行方式阐明每个单独分子的序列的单分子扩增技术。然而，聚合酶群落技术的通量与单独的群落的大小成反比，其范围从数十到数千微米。

产生克隆微球体(clonal microspheres)(即，带有克隆性地扩增的DNA的珠子)的群体的方法是本领域已知的(例如，Dressman(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8817；Brenner et al.(2000)Nat.Biotech.18：630)。然而，这些方法有一些缺点。在Dressman et al.中，通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析珠子，其操作昂贵，并且通量太低(即，低于每秒70,000事件)而不能处理数亿的珠子。在Brenner et al.中，操作珠子以形成包装的平面阵列，物理的包装限制了珠子的分散。

概述

本发明部分地基于有效的低成本产生基于珠子的阵列的新方法的发现。这种阵列对于遗传学研究和诊断应用特别有用。在此描述的方法和组合物容许以经济的方式在合理的时间内搜寻数千万到数十亿个离散的核酸序列。

本发明的实施方式涉及基于珠子的阵列和制造基于珠子的阵列的方法。根据某些实施方式，提供了具有多个珠子的阵列，其中单个的珠子具有附着于其上的基本上同一的核酸序列群体，其中所述基本上同一的核苷酸序列群体在序列上不同于附着于其它珠子上的基本上同一的核苷酸序列群体。多个珠子被固定在半固体(semi-solid)介质上形成阵列。所述半固体介质可以由聚丙烯酰胺、纤维素、聚酰胺、交联的琼脂糖、交联的葡聚糖或交联的聚乙二醇制成。在某些方面，所述半固体介质具有x、y和z轴，多个珠子相对于x和y轴随机地排列。珠子可以固定为单层，例如，接近所述半固体介质的顶面。

在某些方面，所述半固体介质可以附着于固相支持物，例如显微镜载玻片或流动池(flow cell)。固相支持物可以附着于半固体介质的底面。

在其它方面，两个、三个或四个不同的基本上同一的核酸序列群体可以附着到珠子上。在其它方面，所述珠子是克隆珠子。在其它方面，所述珠子包括文库。

在其它实施方式中，制造基于珠子的阵列的方法包括提供附着有基本上同一的核酸序列群体的多个珠子，将所述珠子固定在半固体介质中以形成阵列，以及扩增基本上同一的核酸序列群体以形成附着有扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个珠子。在某些方面，所述半固体介质包括扩增引物。在其它方面，所述半固体介质包括在半固体介质中形成空隙(voids)的添加剂，例如阳离子脂质、多胺或聚阳离子。

在其它实施方式中，制造基于珠子的阵列的方法包括提供附着有基本上同一的核酸序列群体的多个珠子，以及扩增基本上同一的核酸序列群体以形成附着有扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个固定的珠子。然后将珠子固定在半固体介质上形成阵列。在某些方面，通过乳状液PCR(emulsionPCR)进行扩增。

在其它实施方式中，制造基于珠子的阵列的方法包括提供附着有基本上同一的核酸序列群体的多个珠子，以及扩增基本上同一的核酸序列群体以形成附着有扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个珠子。富集具有附着于其上的扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个珠子，以形成富集的珠子群体，将珠子固定在半固体介质中以形成阵列。

本发明的实施方式涉及富集附着有第一核酸序列的珠子群体的方法。这些方法包括提供珠子群体，其中所述群体的至少一部分包括附着有第一核酸序列的珠子。使所述珠子群体接触与所述第一核酸序列互补的第二核酸序列，一同孵育所述珠子群体和所述第二核酸序列，从而发生杂交以形成杂交珠子的群体和未杂交珠子的群体。然后从未杂交珠子的群体中分离杂交珠子的群体。在某些方面，所述第二核酸被固定在捕捉珠子(capture bead)上。在其它方面，通过密度或亲合性从未杂交珠子的群体中分离杂交珠子的群体。

根据另一个实施方式，提供了试剂盒，其含有在半固体介质中固定了多个珠子的阵列，其中基本上同一的核酸序列群体附着在所述珠子上。

附图的简要说明

根据以下的结合附图对说明性实施方式的详细说明，将更完整地理解本发明的上述和其它特征和益处。

附图1描绘了生物素化的引物(SEQ ID NO：1)和链霉抗生物素蛋白包被的珠子的示意图。

附图2A-2C描绘了经历了在此描述的富集程序的珠子。(A)描绘了未富集的珠子。包含扩增的序列的珠子(″扩增的″)是红色，不具有扩增的序列的珠子(“空”)是绿色。(B)描绘了富集的扩增的珠子。(C)描绘了来自显示大比例空珠子的团粒部分的珠子。

附图3描绘了本文所述的单层化(monolayering)程序的示意图。

附图4描绘了聚焦图。

附图5描绘了在高密度下用透射的明视野的单层珠子的图像。

附图6描绘了对偶联到8.8微米珠子的寡核苷酸的平行测序。各带有五个80mer寡核苷酸之一的珠子群体被固定在丙烯酰胺中，并经历多轮荧光原位测序(FISSEQ)直到获得五至八个碱基对读取结果。这个处理后的图像显示了玻片的区域，伪彩色代表单个的序列(深蓝色代表“噪声标志”(noise signitures))。显示了600×600像素区，其中在每个维度上分辨率是每像素约0.5微米。在倒置落射荧光显微镜上采集图像。

附图7描绘了对偶联到1微米珠子的寡核苷酸的平行测序。各带有三个80mer寡核苷酸之一的1微米珠子的群体被固定在丙烯酰胺中，并经历多轮FISSEQ直到获得四个碱基对读取结果。混合进了较大的珠子(2.8微米)来充当图像配准的参照参照标记。正确的序列标志是伪彩的红色、白色、黄色；噪声标志是伪彩的深蓝色；参照(fiduciary)标记物是伪彩的绿色。显示了200×200像素区，其中在每个维度上分辨率是每像素约0.5微米。在倒置落射荧光显微镜上采集图像。

附图8描绘了通过对流自组装制备的顺磁性聚苯乙烯微球体(1微米直径)的单层。通过改变所添加去污剂(detergent)的量，单层可以是松散地包装的(A)或更紧密地包装的(B)。

附图9A-9D描绘了没有乳状液的情况下在粒子上的核酸扩增。

附图10描绘了排除体积(excluded volume)法的示意图。

附图11描绘了文库构建的终产物的示意图。

附图12描绘了切割之后用于剪切片段的大小选择的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶。

附图13描绘了用于对选择了大小的片段定量的PAGE凝胶。

附图14描绘了MmeI消化的滚环扩增(PCA)材料的诊断性6％PAGE。

附图15描绘了凝胶纯化的、无引物文库的鉴定性6％PAGE凝胶。

附图16描绘了最终文库的鉴定性6％PAGE凝胶。

详细说明

本发明提供了制备和阵列化(arraying)带有扩增的DNA的大量微球体的方法。然后可以对扩增的DNA应用各种杂交和基于酶的方法，同时对阵列的珠子使用单个的小的试剂体积。在某些方面，平行的核酸分析，例如DNA测序和RNA表达谱分析(expression profiling)，可以与本发明的珠子组合。在此描述的珠子以及制造和使用基于珠子的、高密度阵列的方法，对于各种基于遗传学的研究和诊断应用是有用的，以下进一步讨论这一点。

本发明提供了与本领域已知的基于珠子的方法相比的优点。例如，在此描述的方法通过将读出(readout)降低到一个微米(single)的尺度，大大地提高了当前的测序方法的分辨率。本发明的某些方法的另一个优点是，将珠子包埋在聚合物或凝胶中增强了当前的“聚合酶捕获”(polymerasetrapping)方法。在此描述的某些方法的又一个优点是，由于珠子以优于0.4微米的精确度保持固定，包埋可以帮助图像对准。本发明还有利地提供了相对于未扩增的珠子来富集扩增的珠子的便利方法。在本发明的其它方面，包含单层的固定的珠子相对于Z轴是有序的，但对于X和Y轴是完全无序的。这提供了益处，容许人们产生珠子阵列而不需要使用在珠子模式上产生秩序的基质(例如，具有珠子可以掉入的蚀刻孔的表面)。在此描述的方法关于包埋或者连接珠子的进一步益处是，它可以整合到采集系统中，在该系统中珠子相对于检测装置是运动的，从而可以从比该检测装置通常所使用的元件更大的元件上收集数据。

本发明提供了珠子和基于珠子的阵列。如在此使用的，术语“珠子”是指离散的颗粒，其可以是球形的(例如，微球体)或具有不规则的形状。珠子的直径可以小到约0.1μm，或大到约几毫米。珠子的大小范围一般从直径约0.1μm到200μm，从直径约0.25μm到100μm，从直径约0.5μm到50μm，从直径约0.6μm到40μm，从直径约0.7μm到30μm，从直径约0.8μm到20μm，从直径约0.9μm到10μm或从直径约1μm到9μm。在某些方面，本发明的珠子直径大约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm或9μm。珠子可以包含各种材料，包括但不限于，顺磁性物质、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸类聚合物、钛、乳胶、琼脂糖(sepharose)、纤维素、尼龙，等等。

根据某些实施例，珠子可以在它们的表面上具有官能团，其可以用于将核酸序列结合到珠子上。可以通过杂交(例如，与聚合物结合)、共价附着(covalent attachment)、磁附着(magnetic attachment)、亲合性附着(affinityattachment)等将核酸序列附着到珠子上。例如，珠子可以包被有链霉抗生物素蛋白，核酸序列可以包括生物素部分。生物素能够结合珠子上的链霉抗生物素蛋白，从而将核酸序列附着到珠子上。包被有链霉抗生物素蛋白、寡聚dT和组氨酸标签结合基质的珠子是商业上可获得的(Dynal Biotech，Brown Deer，WI)。也可以使用，例如，本领域已知的固相化学作用，例如用于产生核酸阵列的那些，如羧基、氨基和羟基，或功能化的硅化合物，来将珠子官能化(参见，例如，美国专利No.5,919,523，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)。

描述了将寡核苷酸固定到支持物上的方法，是本领域已知的(珠子：Dressman et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8817，Brenner et al.(2000)Nat.Biotech.18：630，Albretsen et al.(1990)Anal.Biochem.189：40，和Lang et al.Nucleic Acids Res.(1988)16：10861；硝化纤维：Ranki et al.(1983)Gene 21：77；纤维素：(Goldkom(1986)Nucleic Acids Res.14：9171；聚苯乙烯：Ruth et al.(1987)Conference of Therapeutic and DiagnosticApplications of Synthetic Nucleic Acids，Cambridge U.K.；聚四氟乙烯-丙烯酰胺：Duncan et al.(1988)Anal.Biochem.169：104；聚丙烯：Polsky-Cynkinet al.(1985)Clin.Chem.31：1438；尼龙：Van Ness et al.(1991)NucleicAcids Res.19：3345；琼脂糖：Polsky-Cynkin et al.，Clin.Chem.(1985)31：1438；以及聚丙烯酰胺葡聚糖(sephacryl)：Langdale et al.(1985)Gene36：201；乳胶：Wolfetal.(1987)Nucleic Acids Res.15：2911；为了所有目的通过完全引用将它们合并在此)并且在本文中进行了进一步描述。

如在此使用的，术语“附着”(attach)是指共价相互作用和非共价相互作用两者。共价相互作用是在两个原子或基团(radical)之间通过共用一对电子(即，单键)、两对电子(即，双键)或三对电子(即，三键)形成的化学键。共价相互作用在本领域也称为电子对相互作用(electron pairinteractions)或电子对键(electron pair bonds)。非共价相互作用包括，但不限于，范德华相互作用、氢键、弱化学键(即，通过短程的非共价力)、疏水相互作用、离子键，等等。非共价相互作用的综述可以在Alberts et al。in Molecular Biology of the Cell，3d edition，Garland Publishing，1994中找到，为了所有目的通过完全引用将它合并在此。

本发明的实施方式提供了珠子，在其上附着了一个到数百万个核酸序列(例如，寡核苷酸序列或多核苷酸序列)的拷贝。在一个方面，珠子可以具有附着于其上的单个核酸序列的多个拷贝(即，克隆珠子)。在另一个方面，珠子可以具有附着于其上的两种、三种、四种、五种、十种或更多种核酸序列。例如，在一个方面，基因序列的两种方向(即，正链和负链)都可以附着在珠子上。

在某些实施方式中，提供了其上附着有基本上同一的核酸序列群体的珠子。如在此使用的，术语“基本上同一的核酸序列”意图包括，但不限于，相互具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的核酸序列。在某些方面，“基本上同一”包括100％的序列同一性。术语“基本上同一”适用于附着到珠子上的所有核酸序列、适用于附着在珠子上的引物和/或适用于附着在珠子上的扩增产物。

如在此使用的，术语“寡核苷酸”意图包括，但不限于，单链DNA或RNA分子，一般是通过合成方法制备的。本发明的核苷酸一般是天然存在的核苷酸，例如衍生自腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷的核苷酸。当寡核苷酸被称为“双链的”时，本领域技术人员了解的是，寡核苷酸的配对存在于的氢键键合的螺旋状阵列中，该阵列通常与例如DNA联系在一起。除了双链寡核苷酸的100％互补形式之外，在此使用的术语“双链的”还意味着包括那些形式，其包括诸如凸起(bulge)和环(loop)的结构特征(参见，Stryer，Biochemistry，Third Ed.(1988)，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)。如在此使用的，术语“多核苷酸”是指可以是各种不同大小的核酸的链。多核苷酸可以是与寡核苷酸相同大小，或可以是寡核苷酸大小的两倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更大。寡核苷酸和多核苷酸包括附着在珠子上和通过使用在此描述的任何方法扩增制造的(即，“扩增产物”)那些。

寡核苷酸和/或多核苷酸可以分离自天然来源或购自商业的来源。寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以通过任何适合的方法制备，例如，Beaucage和Carruthers((1981)Tetrahedron Lett.22：1859)描述的亚磷酰胺法，或根据Matteucci et al.1981)J.Chem.Soc.103：3185的三酯法，为了所有目的通过完全引用将两者合并在此，或通过利用商业的自动化寡核苷酸合成仪或在此描述的本领域已知的高通量、高密度阵列法(参见，美国专利No.5,602,244、5,574,146、5,554,744、5,428,148、5,264,566、5,141,813、5,959,463、4,861,571和4,659,774，为了所有目的通过完全引用将它们合并在此)的其它化学方法。也可以从各个供应厂家商业性地获得预先合成的寡核苷酸。

在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域已知的各种微阵列技术来制备寡核苷酸和/或多核苷酸。预先合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以附着到支持物上或使用以下参考文献中阐述的光指引(light-directed)法、流体通道(flow channel)和斑点(spotting)法、喷墨(inkjet)法、基于针(pin-based)的方法和基于珠子的方法来原位合成：McGall et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13555；Synthetic DNA Arrays In GeneticEngineering，Vol.20：111，Plenum Press(1998)；Duggan et al.(1999)Nat.Genet.S21：10；Microarrays：Making Them and Using Them In MicroarrayBioinformatics，Cambridge University Press，2003；美国专利申请公开No.2003/0068633和2002/0081582；美国专利No.6,833,450、6,830,890、6,824,866、6,800,439、6,375,903和5,700,637；和PCT申请Nos.WO04/031399、WO 04/031351、WO 04/029586、WO 03/100012、WO 03/066212、WO 03/065038、WO 03/064699、WO 03/064027、WO 03/064026、WO03/046223、WO 03/040410和WO 02/24597；为了所有目的通过完全引用将它们合并在此。

在某些实施方式中，本发明的珠子对于分析文库，例如，基因组文库、cDNA文库等是有用的。用于分子文库合成的方法的实例可在本领域中找到，例如：DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho et al.(1993)Science 261：1303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37：1233，为了所有目的通过完全引用将它们合并在此。在本文进一步描述了文库。

在某些实施方式中，本发明的珠子被固定在半固体介质中。半固体介质包括有机的和无机的物质，包括但不限于，聚丙烯酰胺、纤维素和聚酰胺(尼龙)，以及交联的琼脂糖、葡聚糖或聚乙二醇。例如，在此描述珠子可以被物理地固定在聚合物凝胶中。凝胶可以在其X和Y维度(例如，几个厘米)上比其Z维度(例如，约30微米)上更大，其中Z维度比固定在其中的珠子厚得多(例如，30微米的凝胶对比一微米的珠子)。

在某些方面，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的固定在半固体介质中的珠子具有附着于其上的核酸序列(例如，扩增的核酸序列)。也就是说，固定在半固体介质中的一些珠子可以是空的(即，不具有附着在其上的核酸序列)，一些可以仅具有扩增引物(即，不具有附着在其上的扩增的核酸序列)，并且/或者，一些可以具有附着在其上的异质核酸群体(即，不是基本上同一的序列)。

在其它方面，含有附着在其上的核酸序列的每个固定的珠子将具有与其它固定的珠子不同的核酸序列。也就是说，50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的固定的珠子将具有连接在其上的核酸序列(例如，扩增的核酸序列)，该核酸序列与附着在一个或多个其它固定珠子上的核酸序列基本上相同。附着在珠子上的核酸序列可以适用于附着在珠子上的所有核酸序列、适用于附着在珠子上的引物和/或适用于附着在珠子上的扩增产物。

在其它方面，本发明的半固体介质与固相支持物一同使用。例如，在上述段落中描述的凝胶可以按这样的方式被聚合，从而凝胶的一个表面附着在固相支持物(例如，玻璃表面)上，而凝胶的另一个表面是暴露的。在某些方面，可以以这样的方式注入凝胶，从而珠子形成驻留于接近凝胶的暴露表面的单层。

本发明的固相支持物可以塑成各种形状。在某些实施方式中，固相支持物基本上是平面的。固相支持物的实例包括平板如载玻片、微滴板、流动池、盖玻片、微芯片等，容器如microfuge管、试管等，管，薄片，垫片，薄膜等等。另外，固相支持物可以是，例如，生物的、非生物的、有机的、无机的，或它们的组合。在某些实施方式中，珠子和/或固相支持物可以被官能化，从而珠子可以结合到固相支持物上。在此进一步讨论了官能团。

在某些实施方式中，珠子的阵列可以在标准的落射荧光显微镜上成像。使用固定的珠子容许阵列经历杂交/基于酶的操作的多个循环，继之以对杂交到固定在珠子上的DNA的分子、或掺入到固定在珠子上的DNA本身中的视觉可检测标记进行视觉可检测标记的成像。可以与在此进一步描述的测序分析一同使用多种可检测标记。用于本发明的标记的实例包括视觉上可检测的标记，例如荧光素(例如，FITC)、罗丹明(例如，TRITC、RITC)、DAPI、BODIPY、Cy3、Cy5、Alexa、Texasred、Cascadeblue、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、抗生物素蛋白、生物素、荧光素酶(例如，海肾(renilla)荧光素酶、萤火虫荧光素酶)，等等。许多适合的标记是本领域已知的，可以从例如Molecular Probes(Eugene，OR)和Sigma-Aldrich(St.Louis MO)的目录定购，为了所有目的通过完全引用将它们合并在此。

本发明的实施方式进一步涉及在珠子上扩增核酸序列。在某些方面，扩增寡核苷酸的方法包括乳状液PCR，其在以下进一步描述了。扩增核酸序列的其它方法包括，但不限于，在乳状液中使用有引物的珠子来捕获反应产物的滚环扩增(高分支的或线性)；在水溶液中的滚环扩增(高分支的或线性)，继之以在珠子上的克隆“捕获”；在乳状液中的解旋酶置换扩增(HDA)；和使用例如SiO₂-表面低聚物(SiO₂-surface oligos)、或薄凝胶固定的低聚层(oligo layer)的原位滚环扩增。

在某些方面，扩增寡核苷酸的方法包括使用PCR，例如锚式PCR或RACE(cDNA末端快速扩增)PCR，或作为选择，在连接链式反应中(LCR)(参见，例如，Landegran et al.(1988)Science 241：1077-1080；和Nakazawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：360-364；为了所有目的通过完全引用将它们合并在此)。可选择的扩增方法包括：自保持的序列复制(self-sustained sequence replication)(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)，转录的扩增系统(transcriptional amplification system)(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.US.86：1173，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)，Q-Beta复制酶((Lizardi et al.(1988)BioTechnology 6：1197，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)，循环PCR(recursive PCR)(Jaffe et al.(2000)J.Biol.Chem.275：2619；和Williams et al.(2002)J.Biol.Chem.277：7790；为了所有目的通过完全引用将它们合并在此)或使用本领域技术人员公知的技术的任何其它核酸扩增方法。在美国专利No.6,391,544、6,365,375、6,294,323、6,261,797、6,124,090和5,612,199中描述了各种扩增方法，为了所有目的通过完全引用将它们合并在此。

本发明的实施方式涉及使用在此描述的扩增方法来扩增寡核苷酸的方法。在某些方面，通过使用常规方法使扩增引物与寡核苷酸的3’末端的扩增位点选择性杂交来扩增寡核苷酸。扩增引物的长度是6-100、甚至达到1,000个核苷酸，但一般从10到40个核苷酸，不过不同长度的寡核苷酸是有用的。扩增引物可以存在于溶液中，例如乳状液PCR那样，和/或存在于在此描述的半固体介质中。

一般地，当两个核酸序列是基本上互补的，即在至少14到25个核苷酸的序列段上至少约65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％互补。参见Kanehisa，M.，1984，NucleicAcids Res.12：203，为了所有目的通过完全引用将它合并在此。

总的说来，五个因素影响了引物与第二核酸分子杂交的效率和选择性。当设计非随机引物序列时这些因素是重要的考虑内容，它们是(i)引物长度，(ii)核苷酸序列和/或组成(composition)，(iii)杂交温度，(iv)缓冲化学和(v)引物需要与之杂交的区域中的空间阻碍。

在引物长度和引物同目标序列退火的效率与精确度之间存在正相关性；与较短的序列相比，更长的序列具有更高的Tm，并且较少可能在给定的目标序列内重复，从而减少(cut down)混杂的杂交(promiscuous hybridization)。具有高G-C含量或包含回文序列的引物序列倾向于自我杂交，它们的预定目标位点也是一样，因为单分子的、而不是双分子的杂交动力学一般地在溶液中是有利的；同时，设计含有足够数量的G-C核苷酸对的引物以紧密地结合目标序列是重要的，因为每个这种配对由三个氢键连接，优于A和T碱基对时存在的两个氢键。杂交温度与引物退火效率成反比，可能被包括在杂交混合物中的有机溶剂例如甲酰胺的浓度也与引物退火效率成反比，而盐浓度的增加促进结合。在严格杂交条件下，与较短的探针相比，更长的探针更有效地杂交，在更为许可的条件下较短的探针是足够的。严格杂交条件一般包括低于约1M的盐浓度，更通常地低于约500mM，优选的低于约200mM。杂交温度范围从低至0℃到大于22℃、大于约30℃，和(最经常地)超过约37℃。对于特异性杂交，更长的片段可能需要更高的杂交温度。由于几个因数影响杂交的严格度，与任何单独一个参数的绝对大小相比，参数的组合是更重要的。杂交条件是本领域技术人员已知的，可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到，为了所有目的通过完全引用将它合并在此。

注意上述前四个考虑内容设计引物。虽然多数序列的相对优点是心理估计的，已经设计了计算机程序来帮助评估这几个参数和优化引物序列(参见，例如，Hoover et al.(2002)Nucleic Acids Res.30：e4和Rouillard et al.(2004)Nucleic Acids Res.32：W176，为了所有目的通过完全引用将它们合并在此)。

根据某些实施例，提供了富集其上附着有目的核酸序列的珠子的方法。通过在容许目的核酸序列与互补核酸序列杂交的条件下，使珠子的群体(其中珠子的至少一个具有附着在其上的目的核酸序列)同与所述目的核酸序列互补的核酸序列接触，可以富集具有目的核酸序列的珠子。然后使用本领域公知的方法从杂交的珠子中分离未杂交的珠子，杂交的珠子含有附着在其上的目的核酸序列。在某些方面，与在起始珠子群体中其上附着有目的核酸序列的珠子的百分比相比，其上附着有目的核酸序列的珠子被富集至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在某些实施方式中，互补核酸序列被固定在支持物上。适合的支持物包括，但不限于，合成聚合物支持物，例如，聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯(例如，胺化或羧化的聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯等等，聚合物珠子、磁性珠子、玻璃珠子、琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素，或任何在亲和层析中有用的材料。在此进一步描述了富集具有目的核酸序列的珠子的方法。

根据某些实施例，提供了在珠子上测序核酸序列的方法。本领域已知的一般测序方法，例如通过用可逆(reversible)终止子延伸的测序、荧光原位测序(FISSEQ)、焦磷酸测序(pyrosequencing)、大规模平行标志测序(MPSS)等(描述于Shendure et al.(2004)Nat.Rev.5：335，通过完全引用合并在此)，适合于同在此描述的珠子和基于珠子的阵列使用。可逆终止法使用分步式测序-合成(sequencing synthesis)生物化学，结合可逆的终止作用(reversible termination)和可去除的荧光(Shendure et al.同上，和美国专利No.5,750,341和6,306,597，通过引用合并在此)。FISSEQ中通过向反应中添加单种荧光标记的三磷酸核苷(nucleotide triphosphate)、洗去未掺入的核苷酸、通过测量荧光检测核苷酸的掺入并重复该循环，延伸了DNA。在每个循环，来自前一循环的荧光被漂白或用数字化手段减去，或荧光基团从核苷酸上裂解并被洗去。在Mitra et al.(2003)Anal.Biochem.320：55中进一步描述了FISSEQ，为了所有目的通过完全引用将它合并在此。焦磷酸测序中在每个核苷酸掺入事件(即，当核苷酸被添加给生长的多核苷酸序列时)期间释放焦磷酸(PPi)。通过ATP硫酸化酶和荧光素酶，在能够可视地检测的偶联反应中，检测在DNA聚合酶催化反应中释放的PPi。通过核苷酸降解酶，添加的核苷酸被连续地降解。在第一次添加的核苷酸被降解之后，可以添加下一个核苷酸。随着上述过程的重复，模板序列的更长的片段可以推断出来。在Ronaghi et al.(1998)Science 281：363中进一步描述了焦磷酸测序，为了所有目的通过完全引用将它合并在此。MPSS同时地在微珠上利用了基于连接的DNA测序。包含所有可能的突出端的标记的接头的混合物与四个核苷酸的目标序列退火。在成功的连接接头时检测标记。然后使用限制性内切酶来裂解DNA模板以暴露下四个碱基。在Brenneret al.(2000)Nat.Biotech.18：630中进一步描述了MPSS，为了所有目的通过完全引用将它合并在此。

通过以下实施例进一步说明了本发明，实施例不应被看作是限制。在整个本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容为了所有目的通过完全引用将它们合并在此。

实施例I

克隆珠子

步骤1：将寡核苷酸偶联到珠子上

使用从Integrated DNA Technologies获得的商业上可获得的寡核苷酸(Coralville，IA)。通过寡核苷酸5′末端的双生物素部分将寡核苷酸附着到链霉抗生物素蛋白包被的顺磁性珠子(1μM MYONE^TM珠子(Dynal Biotech，Brown Deer，WI))上(附图1)。寡核苷酸的序列与以下的文库产生程序(实施例VI)中描述的文库分子的PR1-F切片相同。在这个步骤之后，在此处描述的模板文库的扩增期间，这容许珠子固定化的寡核苷酸充当PCR引物。在此处描述的方案中，这个序列被称为“正向”PCR引物。

产生负载正向引物的珠子的步骤如下：

1)使用磁场将珠子吸引到微离心管的侧面，在200μl TE中洗涤1×10⁹个MYONE^TM链霉抗生物素蛋白顺磁性珠子(100μL的贮存溶液)一次。

2)将珠子重悬浮在180μl结合(Bind)&洗涤(Wash)缓冲液(5mMTris-HCl pH 7.5，0.5mM EDTA，1.0M NaCl)中

3)在25℃将珠子与20μl 100μM(2nmole)5′生物素化的PCR引物PR1-F-2BIO：2Bio-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO：1)孵育30分钟

4)使用磁场将珠子吸引到微离心管的侧面，用200μl TE洗涤珠子两次。

5)将珠子重悬浮在200μl TE(5×10⁸个珠子/μl)中，并保存在4℃直到用于随后的步骤。

步骤2：制备微乳状液

在油包水乳状液中进行PCR反应。乳状液的使用使得非常小体积的乳状液的水性成分互相隔离，因而，在热循环反应的过程中PCR试剂和PCR反应的产物被相互隔离。使用固定到珠子(例如，步骤1的珠子)上的寡核苷酸作为两个PCR引物之一，产生了在PCR反应结束时被物理地固定在珠子上的PCR产物。用于PCR反应的模板包括多核苷酸的复杂混合物，这些多核苷酸含有两个侧翼“共有”区，以及分子与分子间不同的间插序列。在这个实施例中，使用了E.coli基因组文库。侧翼于这个文库的独特区域的共有序列在此称为“PR1-F”和“PR1-R”。使用低浓度的模板用于PCR，从而在PCR反应开始时，含有珠子的乳状液的大部分水性区室(compartment)含有零个或一个模板。在PCR反应结束时，许多珠子是“空的”(empty)，因为它们处在不含有任何模板的区室中。其它的珠子是“克隆的”(clonal)，因为它们含有相同PCR产物的数千个拷贝。每个克隆珠子的PCR产物不同于其它克隆珠子的PCR产物。较不常见的、但也存在的是，珠子存在于有两个或多个模板的区室中。这个第三种“非克隆”(non-clonal)珠子含有来自多于一个模板的PCR产物的混合物。因而，珠子的分布分出三个种类：空的、克隆的和非克隆的，其可以使用泊松分布(Poisson distribution)来模型化。

A.乳状液油相的制备

令人惊讶地，已经发现，乳状液的稳定性对于油相的每种成分的比例非常敏感。因此，当测量每种成分以确保一个实验与下一个实验的最小差异性时要格外小心(例如，使用反向移液(reverse pipetting)，通过正置换注射器来测量，等等)。使用注射器来量出10％(v/v)Span 80实现了乳状液PCR的一致的性能。

1)制备10％的(v/v)Span 80的矿物油溶液，使用10ml或1ml注射器和16号针头来测量：

a)9ml轻质矿物油

b)1ml SPAN^80(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)

2)通过反向移液向微离心管中添加以下的：

a)545μl轻质矿物油(Sigma-Aldrich)

b)450μl矿物油中的10％SPAN

c)4μl TWEEN80(Sigma-Aldrich)

d)0.5μl TRITON^X-100(Sigma-Aldrich)

3)将溶液涡旋30秒以彻底地混合。

B.乳状液水相的制备

已经发现，将核苷酸的浓度提高到以下列出的高量，在此处描述的珠子-凝胶-成像系统中产生了更多的信号。MgCl₂浓度上的同时增加对于保持核苷酸∶MgCl₂的比例足够接近10∶1也是必要的。

将以下的添加到微离心管中，轻轻地吹吸混合：8.0μl 10×MgCl₂-PLATINUMTaq PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)；30μl 50mM MgCl₂(18.75mM)(Invitrogen)；11.3μl 25mM(每一种)dNTP混合物(3.5mM)(Invitrogen)；1.0μl 2mM未修饰的反向PCR引物PR1-R(Integrated DNA Technologies(IDT)，Coralville，IA)：CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT(SEQ ID NO：2)；0.4μl 10μM未修饰的短正向PCR引物PR1-3LF：IDT，CCTCTCTATGGGCA GTCGGTGAT(SEQ ID NO：3)；5μl带有PR1-F正向引物的1微米珠子；20.5μl无菌dH2O；4.5μl PLATINUMTaq(Invitrogen；5U/μl)；和0.25μl 1nM模板DNA。

C.油包水乳状液的制备

以下的乳状液制备是用于5μl(大约2.5×10⁹个)珠子。使用的模板的量一般产生10％扩增的珠子。一般地，在不富集时使用每载玻片5-50μl珠子，或使用每载玻片50-200μl富集的珠子。已经发现，油相与水相的比例影响乳状液的稳定性，已经确定了1∶6的水∶油比例产生一致地稳定的乳状液。

1)在具有磁搅拌子的设置为1400RPM的闭环磁力搅拌板上，将400μl油相添加到2ml圆底冻存管中。

2)将75μl水相滴加到搅动的油相中。

3)在VWR科学型565磁性搅拌器上用磁搅拌子(no.58948-353，VWRScientfic，West Chester，PA)在1400RPM将混合物搅动30分钟。

4)将试管的内含物分到8×200μl试管中(每个50μl)

D.热循环

已经发现，提高PCR循环数和增加延伸时间提高了信号。因此使用120个PCR循环和75秒的延长阶段。

根据以下程序将乳状液热循环(分:秒)：

a)94℃2:00

b)94℃0:15

c)57℃0:30

d)70℃1:15

e)再重复步骤b)-d)119次

f)72℃2:00

g)4℃待用

E.从乳状液中回收珠子

使用以下方案来从乳状液中回收珠子：

1)将8×200μl PCR试管的内含物集中到单个1.5μl微离心管中。

2)添加800μl NX缓冲液(100mM NaCl；1％TRITON^X-100；10mMTris-HCl pH 7.5；1mM EDTA)。

3)将试管涡旋30秒。

4)在11,000RPM将试管离心1.5分钟。

5)不扰动沉淀地除去约1150μl上清液。

6)再重复两次(teo more times)步骤2-5。

7)使用磁性分离将珠子吸引到微离心管的侧面，除去剩余液体。

8)用50μl TE洗涤珠子两次。

9)将珠子重悬浮在5μl TE中。

F.核酸外切酶处理以从珠子上除去未延伸的正向引物

在乳状液PCR之后，“扩增的”珠子带有PCR产物(双链的，一条链固定在珠子上)和残余的、未延伸的正向引物(单链的)。已经发现，残余的、未延伸的正向引物在随后的核酸分析步骤中可能是背景信号的来源。因此，希望消除它。使用核酸外切酶I来选择性地消化残余的未延伸引物。

1)混合以下的：

86μl珠子+dH2O

10μl 10×核酸外切酶I反应缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)

4μl of核酸外切酶I(20单位/μl，New England Biolabs)

2)在37℃孵育混合物1小时，在30分钟时点混合一次以打散沉积的珠子。

3)将混合物在80℃孵育20分钟以钝化核酸外切酶。

4)使用磁力分离，用200μl NX缓冲液洗涤珠子5次。

5)将珠子保存在4℃待用。

G.用氢氧化钠使结合珠子的产物单链化(single-stranding)

已经发现，这个步骤对于实现珠子固定化的PCR产物的单链化是重要的。

1)通过磁力分离从珠子中除去所有液体

2)添加50μl 0.1M NaOH并与珠子混合

3)在25℃孵育10分钟

4)用50μl 0.1M NaOH洗涤一次

5)用TE洗涤两次

6)将珠子重悬浮在50μl TE中

这种方案允许文库的扩增，与使用本领域已知的基于珠子的方法产生的库相比，该文库更复杂几个数量级。

可以通过将200μl水相滴加到2ml圆底冻存管(no.430661，Corning)中的400μl油相中来制备油包水微乳状液。当混合物在VWR 565磁性搅拌器上用磁搅拌子(no.58948-353，VWR Scientific，West Chester，PA)在1,400rpm搅动时，可以进行滴加1分钟。在加入水相之后，可以搅拌混合物30分钟的总时间。通过将两个试管放置在置于磁性搅拌器中心的支架中，可以一次制备两个乳状液。

实施例II

珠子的富集

以下方案可用于从克隆珠子中分离空珠子。乳状液PCR反应中的低模板浓度以及富集程序(protocol)的组合使用，与其它可能的手段相比，产生了更高比率(fraction)的“克隆扩增的’’珠子。富集的基础是使用第二组大的(3微米直径)、无磁性的珠子(即，“捕获珠子”)，其包括具有与“反向”PCR引物序列(PR1-R)相同序列的引物。由于与反向PCR引物互补的序列将仅存在于PCR反应产物的DNA的链上，扩增的珠子选择性地与这些大的捕获珠子杂交，而空的珠子不与捕获珠子有效地杂交。根据它们的密度差异(例如，通过在密度梯度溶液中离心珠子)，将与1微米扩增珠子杂交的3微米捕获珠子从1微米空珠子中分离。

如下制备捕获珠子：将50μl SPHERO^TM聚苯乙烯链霉抗生物素蛋白包被的珠子(非顺磁性的，3微米直径珠子，Spherotech，Libertyville，IL)移入1.5μl微离心管，在13.2krpm下离心30秒沉淀，重悬浮在50μl的结合&洗涤缓冲液中。将珠子再次离心，从珠子沉淀中吸出所有液体，将珠子重悬浮在49.5μl的结合&洗涤缓冲液中。添加0.5μl的1mM生物素修饰的“捕获引物”PR1-R-BioXL：生物素-5′-cgtaccccgcttggtctttctcccgtaccccgcttggtctttctccCTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT(SEQ ID NO：4)。在室温下将珠子孵育20分钟，其间不时混合。将珠子离心30秒沉淀，除去液体，添加50μl的结合&洗涤缓冲液。重复这个洗涤步骤，将珠子重悬浮在10μl的结合&洗涤缓冲液中。将捕获珠子保存在4℃待用。

将TE中40μl 1微米的处理的珠子(在上一节中产生的扩增的和未扩增的珠子的混合物)重悬浮在20μl的结合&洗涤缓冲液中。将10μl 3微米捕获珠子添加到20μl的1微米处理的珠子中，吹吸混合珠子。通过在56℃孵育混合物10分钟使捕获珠子与处理的珠子杂交。然后将混合物小心地吸移到1.5μl微离心管中150μl 60％甘油(v/v)的顶端。在13.2kpm将微离心管离心1分钟。由于非磁性3微米珠子和磁性1微米珠子的不同密度，3微米珠子保留在上清液中(带有与它们杂交的扩增的1微米珠子)，而未杂交的、未扩增的1微米珠子在试管的底部形成沉淀。从微离心管吸出液体(不扰动试管底部的珠子沉淀)，并移液到新的微离心管中。与捕获珠子杂交的扩增的珠子在这个上清液中被富集。

接下来，从捕获珠子中纯化出扩增的1微米珠子的富集部分。向含有上清液的新试管中添加1mL水，吹吸混合，在13.2krpm离心2分钟。吸出所有的液体，只留下20至30μl，添加50μl新水，混合，在13.2krpm再次离心2分钟。从珠子的沉淀除去所有的液体，将珠子重悬浮在50μl的0.1M氢氧化钠中。将珠子孵育10分钟并不时混合以使1微米珠子与3微米捕获珠子分开。向微离心管施加磁场来将磁性1微米珠子吸引到试管的侧面，除去所有上清液。含有3微米捕获珠子的上清液是白色云雾状的。在0.1MNaOH中洗涤1微米珠子一次，在1×PCR缓冲液中洗涤三次。将1微米珠子重悬浮在5μL的TE中，保存在4℃。

附图2A-2C描绘了经历了如上所述的程序的一组珠子。珠子取自各个步骤以检查扩增的珠子相对于空的珠子的比率。在这些伪彩色的附图中，绿色珠子是空的，红色珠子是扩增的。在由乳状液PCR产生的、经过处理的但未经过富集的1微米珠子的起始材料中，大约8％的珠子是扩增的(附图2A)。在通过上述过程汰弃的珠子组中，低于1％是扩增的(附图2C)。在富集了扩增珠子的材料的部分中，扩增珠子的比率从8％提高到43％(附图2B)，即5.5倍的富集。

实施例III

无序的、固定的珠子的单层

在高分辨率显微镜的视野深度下，可以了解单层化(monolayering)的关键性质。例如，20× Plan Apo(NA＝0.75)物镜就分辨率而言商业上可获得的最好的物镜之一，其的视野深度是1.9微米。当克隆微球体仅有1微米直径时，如果显著地偏离单层，将不可能在对阵列的珠子成像的同时将焦点维持在给定视野内的所有珠子上。

在扩增(例如，通过制造克隆微球体群体的方法)之前或之后，及任选的，在已经进行了珠子富集方案之后，可以采取以下步骤。在已经使珠子单层化之后可以进行平行测序或其它形式的循环核酸分析。

为了形成珠子的单层，使用以下程序。混合以下试剂：3.00μl珠子(以期望的密度)；5.10μl的dH₂O；1.50μl的丙烯酰胺:双(38％丙烯酰胺，2％双丙烯酰胺；Roche)；0.60μl的RHINOHIDE^TM(聚丙烯酰胺凝胶加强剂)(Molecular Probes，Eugene，OR)；1.20μl的5％N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)；和1.80μl的过硫酸铵溶液(APS)(0.5％)。

将混合的试剂倾倒在聚四氟乙烯(teflon)包被的显微镜用载玻片和盖玻片之间，使其聚合，产生30微米厚的凝胶。盖玻片或显微镜载玻片包被有结合硅烷(Bind Silane)(3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷)，因而聚合之后凝胶将粘在显微镜用载玻片上或盖玻片上。例如，在Mitra et al.(同上)中描述了在结合硅烷中包被玻璃表面的程序。简言之，将220μl乙酸和4mL的结合硅烷试剂混合到1升dH₂O中。通过温和振荡下浸泡1小时将玻璃表面暴露在这个溶液中。通过在dH₂O中浸泡三次和在100％乙醇浸泡一次来洗涤玻璃表面。将载玻片风干并干燥保存。

在聚合作用期间，将显微镜载玻片和聚合凝胶置于一个朝向，使得珠子向着凝胶的期望的侧面沉积。因而，相对于凝胶的暴露表面，珠子将形成“顶层”或“底层”(附图3)。为了在固定到珠子的DNA上进行杂交和酶反应，已经发现，在“顶层的”凝胶中的珠子对于施加到它们上的酶和寡核苷酸而言更加可及，容许更为有效的反应动力学。这不是令人惊讶的，因为许多用于搜寻凝胶的酶反应通过酶来进行，如果珠子实际上在凝胶内的深部，酶将难以接近珠子。凝胶是30微米厚的，而珠子仅1微米厚。虽然凝胶孔是大的，例如，如果珠子位于凝胶的底部，酶和或寡核苷酸扩散通过凝胶孔将是缓慢的。

最终产物由经由结合硅烷试剂附着了丙烯酰胺凝胶的玻璃表面组成(附图3)。凝胶大约30微米厚。珠子存在于凝胶顶部的单层中(即，最远离于经由结合硅烷附着了凝胶的玻璃盖玻片)。

这个实施例规定，催化试剂(APS和TEMED)的浓度比本领域一般用于聚合凝胶的低得多，因而在倾倒凝胶之后，它将以缓慢的速率聚合(约一小时)，容许珠子通过重力沉积到凝胶的一个表面的单层中。已经确定了，如果聚合过程太急速，珠子没有足够的时间沉积到单层中，结果是一层不能在单个焦平面中显现的珠子。翻转聚合凝胶的动作从而珠子沉积到凝胶的暴露表面的单层中，对于允许随后用于在珠子上操作DNA的酶反应是有益的。

使用珠子或其它基质的“有序”阵列(即，技术中基于珠子的阵列)的动机是对于进行相同特征的重复独立观察的期望，或者说对于“可寻址性”的期望，一般采用带有笛卡尔(Cartesian)座标的有序阵列的形式。在这个实施例中描述的阵列对于Z轴是有序的，因为它们是单层的，但是对于X和Y轴是无序的。在高密度下显现和辨别了单个珠子，并且进行了重复；对凝胶的给定分区进行了独立的观测，并与对凝胶的相同分区的先有观测对准，这样就使在每个分区内对单个珠子的多次独立观测成为可能。珠子位置即使在多次酶操作、暴露于95℃的热等条件下仍然保持不变。这样，使用无序的单层避免了许多与产生有序阵列相关的难点而实现了相同的目标。

实施例IV

引物杂交和通过单碱基延伸测序

在所述程序的这个步骤中，珠子存在于本身附着于玻璃盖玻片的丙烯酰胺聚合物凝胶的暴露表面处的单层中。珠子表面上的DNA因而可以容易地暴露于各种试剂和条件而不影响它们在凝胶中的绝对位置。已经发现，可以在以这种形式固定的DNA上进行各种酶反应和化学反应，包括但不限于，序列特异性寡核苷酸杂交、聚合酶驱动的引物延伸、限制性内切酶驱动的序列特异性裂解、连接酶驱动的寡核苷酸连接、核酸外切酶驱动的DNA降解等。

作为这些酶反应的实例，描述了杂交寡核苷酸引物然后用荧光核苷酸进行聚合酶驱动的单碱基延伸的方案。

由于珠子上的PCR产物已经被单链化，现在它们从5′到3′由下列组成：将链固定到珠子上的双生物素部分、PR1-F正向引物序列、未知序列(取决于来自所构建库的材料，珠子与珠子间也有不同)，和与PR1-R引物互补的序列。为了将PR1-R引物杂交到珠子固定化的DNA上，将100μl的杂交缓冲液(6× SSPE和0.01％TRITON^X-100)中1μM PR1-R施加到凝胶，使用125μl的FrameSeal室将液体密封与凝胶接触。在56℃将载玻片加热10分钟，除去FrameSeal室，将载玻片浸入1×洗涤缓冲液(10mM Tris，pH7.5；50mM KCl；2mM EDTA；0.01％TRITON^X-100)。在洗涤液中振荡孵育载玻片2分钟，在1×洗涤缓冲液中洗涤两次。从而PR1-R引物与DNA杂交。PR1-R引物的3′末端位置紧密邻近于珠子固定化分子的未知序列。

为了通过聚合酶驱动的单碱基延伸搜寻第一个未知碱基的同一性，制备以下混合物，含有聚合酶和荧光团标记的ddNTP：122μl的1×ThermoSequenase^TM缓冲液(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)、1μl的ThermoSequenase^TM(4u/uL，Amersham BioSciences)、0.5μl的R110-ddGTP(100μM，PerkinElmer，Wellesley，MA)、0.5μl的Cy5-ddCTP(100μM，PerkinElmer)、0.5μL的Cy3-ddUTP(100μM，PerkinElmer)和0.5μl的Texas-Red ddATP(100μM，PerkinElmer)。

使用125μl FrameSeal室将混合物施加到上述载玻片上，在42℃孵育5分钟来延伸。在室温下缓慢振荡在1×洗涤缓冲液中洗涤浸液2分钟，在成像前重复洗涤1到2次。在装备有氙灯光源和对在此使用的荧光团适合的滤光器组的落射荧光显微镜上进行成像。每个珠子通过相应于四种荧光基团的仅一种的滤光器发射荧光，从而揭示了掺入的碱基的身份以及DNA序列中未知位置的身份。

实施例V

在落射荧光显微镜上成像

珠子被固定在固定到玻璃盖玻片上的凝胶上。凝胶和玻璃都可以贯穿地成像。已经确定，丙烯酰胺凝胶在所使用的％下不产生显著的自身荧光或对光透射的干扰。

为了使被掺入或位于与固定到珠子的DNA相连的分子上的荧光部分成像，使用了具有自动的X-Y平台(Prior)和聚焦控制的落射荧光显微镜(Nikon TE2000)。落射荧光照明是通过汞弧灯、氙弧灯、或卤化汞弧光灯。通过安装在显微镜上的基于CCD的检测器采集图像。使用长焦距物镜或高数值光圈物镜，典型的放大率从10×到40×。一般地，珠子被固定在附着于显微镜载玻片的凝胶中。做为选择，固定化的珠子-凝胶偶尔附着于玻璃盖玻片上，该玻璃盖玻片被安装在流动池(flow cell)或流动池中安装的显微镜载玻片中。流动池或显微镜载玻片装入平台中的零件中。对于显微镜载玻片来说，在图象获取的循环之间可以移开载玻片以进行实验程序(例如，测序)。与在图象获取循环之间从平台移开载玻片相关的一个问题是，不能在微米精确度上将载玻片精确复位到显微镜平台上。一般地，人们可以预期100微米或更多的复位误差。在7微米CCD像素大小和40×放大率下，由于从一个循环到下一个的图像不对准，这个误差将产生75％或更多的数据损失。应注意的是，即使不从显微镜上移开载玻片或流动池，但如果进行的涉及载玻片或流动池的温度上的波动的实验程序，这个问题也可能较小程度地发生。这种温度的改变将引起载玻片或流动池的几何形状方面的机械变化，可以引起图像不对准。为了在成像和载玻片移开的逐次循环之后在X、Y和Z轴上精确地复位显微镜平台达到X和Y上的几个微米之内并在Z上低于1微米，可以使用以下步骤：

步骤1

在实验开始时，产生要成像的表面的“焦点图”。这个焦点图是珠子阵列上x、y、z座标的列表，用于显微镜在每个采集循环期间来访问。通常通过在列表中的每个x、y位置进行“自动对焦”程序以产生相应的z位置来产生这个焦点图。使用的自动对焦算法通过METAMORPH采集软件(UniversalImaging Corporation，Downingtown，PA)实现，使用透射亮视野图像、反射亮视野图像、或落射荧光图像，其中目的珠子已经用一或多种荧光分子标记了。

步骤2

在每个成像循环开始时，软件回到焦点图中的第一个x、y、z硬件位置。对这个特定的视野执行自动对焦程序来补偿z轴上的定位误差。然后采集图像并传送给图像配准软件程序，其在x和y轴中找到合适的偏移量来转换新的图像以将它与该帧的原始图像配准(到一个像素内；由像素大小给出按微米的距离，通常约7μm)。由于珠子是固定的，它们可以充当参照(fiduciary)标记物，避免了向阵列中引入额外特征的需要。因而，当进行精确的图像比对时，无序的珠子有很大的优势。然后根据这些偏移量在x和y上移动显微镜平台。然后珠子阵列处在接近步骤1的原始位置的x、y、z位置上。已经发现，使用该方法可以将图像在亚微米分辨率下进行比对。进行第二次自动对焦以确保新的x、y位置处在焦点中。在这个新的位置重新设置起点。

步骤3

通过访问原始焦点图中的每个位置来采集图像。这些图像在所有之前的循环时互相对准的，容许提取每个帧中大多数或所有珠子的数据。典型的“焦点图”的标绘坐标的实例在附图4中示出，其显示了有两个大孔的圆形凝胶(约1cm直径)。红色的点表明单个帧(frame)的相对XYZ座标。附图5描绘了在高密度用透射的亮视野的单层珠子的样品图像。

实施例VI

配对标签(paired-tag)体外文库构建

已经开发了产生线性dsDNA分子池的体外文库构建程序，其中每个分子长度大约134-136bp，并包括来自目的基因组的17-18bp标签的独特的配对。这些独特的标签的侧翼是一组与通用引物互补的序列(PR1-R和PR1-F)，由附加的通用间隔区序列(“T30”)分隔(附图11)。独特的标签是“配对的”，因为它们在目的基因组上方向相同，在目的基因组上它们的分离落入了限制范围(例如1000+/-100个碱基)。该程序是独特的，因为它是完全体外的；不需要转化入大肠杆菌(E.coli)。

通过体外方法按这种形式构建的文库，提供了相对常规的基因组鸟枪测序(genomic shotgun sequencing)的以下益处：(a)乳状液PCR程序对于扩增短序列显著地更有效；因而存在着最小化库中每个可扩增分子的总长度的动机；(b)基于Sanger的基因组计划的经验表明，配对的读取结果对于基因组重测序是极其有用的，特别是当基因组含有重复元件时；(c)在此描述的测序独特碱基的方法依靠经由通用“锚”序列的定位。在这种文库格式中，对于两个标签存在近端和远端的锚，有效地允许人们通过对每个标签独立地应用测序方法来使读出长度加倍。

文库构建方案有以下步骤：

1.基因组DNA的纯化

2.剪切基因组DNA以产生片段

3.DNA片段的末端修复(end-repair)和A加尾

4.剪切的片段的PAGE大小选择

5.用T尾的间隔寡核苷酸(“T30”)环化

6.用随机六聚物滚环扩增(RCA)

7.用MmeI消化(II型)来释放配对的标签

8.标签-T30-标签文库的PAGE纯化

9.标签-T30-标签文库的末端修复

10.FDV2(PR1-F)和RDV2(PR1-R)引物寡核苷酸的连接

11.配对的标签库的PAGE大小选择

12.切口平移以消除dsDNA库中的切口

13.配对的标签文库的PCR扩增

14.配对的标签文库的PAGE大小选择

15.经由克隆和Sanger测序的文库验证

以下给出了每个上述步骤的详细方案，进行它们来为“M”和“R”大肠杆菌菌株构建了配对的标签文库。

基因组DNA的纯化

对于每个大肠杆菌菌株“M”和“R”，在3mL的LB中使培养物生长过夜，用Qiagen DNEASY^Tissue试剂盒根据厂家的程序分离。每次基因组DNA纯化的产量是大约30μg(Qiagen Inc.，Valencia，CA)。

用宽的大小分布剪切基因组DNA来产生片段

由Agencourt Bioscience Corporation(Beverly，MA)进行来自两个菌株的基因组DNA的剪切。产生的DNA片段的大小分布是相当宽的，这可以在以下的凝胶上看到(附图12)。

DNA片段的末端修复和A加尾

除非另有说明，所有的DNA定量在Nanodrop ND-1000分光光度计上进行。

剪切的基因组“M”DNA定量为57ng/μl，剪切的基因组“R”DNA定量为55ng/μl。用EpiCentre END-ITTM DNA末端修复试剂盒(Madison，WI)对剪切的DNA片段进行末端修复。对每个文库，制备以下混合物：170μl剪切的大肠杆菌DNA(～9-10μg)、25μl的10× END-IT^TM缓冲液、25μl的10×END-IT^TM ATP、25μl的10× END-IT^TM dNTPs和5μl的END-IT^TM酶，总体积250μl。

在室温下孵育反应1小时。根据厂家对于PCR产物纯化的推荐，在Qiagen QIAQUICK^柱上纯化DNA。使用约90μl的缓冲液EB(10mMTris·Cl，pH 8.5)用于洗脱。“M”DNA定量为96.5ng/μl，“R”DNA定量为75.1ng/μl。将每个体积分配到4个大约22μl的试管。为了消除残余的酶活性，将试管加热到70℃15分钟。如下制备A尾的主混合物：100μl的10×PCR缓冲液(无MgCl₂)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、60μl的50mM MgCl₂(Invitrogen)(终浓度3mM)、5μl的100mM dATP(Invitrogen)(终浓度0.5mM)、5μl的Taq(5U/uL)(New England Biolabs，Beverly，MA)和610μl的dH₂O。

在热钝化之后，将78μl的主混合物添加到含有22μl剪切的、末端修复的DNA片段的每个试管中。在热循环仪中在70℃将试管孵育30分钟。通过将试管冷却到4℃结束循环程序。然后将试管直接从热循环仪转移到冰上。

通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀(P∶C∶P)纯化DNA，如下：

1.添加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)

2.添加0.1体积的3M NaOAc(pH 5.2)

3.添加1.0μl的糖原(20μg/μl)

4.添加2.5体积的冷100％乙醇(来自瓶装保存在-20℃的)

5.通过翻转混合

6.将试管置于-70℃～30-60分钟

7.在4℃的室内在微离心机上以最大数度旋转10分钟

8.除去上清液

9.添加1ml 80％乙醇

10.在室温下在微离心机上以最大速度旋转5分钟

11.除去上清液

12.将试管置于真空离心蒸发浓缩器(Speed-Vac)上～5分钟

13.在40μl缓冲液EB或TE中重悬浮沉淀

剪切的片段的PAGE大小选择

将来自每个文库的一半材料加载到预先成形(pre-cast)的6％TBE-PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将20μl的DNA与5μL 5×高密度样品缓冲液(Novex，San Diego，CA)混合。在这个程序中，将相同的加载缓冲液用于所有随后的PAGE凝胶。每个泳道加载12.5μl的样品/加载缓冲液混合物(每个文库两个泳道)。在标准的设备上运行凝胶，在最小地暴露于UV的情况下切下与大约1000碱基对片段相应的区域。用剃刀将凝胶片段切成小块，将每个文库的片段转移到600μl的PAGE洗脱缓冲液中(10mMTris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，1mM EDTA(pH 8.0))。试管在37℃孵育过夜。

第二天，在微离心机中以最大速度旋转洗出物一分钟，将上清液转移到新试管。为了改善回收率，用额外的200μL PAGE缓冲液洗涤凝胶片段。使用P∶C∶P方案纯化DNA，将每个沉淀重悬浮在22μl的缓冲液EB中。

重复A加尾步骤使可能在凝胶纯化期间发生的A尾部的可能部分降解的影响最小化。进行末端修复和A加尾都可以在基于PAGE的大小选择之后而不是之前进行。如下制备A尾的主混合物：25.00μl的10× PCR缓冲液(无MgCl₂)、15.00μl的50mM MgCl₂(终浓度3mM)、1.25μl的100mMdATP(终浓度0.5mM)、1.25μl的Taq(5U/μl)和152.50μl的dH₂O。

将78μl的A加尾主混合物添加到含有22μl重悬浮的DNA的每个试管中，到总体积100μl。对于每个文库，将这分成各50μl的两个热循环仪兼容的试管中。在热循环机中在70℃将试管孵育30分钟。通过将试管冷却到4℃结束循环程序。然后将试管直接从热循环仪转移到冰上。通过P∶C∶P方案纯化DNA。将每个文库重悬浮在10μl缓冲液EB中并置于冰上。

为了测定回收率和估计回收的片段的大小范围，使用20％纯化的材料运行预成形的6％TBE PAGE凝胶(Invitrogen)(附图13)。“M”基于凝胶的定量为“M”＝43ng(在2μl中，或20％的总量)；范围＝大约850-1150，平均＝大约1000。“R”基于凝胶的定量＝18ng(在2μl中，或20％的总量)；范围＝大约900-1250；平均＝大约1075。在为每个文库保留的大约8μl体积中，存在约171ng的“M”片段和约73ng的“R”片段。

用T尾的间隔寡核苷酸(“T30”)环化

然后，使用T尾的间隔寡核苷酸“T30”将A尾的文库片段环化。通过使两个32bp寡核苷酸退火产生具有单碱基“T”突出端的30bp dsDNA片段，来制备T30片段。

5’GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’(SEQ IDNO：5)

3’TCAGCCTCCGGTTCCGCCGGCATGCAGGTTG 5’(SEQ IDNO：6)

T30片段的侧翼是面朝外(outward facing)的MmeI位点。

低聚物的退火是这样进行的：将低聚物混合到每个低聚物50μM的终浓度、在热循环仪中加热到95℃10分钟、关闭热循环仪并容许混合物在一小时的过程中慢慢冷却回室温。

使用QUICK LIGATION^TM试剂盒(New England Biolabs，Beverly，MA)进行T30片段与A尾的文库片段的连接。如下制备反应物。“M”文库环化反应(总体积80μl)：来自“R”试管的8.0μl A尾的片段(在1000bp～171ng＝0.2599pmol)；27.2μl dH₂O；0.8μl的T30(1μM起始浓度(0.8pmol，过量3倍摩尔数))；40.0μl的2× QUICK LIGATION^TM缓冲液；和4.0μl的QUICK^TM T4 DNA连接酶。″R″文库环化反应(总体积30μl)：来自″R″试管的8.0μl A尾的片段(在1075bp～73ng＝0.1032pmol)；5.2μl dH₂O；0.3μl的T30(1μM起始浓度(0.3pmol，过量3倍摩尔数))；15.0μl的2× QUICK LIGATION^TM缓冲液；和1.5μl的QUICK^TM T4 DNA连接酶。在将酶添加到每个试管之前和之后混合每个反应物。在室温下孵育反应物10分钟，然后移到冰上。

在热循环仪上在65℃将连接酶热钝化10分钟。为了破坏所有非环化的材料，添加核酸外切酶混合物。如下制备核酸外切酶混合物：4.0μl的核酸外切酶I(20U/μl)(New England Biolabs，Beverly，MA)、0.4μl的核酸外切酶III(100U/μl)(New England Biolabs，Beverly，MA)和35.6μl的TE。将10μl核酸外切酶混合物添加到80μl“M”反应物中，将3.75μl核酸外切酶混合物添加到30μl“R”反应物中。试管在热循环仪上在37℃孵育45分钟，继之以80℃20分钟来使核酸外切酶热钝化。在下一步的RCA反应中直接使用这个材料不用任何纯化。

用随机六聚物滚环扩增(RCA)

使用REPLIPHI^TM phi29试剂盒(EpiCentre，Madison，WI)进行高分支(hyperbranched)的RCA来扩增文库材料的量。如下制备主混合物：32.0μl的dNTP混合物(各25μM)、80.0μl的10× REPLIPHITM phi29反应缓冲液、40.0μl的随机DNA六聚物(1mM，合成为5′-NNNN^*N^*N-3′，其中“*”代表硫代磷酯键)、552.0μL的dH₂O和16.0μl的5× SybrGreen。将主混合物分入两个270μl的试管，在试管中30μl的“M”或“R”材料被混合到总体积300μl。然后将每个试管分入6个50μl的试管。为了使环化的模板变性，将试管加热到95℃5分钟，随后快速冷却到4℃。将2.5μl的phi29酶添加到冰上的每个试管，到每试管52.5μl的总体积。良好地混合试管并保持在冰上。在热循环仪中在30℃将试管孵育过夜。

在实时PCR(real-time PCR)仪上进行RCA反应，通过存在于反应中的SybrGreen染料观察扩增。在2小时的时点，dsDNA含量已经上升并且变平，表明运行反应过夜可能不是必需的。

用MICROCON-30^柱(Millipore，Billerica，MA)纯化DNA，用总共1mL的TE洗涤。沉淀有相当的量。采用MICROCON-30^膜的几次洗涤来最大化回收率。使用在50℃加热和添加额外的重悬浮缓冲液(缓冲液EB)的组合来重悬浮DNA。每个文库回收了大约750μL。

在NANODROP^仪(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)上测定样品：“M”＝230ng/μL和“R”＝204ng/μL。因而RCA反应产生每个文库～150μg。

用MmeI消化(IIs型)来释放配对的标签

用MmeI消化每个文库的约40μg。由于在T30片段中MmeI位点在远离其识别位点处切割，在T30片段的两个末端都有面朝外的MmeI位点，这个消化预期释放侧翼是具有2bp突出端的～18bp标签的T30片段。由于在MmeI消化之前用T30环化基因组片段，预期这些标签相对于它们起点的位置是配对的。

如下制备反应物。从New England Biolabs(Beverly，MA)获得MmeI、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和NEBuffer 4(10×)。32mM SAM在1× NEBuffer4中按1∶20稀释(-＞1.6mM)。

反应“M” 反应“R”

DNA 173.9 196.0

dH₂O 664.5 642.4

NEBuffer 4(10×) 100.0 100.0

1.6mM SAM 1.6 1.6

MmeI(2U/μl) 60.0 60.0

总体积(μl) 1000.0 1000.0

表1.

在冰上制备反应物，在添加酶之前良好地混合试剂。每个反应分到8个125μl的试管，在37℃在热循环仪上孵育30分钟。P∶C∶P纯化如上述，只是仅使用2体积的乙醇而不是2.5体积，没有最初的热钝化。将每个文库的消化的片段重悬浮在80μl的TE中。正如所料，在“M”和“R”泳道观察到了约70bp的条带(附图14)。

标签-T30-标签文库的PAGE纯化

每个文库的所有量如上述在10泳道预成形的6％PAGE凝胶上运行，每个文库使用4个泳道(20μl的文库和5μl的5×染料)。切下在约70碱基对处的鲜明条带。核定每个文库类型的所有泳道的片段，如上所述进行凝胶萃取，只是洗脱为大约3小时。在P∶C∶P回收之后，将每个文库的DNA重悬浮在约20μl的TE中。运行鉴定性凝胶来测定回收的材料(附图15)。“M”和“R”文库都被估计为大约12.5ng/μl，在此时各保留了18μl。

标签-T30-标签文库的末端修复

在MmeI消化之后，标签-T30-标签分子含有2bp的3’突出端。如上所述使用EpiCentre END-IT^TM DNA末端修复试剂盒(Madison，WI)对修复末端。如下制备反应物：8.50μl的“M”或“R”片段(12.5ng/μl：约100ng)；1.25μl的10× END-IT^TM缓冲液、1.25μl的10× END-IT^TM ATP、1.25μl的10×END-ITTM dNTPs和0.25μl的END-IT^TM酶，总体积12.5μl。

在室温下孵育反应物45分钟，然后直接移到4℃。通过添加40μl的TE将体积增加到50μl，如上所述P∶C∶P抽提反应物。沉淀步骤在-70℃过夜。回收的DNA重悬浮在8μl的TE中。

FDV2(PR1-F)和RDV2(PR1-R)引物寡核苷酸的连接

1∶1混合(50μM的终浓度)通过退火完全互补的寡核苷酸(100μM，HPLC纯化的)来制备引物-接头(dsDNA，FDV2和RDV2)，加热到95℃10分钟，然后让反应物在1小时的过程中慢慢地冷却。

在“退火”形式中，FDV2和RDV2如下：

FDV2：

5’-AACCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO：7)

3’-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA(SEQ ID NO：8)

RDV2：

5’-AACTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT(SEQ ID NO：9)

3’-TTGACGGGGCCCAAGGAGTAAGAGA(SEQ ID NO：10)

FDV2和RDV2分子是未磷酸化的，因而预期不能自身-自身连接，也不能相互连接。末端修复的连接分子是磷酸化的，因而，使用过量的FDV2和RDV2来最小化文库分子的连环化(concatamerization)事件。引物-接头与文库分子的连接是平末端-平末端的，因而在存在聚乙二醇(PEG)的情况下进行以改善连接效率。每个反应设置如下：12.3μl的dH₂O、8.0μl纯化的平末端化的文库片段(“M”or“R”；大约100ng，即，大约2pmol)、1.0μl的RDV2(50μM，50pmol)、1.0μl的FDV2(50μM，50pmol)、2.5μl的10× T4连接酶缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)、21.2μl的40％PEG(40％聚乙二醇8000)和2.0μl的T4连接酶(2000U/μL)(NewEngland Biolabs)。通过混合除了PEG和连接酶的试剂在室温制备反应物。然后添加和混合入PEG，并添加和混合入连接酶。在16℃孵育反应物过夜。为了纯化，用TE将反应体积增加到100μl，并P∶C∶P纯化。将沉淀重悬浮在10μl的缓冲液EB中。

配对的标签文库的PAGE大小选择

在连同合适的阶梯(ladder)的10孔6％PAGE凝胶上运行整个反应物。使凝胶跑动足够远，从而未连接的RDV2和FDV2(相对于文库以大量的摩尔过量存在)预计已经跑出凝胶。正如所料观察到合适大小的条带的三联体(triplet)(产自RDV2/文库片段/RDV2连接，RDV2/文库片段/FDV2连接或FDV2/文库片段/FDV2连接)。切下含有完整三联体的区域，如上所述纯化凝胶，只是洗脱是三个小时，在-70℃乙醇沉淀过夜。样品各自重悬浮在20μl的缓冲液EB中。

断口翻译以消除dsDNA文库中的切口

由于在连接中仅文库分子是5′磷酸化的，预计连接产物含有必需修复的切口。用剩余材料的一半继续实验，如下进行切口平移：10.0μl的文库(假定100％的回收率，这应该是50ng的标签-T30-标签分子加上连接的引物-接头的质量)；0.5μl的dNTP混合物(25mM，即每种核苷酸的终浓度500μM)、2.5μl的10× NEBuffer-2(New England Biolabs)、1.0μl的大肠杆菌DNA聚合酶I(10U/μl)(New England Biolabs)和11.0μl的dH₂O。在冰上制备反应物并混合，然后在16℃孵育30分钟。为了纯化，用TE将反应物的体积增加到100μl，反应物用P∶C∶P纯化，重悬浮在10μl的TE中。

配对的标签文库的PCR扩增

在这个阶段进行PCR以1)增加我们必需操作的文库材料的数量，和2)在单个步骤中消除无关的连接产物。不希望受理论的限制，这个步骤中描述的PCR所应该产生的唯一连接产物具有在两边侧翼是正确定向的RDV2和FDV2的标签-T30-标签(注意到，T30片段本身不是对称的，因而相对于RDV2和FDV2片段可能是在任何方向上)。

在复杂的混合物被PCR扩增时，关键的是在引物分子耗尽前停止PCR反应。这是由于这样的事实，一旦引物已经用完，文库分子将开始相互充当引物，并且文库分子有足够的相似性(～134个中～100个相同的碱基)，因而在变性之后不太可能的是，给定的单链文库分子将与其完全互补的配偶体退火。在引物耗尽后变性和退火所产生的文库可能含有许多“杂交”文库分子。

在实时PCR仪上进行PCR扩增(OPTICON^TM 2，MJ Research，Bio Rad，Waltham，MA).

每50μl ×20(总体积1000μl)

10×PCR缓冲液 5 100

25mM(每种)dNTPs 0.4 8

50mM MgCl₂ 1.5 30

Platinum Taq 0.2μl 4

水 42.7 853

RDV2-T(100μM) 0.1 2

FDV2-T(100μM) 0.1 2

SybrGreen(200×) 0.0025 0.5

表2.

主混合物(在表2中列出)被分成两个499.5μl的试管，向每个试管添加0.5μl的文库材料(“M”或“R”)。每个文库的PCR被分入各50μl的8个试管(总体积400μl)，来在热循环仪上操作。热循环如下进行：

1.94℃2分钟

2.94℃30秒

3.55℃30秒

4.72℃90秒

到步骤2

在15个循环之后停止反应，因为DNA的数量开始达到稳定。将每个文库的反应物合并到单个试管，用QIAQUICK^(Qiagen，Valencia，CA)柱根据厂家对于PCR产物纯化的推荐来纯化。重悬浮是在100μl的缓冲液EB中。该体积对于下一个步骤来说太大，所以对样品进行乙醇沉淀(如同P∶C∶P方案中，只是不进行苯酚抽提)，在10μl TE中洗涤和重悬浮。

配对的标签文库的PAGE大小选择

在6％PAGE凝胶上运行反应物。如先前所述切下“最终”文库条带(约135碱基对处的鲜明条带)，并洗脱和纯化。这是最后的纯化步骤，因此，为尝试得到尽可能严格的凝胶纯化以最小化可能存在的非文库分子的污染，这是关键的。运行PAGE凝胶时不使用阶梯，因为这些分子也可能是常见的污染物，并以垂直斩落式(guillotine-type)动作使用刀片，而不是解剖刀。

在过夜沉淀的P∶C∶P纯化之后，将回收的文库材料重悬浮在10μl的TE中。为了给文库定量，运行具有合适标记物的6％PAGE凝胶(附图16)。根据文库和阶梯条带的相对强度，估计浓度为2ng/μl，即约9*2＝18ng的每个文库剩余。如果文库是135bp，则浓度是大约23nM。在TE中将文库稀释到用于乳状液PCR的各种水平，原始的文库和它们的稀释物都保存在-20℃。

经由克隆和Saneer测序的文库验证

为了验证文库标签如预期的那样是大肠杆菌衍生的和配对的，用Invitrogen TOPO^TM-4试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆“R”文库片段，随后使用M13F/M13R进行PCR，以及Sanger测序(每个克隆单个读取结果)。尽管提交了96个PCR产物用于测序，其中20个返回的不是垃圾结果，就是与载体或污染物相关。正如所料，剩余的76个插入物显示其为RDV2和FDV2片段所适当地侧翼。这76个中：一个是6bp插入序列(TTATCA)；一个是大肠杆菌基因组片段(长度65bp；在BLAST上63/63100％与大肠杆菌MG1655基因组匹配)；一个是大肠杆菌基因组片段(长度70bp；在BLAST上69/69100％与大肠杆菌MG1655基因组匹配)；一个含有侧翼是～27bp的RDV2引物，在NCBI数据文库中没有显著的匹配；正如所料，七十二个含有被T30片段分隔的两个标签。

在这72个中，标签长度有以下的分布：1个标签为9bp；1个标签为11bp；2个标签为13bp；1个标签为14bp；1个标签为15bp；2个标签为16bp；73个标签为17bp；62个标签为18bp；以及1个标签为22bp。对于配对而言，匹配大肠杆菌基因组的标签如下：4个的情况是一个或两个标签都不具有与大肠杆菌基因组的任何理想匹配(可能由于测序错误或非规范序列)；1个是“未配对的”，因为两个标签都匹配独特的位置，但似乎不来源于相同的基因组区域；以及67个作为配对的标签与大肠杆菌基因组匹配(相同的方向，标签间距离在预期的限制之内)。对于这76个配对的标签，配对的标签的距离分布是951+/-90bp。最小距离是729bp，最大距离是1162bp。

因而，68个读取结果的配对率(paring rate)是67/68，即，大约98.5％。在文库中，呈现由T30片段分隔的配对的大肠杆菌标签的、可被乳状液PCR扩增的分子的比率，最低的估计是67/76，即，88％。如果四个读取结果中有一个或两个标签不匹配，而这样的四个读取结果确实代表由于Sanger测序错误或“R”菌株与规范的基因组序列参照之间的差异而不能匹配的配对的读取结果，实际的比率可能稍微更高。

尽管样本容量很小(n＝72)，在标签序列中观察到偏离了25/25/25/25的频率，其可能是显著的倾向(在表3中列出)。第一栏中的数字代表标签碱基在一个或另一个引物或在T30片段中的位置。表中所列的碱基频率是来自这样的链：如果人们从所述引物或T30片段起进行延伸测序(5’到3’)，就会发现上述频率。。括号中的数字是实际的计数数目(与频率相对)。

引物/标签连接

A G C T

+1 0.315(45) 0.315(45) 0.154(22) 0.217(31)

+2 0.340(49) 0.104(15) 0.208(30) 0.347(50)

+3 0.292(42) 0.208(30) 0.146(21) 0.354(51)

+4 0.229(33) 0.250(36) 0.264(38) 0.257(37)

+5 0.333(48) 0.194(28) 0.243(35) 0.229(33)

T30/标签连接

A G C T

+1 0.299(43) 0.194(28) 0.326(47) 0.181(26)

+2 0.299(43) 0.319(46) 0.146(21) 0.236(34)

+3 0.312(45) 0.222(32) 0.222(32) 0.243(35)

+4 0.188(27) 0.236(34) 0.264(38) 0.312(45)

+5 0.252(36) 0.196(28) 0.273(39) 0.280(40)

表3.

实施例VII

对与珠子偶联的寡核苷酸进行平行测序

在实验中对经由生物素联结到链霉抗生物素蛋白包被的超顺磁性珠子的寡核苷酸获得了5到8个碱基对的读取结果，该实验的结果如图6所示。珠子被固定在丙烯酰胺中。与早先已知的方法相比，在附图6中列出的珠子组容许本领域技术人员在单个载玻片的每个单位面积上测序更多10,000倍的特征。

为了进一步小型化，在1微米珠子上进行实验来产生短序列读取结果(每个模板4个碱基对)(附图7)。这些结果接近“每个像素1个序列读取结果”的分辨率，因为每个珠子仅由约1到4个有效像素代表。在这个证明了的珠子大小和密度下，可以从3英寸显微镜载玻片的每1英寸超过3千万个独立的珠子获得测序读取结果。

实施例VIII

微球体的单层

在实施例III中阐述的程序的变体利用了自组装单层中的亲合性来为扩增珠子的富集提供条件。这避免了与当前的扩增程序有关的问题。在这种程序中，使用稀的目的DNA来避免每个珠子上出现两个扩增子，因而具有零个目标DNA的珠子数目接近泊松分布。

本发明还包括使用类似的乳状液来在载玻片上的核酸样品(例如，组织切片中的RNA、微阵列、伸展的(streched)染色体)的“原位”形成密封室(来限制扩增的蔓延)。使用固定的乳状液还将有助于限制、稳定和产生更均匀分布的乳滴大小。

为了获得3英寸显微镜载玻片的每1英寸上数亿到数十亿个独立的测序读取结果，可以以高密度包装相同的1微米珠子。产生超顺磁性珠子的自组织单层(SOM)(附图8)。也可以使用横向磁场来构建多层。从完好地包被有1微米珠子的单层获取30碱基对读取结果将产生～560亿(billion)个碱基的序列。

实施例IX

无乳状液在粒子上扩增核酸

不受理论的限制，降低聚合酶群落的形体尺寸到微米或亚微粒大小将改善通量至少1000倍。这可以通过将一扩增引物限制在聚合物珠子(例如1μm顺磁性的珠子、可从Dynal，Oslo，Norway获得)、聚合物网络或聚合物纳米结构上来实现。因而，聚合酶群落形体尺寸由珠子或聚合物基质的大小来决定，因而与孔隙大小和/或聚合物基质(丙烯酰胺凝胶)的交联含量(crosslinking content)、和目标扩增子的长度无关。类似于常规的聚合酶群落PCR，在聚合物基质(例如丙烯酰胺凝胶)中对聚合酶群落珠子进行实际的扩增步骤，这有助于保持单个珠子的位置和部分地限制扩增子的扩散。本发明的一个重要的部分是包含添加剂(例如阳离子脂质、多胺、聚阳离子，等等)，其形成凝胶中的(in-gel)空隙，例如微团或聚集物(aggregate)，围绕着聚合物珠子并容许在固相中有效的扩增(附图9A-9D)。这个改进的主要益处是目标扩增子和另一个扩增引物被差异性地分配到珠子附近，其提高了扩增效率和/或对珠子的接近程度。它避免了形成乳状液的必需性，因此容许更简单的多重扩增，甚至保存要扩增的分子的起始组的2D或3D排列。

作为选择，可以将第二扩增引物固定到聚合物基质中(例如，通过acrydite修饰或其它交联方法)。因而，扩增只需很少或无需游离的第二引物。这将消除扩增期间珠子之间的交叉(crossover)并因而增强克隆性(clonality)。除了聚合物基质之外(例如，丙烯酰胺凝胶)，胶粒团或聚集物的形成可以进一步限制游离扩增产物的扩散，如果存在任何产物的话(即，如果存在残余的游离第二扩增引物，或在扩增期间使用游离第二引物)。聚阳离子层(或网络)内聚阴离子(例如，DNA)的移动性相对于从聚阳离子自由扩散开是快的，因而反应可以接近指数的，直到阳离子层被填充因而几乎停住，进一步增强随后的图像的鲜明度。

附图9A-9D描绘了通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用预先交联到1μm Dyna珠子的一扩增引物的拷贝。其它扩增引物被acrydite修饰以允许它通过聚合作用(左)掺入到聚丙烯酰胺凝胶基质中。两个引物，以及目的核酸扩增模板被组装到丙烯酰胺基质中。进行PCR扩增，随后是变性和Cy3标记的探针的杂交。可以检测到很少的扩增产物(右)。与(左)相比，当将阳离子脂质添加到组合混合物并孵育15分钟时，扩增效率大大地提高，这由更亮的信号证明了。

实施例X

使用聚合酶群落测序分析DNA修饰

甲基(CH₃)基团与CpG二核苷酸中胞嘧啶残基的5′碳的连接(这被称为外遗传修饰(epigenic modification))构成了控制细胞基因表达的重要机制。在基因组甲基化模式的动力学方面的定量的知识会地对生物学，包括发育控制和病理状态产生很大的影响。对异常DNA甲基化的全基因组(genome-wide)检测依靠甲基化特异性酶的限制性消化，继之以差异展示(MCA-RDA；Ueki et al.(2001)Cancer Res.61：8540，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)或微阵列分析(DMH(Yan et al.(2000)Clin.CancerRes.6：1432)、ECIST(Shi et al.(2002)Cancer Res.62：3214，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)。虽然可以鉴定候选的差异性甲基化基因座，它们都不能监测对于任何给定的CpG岛是独特的组合的甲基化事件。可以顺式地(in cis)搜寻多个甲基化的关系的唯一的技术是甲基化特异性测序。然而，单个亚硫酸氢盐转化的基因组片段的克隆和常规测序的性能使得这种方法是劳动密集的和低通量的。

在一个实施方式中，本发明涉及在聚合酶群落平台上应用甲基化特异性测序，带来了相对传统的甲基化测序方法的几个优点。在固相或半固相(这里是丙烯酰胺)亚硫酸氢盐转化的DNA片段可以被直接扩增，因而消除了克隆步骤的劳动力需求和由差别的克隆效率引入的可能的偏倚。(2)甲基-dC的检测可以按高度并行方式实现，同时搜寻数千到数百万的单个分子。两种方法，重复探测(repetitive probing)和FISSEQ(Zhu et al.(2003)Science301：836；Mitra et al.(2003)Analyt.Biochem.320：55，为了所有目的通过完全引用将它们合并在此)可以用于监测差异甲基化事件。重复探针适合于研究少量的已知基因座，而FISSEQ对于整个基因组研究当然地具有优势(参见(4)，下文)。(3)由于聚合酶群落平台是基于单个分子的技术，需要的输入材料很少。因而可以利用单个细胞和/或染色体。单独的细胞和/或染色体(例如，染色体分散(chromosome spread))可以包埋到聚合物基质或凝胶(例如，聚丙烯酰胺)中，随后是固相亚硫酸氢盐转化和扩增。这将消除DNA纯化步骤，并避免了样品制备期间样品损耗和污染的可能性。(4)作为(3)的延伸，多重PCR和/或完整基因组扩增(用，例如，Phi29)可以用亚硫酸氢盐转化的细胞和/或染色体进行。这容许在单个细胞和/或单个染色体水平确定完整基因组DNA的甲基化状态。

实施例XI

荧光共振能量传递(FRET)

通过对单个FISSEQ步骤使用形成FRET供体-受体对的两种不同的荧光基团标记的dNTP，例如Cy3-dATP供体加上Cy5-dATP受体，人们可以在均聚物操作中辨别零个、一个和两个相同的碱基。首先用供体dNTP的激发波长来激发并寻找在供体发射波长和接受体波长处的发射。然后用受体激发波长激发并寻找在接受体发射波长处的发射。人们可以将该顺序反过来，并首先激发接受体以最小化FRET导致的受体荧光基团的光漂白。

例如，如果有零个dA残基要掺入到给定循环中，则人们将观察不到(或低的)信号。1个dA将导致对每个由于FRET的发生而被激发的荧光团的相应发射波长被检测到。当在供体激发波长激发时，作为发生FRET的结果，两个dA将产生接受体波长处的发射。作为2dA实例的定量性变体，可以测定三个或更多dA。

实施例XII

文库

用于滚环/扩增的文库

直接从基因组DNA产生环形大文库的一个方法是使用末端处的随机N-mer以及没有用于微阵列杂交的内部标签例如：

NNNNNN...(通用引物(common primer)1)..(切割位点)..(通用引物2)..NNNNNN

这些N-mer可以用来随机地与DNA杂交。不同于本领域的系统，N-mer可以互相隔开一定距离而不是单个碱基。将由所利用的寡核苷酸的长度限制这种距离。

聚合酶、连接酶和dNTPs可以用于缺口填充和连接以产生“挂锁的”(padlocked)探针。不同于通过重新环化释放挂锁，可以用限制性内切酶(具有不存在于寡核苷酸中的位点)和核酸外切酶消化基因组DNA，仅留下含有一段基因组碱基的环化的探针。该环形物可以用于滚环方法。做为选择，如果使用乳状液方法，可以通过裂解环形物来释放挂锁，留下侧翼是通用引物的基因组序列。

跳查(jumping)文库

这个实施例阐述了一种方法，通过这种方法经由phi29滚环扩增引物可以产生准备好聚合酶群落的文库。为了使用MmeI(或EcoP15I)产生跳查文库，可以进行以下步骤：

(1)用核酸内切酶完全或部分裂解基因组(例如NlaIII(CATG^)或CviJI^**(NG^CN)或甚至DNase；4bp突出端可能是起始的最干净的位置)；

(2)可选的大小选择(大小选择越精确，则在复杂重复区域中序列的装配越精确)；

(3)连接双标签双MmeI接头，从而形成环形物；

(4)可选的大小选择；

(5)用MmeI切割，钝化和再次环化；和

(6)通过随机地切口，通过序列特异性切口酶，通过用DNA、PNA、RNA引物的链侵入，或通过RNA聚合酶或引物酶引发，环形物可以被引发进入滚环。

除了最初的核酸内切酶位点的信息之外，这种方法将从每个末端产生多达27个碱基对的序列信息(对于NlaIII总共62个碱基对)，并且更重要地容许装配跨越更长的从头序列(de novo sequence)。

用于非滚环文库和本发明的非滚环文库的特定限制性内切酶的非限制性实例如下：SAGE：BsmFI，可从New England Biolabs(NEB)，Beverly，MA获得(VelculeScu et al.(1995)Science 5235：484，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)；LongSage：MmeI，可从NEB获得(Saha et al.(2002)Nat Biotechnol.20：508，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)；CAGE：MmeI，可从NEB获得(Shiraki et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：15776，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)；SuperSage：EcoP15I(Matsumura et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：15718，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)；SAGS：BsaXI，可从NEB获得(Torsteinand Meyerson，Serial Analysis of Genome Subsets)。BsmFI和EcoP15I具有5′突出端，而MmeI具有3′突出端。对于MmeI，通过连接互补配对，3′的2个碱基对信息被保留)；快速鸟枪克隆利用了两个碱基识别核酸内切酶CviJI(Fitzgerald et al.(1992)Nucleic Acids Res.20：3753，为了所有目的通过完全引用将它合并在此)。

实施例XIII

排除体积(excluded volume)的延伸

这个实施例提供能够以高的扩增珠子：反应物体积比产生克隆扩增珠子，而不需要PCR的手段。一聚合物(或颗粒)与另一聚合物(或颗粒)相互作用可以防止与其它附近的粒子进一步相互作用。通过滚环扩增预先扩增模板来产生长的、大体积的连环体(concatamers)。这样，使用过量的这种模板(附图10)，人们可以饱和试管中的所有珠子而无需每个珠子发生多次连环体结合事件。

例如，使用60-mer切口环形物的文库，各具有30碱基对的通用标签和来自基因组文库的30碱基对的插入序列。使用phi29滚环(没有不同于切口的任何引物)进行约一小时，直到有的接近14个串联的单链重复悬挂于初始环形物。在低盐下，其将有约6⁵bp(＝200微米延伸)的长度，和几立方微米的排阻体积。如果模板的稀溶液与携带互补通用标签的1微米珠子相互作用，则首先接触珠子的模板将在许多位点结合并排除其它模板的结合(在附图10中阐述)。人们可以在低盐下洗涤珠子(来降低与其它模板的聚集)，然后重新开始滚环扩增(仅用结合珠子的引物)。不受理论的限制，这将产生用于测序的足够的单链模板(由于每个引物将与许多串联的单链重复结合，这甚至可能产生比PCR获得的更多)。这种方法将避免热循环或珠子分选的需要。

实施例XIV

参考文献

为了所有目的通过完全引用将每个参考文献合并在此。

Aach and Church(2004)J.Theor.Biol.228：31

Merritt et al.(2003)Nucleic Acids Res.31：e84

Mikkilineni et al.(2003)Biotechnol.Bioeng.86：117

Mitra et al.(2003)Anal.Biochem.320(1)：55

Zhu et al.(2003)Science 301(5634)：836

Butz et al.(2003)BMC Biotechnol.31：11

Denkov et al.(1992)Langmuir 8：3183

Dressman et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8817

Brenner et al.(2000)Nat.Biotechnol.18：630

Mitra et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：5926

Mitra et al.(2003)Anal.Biochem.320：55

Zhu et al.(2003)Science 301：836

序列表

<110>哈佛大学的校长及成员们(PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE)

<120>聚合酶群落荧光原位测序珠

<130>10498-00083

<150>60/548,631

<151>2004-02-27

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>双生物素部分(Dual biotin moieties)

<400>1

ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t 41

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>2

ctgccccggg ttcctcattc tct 23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>3

cctctctatg ggcagtcggt gat 23

<210>4

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的俘获(capture)引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>生物素部分(biotin moiety)

<400>4

cgtaccccgc ttggtctttc tcccgtaccc cgcttggtct ttctccctgc cccgggttcc 60

tcat tctct 69

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的T尾的间隔寡核苷酸(T-tailed spacer oligonucleotide)

<400>5

gtcggaggcc aaggcggccg tacgtccaac t 31

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的T尾的间隔寡核苷酸

<400>6

gttggacgta cggccgcctt ggcctccgac t 31

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>7

aaccactacg cctccgcttt cctctctatg ggcagtcggt gat 43

<210>8

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>8

atcaccgact gcccatagag aggaaagcgg aggcgtagtg gtt 43

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>9

aactgccccg ggttcctcat tctct 25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>10

agagaatgag gaacccgggg cagtt 25

Claims

1.包含多个珠子的阵列，其中单独的珠子具有附着于其上的基本上同一的核酸序列群体，其在序列上不同于附着于其它单独的珠子上的基本上同一的核酸序列群体，且其中所述多个珠子被固定在半固体介质中以形成阵列。

2.权利要求1的阵列，其中所述半固体介质附着在固相支持物上。

3.权利要求2的阵列，其中所述支持物是显微镜载玻片或流动池。

4.权利要求1的阵列，其中所述单独的珠子包含附着于其上的两种、三种或四种不同的基本上同一的核酸序列群体。

5.权利要求1的阵列，其中至少40％的所述单独的珠子包括附着于其上的基本上同一的核酸序列群体。

6.权利要求1的阵列，其中所述珠子被固定为单层。

7.权利要求1的阵列，其中所述半固体介质具有x、y和z轴，且所述多个的珠子相对于x和y轴随机地排列。

8.权利要求1的阵列，其中所述半固体介质具有顶和底表面，且所述多个珠子被固定在接近顶表面。

9.权利要求2的阵列，其中所述半固体介质具有顶和底表面，且所述固相支持物附着于底表面。

10.权利要求1的阵列，其中所述半固体介质选自由聚丙烯酰胺、纤维素、聚酰胺、交联的琼脂糖、交联的葡聚糖和交联的聚乙二醇构成的组。

11.权利要求1的阵列，其中所述多个珠子包含多个克隆珠子。

12.权利要求1的阵列，其中所述多个珠子包含文库。

13.产生阵列的方法，包括步骤：

a)提供多个珠子，其中单独的珠子具有附着于其上的基本上同一的核酸序列群体，其在序列上不同于附着于其它单独的珠子上的基本上同一的核酸序列群体；和

b)将所述珠子固定在半固体介质上形成阵列。

14.权利要求13的方法，进一步包括在步骤b)中将半固体介质附着到固相支持物上。

15.权利要求14的方法，其中所述支持物是显微镜载玻片或流动池。

16.权利要求13的方法，其中所述多个珠子包含附着于其上的两种、三种或四种不同的基本上同一的核酸序列群体。

17.权利要求13的方法，其中至少40％的所述单独的珠子包括附着于其上的基本上同一的核酸序列群体。

18.权利要求13的方法，其中所述珠子被固定为单层。

19.权利要求13的方法，其中所述半固体介质具有x、y和z轴，且所述多个珠子相对于x和y轴随机地排列。

20.权利要求13的方法，其中所述半固体介质具有顶和底表面，且所述多个珠子被固定在接近顶表面。

21.权利要求14的方法，其中所述半固体介质具有顶和底表面，且所述固相支持物附着于底表面。

22.权利要求13的方法，其中所述半固体介质选自由聚丙烯酰胺、纤维素、聚酰胺、交联的琼脂糖、交联的葡聚糖和交联的聚乙二醇构成的组。

23.权利要求13的方法，其中所述多个珠子包含多个克隆珠子。

24.权利要求13的方法，其中所述多个珠子包含文库。

25.产生阵列的方法，包括步骤：

a)提供多个珠子，其中单独的珠子具有附着于其上的基本上同一的核酸序列群体，其在序列上不同于附着于其它单独的珠子上的基本上同一的核酸序列群体；

b)将所述珠子固定在半固体介质上形成阵列；和

c)扩增所述基本上同一的核酸序列群体以形成具有附着于其上的扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个珠子。

26.权利要求25的方法，其中所述半固体介质包括扩增引物。

27.权利要求25的方法，其中所述半固体介质包括在所述半固体介质中形成空隙的添加剂。

28.权利要求27的方法，其中所述添加剂选自由阳离子脂质、多胺和聚阳离子构成的组。

29.产生阵列的方法，包括步骤：

b)扩增所述基本上同一的核酸序列群体以形成具有附着于其上的扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个固定的珠子；和

c)将所述珠子固定在半固体介质上形成阵列。

30.权利要求29的方法，其中所述扩增通过乳状液PCR进行。

31.产生阵列的方法，包括步骤：

b)扩增所述基本上同一的核酸序列群体以形成具有附着于其上的扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个珠子；

c)富集具有附着于其上的扩增的基本上同一的核酸序列群体的多个珠子以形成富集的珠子群体；和

d)将所述珠子固定在半固体介质上形成阵列。

32.富集具有附着于其上的第一核酸序列的珠子群体的方法，包括步骤：

a)提供珠子群体，其中单独的珠子具有附着于其上的基本上同一的核酸序列群体，其在序列上不同于附着于其它单独的珠子上的基本上同一的核酸序列群体；

b)使所述珠子群体与同所述第一核酸序列互补的第二核酸序列接触；

c)一同孵育所述珠子群体和所述第二核酸序列，从而发生杂交以形成杂交珠子的群体和未杂交珠子的群体；和

d)从未杂交珠子的群体中分离杂交珠子的群体。

33.权利要求32的方法，其中所述第二核酸被固定在捕获珠子上。

34.权利要求32的方法，其中通过密度或亲和性从未杂交珠子的群体中分离杂交珠子的群体。

35.含有阵列的试剂盒，所述阵列包含固定在半固体介质中的多个珠子，其中所述多个珠子包括单独的珠子，所述单独的珠子具有附着于其上的基本上同一的氨基酸群体，其在序列上不同于附着于其它单独的珠子上的基本上同一的核酸序列群体。

36.权利要求1的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。

37.权利要求1的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是扩增的核酸序列。

38.权利要求13的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。

39.权利要求13的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是扩增的核酸序列。

40.权利要求25的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。

41.权利要求25的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是扩增的核酸序列。

42.权利要求29的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。

43.权利要求29的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是扩增的核酸序列。

44.权利要求31的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。

45.权利要求31的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是扩增的核酸序列。

46.权利要求32的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是引物。

47.权利要求32的方法，其中所述基本上同一的核酸序列是扩增的核酸序列。