CN101031659A - 基因组分析 - Google Patents
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Abstract
一种检测基因组样品中核酸序列的方法，包括：提供含有双链核酸靶核酸序列的基因组样品；提供含有探针核酸序列的探针；提供含有基因组样品、探针、杂交促进试剂和标记物的杂交混合物；将杂交混合物保温；用能够有效刺激至少某些标记物发射能量的射线照射被保温的混合物；以及从荧光信号检测探针是否与靶核酸序列完全匹配，其中检测在提供杂交混合物后60分钟内完成，并且执行本方法不需要变性和双链核酸的PCR扩增。一种实践本方法的试剂盒，其中包括探针、杂交促进试剂和标记物。
Description
发明背景
1、发明领域
本发明涉及基因组材料的分析，更具体来说涉及检测核酸双链体、三链体和/或四链体杂交的方法和试剂盒。
2、相关技术描述
以前我们已经公开了特异性结合的Watson-Crick类型的四链体和其它特异性结合的非典型的四链体、三链体和双链体，例如在美国专利No.6,656,692和美国专利No.6,927,027中。在这些出版物中，对于选择适合的杂交条件以获得其中公开的任何不同的多链体、包括平行的或反向平行的双链体、在同源的或Watson-Crick配对的基序结合的三链体或四链体，提供了足够的指导。也可以参见Erikson等的美国专利No.6,420,115和Daksis等的美国专利No.6,403,313，以及2004年9月16日出版的共同待决的美国专利申请No.2004/0180345。
尽管已经有了上述的发展，但仍然需要提供其它灵敏的、耐用的和可靠的分析核酸的手段。特别需要的是提供能够分析基因组样品中核酸序列的方法和试剂盒。此外，还需要提供不用扩增核酸序列而直接检测基因组样品中核酸序列的方法。此外，还希望提高灵敏度，并更准确可靠地识别所需的结合反应发射出的信号。
此处引用的所有参考文献在此以其全文引为参考。
发明简述
因此，本发明提供了在基因组样品中检测核酸序列的方法，该方法包括：
提供含有双链核酸的靶核酸序列的基因组样品；
提供含有探针核酸序列的探针；
提供含有基因组样品、探针、杂交促进试剂和标记物的杂交混合物；
将杂交混合物保温以提供含有靶核酸序列、探针和标记物复合物的保温的混合物；
用能够有效刺激至少某些标记物发射能量的射线照射被保温的混合物；以及
从荧光信号检测探针是否与靶核酸序列完全匹配，从而检测核酸序列是否存在于基因组样品中，
其中检测在提供杂交混合物后60分钟内完成，并且执行本方法不需要双链核酸的变性，也不需要双链核酸的PCR扩增。
此外还提供了检测基因组样品中核酸序列的方法，该方法包括：
提供含有单链或双链核酸的靶核酸序列的基因组样品；
提供含有探针核酸序列的探针；
提供含有基因组样品、探针、杂交促进试剂和标记物的杂交混合物；
将杂交混合物保温以提供含有靶核酸序列、探针和标记物复合物的保温混合物；
对保温混合物施加能够有效地从杂交混合物引发信号的能量；以及
从信号检测探针是否与靶核酸序列完全匹配，从而检测核酸序列是否存在于基因组样品中，
其中检测在提供杂交混合物后60分钟内完成，并且执行本方法不需要双链核酸的变性，也不需要双链核酸的PCR扩增。
此外还提供了实施本发明的方法的试剂盒。
附图简述
本发明将与下面的图一起进行描述，其中提到的相同号码对应于同样的图元，并且其中：
图1、2、3、4和5是荧光强度对保温时间的作图，显示了荧光强度随时间的增大和减小。
发明详述
我们以前已经公开了杂多聚链与双链体核酸的特异性结合以及双链体核酸和其它双链体核酸的特异性结合。我们的发现所提供的方法可以使天然发生的双链体中的碱基序列与第三条链中的碱基序列发生特异性反应，而同时在双链体中仍保持稳定的配对，这是以前没有被认识到的非常重要的事实。参见例如美国专利No.6,656,692和美国专利No.6,927,027。我们也公开了杂多聚核酸(和/或其类似物)可以通过同源碱基结合以及Watson-Crick碱基相互作用在彼此之间进行特异性结合，并且该碱基结合作用不限于彼此之间具有相对的反向平行方向性的链。参考文献同上。因此杂多聚杂多聚核酸(和/或其类似物)可以彼此之间平行或反向平行地特异性结合，其中碱基通过同源碱基结合和/或Watson-Crick碱基结合规则进行结合。我们关于核酸的结合基序优选性的发现同样也是以前没有认识到的，同样也非常重要。所有上述的特定复合物都可以容易地重复产生，已经在体外使用容易获得的仪器和试剂在温和和宽松的条件下被检测到。
我们以前已经公开了将探针与探针保温试剂预先保温和/或将靶与靶保温试剂预先保温，可以增加被检测的信号与背景信号(即干扰或背景噪音)的区别，这是通过：(a)增加完全匹配的靶和探针的结合亲和性或信号强度；和/或(b)减少误配的靶和探针的结合亲和性或信号强度。参见美国专利申请No.2004/0180345。
现在我们公开几个其它的参数，包括探针长度、探针浓度、靶浓度和标记物的浓度，这些参数的调整可以产生未被预料到的有益的效果。
因此，本发明提供了分析核酸结合的方法，其中为了获得有益的效果，对上述参数中的至少一个进行了调整。
此外，我们现在公开了能够在基因组靶例如人类dsDNA中不进行靶扩增就检测核苷酸多态性的方法。与任何其它我们所知道的方法不同，本发明的方法可以在非变性的温度下、在少于60分钟的时间内进行，优选少于15分钟。
本发明包括了新的核酸双链体、三链体和/或四链体复合物(和/或其类似物)的使用和/或形成。
核酸链具有内在的方向性。通常的知识坚持说具有相反方向性、即彼此方向反向平行的链可以通过它们相应碱基的Watson-Crick互补结合形成双链体。因此，作为两条反向平行的链只服从Watson-Crick碱基配对规则时才能结合在一起的探针和靶核酸序列被排除在本发明的某些实施方案之外。
另一方面，根据本发明，某些双链体含有彼此之间平行地杂交的两条核酸(和/或核酸类似物)链，其中特异性结合既可以通过同源碱基配对也可以通过Watson-Crick碱基配对。通常的知识坚持说这样的双链体不存在，或至少将是极其不稳定的，这是由于例如平行的碱基结合的构象需要所必需的骨架不规则性。
更令人吃惊的是我们发现在适当的杂交条件下，同源结合优选被YOYO-1促进并由其产生信号，这证实了足以与Watson-Crick互补反向平行双链体相匹敌的特异性和稳定性。
本发明也包括了含有两条彼此之间反向平行杂交的核酸(和/或核酸类似物)链的双链体，其中特异性结合通过同源碱基配对来进行。
本文中使用的术语“Watson-Crick碱基配对”、“互补碱基配对”等是为了定义相对的或邻近的核酸和/或核酸类似物链通过匹配的碱基(例如.A:T、G:C和/或A:U)形成的特异性关系。在本文描述的非典型复合物、包括平行的双链体、平行的和反向平行的三链体、平行的和反向平行的四链体中，术语“Watson-Crick碱基配对”和“互补碱基配对”是指在A和T、A和U和/或G和C之间的结合，但是不是必须采取由Watson和Crick首先描述的在边缘(edgewise)的平面的构象。除了首先由Watson和Crick提出的常规结合基序(“W-C基序”)以及被上述的Watson-Crick碱基配对所涵盖的其构象变异体之外，本发明还包含了通过同源碱基结合形成的复合物。在同源碱基结合中，碱基与相同的碱基而不是互补的碱基特异性结合。因此，在“同源基序”中，同源碱基配对包括A:A、G:G、C:C、T:T、U:U和T:U。
核酸链碱基的结合受许多因素的影响或调节，特别是遵循W-C基序或同源基序的链的结合电位以及离子条件(例如盐浓度和/或类型)。盐性条件倾向有利于Watson-Crick结合更甚于同源结合。在相同的缓冲条件下，同源基序四链体比W-C基序四链体更有利。
在本发明的复合物的每条链中可以含有任何核苷碱基和/或核苷碱基类似物的序列，只要核苷碱基与它们将要通过W-C基序或同源基序特异性结合的核苷碱基相关。与某些现有技术中的说法相反，为了完成结合，靶和探针不必需是同型多聚体，即使是在形成三链体或四链体的情况下。因此，在某些实施方案中，探针核苷碱基排列在含有散布的嘌呤和嘧啶的杂多聚探针序列中，而靶核苷碱基排列在与探针序列至少部分互补或部分同源的靶序列中。例如，探针序列可以含有任何顺序的25％到75％的嘌呤碱基和75％到25％的嘧啶碱基。本发明的复合物可以从杂多聚序列形成，它们正如此处定义的，意味着序列至少在它们的杂交区域内含有至少一个嘌呤核苷碱基或嘌呤类似物和至少一个嘧啶核苷碱基或嘧啶类似物。这样的杂多聚序列优选在缺少超过5个碱基长度的同源多聚片段。其它的核苷碱基也适合用于本发明，例如天然存在的碱基的合成类似物，只要它们与其它碱基具有特异的Watson-Crick和/或同源结合亲和性。
除了双链体之外，本发明的复合物也包括三链体和四链体，其中相对的杂多聚链通过Watson-Crick互补碱基或同源碱基连接，结合的序列的相对方向性彼此是平行的或反向平行的。
探针链可以特异性结合到双链靶的大沟或小沟中。此外，单链的探针的碱基可以与双链靶的一条或两条链的碱基发生特异性相互作用。相似地，双链探针每条链的碱基可以与本发明的四链体中双链靶的一条或两条链的碱基发生特异性相互作用。因此，在本发明的某些三链体实施方案中，探针的至少一个碱基通过Watson-Crick互补碱基相互作用和/或同源碱基相互作用与靶的至少一个碱基或碱基对结合，从而使复合物成为三链体，在本发明的某些四链体实施方案中，探针的至少一个碱基通过Watson-Crick互补碱基相互作用和/或同源碱基相互作用与靶的至少一个碱基或碱基对结合，从而使复合物成为四链体。
在某些三链体和四链体实施方案中，每个核苷碱基与一个或两个其它的核苷碱基结合。因此，除了上述的传统的双链体Watson-Crick碱基对和双链体同源碱基对之外，这样的实施方案包括下列的Watson-Crick碱基配对三联体：A:T:A、T:A:T、U:A:T、T:A:U、A:U:A、U:A:U、G:C:G和/或C:G:C(包括C+:G:C，和/或任何其它离子化类型的碱基)，和/或下列同源碱基三联体：A:A:T、T:T:A、U:U:A、T:U:A、A:A:U、U:T:A、G:G:C和/或C:C:G(包括C:C+:G，和/或任何其它离子化类型的碱基)。
因此，在探针被定义为通过Watson-Crick碱基配对相关联的第一个和第二个反向平行链的双链体、而靶被定义为具有相似结构的第三和第四条链形成的双链体的四链体实施方案中，除了：(a)第一和第二条链的相对碱基之间的结合；(b)第三和第四条链的相对碱基之间的结合；以及(c)第二和第四条链的相对碱基之间的结合之外，据信第一和第三条链的碱基也彼此结合。
在本发明的某些三链体和四链体结构的实施方案中，碱基结合序列与另一个碱基结合序列之间是不邻近的。也就是说至少有三条分离的链。尽管折叠的构象等(例如发夹转角等)也包含在本发明的范围内(具体来说但不限于RNA干扰的实施方案，其中发夹设计已经被发现有利于引起基于常规的Watson-Crick双链体结合RNA靶的干扰，参见Hemann等″An epi-allelic series of p53 hypomorphs created bystable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo.″(由稳定的RNAi产生的一系列上等位(epi-allelic)的p53亚等位基因在体内产生了独特的肿瘤表现型)Nat.Genet.2003 Mar；33(3)：396-400)，单链的折叠部分不能在计算链数时被计算超过一次，最少仍为三条分离的链。
本发明的复合物优选不依赖Hoogsteen结合(包括反向Hoogsteen结合)或G四分体来维持复合物的结构，尽管Hoogsteen结合(包括反向Hoogsteen结合)和/或G四分体可能存在。也就是说，本发明的复合物在优选情况下基本上不含Hoogsteen结合(包括反向Hoogsteen结合)和G四分体。
复合物的每条链独立地包含具有脱氧核糖磷酸或核糖磷酸骨架的核酸(例如DNA、RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA)，或含有核酸骨架或碱基类似物。优选的核酸类似物含有不带电荷或带有部分电荷的骨架(即不具有象天然的DNA骨架那么多负电荷的骨架)，包括例如PNA和LNA。某些实施方案不含PNA。为了增加稳定性，探针可以以磷酸三酯的形式提供，以抑制在使用过程中的降解。
与某些与PNA特别相关的复合物不同，本发明的三链体不依赖于链侵入机制。
复合物的至少一部分是分离的、纯化的、人工制造的或合成的。
在实施方案中，复合物的一部分是PCR扩增的产物。但是，本发明的优选实施方案不包含PCR扩增及其产物。
本发明的复合物可以存在于溶液中、固相支持物上、体外、体内或芯片中。固相支持物可以是导电的(例如电极)，也可以是不导电的。在某些实施方案中，固相支持物是银岛膜(silver island film)或其它能够利用荧光金属相互作用以增加灵敏度的材料，参见Asian等，Metal-enhanced fluorescence：an emerging tool in biotechnology.(金属增强的荧光：生物技术中正在兴起的工具)Current Opinion inBiotechnology 2005，16：55-62。此外，复合物在延伸后可以被光学作图或测序，参见Schwartz的美国专利Nos.6,147,198和5,720,928。
核酸间的特异性结合发生在广泛的不同条件下，这些条件中具有不同的温度、盐浓度、静电强度、缓冲液成分和核酸的相对摩尔浓度。这些条件和使用它们的方法的例子在现有技术中是已知的。
我们以前已经公开了在核酸分析等中特别适合于提供我们独一无二和特定的复合物的条件。参见例如美国专利No.6,656,692和美国专利No.6,927,027。我们现在对以前关于该条件的说明进行进一步的阐述。
与许多在pH水平高于大约7.6时不稳定或不存在的Hoogsteen类型的复合物不同，本发明的复合物在广阔的pH范围内稳定，优选从大约pH5到大约pH9。
正如在下面描述的实施例中显示的那样，我们意外地发现可以获得基因组靶材料操作的经济性而没有相称的对分析信号的牺牲。因此，能够在本发明的分析中减少基因组靶材料的量而不引起分析的特异性和/或灵敏度的成比例的降低，这是另人惊奇的。在某些情况下，减少基因组材料的量显示出增加了分析的特异性和/或灵敏度。同样地，在某些条件下，减少的杂交促进剂或标记物的量导致信号发射的增加。
不希望受到任何理论的束缚，我们对该现象有一个可能的解释。我们相信存在至少两个相反的限制因素控制了插入到复合物中的标记物的最适数量。复合物发射的荧光的强度随着其中插入的标记物的数量而增加。但是，每个复合物的标记物的数量受到可用于标记物的位点的数量的限制，并且可能更重要的是受到邻近的标记物之间的电荷相互排斥的限制。因此，如果标记物与复合物(或靶)的比率达到了饱和，在系统中加入更多的靶预计将会将比率降低到饱和点之下。那样的话，每个复合物将含有少于最大数量的标记物，使得每个复合物的荧光减少。每个复合物的荧光减少将导致荧光的总量减少(当每个复合物的荧光的减少超过荧光复合物的数量的增加时)，或荧光的增加低于复合物数量增加的比例(当荧光复合物的数量的增加超过每个复合物的荧光的减少时)。我们还相信双链体DNA在某种程度上屏蔽了插入到双链体小沟中的标记物之间的电荷排斥，并且在第三条链或双链体探针附近聚集的标记物为复合物中过高密度的标记物浓度提供了机会。并且，那些标记物由于相互邻近，当以供体：供体能量迁移模式照射时据信将相互作用。对于关于供体-供体能量转移系统的其它信息参见例如美国专利No 6,911,310。
我们也已经观察到某些标记物，例如嵌入剂YOYO-1，能够进行各种不同强度的发射，这依赖于它们所插入的复合物的结构。这可能是因为它们被水合作用所淬灭。三链结构在形成时，可能为插入的标记物提供了比嵌入剂存在于双链体中时存在的更强的脱水环境，上述环境是在嵌入剂接近第三条链而结合形成三链体之前。也可能被嵌入剂稳定的三链体的形成可以引起局部的DNA塌陷，这又引起了标记物更大的脱水作用以及从这些标记物发出的更大的发射。
基于前面对本发明的理解在本文中使用了下面的语言。
标记物的复合物饱和量是在固定的核酸浓度下，在荧光强度对标记物浓度的图中至少足够达到最大强度值的标记物浓度。
探针的靶饱和量是在杂交介质中至少足够结合所有靶的探针浓度。该理论值可以根据实验数据进行调整(例如，在含有固定靶浓度的杂交混合物中滴定探针)。在实际中，理论值可能与经验值不一致，这是由于探针的自身结合、与底物的非特异性结合等因素。本文中使用的“靶饱和量”的表述除非特别说明，是指凭经验获得的量。
探针的靶饱和量也可以被表示成探针与靶的比率。该比率优选为大约1∶1到大约1012∶1。
杂交混合物中的探针和标记物的绝对浓度一般根据混合物中被认为的靶浓度进行选择。本发明的分析是极其灵敏的，因此排除了对靶进行PCR扩增的需要。例如，对体积大约为80微升、含有大约19yoctomoles人类基因组靶和大约3.2pmoles探针的测试样品进行分析是可能的。本发明的实施方案具有足够的灵敏度，能够分析浓度为2.4×10-18M的人类基因组靶，优选情况下浓度不超过2.4×10-19M。本发明的实施方案的灵敏度足够使用浓度为4×10-7M的探针，，优选情况下浓度不超过4×10-8M。不言而喻，上述的值不是为了表明本方法不能检测更高或更低浓度的靶，或探针的浓度不可以更高或更低。
在特别优选实施方案中，未被扩增的基因组靶可以在它们的天然浓度下被检测。本发明的分析的灵敏度足够检测重量为4ng到75pg、其中含有约604个到11个核酸靶序列拷贝(在80μl杂交混合物中，浓度为1.3×10-17M到2.4×10-19M)的人类基因组样品中的单核苷酸多态性(SNPs)和/或多核苷酸多态性。因此，在某些实施方案中，如果在80μl的反应混合物中进行，可以对含有不到700个靶核酸序列拷贝的基因组样品进行分析，在优选情况下为大约150到大约300个靶核酸序列(在本文的后面有时被称为“靶”)拷贝。同相似地，在80μl的反应混合物中，我们检测到了5个球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)靶核酸拷贝中存在的特征序列。
为了达到这样的灵敏度不必需对靶进行部分或完全纯化。在优选实施方案中，从生物体或细胞获得生物学样品，通过裂解或消化或将至少一部分(更优选情况下基本上所有)非核酸类物质例如组蛋白等从DNA中除去，从样品中制备出基因组样品。适合用于本发明的基因组材料的来源包括但不限于真核生物、植物、动物、脊椎动物、鱼类、哺乳动物、人类、微生物和病毒。
此外，基因组样品中的基因组DNA可以通过多重置换扩增方法扩增，优选在Dean等的美国专利No.6,617,137 B2中公开的方法，其中变性条件被避免。
尽管某些现有的分析方法需要将基因组样品的DNA进行消化以便于接近靶核酸序列，本发明不需要将基因组DNA片段化成较小的序列就能直接检测构成完整的基因组的无穷小部分的靶核酸序列。因此，当基因组样品包含没有被分级或仅仅被部分分级的基因组靶时，本发明可以检测其中的靶核酸序列。在某些实施方案中，基因组样品含有完整基因组的至少1％、优选至少10％、更优选至少100％。在某些实施方案中，靶核酸序列可以在超过2kb长、优选超过5kb长的基因组序列中被检测。因此，含有靶核酸序列的基因组材料的长度不是分析的限制因素。在优选情况下，靶核酸序列存在于单链或双链的长度从8bp到3.3×109bp的基因组材料中。
在优选情况下，靶核酸序列的长度足够长，使得在样品中靶核酸序列是独一无二的(尽管在基因组中有大量不独特的较短的序列可以指向基因组的独特鉴定性质)。优选的靶核酸序列长度为8到200个碱基，更优选为15到30个碱基。靶核酸序列可以是未被扩增的基因组材料，也可以从基因组材料扩增或合成。靶核酸序列可以是被提取了基因组材料的生物体或细胞的全部或部分基因组，也可以属于存在(或以前存在)于生物体或细胞中的病原体。因此，本发明不仅适合于诊断遗传突变，也适合于检测感染宿主生物体或细胞的病原体的核酸。
本发明的分析也适合于检测非基因组的靶，例如cDNA，特别是出于筛选cDNA文库的目的。
分析可以使用一种或多种探针检测一种或多种靶的存在。对于检测单倍体来说，使用多种不同的探针检测多种不同的靶是特别有用的。
我们以前已经公开了探针优选为2到200个碱基长，更优选为5到30个碱基长，可以是单链的也可以是双链的。此后，我们意外地发现了可以调整探针的长度以增加检测的灵敏度和特异性的方法。例如，在实施例描述的系统中，25个单体和30个单体的探针的工作性能优于15个单体和20个单体的探针，当目的是检测SNP的存在时，具有25个单体的探针有时提供了最高的灵敏度和特异性。因此，形成三链体的探针当长度为25个单体时对SNP的检测具有最佳的特异性，这与形成双链体的探针在较短时而不是较长时对SNP的检测具有最适的特异性不同。
不希望受到任何理论的束缚，我们为这种现象提供了一个可能的解释。假设例如标记物能够结合在探针-靶复合物的小沟内被11个碱基隔开的位点上，我们将预计25个单体长的探针-靶复合物在每个复合物上含有两个结合小沟的标记物，而预计15个单体长的探针-靶复合物在每个复合物上只含有一个结合小沟的标记物。这可以解释为什么25个单体长的探针比15个单体长的探针工作性能优越。30个单体长的探针-靶复合物预计将含有与25个单体长的探针-靶复合物相同的结合小沟标记物的数量(两个标记物)，但是30个单体长的探针对核苷酸多态性不如25个单体长的探针灵敏性高，这是因为荧光强度与结合亲和性相关，而，碱基的误配将对25个单体长的探针产生比对30个单体长的探针的更强的去稳定作用。
另一种可能的理论假设标记物的互相排斥作为距离的第一个函数(F1)，而标记物能够增强邻近的标记物的荧光(例如通过FRET荧光共振能量转移或通过DDEM供体：供体能量迁移)作为距离的第二个函数(F2)，其中F1与F2负相关。可能存在带电荷的标记物的浓度或浓度范围允许探针-靶复合物的最大嵌入和最大的FRET类型的发射或DDEM。可能在靶中添加探针能够为标记物提供额外的嵌入位点，但是这种位点的数量和位置受到标记物之间的相互排斥的限制。因此，小于某个长度的探针(我们预计该长度将在某种程度上根据探针、靶、标记物和环境的性质而变化)可能不能为邻近标记物的相互排斥的电荷提供足够的屏蔽，和/或可能不能为小沟中或嵌入到靶的碱基之间的标记物之间的FRET类型的或DDEM相互作用提供有利的位点。
例如，假设在整个双链靶中每20个碱基可以嵌入标记物，并且这些标记物之间的距离太大而不能支持FRET类型的或DDEM相互作用。如果在靶的这种嵌入的标记物和与探针相连的标记物(例如通过结合到小沟中、嵌入到探针和靶的碱基之间等)之间不发生FRET类型的或DDEM相互作用，与探针相连的标记物和与靶相连的标记物的排列对于较长的探针来说将更加可能。具有足够长度的探针链可以允许足够数量的标记物进入这种彼此紧密邻近的区域，使得标记物之间的能量转移或能量迁移能够增强来自探针：靶复合物的发射，从而改进检测。
因此，本发明的探针优选为长度为15到30个碱基的单链核酸，其中信号与背景信号之间的区别通过靶内嵌入的标记物和探针-靶之间嵌入的标记物之间的能量转移或能量迁移得到最大化。在更优选情况下，探针具有最适合能量转移或能量迁移的长度。优选情况下，长度大于15个碱基。更优选情况下，探针长度为20-30个碱基。
适合用于本发明的分析的探针包括例如ssDNA、RNA、ssPNA、LNA、dsDNA、dsRNA、DNA:RNA杂交体、dsPNA、PNA:DNA杂交体以及其它单链或双链的核酸和核酸类似物，它们全部或部分含有不带电荷的、带有部分电荷的糖-磷酸骨架和/或肽骨架，或者全部或部分含有碱基类似物。在某些实施方案中，探针的长度可以被选择以匹配靶的长度。
在优选情况下，本发明的探针可以安全使用和稳定多年。因此，探针可以大量制造或订购并储存。
在本发明的某些实施方案中，除了目的在于结合靶核酸序列的探针之外，还可以使用阻断探针。参见例如美国专利No.6,110,676。
在存在杂交促进试剂(HPA)的情况下进行探针和靶的杂交。HPAs通常是已经被发现能够增加用其进行的分析的特异性和/或灵敏性的离子。我们也发现HPAs能够用于时间长的分析，以稳定从含有探针和标记物的对照样品发射出的荧光的强度。适合的HPAs包括但不限于(CH3)4NCl阳离子、(CH3)3N·HCl、NaCl、Na2SO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4。优选的HPAs包括在Fresco等的美国专利No.6,783,932 B2中公开的制造水结构的物质(即水结构制造者(kosmotropes)或水结构制造试剂(kosmotropic agents))。
在反应混合物中使用一种或多种HPAs的好处以及在任何选定的分析条件下使用的最佳浓度可以根据本公开的指导通过实验确定。选定的HPAs的优选浓度包括但不限于如下：50到80mM的NaCl，10到60mM的Na2SO4，50mM的Na2HPO4，125到250mM的(NH4)2SO4，30mM的三甲基铵盐酸盐(或盐酸三甲胺)，30到52.5mM的四甲基铵盐酸盐(TMA-Cl)，每种分别加入，或50mM TMA-Cl与10到20mMNaCl相组合。Fresco等的美国专利No.6,783,932 B2中介绍了使用更高浓度的水结构制造者以稳定基于多聚嘌呤序列的三链体。尽管这种较高的浓度也在本发明的范围内，它们对于稳定本发明的特异的杂多聚三链体和四链体并不是必需的。
在某些实施方案中，HPA也是荧光标记物。在这样的实施方案中，可以选择使用非HPA的标记物和附加的HPA标记物。也可以选择HPA-标记物之外的HPAs。HPA标记物优选为嵌入标记物，更优选为二聚体花青染料，更优选为YOYO-1。
本发明的标记物(无论其功能是只作为标记物、只作为HPAs、还是同时作为HPAs和标记物)优选为嵌入式的荧光团。优选的标记物是从包含下列物质的组中选择的成员：YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花青素二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花青素单体、溴化乙锭、乙锭二同聚体-1、乙锭二同聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭-吖啶杂二聚体、单叠氮乙锭、碘化丙啶、SYTO染料、SYBR Green 1、SYBR染料、Pico Green、SYTOX染料和7-氨基放线菌素D。更优选情况下，标记物是花青染料或花青染料的同二聚体或杂二聚体，它们在与核酸结合时可以发出增强的荧光，例如在美国专利Nos.4,883,867(Lee)、5,582,977(Yue等)、5,321,130(Yue等)和5,410,030(Yue等)中描述的那些，包括来自Molecular Probes公司(Eugene，OR)的商标名为TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO的可以购买到的核酸染料。其中，YOYO-1(在本文中有时称为“YOYO”)是最优选的。
非嵌入式的标记物也适合用于本发明。这样的标记物的优选的例子包括生物素、若丹明、荧光素、以及其它的标记物或标记物对，当用激发能量照射时将荧光或没有荧光来表示它们是否被结合到靶/探针复合物。
本发明还包含了发射出非荧光信号的标记物的使用。这样的标记物包括发冷光的试剂、可检测到散射光的微粒(参见例如Yguerabide等的美国专利No.6,214,560)、磁性标记物(参见例如Chemla等的″Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay.″(用于同源免疫分析的超高灵敏度磁性生物传感器)Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.vol.97，14268-14272(2000))等。在某些实施方案中，标记物是在Yamamoto等的美国专利No.5,939,256中公开的那些，它们通过与复合物自身进行反应或相互作用引起可检测的变化，或在存在大量螺旋结构的情况下相互作用从而产生可检测的变化。在某些实施方案中，标记物是双组分探针的氧化还原组(例如氧化还原对)，象在Coull等的美国专利No.6,361,942 B1中公开的那些。在某些实施方案中，标记物是量子点。
本发明的范围内还包含了适合于荧光各向异性检测方法的标记物，例如在Walker等的美国专利No.5,593,867中公开的那些。
在某些实施方案中不需要标记物，例如，杂交可以通过将杂交复合物拉过纳米孔、施加电场并检测纳米孔的电流变化来检测，象在Akeson等的美国专利申请No.2003/0099951 A1中公开的那样。
也可能可以通过检测相似复合物的熔点曲线之间的区别来确定复合物是否相同。参见例如Lipsky等的美国专利申请No.2003/0157507A1。在这种实施方案中，小沟结合剂也可以用于拉近(level)探针的熔点温度，以便它们表现出可比较的靶结合亲和性和用于变性分析的可比较的变性曲线。参见Dempcy等的美国专利No.，6,683,173 B2。
标记物、探针、靶和HPA被合并以提供杂交混合物，其中还包含任何其它的成分，例如水、至少一种缓冲液等。向杂交混合物中加入成分的次序不是关键，但是如果加入反应混合物的次序被改变并同时监测和比较标记物的发射情况，就可以获得关于靶的重要信息。例如，HPA(和/或HPA标记物)可以加入到已经含有需要被稳定的复合物的溶液中，也可以随着一条或多条链一起加入。此外，杂交混合物的成分可以采取分离的化合物的形式或各单个成分的复合物的形式。这样的复合物的例子包括例如HPA、HPA-标记物和/或与探针和/或靶共价结合或嵌入其中的标记物。在某些实施方案中，制剂可以是在Reed等的美国专利申请No.2004/0081959 A9中公开的那种类型的“寡聚核苷酸-淬灭剂-荧光染料结合物”。这样的实施方案还可以包括Reed等的小沟结合剂(MGBs)。Reed等的MGBs也适合于作为杂交混合物的离散的成分加入，预计将有利于多聚物的形成而不增加来自非特异性荧光的背景噪音。也参见Hegpeth等的美国专利申请No.2004/0058322A1。
在某些实施方案中向杂交混合物中加入成分的次序可能是重要的。然而，我们尚未发现添加的次序必定如此重要以至于在任何特定的添加次序下使本方法无法执行。但是，我们发现改变添加的次序可以鉴定出优选的添加次序，相对与优选性低的添加次序它能够产生改进的结果。例如，我们意外地发现在杂交混合物中最后加入靶核酸序列(例如包含在基因组样品中的)可以导致增强的特异性和灵敏度。考虑到对于某些其它的实施方案来说在杂交混合物中最后加入标记物是更加优选的，这种情况特别令人吃惊。
当某些或所有的成分按照我们在以前的美国专利申请No.2003/0170659中公开的方法进行电学预处理时，添加的次序也可能是重要的。例如，在将探针与其它成分合并以形成杂交混合物之前，缓冲溶液可以先进行电学预处理。电学预处理可以增强分析的灵敏度和/或特异性。
可以将杂交混合物保温一段时间以允许杂交发生。保温在少于60分钟的一段时间内进行，优选少于15分钟，更优选不超过10分钟，更优选大约5分钟或以下，最优选1分钟或以下。保温优选在非变性温度下进行，更优选在20-40℃的温度范围内进行。当使用在本文中时，术语“非变性温度”是指不足以变性双链靶核酸序列的温度，明确地说包含了高达至少40℃的温度。足够变性靶的温度不是优选的，因为它们使该方法增加了成本、延迟和不必需的复杂性。
如果杂交混合物含有荧光团，在优选情况下杂交混合物在保温后用位于或接近标记物的最大激发波长的相干光进行照射，并检测荧光。对于YOYO(即YOYO-1)来说，优选的激发波长为488nm。已经发现用于照射测试样品的光的能量密度是重要的，当标记物是YOYO-1时优选被设置为发射大约84W/cm2/sec的射线。过分高的能量密度，不论是来自激光还是明亮的灯光光源，不仅会破坏分析，而且会损坏试剂，使得随后使用能量适当的照射也不能进行分析。这是因为YOYO-1如果被合适地刺激可以作为光切割剂。由能够产生脉冲的或连续的亮光的“灯光”光源例如氙灯供能的仪器，即使随后进行滤光，也不适合于进行使用YOYO-1的分析，并且通常会产生难以理解的结果。过滤的“灯光”不等价于激光激发。功率非常低的光电二极管，例如由4节AAA电池供电的存在于Turner Design的“TD”Picofluor仪器中的光电二极管，可用于执行测量YOYO-1荧光发射的分析。
一个或多个不同光源可以被用来照射标记物。当使用具有不同激发特征的标记物时，用多束不同波长的光照射标记物是特别有用的。例如，488nm的激光被用于激发定向检测一个靶序列的YOYO-1标记物，而另一个波长的激光被用于激发另一种存在的标记物。
在可选的实施方案中，分析的特异性可以通过消化杂交介质中的任何双链体来改善，否则这些双链体可能产生非特异性的信号。三链体中的双链体靶受到保护不被消化，正如在Ramberg的美国专利No.6,458,540 B1中所显示的那样。在Tolun等的″A real-tjme DNase assay(ReDA)based on PicoGreen fluorescence.″(基于PicoGreen荧光素的实时DNA酶分析(ReDA)Nucleic Acids Res.2003 Sep.15；31(18)：elll中显示了双链体中的嵌入剂不一定使消化停止，但是三链体DNA的嵌入和稳定化作用可以阻止消化。
在本发明的某些实施方案中，在检测从杂交介质发射的信号之前先进行分离的步骤。该步骤将未结合的探针与靶-探针复合物分离开来。优选情况下，分离步骤包括使用美国专利No.5,599,667中阐述的多聚阳离子固相支持物。
在照射一次或多次后，杂交混合物的标记物发射可以被监测一次或多次。测量的信号在优选情况下是从杂交混合物发射出的荧光强度。在这样的实施方案中，探针和靶的结合亲和性可以与强度正相关或负相关，这取决于标记物是通过信号淬灭还是信号发射来指示杂交的。因此，由嵌入试剂产生的荧光强度与探针-靶的结合亲和性正相关，但是使用与探针共价结合的非嵌入的荧光团的实施方案的荧光强度可能与探针-靶的结合亲和性反相关。在某些实施方案中，荧光强度随着探针和靶之间的匹配程度而增加(或对于非嵌入剂来说减少)，优选在包含0-2个误配和/或缺失的范围内，更优选在包含0-3个误配和/或缺失的范围内。
本发明的实施方案包括根据参比信号校正测量的信号，以确定探针是否与靶核酸序列完全配对。可以产生校正曲线，其中测量到的信号的强度(例如荧光强度)是靶核酸序列与探针之间的结合亲和性的函数。因为靶核酸序列和探针之间的结合亲和性随着杂交复合物中误配碱基的数量、误配的本质(A-G、A-C、T-G、T-C等)、误配的位置等而变化，本发明的方法可以用来检测探针和靶核酸序列是完全配对的还是误配的，从而最终确定靶核酸序列的序列。
发射的信号可以被即时地连续收集并作为时间的函数进行评估。例如，可以监测荧光信号随着时间的变化以更好地确定在含有嵌入标记物的杂交混合物中探针是否与靶核酸序列完全配对，其中荧光信号随着时间的增加(“上涨”)表明完全配对，荧光信号随着时间的减小(“下落”)表明缺少完全配对。同样地，含有非嵌入的标记物的杂交混合物产生的信号的上涨或下落分别表明不完全配对和完全配对。尽管在某些情况下缺少完全配对的混合物的信号强度不随时间减小，仍然可能通过误配混合物发射的信号的变化速度比配对混合物的低、或通过误配混合物发射的信号显示出明显的不连续变化和衰退来区分完全配对和误配。
本发明包含了前述的一种或多种信号测量和数据分析规程的使用。使用一种以上的规程可以增加分析的可靠性。其它的分析参数(例如添加杂交混合物的次序、探针的长度等)也可以被改变，以检查多种规程的一致性并增加分析的可靠性。
荧光信号的检测优选在提供杂交混合物后60分钟内完成，更优选在15分钟内，更优选在10分钟内，更优选在大约5分钟内。在非变性温度下，整个方法优选在少于60分钟内进行，更优选少于15分钟，更优选少于10分钟，更优选少于大约5分钟或以下。
本发明的可靠性不依赖于探针或靶中的鸟嘌呤和胞嘧啶含量。在常规的W-C基序中，因为G:C碱基对形成3个氢键，而A:T碱基对只形成两个氢键，具有较高G或C含量的靶和探针序列更加稳定，拥有更高的熔点温度。因此，与完全配对的杂交体相比，增加了杂交的探针和靶区域中的GC含量的碱基对的误配可以抵消与误配探针相关的结合力的减弱。
本发明的方法可以以空前的速度和可靠性用于检测遗传突变，包括SNPs。核酸序列重复、插入和/或缺失也可以被检测。本方法还可用于检测从其中获得基因组样品的生物体或细胞的形态学状态。形态学状态优选包括与(a)发育阶段、(b)高级结构、(c)结合事件和/或(d)疾病状态相关的信息。
本方法可以在生物细胞内进行。
除了上述的方法之外本发明还包含了用于实现这些方法的试剂盒。试剂盒优选包含：用于收集基因组样品的样品收集装置、探针、杂交促进试剂和标记物。
适合的样品收集装置包括但不限于注射器、杯、管状瓶、海绵、拭子、棒状物、毛细管、吸附纸、膜、薄膜、微孔、柱、珠子、芯片等。优选情况下，样品收集装置适合于收集组织、口腔细胞、血液、流体、痰、尿液和/或粪便。
在某些实施方案中，在样品中加入分子识别标签以提供标记生物样品的试剂盒和方法，用于追踪其历史并提供明确的检查跟踪系统。标签是至少一个能够被检测的分子。优选情况下，标签是核酸或核酸类似物序列，它已经被功能化而带有至少一个可检测的标记物(优选为旋转标记物或量子点)，也可以任选带有至少一种交联试剂。用在方法和试剂盒中的样品收集装置优选包括标签(例如交联到支持物表面上)，带有条形码或其它的用于识别哪个标签独特对应于样品的装置。参见例如美国专利No.6,153,389，其中公开了用于基于PCR的分析的识别标签。
在某些实施方案中，探针被提供在支持物上，支持物选自珠子、平板、膜、薄膜、微孔、电极、柱子或毛细管。
试剂盒中的探针、标记物和HPAs与方法中的基本相同。
参考下面的实施例将对本发明进行更详细的说明，但是应该理解本发明不被视为仅限于此。
实施例
实施例1
在本实施例中，我们比较了使用15个单体或25个单体的单链寡聚核苷酸探针分析双链体扩增子靶时发射出的三链体分析信号。从人类血液样品中使用QIAamp DNA血液纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，Canada)按照制造商的说明书提取基因组dsDNA。通过PCR扩增了对应于囊性纤维变性基因的临床重要的外显子区域10[Genomics 10，214-228(1991)]的491bp的dsDNA片段(SEQ ID No：1)。在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成了20个单体的上游引物和20个单体的下游引物，柱纯化并溶解在双蒸水中。20个单体的上游引物的序列为5′-GCA GAG TAC CTG AAA CAGGA-3′(SEQ ID NO：2)。20个单体的下游引物的序列为5′-CAT TCA CAGTAG CTT ACC CA-3′(SEQ ID NO：3)。将每种引物100pmole与1μg基因组dsDNA使用Taq PCR Master混合试剂盒(QIAGEN，Mississauga，Canada)在100μl PCR反应混合物中混合。使用下面的PCR循环参数：94℃×5min进行一个循环，(93℃×30sec，48℃×30sec，72℃×45sec)进行25个循环，72℃×7min进行1个循环。PCR片段的大小通过凝胶电泳证实。未进行样品的纯化以除去痕量的残余引物或基因组DNA。通过紫外分光光度法测定PCR扩增的491bp的dsDNA靶以及残留的引物和基因组DNA的浓度，制备1pmol/μl的储存溶液。
在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成了从人类囊性纤维变性基因的外显子10衍生的15个单体或25个单体的反义ssDNA探针序列，柱纯化并溶解在双蒸水中，浓度为1pmol/μl。
探针CF01-15(SEQ ID NO：4)是15个单体长的ssDNA探针，被设计为与野生型PCR扩增的491bp的dsDNA靶(SEQ ID NO：1)的正义链的15个核苷酸的片段完全互补，覆盖了505到510位的氨基酸[Genomics 10，214-228(1991)]。
探针CF01-15(SEQ ID NO：4)的序列为5′-CAC CAA AGA TGATAT-3′。
探针CF10-15和CF09-15是除了一个碱基突变之外(下划线)，与野生型探针CF01-15的序列完全相同的15个单体长的突变ssDNA探针。
探针CF10-15(SEQ ID NO：5)的序列是5′-CAC CAA AGACGATAT-3′。
探针CF09-15(SEQ ID NO：6)的序列是5′-CAC CAG AGA TGATAT-3′。
探针CF01-25(SEQ ID NO：7)是25个单体长的ssDNA探针，被设计为与野生型PCR扩增的491bp的dsDNA靶(SEQ ID NO：1)的正义链的25个核苷酸的片段完全互补，覆盖了504到512位的氨基酸[Genomics 10，214-228(1991)]。
探针CF01-25(SEQ ID NO：7)的序列是5′-TAG GAA ACA CCAAAG ATG ATA TTT T-3′。
探针CF 10-25和CF09-25是除了一个碱基突变之外(下划线)，与野生型探针CF01-25的序列完全相同的25个单体长的突变ssDNA探针。
探针CF10-25(SEQ ID NO：8)的序列是5′-TAG GAA ACA CCAAAG ACG ATA TTT T-3′.
探针CF09-25(SEQ ID NO：9)的序列是5′-TAG GAA ACA CCACAG ATG ATA TTT T-3′。
用荧光嵌入剂例如YOYO-1产生信号的三链体分析使用几种激光器的激发照射来进行，包括Melles Griot公司的型号为532-AP的50mW氩离子激光器、Ion Laser Technology公司的型号为5490 ACM-00的25mW氩离子激光、型号为Sapphire 488-20 OEM的20mW的相干固态激光器、含有型号为35-IMA-415-120的Melles Griot公司的15mW氩离子激光器的Genexus分析仪，以及含有型号为Sapphire 488-20OEM的20mW的相干固态激光器的Genexus分析仪。所有这些激光器被设置为发射波长为488nm的射线，强度在80-84W/cm2/sec之间。
反应混合物(80μl)含有：0.05pmoles的PCR扩增的491bp dsDNA靶，1.25pmoles的15个单体或25个单体长的ssDNA探针，0.5×TBE和150nM DNA嵌入剂YOYO-1(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)。除非特别说明，在此处和所有其它实施例中提到的反应混合物的终体积都是80μl，并在室温(RT)保温。在室温(24℃)保温5分钟后，将反应混合物放入Corning的无结合表面384孔板(黑色，底部透明)，用Genexus分析仪的15mW氩离子激光器在波长488nm处照射。从每个孔的底部用10mW的激光光线照射样品。照射发生在60微米的取样间隔，被设置为20赫兹、32％的PMT和10A/V的灵敏度。监测荧光发射，并在继续保温10分钟之后再一次照射。除非特别说明，在所有随后的实施例中都使用Genexus分析仪。
当ssDNA探针与YOYO-1保温作为对照时，与和YOYO-1保温的dsDNA靶对照相比，产生了相对高水平的荧光。在每个对照中，使用的YOYO-1的量与相关的反应混合物中使用的量相同。来自ssDNA探针对照的高水平的荧光是被YOYO-1稳定和产生信号的复合物形成的结果。25个单体长的探针对照产生出比15个单体长的探针对照高得多的荧光水平(表1)。
在存在150nM YOYO-1的情况下形成的由491bp的dsDNA(SEQID NO：1)和15个单体长的探针CF01-15构成的完全配对的DNA三链体(样品4)在保温5分钟和15分钟后都产生了非常强的荧光发射(表1)。从有一个碱基对A-C误配的dsDNA:ssDNA的15个单体长的三链体(491bp dsDNA+探针CF10-15)(样品6)在保温5分钟和15分钟后产生的发射，与完全配对的15单体长的三链体(样品4)产生的发射相比，在校正了ssDNA探针对照发射的变化之后，分别减少了96.2％和95.4％。从有一个碱基对T-C误配的dsDNA:ssDNA的15个单体长的三链体(491bp dsDNA+探针CF09-15)(样品8)在保温5分钟和15分钟后产生的发射，与完全配对的15单体长的三链体(样品4)产生的发射相比，在校正了ssDNA探针对照发射的变化之后，分别减少了98.2％和98.8％。
在存在150nM YOYO-1的情况下形成的由491bp的dsDNA(SEQID NO：1)和探针CF01-25构成的完全配对的25个单体长的DNA三链体(样品10)在保温5分钟和15分钟后都产生了非常强的荧光发射(表1)。dsDNA靶与匹配的25个单体长的ssDNA探针的复合与dsDNA靶与匹配的15个单体长的ssDNA探针的结合相比，产生了极大增加的发射。因此，使用25个单体长的探针比使用15个单体长的探针产生对双链体靶的更灵敏的三链体分析。含有一个碱基对A-C误配(491bpdsDNA+探针CFl0-25)(样品12)和一个碱基对T-C误配(491bpdsDNA+探针CF09-25)(样品14)的不完全互补的探针和靶复合物，与完全配对的25单体长的三链体(样品10)观察到的发射相比，在校正了ssDNA探针对照发射的变化之后，在保温5分钟后分别减少了98.0％或100％，在保温15分钟后分别减少了98.5％或100％(表1)。这些数据支持了一个令人吃惊的结论，即在检测双链体靶中的SNPs时，25个单体长的探针比15个单体长的探针的特异性更高。在25个碱基的三链体中1个碱基对的误配可能比15个碱基的三链体中1个碱基对的误配更加不稳定，这是重要的、意外的和非常有用的。为了进一步描绘这种与直觉相反的事实，我们比较了在上述条件下用双链体靶和15、20、25、27、30或35个单体的寡聚探针形成的完全配对的三链体。通过实验我们确定了25个单体长的探针在反应条件下是最特异的。因此，较长的形成三链体的探针可能比较短的形成三链体的探针更加特异。
当25个单体的探针在存在YOYO-1的情况下与双链体靶复合而形成误配的三链体时，产生的发射可能会低于探针对照的发射(对照样品13和14)(表1)。这种结果可以发生是因为尽管YOYO-1可能有利于探针的自身结合从而在照射时产生发射，这种自身结合和与YOYO-1的复合显然在双链体靶的引入被分散，并且不足以抵消YOYO-1嵌入到双链体靶的小沟和任何形成的误配三链体产生的新的沟中所引起的荧光的增加。从误配三链体产生的发射的分析，它比相关的探针对照的发射更小，这提供了溶液SNP分析中非常适合需要的均匀的特征。在这种情况下，本方法为基因组dsDNA靶中存在的SNPs产生了二元分析信号。
实施例2
本实施例比较了当15个单体或25个单体长的dsDNA探针在加入到反应混合物中之前已经与YOYO-1在不同温度下预先保温时发射出的四链体分析信号。
从互补的正义和反义的15个单体或25个单体的序列产生双链体探针被，它们从人类囊性纤维变性基因的外显子10衍生，在DNA合成仪上合成，柱纯化然后溶解在双蒸水中，浓度为1pmol/μl。将等摩尔量的互补的寡聚核苷酸在95℃加热10分钟，然后在存在10mMTris(pH 7.5)、1mM EDTA和100mM NaCl的情况下逐渐退火，直到在1.5小时内将温度冷却到21℃。将dsDNA寡聚物溶解在双蒸水中，浓度为1pmol/μl。
双链探针CF01-15(SEQ ID NO：10)含有15个单体长的dsDNA探针，被设计为与野生型PCR扩增的491bp的dsDNA靶(SEQ ID NO：1)的15个核苷酸的片段同源，覆盖了505到510位的氨基酸[Genomics 10，214-228(1991)]。
双链探针CF01-15(SEQ ID NO：10)的正义链的序列是5′-ATATCA TCT TTG GTG-3′。
双链探针CF10-15和双链探针CF09-15是除了一个碱基对突变之外(下划线)，与野生型双链探针CF01-15的序列完全相同的15个单体长的突变的dsDNA探针。
双链探针CF10-15的正义链的序列(SEQ ID NO：11)是5′-ATATCG TCT TTG GTG-3′。
双链探针CF09-15的正义链的序列(SEQ ID NO：12)是5′-ATATCA TCT GTG GTG-3′。
双链探针CF01-25(SEQ ID NO：13)25个单体长的dsDNA探针，被设计为与野生型PCR扩增的491bp的dsDNA靶(SEQ ID NO：1)的25个核苷酸的片段同源，覆盖了504到512位的氨基酸[Genomics 10，214-228(1991)]。
双链探针CF01-25(SEQ ID NO：13)的正义链的序列是5′-AAAATA TCA TCT TTG GTG TTT CCT A-3′。
双链探针CF10-25和双链探针CF09-25是除了一个碱基对突变之外(下划线)，与野生型双链探针CF01-25的序列完全相同的25个单体长的突变的dsDNA探针。
双链探针CF10-25的正义链的序列(SEQ ID NO：14)是5′-AAAATA TCG TCT TTG GTG TTT CCT A-3′。
双链探针CF09-25的正义链的序列(SEQ ID NO：15)是5′-AAAATA TCA TCT GTG GTG TTT CCT A-3′。
我们以前已经在例如美国专利No.6,656,692和美国专利申请No.2003/0113716中公开了与双链体靶同源的双链体探针将与这样的双链体靶特异地和可检测地结合。如果在复合物中邻近的碱基间存在Watson Crick对应关系，双链体探针和双链体靶也可以特异地和可检测地结合。然而，这种“嵌套互补性”结合发生的可能性不会超过同源四链体结合。
将1.25pmoles野生型或突变的dsDNA探针在0.5×TBE缓冲液中与30nM YOYO-1在室温(24℃)或30℃(在加热板上)预先保温1小时，然后加入0.05pmoles PCR扩增的491bp的dsDNA靶(SEQ IDNO：1)和70nM YOYO-1。然后将80μl的反应混合物在室温或30℃下保温5分钟，放置在石英比色杯中，用波长为488nm的相干固态激光器进行照射，并立刻监测荧光的发射。激光器的照射时间是70毫秒，发射出80W/cm2的射线。发射出的光被Ocean Optics CCD收集，并用Ocean Optics软件记录存档。
将dsDNA探针与30nM YOYO-1在30℃预先保温1小时，极大地降低了每个dsDNA探针对照的发射强度。当将上述预先保温的探针加入到反应混合物中时，最高的发射强度由含有完全配对的平行的同源双链体(491bp dsDNA+双链探针CF01-15和491bp dsDNA+双链探针CF01-25)的dsDNA:dsDNA四链体产生。此外，将反应混合物在30℃保温与将同样的复合物在室温保温相比，导致含有配对的15个单体或25个单体长的同源四链体的样品的发射增强。当在反应中使用25个单体长的dsDNA探针并在30℃下保温时，完全配对的同源四链体发射的增加最明显(数据未显示)。因此，YOYO-1促进和产生信号的SNP分析的灵敏度和特异性可以通过在加入到反应混合物中之前将探针预先保温来增加，也可以通过将反应混合物在高于室温的非变性温度下保温来增加。
产生一个碱基对A-C误配的复合物(491bp dsDNA+双链探针CF10-15)或一个碱基对T-C误配的复合物(491bp dsDNA+双链探针CF09-15)的不完全同源的探针和靶组合，在室温保温5分钟后，与完全配对的平行的同源四链体在室温保温后发射的荧光强度相比，导致与四链体相关的荧光发射强度分别低61.3％或67.8％。一个碱基对A-C误配的四链体(491bp dsDNA+双链探针CF10-25)或一个碱基对T-C误配的四链体(491bp dsDNA+双链探针CF09-25)，在室温保温5分钟后，与完全配对的四链体在室温保温后发射的荧光强度相比，产生的与四链体相关的荧光发射强度都降低了100％。当dsDNA靶与同源的25个单体长的dsDNA探针复合时，与dsDNA靶与同源的15个单体长的dsDNA探针复合时相比，观察到了更高的特异性。因此，较长的双链体探针可能比较短的双链体探针更加特异。对于SNP分析来说，25个单体长的双链体探针是优选的。
与15个单体长的探针(491bp dsDNA+双链探针CF10-15)或25个单体长的探针(491bp dsDNA+双链探针CF10-25)形成的一个碱基对A-C误配的dsDNA:dsDNA四链体发射的与四链体相关的荧光强度，在30℃保温5分钟后，与完全配对的四链体在30℃保温后发射的荧光强度相比，分别低41.5％和85.2％。与15个单体长的探针(491bp dsDNA+双链探针CF09-15)或25个单体长的探针(491bp dsDNA+双链探针CF09-25)形成的一个碱基对T-C误配的dsDNA:dsDNA四链体发射的与四链体相关的荧光强度，在30℃保温5分钟后，与完全配对的四链体在30℃保温后发射的荧光强度相比，都降低了100％。
在四链体在30℃下形成之前将25个单体长的dsDNA探针与30nM YOYO-1在30℃预先保温1小时，与将25个单体长的双链体探针与30nM YOYO-1在室温预先保温1小时或将15个单体长的dsDNA探针与30nM YOYO-1在30℃预先保温1小时后相比，获得了更高的灵敏度和特异性。当反应混合物在30℃下而不是室温下保温时，对于用15个单体长的dsDNA探针或25个单体长的dsDNA探针形成的完全配对的四链体，都观察到了明显的YOYO-1发射强度的增加。当使用25个单体长的dsDNA平行同源探针时，这种增加最显著。因此，双链的25个单体长的探针可能比双链的15个单体长的探针更加灵敏和特异。
实施例3
本实施例描述了纯化的人类基因组靶与15个单体、20个单体、25个单体或30个单体长的ssDNA探针在存在YOYO-1的情况下在室温发生反应形成的三链体。
从血液样品中使用QIAamp DNA血液纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，Canada)按照制造商的说明书提取人类基因组dsDNA。基因组dsDNA的浓度通过紫外分光光度计测定。
具有从人类囊性纤维变性(CFTR)基因的外显子10衍生的序列的反义的15个单体、20个单体或25个单体长的ssDNA探针在DNA合成仪上合成，柱纯化并溶解在双蒸水中，浓度为1pmole/μl。
探针Delta F508-WT15C(SEQ ID NO：4)是与探针CF01-15具有同样序列的15个单体长的野生型ssDNA探针。
探针Delta F508-MUT15C(SEQ ID NO：16)是15个单体长的突变的ssDNA探针，被设计成与人类囊性纤维变性基因的外显子10的正义链的15个核苷酸的片段互补，只是缺失了三个连续的碱基，位于507和508位氨基酸位置上的野生型反义序列AAG被缺失了。
探针Delta F508-MUT15C(SEQ ID NO：16)的序列是5′-AAC ACCAAT GAT ATT-3′。
探针Delta F508-WT20C(SEQ ID NO：17)是20个单体长的野生型ssDNA探针，被设计成与人类囊性纤维变性基因的外显子10的正义链的20个核苷酸的片段互补，覆盖了506到512位的氨基酸。
探针Delta F508-WT20C(SEQ ID NO：17)的序列是5′-TAG GAAACA CCA AAG ATG AT-3′。
探针Delta F508-MUT20C(SEQ ID NO：18)是20个单体长的突变的ssDNA探针，被设计成与人类囊性纤维变性基因的外显子10的正义链的20个核苷酸的片段互补，只是缺失了三个连续的碱基，位于507和508位氨基酸位置上的野生型反义序列AAG被缺失了。
探针Delta F508-MUT20C(SEQ ID NO：18)的序列是5′-ATA GGAAAC ACC AAT GAT AT-3′。
探针Delta F508-WT25C(SEQ ID NO：7)是与探针CF01-25具有同样序列的25个单体长的野生型ssDNA探针。
探针Delta F508-MUT25C(SEQ TD NO：19)是25个单体长的突变的ssDNA探针，被设计成与人类囊性纤维变性基因的外显子10的正义链的25个核苷酸的片段互补，只是缺失了三个连续的碱基，位于507和508位氨基酸位置上的野生型反义序列AAG被缺失了。
探针Delta F508-MUT25C(SEQ TD NO：19)的序列是5′-ATA GGAAAC ACC AAT GAT ATT TTC T-3′。
反应混合物(80μl)含有下列成分：500pg人类基因组dsDNA靶(大约75个拷贝)，3.2pmoles的15个单体、20个单体或25个单体长的ssDNA探针，0.5×TBE和600nM YOYO-1。经过5、15、30、45和60分钟保温后，使用带有15mW氩离子激光器的Genexus分析仪检测从反应混合物中发射的荧光，PMT设置为34％。
在存在600nM YOYO-1的情况下ssDNA探针对照比也含有600nM YOYO-1的基因组dsDNA靶对照产生出更高水平的荧光发射。25个单体长的探针对照与可比较的20个单体或15个单体长的探针对照相比表现出更高的荧光水平(表2)。通过从相关的反应混合物发射值中减去适当的探针对照发射值，对反应混合物的荧光发射值进行了校正以识别与三链体相关的信号，反应混合物发射值和探针对照发射值这两者都是随时间监测的。
由基因组dsDNA和25个单体长的Delta F508-WT25C探针的杂多聚的完全配对的DNA三链体(样品5)，在存在600nM YOYO-1的情况下在少到5分钟的保温之后形成并被检测(表2)。与完全配对的三链体相关的发射比基因组dsDNA靶对照和探针对照的组合发射要明显高得多，这一点是相当引人注目的。另一个值得注意的现象是在某些条件下，这些完全配对的DNA三链体(样品5)的发射水平，在起初的5分钟保温和第一次激光测量之后多达55分钟的时间中不同的时间点处，是基本上稳定的(表2，数据未显示)。在第一个5分钟形成的被检测的三链体复合物可以在整个60分钟的时期内被稳定地检测，这个观察强烈地表明，在室温经过仅仅5分钟的保温后，基因组靶和其它试剂的平衡已经基本上达到。上述的观察构成了反对核酸结合的“随机碰撞”模型的证据。由于手动操作步骤所必然带来的时间限制妨碍了我们在小于5分钟的保温时间内监测基因组靶的三链体形成。
由含有3个碱基对误配(基因组dsDNA+探针DeltaF508-MUT25C)的gDNA:ssDNA三链体(样品6)产生的与三链体相关的荧光发射强度，与完全配对的三链体(样品5)发射的荧光强度相比，在经过5、15、30和45分钟保温后，分别低90.1％、92.9％、92.5％和91.6％(表2)。这些结果清楚地证明了在室温经过少至5分钟的保温后，使用未标记的寡聚ssDNA探针和YOYO-1对均匀分布在溶液中的人类基因组dsDNA进行分析的能力。这样的杂多聚三链体可以被形成以检测人类基因组样品中的SNPs、人类基因组样品中的序列、以及含有人类基因组dsDNA的样品中另一种生物体或病原体的存在或基因型。该分析为与三链体复合物相关的信号提供了直接的检测。有时我们将复合物称为INGENEUS TRIPLEX，将本发明中公开的分析能力称为基因组分析。
由基因组dsDNA和20个单体长的Delta F508-WT20C探针组成的杂多聚的完全配对的DNA三链体(样品10)，也在存在600nMYOYO-1的情况下在5分钟的保温之后形成并被检测(表2)。当使用20个单体长的ssDNA探针而不是25个单体长的ssDNA探针时，与YOYO-1保温5分钟后完全配对的三链体形成的效率表现出明显的降低，这可以由荧光发射的水平来证明。
由含有3个碱基对误配(基因组dsDNA+探针DeltaF508-MUT20C)的20个单体长的三链体(样品11)产生的与三链体相关的荧光发射强度，与完全配对的20个单体长的三链体(样品10)发射的荧光强度相比，在经过5、15、30和45分钟保温后，分别低43.0％、77.6％、85.9％和95.5％(表2)。尽管在保温5分钟后，完全配对的20个单体长的三链体与含有基因组dsDNA和20个单体长的ssDNA探针的3个碱基对误配的三链体之间的差异水平明显比从含有基因组dsDNA和25个单体长的ssDNA探针的三链体观察到的差异水平小，但是将保温延长直到45分钟，可以引起配对的和误配的20个单体长的三链体之间的差异水平的持续增加(表2)。这是由于完全配对的20个单体长的三链体的形成随着时间的稳定增加与误配的20个单体长的三链体形成的持续减少同时发生。这种形势在45分钟和60分钟的保温时期内持续存在并被监测(数据未显示)。保温45分钟后，配对的和误配的含有基因组dsDNA和20个单体长的ssDNA探针的三链体之间的差异水平与配对的和误配的含有基因组dsDNA和25个单体长的ssDNA探针的三链体之间的差异水平相当(表2)，尽管与三链体相关的荧光发射信号更低。
当基因组dsDNA和探针Delta F508-WT15C(样品15)在存在600nM YOYO-1的情况下保温5分钟时，对15个单体长的完全配对的三链体观察到明显较低的荧光发射水平(表2)。在经过短时间保温后，从含有基因组dsDNA和探针Delta F508-MUT15C的3个碱基对误配的15个单体长的三链体(样品16)观察到荧光发射比完全配对的15个单体长的三链体(样品15)的荧光发射高。但是在存在600nMYOYO-1的情况下经过45分钟保温后，与误配的15个单体长的三链体相关的荧光已经降低了很多，使得含有3个碱基对误配的15个单体长的三链体(样品16)的与三链体相关的荧光发射比完全配对的15个单体长的三链体(样品15)的荧光发射降低了83.1％(表2)。经过60分钟保温后这种差异被维持(数据未显示)。
上面的结果清楚地展示了杂多聚三链体分析在非变性的、非扩增的人类基因组dsDNA靶中检测SNP误配的惊人效率，优选是在使用YOYO-1和25个单体长的ssDNA探针时。考虑到500pg基因组dsDNA、大约75个拷贝、被均匀分散在终体积为80μl的反应混合物中进行分析，基因组dsDNA靶的杂多聚三链体分析的灵敏度是令人吃惊的。重量从2ng到100pg、大约302到15个拷贝的人类基因组靶中的SNPs也同样在溶液中使用不同的YOYO-1浓度得到了分析。
具有从人类甲叉四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的外显子4衍生的序列的反义的20个、25个或30个单体长的ssDNA探针在DNA合成仪上合成，柱纯化并溶解在双蒸水中，浓度为1pmole/μl。
探针C677T-WT20C(SEQ ID NO：20)是20个单体长的野生型ssDNA探针，被设计为与人类MTHFR基因的外显子4的正义链的20个核苷酸的片段互补[Nature Genetics 7，195-200(1994)]。
探针C677T-WT20C(SEQ ID NO；20)的序列是5′-TGA TGA TGAAAT CGG CTC CC-3′。
探针C677T-MUT20C(SEQ ID NO：21)是20个单体长的突变的ssDNA探针，其序列与野生型探针C677T-WT20C相同，只是有一个碱基的突变(下划线)。MTHFR 677多态性是MTHFR基因的正义链中胞嘧啶变为胸腺嘧啶的取代，导致在MTHFR酶中丙氨酸变为缬氨酸的取代。
探针C677T-MUT20C(SEQ ID NO：21)的序列是5′-TGA TGA TGAAAT CGA CTC CC-3′。
探针C677T-WT25C(SEQ ID NO：22)是25个单体长的野生型ssDNA探针，被设计为与人类MTHFR基因的外显子4的正义链的25个核苷酸的片段互补。
探针C677T-WT25C(SEQ ID NO：22)的序列是5′-TGA TGA TGA 5AAT CGG CTC CCG CAG A-3′。
探针C677T-MUT25C(SEQ ID NO：23)是25个单体长的突变的ssDNA探针，其序列与野生型探针C677T-WT25C相同，只是有一个碱基的突变(下划线)。
探针C677T-MUT25C(SEQ ID NO：23)的序列是5′-TGA TGA TGAAAT CGA CTC CCG CAG A-3′。
探针C677T-WT30C(SEQ ID NO：24)是30个单体长的野生型ssDNA探针，被设计为与人类MTHFR基因的外显子4的正义链的30个核苷酸的片段互补。
探针C677T-WT30C(SEQ ID NO：24)的序列是5′-GCG TGA TGATGA AAT CGG CTC CCG CAG ACA-3′。
探针C677T-MUT30G(SEQ ID NO：25)是30个单体长的突变的ssDNA探针，其序列与野生型探针C677T-WT30C相同，只是有一个碱基的突变(下划线)。
探针C677T-MUT30C(SEQ ID NO：25)的序列是5′-GCG TGA TGATGA AAT CGA CTC CCG CAG ACA-3′。
反应混合物(80μl)含有下列成分：1ng或2ng人类基因组dsDNA靶(分别为大约151个拷贝或302个拷贝)，3.2pmoles的20个单体、25个单体或30个单体长的ssDNA探针，0.5×TBE和500nM YOYO-1。象实施例1中描述的那样，经过5、15、30、45和60分钟保温后，使用带有15mW氩离子激光器的Genexus分析仪检测从反应混合物中发射的荧光，PMT设置为30％。
由于在这些条件下在存在YOYO-1的情况下每个探针的自身杂交性质的水平不同，对野生型和突变的ssDNA探针对照观察到的荧光发射水平有非常大的区别。30个单体长的探针表现出比25个单体或20个单体长的探针更高的荧光水平。通过从相关的反应混合物发射值中减去适当的探针对照发射值，对反应混合物的荧光发射值进行了校正以识别与三链体相关的信号，反应混合物发射值和探针对照发射值这两者都是随时间监测的。
由基因组dsDNA和探针C677T-WT30C或探针C677T-WT25C组成的杂多聚的完全配对的30个单体和25个单体长的三链体(分别为表3中的样品5和10)，在存在500nM YOYO-1的情况下在5分钟保温时间内形成。在经过仅仅5分钟保温后，与完全配对的30个单体和25个单体长的三链体相关的信号水平明显高于靶基因组dsDNA对照加相关的探针对照的合并的荧光信号。30个单体和25个单体长的三链体复合物在保温5分钟后形成并可以直接检测，以及检测信号在随后的55分钟时间中一直稳定(表3)，这些事实表明在经过仅仅5分钟的保温后，平衡已经基本上达到。在基因组三链体分析中使用一半量的的基因组dsDNA靶、即用1ng代替2ng，令人吃惊地并不导致形成的完全配对的30个单体或25个单体长的三链体复合物发射的与三链体相关的信号的成比例的降低(数据未显示)。完全配对的25个单体长的三链体的形成具有相同的效率，这已经被可比较的反应混合物的荧光发射水平所证实(数据未显示)。根据与三链体相关的荧光发射水平，在测试的反应条件下，完全配对的25个单体长的三链体的形成比完全配对的30个单体长的三链体的形成更有效(比较表3中的样品10和样品5)。
经过5、15、30和45分钟保温后，在含有2ng基因组dsDNA和探针C677T-MUT-30C的反应混合物中1个碱基对C-A误配的30个单体长的三链体(样品6)的与三链体相关的荧光发射，与含有完全配对的30个单体长的三链体(样品5)的反应混合物的荧光发射相比，分别减少了90.4％、92.6％、92.4％和93.3％，每种情况下都是经过可比较的保温后测定的(表3)。同样地，当1ng基因组dsDNA与探针G677T-MUT30C反应形成1个碱基对C-A误配的30个单体长的三链体时，经过5、15、30和45分钟保温后，该误配的三链体的与三链体相关的荧光发射与含有完全配对的30个单体长的三链体的反应混合物的荧光发射相比，分别减少了80.2％、84.9％、86％和87.3％，每种情况下都是经过可比较的保温后测定的(数据未显示)。这些结果清楚地展示了使用30个单体长的ssDNA探针检测人类基因组dsDNA靶中的SNP误配时，INGENEUS TRIPLEX发射信号的效率。值得注意的是，在存在YOYO-1和人类基因组DNA样品的情况下，在30个单体长的INGENEUS TRIPLEX中1个碱基对的误配可以使之如此地不稳定，以至允许在完全配对的30个单体长的三链体和误配的30个单体长的三链体之间存在如此高水平的差异。
当2ng基因组dsDNA与探针G677T-MUT25C反应形成1个碱基对C-A误配的25个单体长的三链体时(样品11，表3)，经过5、15、30和45分钟保温后，含有该误配的三链体的反应混合物的与三链体相关的荧光发射与含有完全配对的25个单体长的三链体(样品10)的反应混合物的荧光发射相比，分别减少了98.1％、99.0％、99.3％和99.4％。经过5、15、30和45分钟保温后，在含有1个碱基对C-A误配的25个单体长的含有1ng基因组dsDNA和探针C677T-MUT-25C的三链体的反应混合物中的荧光发射，与含有完全配对的25个单体长的三链体的反应混合物的荧光发射相比，分别减少了91.4％、93.7％、94.4％和95.2％(数据未显示)。这些结果合在一起展示了，在使用30个单体或25个单体长的ssDNA探针和YOYO-1进行分析以检测人类基因组dsDNA靶中的SNP误配时，杂多聚三链体分析的高水平的特异性。
在含有2ng或1ng基因组dsDNA和探针C677T-WT20C的反应混合物中(分别为表3中的样品15和未显示的数据)杂多聚的完全配对的20个单体长的三链体形成的效率，明显低于使用可比较的25个单体或30个单体长的探针时三链体形成的效率。尽管经过5分钟保温后，完全配对的20个单体长的三链体(样品15)与含有基因组dsDNA和20个单体长的ssDNA探针的1个碱基对误配的三链体(样品16)之间水平的差异，明显低于从含有基因组dsDNA和25个单体或30个单体长的ssDNA探针的三链体观察到的差异，但继续保温到45分钟，导致配对的和误配的20个单体长的三链体之间差异水平的持续增加(表3)。
上述的结果显示，对于含有人类基因组DNA的样品的杂多聚三链体分析来说，25个单体或30个单体长的ssDNA探针明显优于长度较短的15个或20个碱基的探针。
实施例4
实施例4展示了实验介质的电学电学预处理对随后在ssDNA探针、YOYO-1和人类基因组dsDNA靶之间杂多聚三链体形成的影响。以前我们已经公开了在将介质加入到含有比人类基因组dsDNA的复杂性低的靶的反应混合物中之前，对其进行电学预处理电学预处理的优点。参见美国专利申请No.2003/0170659。
含有0.7×TBE的实验介质放置在1.5ml微量离心管中，在使用前不处理或进行电学预处理。通过将相隔2mm的两个铂/铱电极浸泡在实验介质中对实验介质进行电学预处理。对含有0.7×TBE的56μl的实验介质施加40次500毫秒的9伏直流电脉冲，每次间隔10秒。在最后一次直流电脉冲之后，立即在未处理的和电学预处理的实验介质中加入3.2pmoles杂多聚的25个单体长的ssDNA探针(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：19)、500pg人类基因组dsDNA靶(大约75个拷贝)和YOYO-1，从而产生终体积为80μl的反应混合物。最终的缓冲液浓度是0.5×TBE，YOYO-1的终浓度是600nM。经过5、15、30、45和60分钟保温后监测荧光发射，PMT设置为30％。
尽管含有完全配对的DNA三链体(基因组dsDNA+探针DeltaF508-WT25C)的反应混合物发射出最高的荧光强度，在经过5、15、30、45和60分钟保温后，含有具有3个碱基对误配的不完全互补的三链体(基因组dsDNA+探针Delta F508-MUT25C)的反应混合物产生的与三链体相关的荧光发射，与经过可比较的保温后未处理的介质中完全配对的三链体的发射相比，分别低54.7％、79.9％、84.7％、98.6％和90.5％(数据未显示)。
在加入测试成分之前对实验介质施加40次9伏的脉冲，导致ssDNA探针对照的荧光发射水平比同样的对照在未处理的实验介质中观察到的发射水平降低了大约2倍。但是在实验介质电学预处理后基因组dsDNA对照的荧光发射没有变化。上述的对实验介质的电学预处理极大地增加了含有完全配对的杂多聚的25个单体长的三链体的反应混合物发射的信号，在这个例子中增加的程度是9250％，这是与在未处理的实验介质中形成的同样的完全配对的三链体中观察到的信号相比(数据未显示)。通过对实验介质施加40次9伏脉冲，从形成的具有3个碱基对误配的三链体(基因组dsDNA+探针DeltaF508-MUT25C)发射的信号也明显地增加了，以至于经过5分钟保温后，在预处理的介质中含有3个碱基对误配的复合物的反应混合物的与三链体相关的荧光发射，与完全配对的复合物获得的发射相比，只减少了17.4％(数据未显示)。配对的和误配的杂多聚的25个单体长的DNA三链体的异常高水平的荧光发射不仅随时间持续，而且在监测的60分钟保温时期内轻微地增加。
这种与三链体相关的信号发射的剧烈增加表明，通过在加入被分析物和试剂之前对实验介质进行电学预处理，能够极大地增加使用25个单体长的ssDNA探针和YOYO-1的三链体分析的灵敏度。这种灵敏度的增加允许检测在终体积为80μl的反应混合物中存在的远少于75个所需序列的拷贝，即使是在存在人类基因组背景的情况下。
实施例5
本实施例显示了在存在YOYO-1的情况下，从血液或唾液纯化的人类基因组dsDNA靶在不同靶浓度下与25个单体长的ssDNA探针反应、特异性形成INGENEUS TRIPLEX的能力。
从人类血液样品中使用QIAamp DNA血液纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，Canada)或者从人类唾液中使用Oragene DNA收集试剂盒(DNA Genotek，Ottawa，Canada)按照制造商的说明书提取人类基因组dsDNA。基因组dsDNA的浓度通过紫外分光光度计测定。
具有从人类因子V基因的外显子10或人类囊性纤维变性(CFTR)基因的内含子14b衍生的序列的反义的25个单体长的ssDNA探针在DNA合成仪上合成，柱纯化并溶解在双蒸水中，浓度为1pmole/μl。
探针FVL-WT25C(SEQ ID NO：26)是25个单体长的野生型ssDNA探针，被设计成与人类因子V基因的外显子10的正义链的25个核苷酸的片段互补。
探针FVL-WT25C(SEQ ID NO：26)的序列是5′-CCC TCT GTATTC CTC GCC TGT CCA G-3′。
探针FVL-MUT25C(SEQ ID NO：27)是与野生型探针FVL-WT25C的序列相同的25个单体长的突变的ssDNA探针，只是发生了一个碱基的突变(下划线)，对应于因子V的Leiden(FVL)突变G1691A[Nature369，64-67(1994)]。该突变导致在凝集因子V蛋白的氨基酸序列中506位的谷氨酰胺被精氨酸取代。
探针FVL-MUT25C(SEQ ID NO：27)的序列是5′-CCC TCT GTATTC CTT GCC TGT CCA G-3′。
探针2789+5G-＞A-WT25C(SEQ ID NO：28)是25个单体长的野生型ssDNA探针，被设计成与人类CFTR基因的外显子14b和内含子14b的正义链的25个核苷酸的片段互补。
探针2789+5G-＞A-WT25C(SEQ ID NO：28)的序列是5′-AATAGG ACA TGG AAT ACT CAC TTT C-3′.
探针2789+5G-＞A-MUT25C(SEQ ID NO：29)是与野生型探针2789+5G-＞A-WT25C的序列相同的25个单体长的突变的ssDNA探针，只是发生了一个碱基的突变(下划线)，对应于人类CFTR基因的内含子14b中的2789+5G-＞A突变。
探针2789+5G-＞A-MUT25C(SEQ ED NO：29)的序列是5′-AATAGG ACA TGG AAT ATT CAC TTT C-3′。
反应混合物(80μl)含有下列成分：75pg到4ng人类基因组dsDNA靶(大约11个到604个拷贝)，3.2pmoles的25个单体长的ssDNA探针，0.5×TBE和500nM YOYO-1。经过5、15、30、45和60分钟保温后，从反应混合物中发射的荧光被检测，PMT设置为30％。
从野生型和突变的ssDNA探针对照观察到了不同的荧光发射水平。通过减去适当的探针对照发射值，对反应混合物的荧光发射值进行了校正以识别与三链体相关的信号，反应混合物发射值和探针对照发射值这两者都是随时间监测的。
由2ng、1ng、500pg或200pg基因组dsDNA(从血液中纯化)和探针FVL-WT25C组成的杂多聚的完全配对的25个单体长的三链体(分别为表4中的样品5、8、11和14)，在存在500nM YOYO-1的情况下在经过5分钟保温后形成。经过仅仅5分钟的保温后，完全配对的25个单体长的三链体的信号水平都明显高于靶基因组dsDNA对照和野生型探针对照的合并的荧光信号。当反应混合物中存在1ng基因组dsDNA时，在60分钟的保温时间内完全配对的25个单体长的三链体(样品8，表4)的荧光发射逐渐增加。而降低基因组dsDNA对照的浓度将产生逐渐减少的荧光发射，反应混合物中基因组dsDNA浓度的降低不会导致形成的完全配对的25个单体长的三链体的与三链体相关的发射的成比例的降低(表4)。
在经过5、15、30、45和60分钟保温后，从含有1个碱基对G-T误配的25个单体长的三链体和重量在2ng到200pg之间的基因组靶和探针FVL-MUT25C(表4中的样品6、9、12和15)的反应混合物发射的与三链体相关的荧光，与含有完全配对的25个单体长的三链体和相当含量的基因组dsDNA和探针FVL-MUT25C(分别为表4中的样品5、8、11和14)的反应混合物发射的荧光相比，都低100％。正如实施例1中讨论的那样，尽管YOYO-1促进的探针的自身结合显示出在基因组双链体靶的引入后极大地减少了，导致YOYO-1发射的降低，其程度不足以抵消由于嵌入到双链体靶和任何误配的三链体形式中所引起的荧光的增加。这可能导致含有误配的基因组DNA三链体的反应混合物的荧光发射低于可比较的探针对照的发射。
在含有4ng、2ng、1ng、500pg、200pg、100pg或75pg基因组dsDNA(从血液中纯化)和3.2pmoles探针CFTR2789+5G-＞A-WT25C的反应缓冲液中，在存在500nM YOYO-1的情况下经过5分钟保温后，以与完全配对的由基因组dsDNA和探针FVL-WT25C构成的25个单体长的三链体(显示在表4中)相同的效率形成杂多聚的完全配对的25个单体长的三链体(数据未显示)。与CFTR完全配对的25个单体长的三链体相关的发射都明显高于靶基因组dsDNA对照和相关的探针对照发射的合并的荧光发射。正如在使用的分析条件下所经常发生的那样，反应混合物与三链体相关的发射在60分钟的保温时期内是稳定的(数据未显示)。
含有由4ng到75pg之间的基因组dsDNA和探针2789+5G-＞A-MUT25C构成的1个碱基对T-G误配的25个单体长的三链体的反应混合物，在经过5、15、30、45和60分钟保温后，与含有由可比较的量的基因组dsDNA构成的完全配对的25个单体长的三链体的反应混合物相比，其与三链体相关的荧光发射在用相关的探针对照值(数据未显示)校正后，都低100％。
上面的结果清楚地显示INGENEUS TRIPLEX使基因组分析能够在宽广的基因组dsDNA浓度范围内，直接检测非变性的、非扩增的人类基因组dsDNA靶中不同基因的不同误配的令人吃惊的效率和灵敏度。上述的分析能力最令人吃惊的是，它允许在研究人员可以获得的尚未被最适化以提高检测灵敏度的设备上，使用不超过75pg、即大约11个拷贝的基因组dsDNA来分析SNPs，或可以在少于80μl的终体积中工作。
通过基因组分析使用基本上与本实施例中描述的相同的分析规程，成功地分析了大量的SNPs。被分析的SNPs包括因子V Leiden Gl691 A、MTHFR C677T、CFTR delta F508、CFTR deltaI507、CFTR2789+5G-＞A、CFTR 3849+10kbC-＞T、CFTR 3659delC、CFTR G551D、CFTR 621+1G-＞T、CFTR R1162X、CFTR 1717-1G-＞A、CFTR A455E、CFTR G542X、CFTR N1303K、CFTR R560T和CFTR W1282X。在上述的基因组分析中分析的双链体靶中75％的靶序列含有一个或多个含4到5个替换的嘌呤和嘧啶碱基区域，它们在温和的条件下可以形成ZDNA区域。该Z DNA潜力导致在执行基因组分析中不存在分析困难。
在所有这些情况中，分析的是从血液纯化的人类基因组dsDNA样品。也可以使用从唾液样品纯化的基因组dsDNA进行基因组三链体分析以分析CFTR 2789+5G-＞A突变，该样品在经过50℃保温30分钟后已经在室温保存了1星期。50℃保温由Oragene试剂盒的制造商推荐，以允许唾液样品在室温长期保存。
表5比较了从唾液纯化的人类基因组dsDNA和从血液纯化的人类基因组dsDNA获得的分析结果。使用3.2pmoles探针2789+5G-＞A-WT25C(表5中的样品5和8)分析了4ng或2ng人类基因组dsDNA。反应混合物的发射表明，在存在500nM YOYO-1的情况下经过5分钟保温后，配对的三链体(表5中的样品5和8以及未显示的数据)形成的效率相当。在45分钟的时间内监测到的与三链体相关的发射保持稳定。
在经过5、15、30、和45分钟保温后，从含有由4ng基因组dsDNA和探针2789+5G-＞A-MUT25C构成的含有1个碱基对T-G误配的25个单体长的三链体(样品6，表5)的反应混合物发射的与三链体相关的荧光发射，与含有完全配对的25个单体长的三链体(表5中的样品5)的反应混合物发射的荧光相比，分别低94.9％、93.1％、94.1％和93.8％。同样地，当2ng基因组dsDNA与同样的探针反应形成1个碱基对T-G误配的25个单体长的三链体(样品9，表5)时，在经过5、15、30、和45分钟保温后，与三链体相关的荧光发射与含有完全配对的25个单体长的三链体(表5中的样品8)的反应混合物发射的荧光相比，分别低100％、97.7％、100％和100％。
上述的结果表明，从唾液纯化的人类基因组DNA的基因组分析可以与从血液中纯化的人类基因组DNA的情况下具有同样的效率和特异性。因此，当使用Qiagen试剂盒时发生的广泛的基因组DNA纯化对含有人类基因组dsDNA的样品的三链体分析来说，可能不是必需的。从唾液获得用于分析的人类基因组DNA与从血液获得的相比，在操作、储存和运输方面提供了明显的优势。在并列比较中，通过Qiagen试剂盒纯化1ml外周血，产生的人类基因组DNA足够执行9000次以上在这些实施例中描述的三链体分析，如果每次反应分析3ng的话。用Oragene试剂盒半纯化典型的痰液样品，产生的人类基因组DNA足够执行7000次以上的三链体分析。
已经观察到，在这些实施例中所有的数据都与一个结论相符合，即YOYO-1分子与三链体核酸复合后比它们与双链体核酸复合后发射出更多的光。
实施例6
本实施例描述了人类基因组dsDNA靶与25个单体长的ssDNA探针反应的SNP分析，其中随时间监测和评估发射的上涨和/或下落。
按照实施例3中的描述从人类血液样品中纯化人类基因组dsDNA并定量。具有从人类CFTR基因的内含子19衍生的序列的反义的25个单体长的ssDNA探针在DNA合成仪上合成，柱纯化并溶解在双蒸水中，浓度为1pmole/μl。
探针3849+10kbC-＞T-WT25C(SEQ ID NO：30)是25个单体长的野生型ssDNA探针，被设计成与人类CFTR基因的内含子19的正义链的25个核苷酸的片段互补。
探针3849+10kbC-＞T-WT25C(SEQ ID NO：30)的序列是5′-GTGTCT TAC TCG CCA TTT TAA TAC T-3′。
探针3849+10kbC-＞T-MUT25C(SEQ ID NO：31)是与野生型探针3849+10kbC-＞T-WT25C序列相同的25个单体长的突变的ssDNA探针，只是含有1个碱基的突变(下划线)，对应于人类CFTR基因的内含子19中的3849+10kbC-＞T突变。
探针3849+10kbC-＞T-MUT25C(SEQ ID NO：31)的序列是5′-GTGTCT TAC TC
A CCA TTT TAA TAC T-3′。
反应混合物(80μl)含有下列成分：2ng人类基因组dsDNA靶(大约302个拷贝)，3.2pmoles的25个单体长的ssDNA探针，0.5×TBE、500nM YOYO-1以及40mM或45mMkosmotropic的阳离子四甲基铵盐酸盐(TMA-Cl)。在每个实验中制造两份反应混合物，一份在最后将YOYO-1加入到反应混合物中。在另一份反应混合物中，反应混合物的所有成分在加入基因组DNA之前已经被混合。在所有情况下反应混合物被保温5分钟，然后进行照射。如同实施例1中描述的那样，经过5、15、30、45和60分钟保温后，使用带有15mW氩离子激光器的Genexus分析仪监测反应混合物中的荧光发射，PMT设置为32％。
在存在45mM或40mM TMA-Cl的情况下，每个被分析的SNP的野生型和突变的ssDNA探针对照的荧光发射在经过5分钟保温后是相同的(表6、7，数据未显示)，并在随后的55分钟时间内维持稳定。表6和7中只显示了从保温15到60分钟后的反应混合物获得的与三链体相关的发射值。
不论是YOYO-1还是基因组DNA最后被加入到反应混合物中，在存在45mM TMA-Cl和500nM YOYO-1的情况下保温15分钟后，监测到的由基因组DNA和探针2789+5G-＞A-WT25C(样品5和9，表6)组成的反应混合物中的两份完全配对的25个单体长的三链体的与三链体相关的发射是相同的。在两个三链体分析规程中完全匹配的三链体相关的发射在检测的60分钟阶段内急剧增加(表6，图1和2)。
不论是YOYO-1还是基因组DNA最后被加入到反应混合物中，在存在45mM TMA-Cl和500nM YOYO-1的情况下保温15分钟后，监测到的由基因组DNA和探针2789+5G-＞A-WT25C(样品5和9，表6)组成的反应混合物中的两份错配的25个单体长的三链体的与三链体相关的发射是相同的，产生的发射与含有完全配对的三链体的反应混合物(分别为表6中的样品5和9)相比，低55％或54％。最后加入YOYO-1的反应混合物中形成的误配的三链体，在60分钟的时间内监测时，其与三链体相关的发射保持相对恒定(样品6，表6和图1)。因为与相应的完全配对的三链体相关的发射在监测期间显著地增加，在最后加入YOYO-1的反应混合物中完全配对的三链体信号和1个碱基对误配的三链体的信号之间的差异水平从55％增加到了65％。在最后加入基因组DNA的反应混合物中形成的误配的三链体的与三链体相关的发射，随着时间轻微地增加(样品10，表6和图2)。然而在这些反应混合物中误配的三链体的与三链体相关的发射的增加速度比含有可比较的完全配对的三链体的反应混合物的增加速度低，以至于在监测期间，与完全配对的三链体相关的信号和与1个碱基对误配的三链体相关的信号之间的差异水平从54％增加到了60％。
不论是YOYO-1还是基因组DNA最后被加入到反应混合物中，在存在40mM TMA-Cl和500nM YOYO-1的情况下保温15分钟后，监测到的由基因组DNA和探针3849+10kbC-＞T-WT25C组成的反应混合物中完全配对的25个单体长的三链体(样品5和9，表7)的与三链体相关的发射是相同的。在两种三链体分析规程中，直到监测进行到60分钟的时间点时，与完全配对的三链体相关的发射都增加了(表7，图3和4)。
在含有40mM TMA-Cl的最后加入YOYO-1的反应混合物中，由基因组DNA和探针3849+10kbC-＞T-MUT25C组成的误配的25个单体长的三链体(样品6，表7)，在经过5、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟保温后，其与三链体相关的发射与同样被监测的含有完全配对的25个单体长的三链体的反应混合物(样品5，表7)的发射相比，分别低70％、84％、90％、94％、99％、98％、100％、100％、100％、100％和100％。在含有40mM TMA-Cl的最后加入基因组的反应混合物中，由基因组DNA和探针3849+10kbC-＞T-MUT25C组成的误配的25个单体长的三链体(样品10，表7)，在经过15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟保温后，其与三链体相关的发射与同样被监测的含有完全配对的25个单体长的三链体的反应混合物(样品9，表7)的发射相比，分别低49％、55％、62％、66％、69％、72％、73％，、76％、85％和88％。
因此，在分析反应混合物中加入特定浓度的TMA-Cl或分别或组合地加入一种或多种kosmotropic的阳离子，如果发生了完全配对的结合，可以导致信号发射的逐渐增加，而误配结合的发生可以导致分析反应混合物的信号发射逐渐减小(表7，图3和4，以及未显示的数据)。因此可以选择反应混合物，其中完全配对的结合和误配的结合之间的差异水平可以随时间监测。也可以将监测转向观察反应混合物与结合相关的信号的高的、恒定的或增加的水平，而误配的结合信号是低的。因此，进行两份分析是有优势的，可以使用不同的规程或试剂，以便获得其几个特征证实了样品的评分的信号。我们将这些检测配对或误配结合的方法统称为“涨落”方法。它对于产生荧光信号基因组分析是非常有用的，这些分析不仅可以依赖发射强度的相对增加，而且也可以利用随时间发生的显著发射的变化速度和方向。
当在含有40mM TMA-Cl和500nM YOYO-1、以及在反应混合物中最后加入YOYO-1或基因组DNA的反应混合物中将2ng基因组DNA与25个单体长的Delta F508-WT25C探针或25个单体长的DeltaF508-MUT25C探针进行反应时，在60分钟的保温时间内观察到了与完全配对的三链体相关的发射和与误配的三链体相关的发射的上涨和下落(数据未显示)。在这种情况下，在反应混合物保温24小时后也监测了与三链体相关的发射。在保温24小时后上涨和下落的发射形式是明显的(数据未显示)。
当在含有50mM TMA-Cl、20mM NaCl和500nM YOYO-1、以及在反应混合物中最后加入YOYO-1或基因组DNA的反应混合物中将2ng基因组DNA与25个单体长的FVL-WT25C探针或25个单体长的FVL-MUT25C探针进行反应时，在对反应混合物进行的24小时以上的监测中，观察到了上涨和下落的发射形式(数据未显示)。
大量的kosmotropic的阳离子已经被用于和500nM YOYO-1一起增加基因组分析的特异性，同时也增强了与三链体相关的发射的涨落。这包括50到80mM NaCl、10到60mM Na2SO4、50mM Na2HPO4、125到250mM(NH4)28O4、30mM TriMA-Cl、30到52.5mM TMA-Cl，每种都分别加入，50mM TMA-Cl也可以与10到20mM NaCl一起加入。在反应混合物中使用一种或多种kosmotropic的阳离子的好处以及在任何选定的分析条件下的最佳使用浓度可以通过实验确定。
因此，显然可以通过在按照两个或多个规程装配的两种或多种反应混合物中形成INGENEUS TRIPLEX来进行基因组分析，这些规程被计算过能够产生随时间被监测的与三链体相关的发射，并允许多个发射特征被观察和评估，以允许更准确的分析。
实施例7
本实施例显示在存在YOYO-1和过量的人类基因组dsDNA的情况下，病原体的基因组dsDNA靶与25个单体长的ssDNA探针反应特异性地形成INGENEUS TRIPLEX的能力。
营养期球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)(BG)细胞悬浮液由DycorTechnologies Ltd.(Edmonton，Alberta，Canada)提供。将1ml BG在5000xg(7500rpm)离心5分钟沉淀，重新悬浮在20μl细菌细胞释放试剂中(New Horizons，Columbus，MD)，然后在室温保温5分钟。然后将裂解的细菌重新悬浮在160μl缓冲液AL中(在QIAamp DNA微量纯化试剂盒中提供，QIAGEN，Mississauga，Canada)，然后与20μl蛋白酶K在56℃下保温30分钟。BG基因组dsDNA的分离使用QIAampDNA纯化试剂盒按照制造商的说明书完成。BG基因组dsDNA的浓度使用紫外分光光度计测定。人类基因组dsDNA按照实施例3中的描述从人类血液样品中提取并定量。
反义的25个单体长的ssDNA探针具有与球形芽孢杆菌(Bacillusglobigii)的BglI限制性内切酶(bglIR)基因或芽孢形成特异性的SASP蛋白(csgA)基因的正义链的25个核苷酸的片段互补的序列，在DNA合成仪上合成，柱纯化并溶解在双蒸水中，浓度为1pmole/μl。
探针bglIR-WT25C(SEQ ID NO：32)的序列是5′-TAT TTT GATTAT AGG ACA TGA AGA T-3′。
探针csgA-WT25C(SEQ ID NO：33)的序列是5′-GCA AAT AACCGA GTG TAA CAT CCA T-3′。
反应混合物(80μl)含有下列成分：0.46pg BG基因组dsDNA(100个拷贝)，3.2pmoles的25个单体长的ssDNA探针，0.5xTBE，40mMTMA-Cl，500和300nM之间的YOYO-1以及含有或不含2ng人类基因组dsDNA靶(大约302个拷贝)。在所有情况下YOYO-1最后加入到反应混合物中，保温5分钟，然后进行照射。如同实施例1中描述的那样，经过5、15、25、35、45、55和65分钟保温后，使用带有15mW氩离子激光器的Genexus分析仪监测反应混合物中的荧光发射，PMT设置为32％。
在存在40mM TMA-Cl的情况下，bglIR-WT25C和csgA-WT25CssDNA探针对照的荧光发射水平都随着反应混合物中YOYO-1浓度的增加而增加(表8和未显示的数据)，表明了在不同YOYO-1浓度下探针自身杂交的水平。每个探针对照的荧光发射水平在65分钟的保温期间保持恒定。正如预期的那样，人类基因组DNA对照的荧光发射水平随着YOYO-1浓度的降低轻微地减少，在65分钟的保温期间保持相对恒定(表8)。在PMT设置为32％(表8)或34％(数据未显示)时被监测的BG基因组DNA对照没有观察到荧光信号，反映出被分析的BG基因组DNA的拷贝数非常低。在PMT设置为36％时，在每种被分析的YOYO-1浓度下，BG基因组DNA对照的荧光发射值比YOYO-1对照的发射值略高(数据未显示)。通过减去适当的探针对照发射值，可以将反应混合物的荧光发射值进行校正，以识别与三链体相关的信号，这两个荧光发射值都是随时间监测的。
在存在500、400或300nM YOYO-1的情况下，由100个拷贝的BG基因组dsDNA和探针bglIR-WT25C构成的杂多聚的完全配对的25个单体的三链体(分别为表8中的样品5、10和15)在5分钟的保温时期内形成。完全配对的反应混合物的信号发射水平都明显高于靶BG基因组dsDNA对照或探针对照的合并的荧光信号。随着含有100个拷贝的BG基因组DNA的反应混合物中YOYO-1的浓度从500nM降低到300nM，三链体形成的效率提高了。当反应混合物中存在300nM的YOYO-1时，在保温的前35分钟完全配对的25个单体长的三链体的荧光发射逐渐地增加(样品15，表6)，随后观察到荧光发射的平台期。当使用bglIR-WT25C探针分析200个拷贝的BG基因组DNA时，在存在500-300nM YOYO-1的情况下经过5分钟保温后，也观察到了有效的三链体形成，其中在80μl反应混合物中YOYO-1的优选浓度是400nM和500nM(数据未显示)。使用csgA-WT25C探针也成功地分析了浓度范围在每80μl 1000个拷贝到30个拷贝之间的BG基因组DNA(数据未显示)。使用bglIR-WTC探针，在存在300nMYOYO-1的情况下可以在80μl的反应体积中可重复地分析少至10个拷贝的BG基因组DNA，这清楚地证明了INGENEUS TRIPLEX分析在检测病原体时的极端灵敏性(数据未显示)。
更值得注意的是INGENEUS TRIPLEX在巨大的人类基因组DNA背景中特异性分析100个拷贝的细菌基因组DNA的能力。在100个拷贝的BG基因组dsDNA和探针bglIR-WT25C之间形成的杂多聚的完全配对的三链体，在存在300nM YOYO-1、40mM TMA-Cl和302个拷贝的人类基因组DNA的情况下，在5分钟的保温时期内形成(表8中的样品17)。此外，在65分钟的保温时期内，BG三链体的荧光发射逐渐地增加。表8中显示的反应混合物的荧光发射在保温24小时后也被监测。而在不存在背景人类基因组DNA的情况下观察到的与BG三链体相关的荧光在保温24小时后轻微地降低，在存在过量的人类基因组DNA的情况下观察到的与BG三链体相关的荧光在24小时的保温期间继续增加。均匀地分析每个人类基因组DNA拷贝中存在的0.33个拷贝的细菌基因组DNA的能力，证明了INGENEUS TRIPLEX分析在不超过5分钟的时间内检测病原体的极端的灵敏性。
实施例8
本实施例证明了分析野生型纯合的、突变的杂合的或突变的纯合的人类基因组dsDNA样品中MTHFR C677T突变的能力。
对于MTHFR C677T来说是野生型纯合的、突变的杂合的或突变的纯合的人类基因组dsDNA，按照实施例3中的描述从病人血液样品中提取并定量。按照实施例3中的描述制备具有从人类MTHFR基因的外显子4衍生的序列的反义的25个单体长的ssDNA探针。
反应混合物(80μl)含有下列成分：1ng或2ng人类基因组dsDNA靶(分别为大约151个拷贝或302个拷贝)，3.2pmoles的野生型或突变的25个单体长的ssDNA探针，0.5xTBE和500nM的YOYO-1。如同实施例1中描述的那样，经过5、15、30、45和60分钟保温后，使用带有15mW氩离子激光器的Genexus分析仪监测反应混合物中的荧光发射，PMT设置为30％。
在存在YOYO-1的情况下，从野生型探针C677T-WT25C(SEQ IDNO：22)和突变的探针C677T-MUT25C(SEQ ID NO：23)对照观察到了不同的荧光发射水平，这是由于每个探针序列特征性的自身杂交水平的不同(数据未显示)。通过从相关的反应混合物发射值中减去适当的探针对照的发射值，可以将反应混合物的荧光发射值进行校正，以识别与三链体相关的信号，这两个荧光发射值都是在经过同样时间的保温后测量的。
由野生型纯合的人类基因组dsDNA和野生型探针C677T-WT25C或突变的纯合的人类基因组dsDNA和突变的探针C677T-MUT25C构成的反应混合物中的杂多聚的完全配对的DNA三链体，在存在500nMYOYO-1的情况下经过仅仅5分钟的保温后，就有效地形成并被检测到(分别为图5中的样品1和4)。经过5分钟保温后，由三链体相关的荧光的出现所表明的配对的三链体形成的效率，在含有1ng突变的纯合的基因组dsDNA和突变的探针C677T-MUT25C的反应混合物中(样品4，图5)，比在含有1ng野生型纯合的基因组dsDNA和野生型探针C677T-WT25C的反应混合物中(样品1，图5)略高。配对的三链体(样品4，图5)的与三链体相关的荧光发射在监测的60分钟保温时期后轻微减小，而配对的三链体(样品1，图5)的与三链体相关的荧光发射随着时间保持相对恒定。当反应混合物中存在2ng而不是1ng基因组dsDNA时，从含有两种完全配对的三链体中的任何一种的反应混合物中观察到的与三链体相关的荧光发射强度更加相似(数据未显示)。
当1ng突变的杂合的人类基因组dsDNA与突变的探针C677T-MUT25C反应时(样品3，图5)，经过5、15、30、45和60分钟保温后，其与三链体相关的荧光发射与含有由1ng野生型纯合的人类基因组dsDNA和野生型探针C677T-WT25C构成的完全配对的三链体的反应混合物(样品1，图5)的发射相比，分别低77％、80％、85％、88％和90％，每个都是在经过可比较的保温时间后评估的。
由1ng野生型纯合的人类基因组dsDNA和突变的探针C677T-MUT25C构成的反应混合物中的1个碱基对C-A误配的三链体(样品2，图5)，经过5、15、30、45和60分钟保温后的与三链体相关的荧光发射与含有由1ng野生型纯合的人类基因组dsDNA和野生型探针C677T-WT25C构成的完全配对的三链体的反应混合物(样品1，图5)的发射相比，分别低92％、95％、98％、98％和98％，每个都是在经过可比较的保温时间后评估的。由1ng突变的纯合的人类基因组dsDNA和野生型探针C677T-WT25C构成的反应混合物中的1个碱基对C-A误配的三链体(样品5，图5)，经过5、15、30、45和60分钟保温后的与三链体相关的荧光发射与含有由1ng突变的纯合的人类基因组dsDNA和突变的探针C677T-MUT25C构成的完全配对的三链体的反应混合物(样品4，图5)的发射相比，都低100％。
上述的结果证明了分析野生型纯合的、突变的纯合的或突变的杂合的人类基因组dsDNA样品的方法的高度有效性和特异性。这些结果使用MTHFR C677T的反义的25个单体长的野生型探针和突变探针获得。当使用MTHFR C677T正义的25个单体长的野生型探针和的突变探针进行类似的反应时，也观察到了可比较的结果(数据未显示)。使用野生型探针C677T-WT25C和突变的探针C677T-MUT25C在80μl的终反应体积中成功地分析了重量在2ng到200pg范围内的人类基因组dsDNA(数据未显示)，这进一步证明了分析的灵敏性。
尽管参照其具体的实施例已经对本发明进行了详细的描述，对于本领域的专业技术人员来说，显然可以对其进行各种不同的改变和修饰，而不脱离本发明的精神和范围。
表1、使用15个单体和25个单体长的ssDNA探针的三链体分析的比较
靶＝CF 491bp dsDNA扩增子
15个单体长的探针＝CF01-15(正常)，CF10-15(突变)，CF09-15(突变)
25个单体长的探针＝CF01-25(正常)，CF10-25(突变)，CF09-25(突变)
每个样品中存在150nM YOYO-1
| 样品探针∶靶＝25∶1 | Genexus氩激光器@PMT32在5分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于第4行完全配对的变化％ | 相对于第10行完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT32在15分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于第4行完全配对的变化％ | 相对于第10行完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(150nM) | 0 | 0 | ||||||
| 2)491bp(0.05pmole) | 0 | 10 | ||||||
| 3)CF01-15(1.25pmole) | 530 | 223 | ||||||
| 4)CF01-15+491bp(完全配对) | 25128 | 24598 | 24764 | 24541 | ||||
| 5)CF10-15(1.25pmole) | 293 | 240 | ||||||
| 6)CF10-15+491bp(1bp A-C) | 1239 | 946 | -96.2 | 1375 | 1135 | -95.4 | ||
| 7)CF09-15(1.25pmole) | 1848 | 1787 | ||||||
| 8)CF09-15+491bp(1bp T-C) | 2303 | 455 | -98.2 | 2082 | 295 | -98.8 | ||
| 9)CF01-25(1.25pmole) | 3086 | 2979 | ||||||
| 10)CF01-25+491bp(完全配对) | 35647 | 32561 | 37148 | 34169 | ||||
| 11)CP10-25(1.25pmole) | 663 | 459 | ||||||
| 12)CF10-25+491bp(1bp A-C) | 1307 | 644 | -98.0 | 982 | 523 | -98.5 | ||
| 13)CF09-25(1.25pmole) | 8538 | 8005 | ||||||
| 14)CF09-25+491bp(1bp T-C) | 6430 | ＜0 | -100 | 6039 | ＜0 | -100 |
表2、使用15、20或25个单体长的ssDNA探针进行的人类基因组dsDNA的三链体分析的比较
靶＝人类基因组dsDNA，CFTR野生型
15个单体长的探针＝delta F508-WT15C(野生型)，delta F508-MUT15C(突变型)
20个单体长的探针＝delta F508-WT20C(野生型)，delta F508-MUT20C(突变型)
25个单体长的探针＝delta F508-WT25C(野生型)，deltaF508-MUT25C(突变型)
每个样品中存在600nM YOYO-1。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT34在5分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT34在15分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(600nM) | 207 | 211 | ||||
| 2)delta F508-WT25C(3.2pmole)(反义) | 13680 | 9381 | ||||
| 3)delta F508-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 9169 | 8696 | ||||
| 4)wt gDNA(500pg) | 2723 | 2674 | ||||
| 5)wt gDNA(500pg)+delta F508-WT25C(完全配对) | 21217 | 7537 | 18698 | 9317 | ||
| 6)wt gDNA(500pg)+delta F508-MUT25C | 9913 | 744 | -90.1 | 9355 | 659 | -92.9 |
| 7)delta F508-WT20C(3.2pmole)(反义) | 6293 | 5826 | ||||
| 8)delta F508-MUT20C(3.2pmole)(反义) | 767 | 809 | ||||
| 9)wt gDNA(500pg) | 2481 | 2381 | ||||
| 10)wt gDNA(500pg)+delta F508-WT20C(完全配对) | 7155 | 862 | 6820 | 994 | ||
| 11)wt gDNA(500pg)+delta F508-MUT20C(3bp AAG del) | 1258 | 491 | -43.0 | 1032 | 223 | -77.6 |
| 12)delta F508-WT15C(3.2pmole)(反义) | 3825 | 3639 | ||||
| 13)delta F508-MUT15C(3.2pmole)(反义) | 4597 | 4549 | ||||
| 14)wt gDNA(500pg) | 2505 | 2495 | ||||
| 15)wt gDNA(500pg)+delta F508-WT15C(完全配对) | 4416 | 591 | 4067 | 428 | ||
| 16)wt gDNA(500pg)+delta F508-MUT15C(3bp AAG del) | 5741 | 1144 | +93.5 | 5509 | 960 | +124 |
表2续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT34在30分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT34在45分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(600nM) | 187 | 207 | ||||
| 2)delta F508-WT25C(3.2pmole)(反义) | 8116 | 7455 | ||||
| 3)delta F508-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 8363 | 8120 | ||||
| 4)wt gDNA(500pg) | 2802 | 2798 | ||||
| 5)wt gDNA(500pg)+delta F508-WT25C(完全配对) | 17776 | 9660 | 17380 | 9925 | ||
| 6)wt gDNA(500pg)+delta F508-MUT25C(3bp AAG del) | 9092 | 729 | -92.5 | 8953 | 833 | -91.6 |
| 7)delta F508-WT20C(3.2pmole)(反义) | 5435 | 5193 | ||||
| 8)delta F508-MUT20C(3.2pmole)(反义) | 826 | 802 | ||||
| 9)wt gDNA(500pg) | 2324 | 2300 | ||||
| 10)wt g-DNA(500pg)+delta F508-WT20C(完全配对) | 6652 | 1217 | 6549 | 1356 | ||
| 11)wt gDNA(500pg)+delta F508-MUT20C(3bp AAG del) | 997 | 171 | -85.9 | 863 | 61 | -95.5 |
| 12)delta F508-WT15C(3.2pmole)(反义) | 3528 | 3459 | ||||
| 13)delta F508-MUT15C(3.2pmole)(反义) | 4398 | 5098 | ||||
| 14)wt gDNA(500pg) | 2534 | 2490 | ||||
| 15)wt gDNA(500pg)+delta F508-WT15C(完全配对) | 4089 | 561 | 4139 | 680 | ||
| 16)wt gDNA(50pg)+delta F508-MUT15C(3bp AAG del) | 5384 | 986 | +75.8 | 5213 | 115 | -83.1 |
表3、使用20、25或30个单体长的ssDNA探针进行的人类基因组dsDNA的三链体分析的比较
靶＝人类基因组dsDNA，CFTR野生型
20个单体长的探针＝C677T-WT20C(野生型)，C677T-MUT20C(突变型)
25个单体长的探针＝C677T-WT25C(野生型)，C677T-MUT25C(突变型)
30个单体长的探针＝C677T-WT30C(野生型)，C677T-MUT30C(突变型)
每个样品中存在500nM YOYO-1。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在5分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT30在15分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | |||||
| 2)C677T-WT30C(3.2pmole)(反义) | 24304 | 22982 | ||||
| 3)C677T-MUT30C(3.2pmole)(反义) | 1795 | 1537 | ||||
| 4)wt gDNA(2ng) | 2501 | 2234 | ||||
| 5)wt gDNA(2ng)+C677T-WT30C(完全配对) | 38355 | 14051 | 37063 | 14081 | ||
| 6)wt gDNA(2ng)+C677T-MUS30C(1bp C-A) | 3138 | 1343 | -90.4 | 2575 | 1038 | -92.6 |
| 7)C677T-WT25C(3.2pmole)(反义) | 7856 | 7397 | ||||
| 8)C677T-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 1435 | 1241 | ||||
| 9)wt gDNA(2ng) | 2045 | 1596 | ||||
| 10)wt gDNA(2ng)+C677T-WT25C(完全配对) | 31234 | 23378 | 30865 | 23468 | ||
| 11)wt gDNA(2ng)+C677T-MUT25C(1bp C-A) | 1882 | 447 | -98.1 | 1474 | 233 | -99.0 |
| 12)C677T-WT20C(3.2pmole)(反义) | 221 | 69 | ||||
| 13)C677T-MUT20C(3.2pmole)(反义) | 3297 | 2639 | ||||
| 14)wt gDNA(2ng) | 2084 | 1883 | ||||
| 15)wt gDNA(2ng)+C677T-WT20C(完全配对) | 1321 | 1100 | 854 | 785 | ||
| 16)wt gDNA(2ng)+C677T-MUT20C(1bp C-A) | 4245 | 948 | -13.8 | 3083 | 444 | -43.4 |
表3续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在30分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT30在45分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||||
| 2)C677T-WT30C(3.2pmole)(反义) | 22609 | 22302 | ||||
| 3)C677T-MUT30C(3.2pmole)(反义) | 1304 | 1141 | ||||
| 4)wt gDNA(2ng) | 2162 | 2101 | ||||
| 5)wt gDNA(2ng)+C677T-WT30C(完全配对) | 36679 | 14070 | 36279 | 13977 | ||
| 6)wt gDNA(2ng)+C677T-MUT30C(1bp C-A) | 2377 | 1073 | -92.4 | 2078 | 937 | -93.3 |
| 7)C677T-WT25C(3.2pmole)(反义) | 7060 | 6834 | ||||
| 8)C677T-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 1141 | 979 | ||||
| 9)wt gDNA(2ng) | 1518 | 1518 | ||||
| 10)wt gDNA(2ng)+C677T-WT25C(完全配对) | 30392 | 23332 | 30697 | 23863 | ||
| 11)wt gDNA(2ng)+C677T-MUT25C(1bp C-A) | 1303 | 162 | -99.3 | 1111 | 132 | -99.4 |
| 12)C677T-WT20C(3.2pmole)(反义) | 24 | 4 | ||||
| 13)C677T-MUT20C(3.2pmole)(反义) | 2345 | 2163 | ||||
| 14)wt gDNA(2ng) | 1788 | 1651 | ||||
| 15)wt gDNA(2ng)+C677-WT20C(完全配对) | 694 | 670 | 490 | 486 | ||
| 16)wt gDNA(2ng)+C677T-MUT20C(1bp C-A) | 2575 | 230 | -65.7 | 2185 | 22 | -95.5 |
表4、对不同量的人类基因组dsDNA的三链体分析的比较
靶＝人类基因组dsDNA，FVL野生型
25个单体长的探针＝FVL-WT25C(野生型)，FVL-MUT25C(突变型)
在每个样品中存在500nM YOYO-1。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在5分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT30在15分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||||
| 20FVL-WT25C(3.2pmole)(反义) | 6206 | 6035 | ||||
| 3)FVL-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 44456 | 44427 | ||||
| 4)wt gDNA(2ng) | 3409 | 3421 | ||||
| 5)wt gDNA(2ng)+FVL-WT25C(完全配对) | 26341 | 20135 | 26355 | 20320 | ||
| 6)wt gDNA(2ng)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 34222 | ＜0 | -100 | 33941 | ＜0 | -100 |
| 7)wt gDNA(1ng) | 1198 | 1348 | ||||
| 8)wt gDNA(1ng)+FVL-WT25C(完全配对) | 20409 | 14203 | 21450 | 15415 | ||
| 9)wt gDNA(1ng)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 25049 | ＜0 | -100 | 24984 | ＜0 | -100 |
| 10)wt gDNA(500pg) | 4 | 6 | ||||
| 11)wt gDNA(500pg)+FVL-WT25C(完全配对) | 23757 | 17551 | 23451 | 17416 | ||
| 12)wt gDNA(500pg)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 25594 | ＜0 | -100 | 25480 | ＜0 | -100 |
| 13)wt gDNA(200pg) | 7 | 0 | ||||
| 14)wt gDNA(200pg)+FVL-WT25C(完全配对) | 20925 | 14719 | 20874 | 14839 | ||
| 15)wt gDNA(200pg)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 22325 | ＜0 | -100 | 22378 | ＜0 | -100 |
表4续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在30分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT30在45分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||||
| 2)FVL-WT25C(3.2pmole)(反义) | 5803 | 5518 | ||||
| 3)FVL-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 44650 | 44101 | ||||
| 4)wt gDNA(2ng) | 3687 | 3642 | ||||
| 5)wt gDNA(2ng)+FVL-WT25C(完全配对) | 26378 | 20575 | 26041 | 20523 | ||
| 6)wt gDNA(2ng)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 34069 | ＜0 | -100 | 33633 | ＜0 | -100 |
| 7)wt gDNA(1ng) | 1474 | 1598 | ||||
| 8)wt gDNA(1ng)+FVL-WT25C(完全配对) | 22017 | 16214 | 21862 | 16344 | ||
| 9)wt gDNA(1ng)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 25098 | ＜0 | -100 | 24793 | ＜0 | -100 |
| 10)wt gDNA(500pg) | 8 | 14 | ||||
| 11)wt gDNA(500pg)+FVL-WT25C(完全配对) | 23417 | 17614 | 23159 | 17641 | ||
| 12)wt gDNA(500pg)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 25514 | ＜0 | -100 | 25347 | ＜0 | -100 |
| 13)wt gDNA(200pg) | 0 | 0 | ||||
| 14)wt gDNA(200pg)+FVL-WT25C(完全配对) | 20852 | 15049 | 20698 | 15180 | ||
| 15)wt gDNA(200pg)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 22441 | ＜0 | -100 | 22353 | ＜0 | -100 |
表4续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在60分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | ||
| 2)FVL-WT25C(3.2pmole)(反义) | 5505 | ||
| 3)FVL-MUT25C (3.2pmole)(反义) | 44534 | ||
| 4)wt gDNA(2ng) | 3619 | ||
| 5)wt gDNA(2ng)+FVL-WT25C(完全配对) | 26024 | 20519 | |
| 6)wt gDNA(2ng)+PVL-MUT25C(1bp G-T) | 33801 | ＜0 | -100 |
| 7)wt gDNA(1ng) | 1643 | ||
| 8)wt gDNA(1ng)+FVL-WT25C(完全配对) | 22005 | 16500 | |
| 9)wt gDNA(1ng)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 24913 | ＜0 | -100 |
| 10)wt gDNA(500pg) | 16 | ||
| 11)wt gDNA(500pg)+FVL-WT25C(完全配对) | 23240 | 17735 | |
| 12)wt gDNA(500pg)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 25483 | ＜0 | -100 |
| 13)wt gDNA(200pg) | 0 | ||
| 14)wt gDNA(200pg)+FVL-WT25C(完全配对) | 20720 | 15215 | |
| 15)wt gDNA(20pg)+FVL-MUT25C(1bp G-T) | 22448 | ＜0 | -100 |
表5、从唾液获得的人类基因组dsDNA的三链体分析
靶＝人类基因组dsDNA，CFTR野生型
25个单体长的探针＝2789+5G-＞A-WT25C(野生型)，2789+5G-＞A-MUT25C(突变型)
在每个样品中存在500nM YOYO-1。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在5分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT30在15分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||||
| 2)2789+5G-＞A-WT25C(3.2pmole)(反义) | 23291 | 22608 | ||||
| 3)2789+5G-＞A-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 22804 | 22071 | ||||
| 4)wt gDNA(4ng) | 1530 | 1856 | ||||
| 5)wt gDNA(4ng)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对) | 44651 | 21360 | 43624 | 21016 | ||
| 6)wt gDNA(4ng)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G) | 23893 | 1089 | -94.9 | 23531 | 1460 | -93.1 |
| 7)wt gDNA(2ng) | 21 | 19 | ||||
| 8)wt gDNA(2ng)+2789+5G-＞A-WT25(完全配对) | 38650 | 15359 | 38142 | 15534 | ||
| 9)wt gDNA(2ng)+2789+5G-＞A-MUT25(1bp T-G) | 22453 | ＜0 | -100 | 22430 | 359 | -97.7 |
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT30在30分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ | Genexus氩激光器@PMT30在-45分钟之后的荧光 | 减去ssDNA | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||||
| 2)2789+5G-＞A-WT25C(3.2pmole)(反义) | 22243 | 21877 | ||||
| 3)2789+5G-＞A-MUT25C(3.2pmole)(反义) | 21847 | 21714 | ||||
| 4)wt gDNA(4ng) | 1959 | 2102 | ||||
| 5)wt gDNA(4ng)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对) | 42950 | 20707 | 42412 | 20535 | ||
| 6)wt gDNA(4ng)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G) | 23077 | 1230 | -94.1 | 222806 | 1092 | -93.8 |
| 7)wt gDNA(2ng) | 18 | 18 |
| 8)wt gDNA(2ng)+2789+5G-＞A-WT25(perfect) | 37707 | 15464 | 37351 | 15474 | ||
| 9)wt gDNA(2ng)+2789+5G-＞A-MUT25(1bp T-G) | 21835 | ＜0 | -100 | 21541 | ＜0 | -100 |
表6、使用可选的反应规程进行的人类基因组dsDNA的三链体分析
靶＝人类基因组dsDNA，CFTR野生型
25个单体长的探针＝2789+5G-＞A-WT25C(野生型)，2789+5G-＞A-MUT25C(突变型)
在每个样品中存在500nM YOYO-1和45mM TMA-Cl。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT32在5分钟之后的荧光 | 5min时三链体相关的发射 | 相对于完全配对的变化％ | 15min时三链体相关的发射 | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | ||||
| 2)2789+5G-＞A-WT25C(3.2pmole/80ul) | 21363 | ||||
| 3)2789+5G-＞A-MUT25C(3.2pmole/80ul) | 20717 | ||||
| 4)wt gDNA(2pg/80ul) | 4182 | ||||
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对)* | 28146 | 6783 | 7210 | ||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G)* | 23757 | 3040 | -55 | 3221 | -55 |
| 7)2789+5G-＞A-WT25C(3.2pmole/77.9ul)** | 22575 | ||||
| 8)2789+5G-＞A-MUT25C(3.2pmole/77.9ul)** | 20696 | ||||
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对)* | 7728 | ||||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G)** | 3560 | -54 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
**将探针和YOYO-1对照混合，保温5分钟，然后照射。然后加入基因组DNA，将反应混合物保温5分钟，然后照射。
表6续
| 样品 | 20min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 25min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 30min时三链体相关的发射 | ％of变化 |
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对)* | 8035 | 8239 | ||||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G)* | 3176 | -60 | 3145 | -62 | 3120 | -64 |
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对)* | 9378 | 9867 | 10225 | |||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C** | 4334 | -54 | 4918 | -50 | 5027 | -51 |
| 样品 | 35min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 40min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 45min时三链体相关的发射 | ％of变化 |
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对)* | 9239 | 9848 | 9965 | |||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G)* | 3141 | -66 | 3219 | -67 | 3183 | -68 |
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对) | 10485 | 10702 | 11028 | |||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G)** | 4908 | -53 | 5217 | -51 | 4770 | -57 |
| 样品 | 50min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 55min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 60min时三链体相关的发射 | ％of变化 |
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对) | 9419 | 10022 | 9435 | |||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C | 3432 | -64 | 3802 | -62 | 3318 | -65 |
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-WT25C(完全配对) | 11603 | 12147 | 12752 | |||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+2789+5G-＞A-MUT25C(1bp T-G)** | 4925 | -58 | 5925 | -51 | 5121 | -60 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
**将探针和YOYO-1对照混合，保温5分钟，然后照射。然后加入基因组DNA，将反应混合物保温5分钟，然后照射。
表7、使用可选的反应方案进行的人类基因组dsDNA的三链体分析
靶＝人类基因组dsDNA，CFTR野生型
25个单体长的探针＝3849+10kbC-＞T-WT25C(野生型)，3849+10kbC-＞T-MUT25C(突变型)
在每个样品中存在500nM YOYO-1和40mM TMA-Cl。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT32在5分钟之后的荧光 | 5min时三链体相关的发射 | 相对于完全配对的变化％ | 15min时三链体相关的发射 | 相对于完全配对的变化％ |
| 1)YOYO-1(200nM) | 0 | ||||
| 2)3849+10kbC-＞T-WT25C(3.2pmole/80ul) | 20055 | ||||
| 3)3849+10kbC-＞T-MUT25C(3.2pmole/80ul) | 20399 | ||||
| 4)wt gDNA(2ng/80ul) | 7091 | ||||
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)* | 30228 | 10173 | 10115 | ||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)* | 23481 | 3082 | -70 | 1614 | -84 |
| 7)3849+10kbC-＞T-WT25C(3.2pmole/77.9ul)** | 22696 | ||||
| 8)3849+10kbC-＞T-MUT25C(3.2pmole/77.9ul)** | 20253 | ||||
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)** | 10264 | ||||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)** | 5218 | -49 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
**将探针和YOYO-1对照混合，保温5分钟，然后照射。然后加入基因组DNA，将反应混合物保温5分钟，然后照射。
表7续
| 样品 | 20min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 25min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 300min时三链体相关的发射 | ％of变化 |
| 5)wt gNDA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)* | 10279 | 10335 | 10503 | |||
| 6)wt gNDA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)* | 977 | -90 | 503 | -94 | 113 | -99 |
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)** | 10458 | 10492 | 10476 | |||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)** | 4662 | -55 | 3944 | -62 | 3546 | -66 |
| 样品 | 35min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 40min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 45min时三链体相关的发射 | ％of变化 |
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)* | 10625 | 1073T | 10847 | |||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)* | 227 | -98 | ＜0 | -100 | ＜0 | -100 |
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)** | 10233 | 10778 | 10551 | |||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)** | 3216 | -69 | 3025 | -72 | 2833 | -73 |
| 样品 | 50min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 55min时三链体相关的发射 | ％of变化 | 60min时三链体相关的发射 | ％of变化 |
| 5)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)* | 10945 | 10872 | 10695 | |||
| 6)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)* | ＜0 | -100 | ＜0 | -100 | ＜0 | -100 |
| 9)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-WT25C(完全配对)** | 10973 | 11699 | 12112 | |||
| 10)wt gDNA(2ng/80ul)+3849+10kbC-＞T-MUT25C(1bp A-C)** | 2592 | -76 | 1788 | -85 | 1499 | -88 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
**将探针和YOYO-1对照混合，保温5分钟，然后照射。然后加入基因组DNA，将反应混合物保温5分钟，然后照射。
表8、球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)基因组dsDNA的三链体分析
靶＝球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)基因组dsDNA
25个单体长的探针＝bglIR-WT25C(球形芽孢杆菌的野生型)
每个样品中存在40mM TMA-Cl
样品1-5中存在500nM YOYO-1，样品6-10中存在400nM YOYO-，样品11-17中存在300nM YOYO-1。
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT32在5分钟之后的荧光 | 减去对照 | Genexus氩激光器@PMT32在15分钟之后的荧光 | 减去对照 |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||
| 2)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 3)human gDNA(302拷贝/80ul) | 6004 | 5837 | ||
| 4)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 16704 | 16521 | ||
| 5)B.globigii gDNA(100copies/80ul)+bglIR-WT25C* | 19137 | 2433 | 18583 | 2062 |
| 6)YOYO-1(400-nM) | 0 | 0 | ||
| 7)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 8)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5872 | 5964 | ||
| 9)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 22045 | 22429 | ||
| 10)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR)-WT25C* | 26141 | 4096 | 26075 | 3646 |
| 11)YOYO-1(300nM) | 0 | 0 | ||
| 12)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 13)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5321 | 5330 | ||
| 14)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 28663 | 28582 | ||
| 15)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 35536 | 6873 | 36076 | 7494 |
| 16)human gDNA(302拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 40732 | 40568 | ||
| 17)BG gDNA(100拷贝+hgDNA(302拷贝+bglIR-WT25C* | 43378 | 2646 | 43237 | 2669 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
表8续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT32在25分钟之后的荧光 | 减去对照 | Genexus氩激光器@PMT32在35分钟之后的荧光 | 减去对照 |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||
| 2)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 3)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5693 | 5764 | ||
| 4)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 15724 | 15443 | ||
| 5)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 17945 | 2221 | 17601 | 2158 |
| 6)YOYO-1(400nM) | 0 | 0 | ||
| 7)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 8)buman gDNA(302拷贝/80ul) | 6107 | 5961 | ||
| 9)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 21801 | 21647 | ||
| 10)B.globgii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 25297 | 3496 | 25175 | 3528 |
| 11)YOYO-1(300nM) | 0 | 0 | ||
| 12)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 13)buman gDNA(302拷贝/80ul) | 5225 | 5326 | ||
| 14)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 28103 | 28113 | ||
| 15)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 35810 | 7707 | 35886 | 7773 |
| 16)human gDNA(302拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 40238 | 40436 | ||
| 17)BG gDNA(100拷贝)+hgDNA(302拷贝)+bglIR-WT25C* | 43219 | 2981 | 43390 | 2954 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
表8续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT32在45分钟之后的荧光 | 减去对照 | Genexus氩激光器@PMT32在55分钟之后的荧光 | 减去对照 |
| 1)YOYO-1(500-nM) | 0 | 0 | ||
| 2)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 3)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5617 | 5537 | ||
| 4)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 14902 | 14669 | ||
| 5)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 17027 | 2125 | 16669 | 2000 |
| 6)YOYO-1(400nM) | 0 | 0 | ||
| 7)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 8)human gDNA(302拷贝ul) | 5812 | 5939 | ||
| 9)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 21365 | 21232 | ||
| 10)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 24722 | 3357 | 24633 | 3401 |
| 11)YOYO-1(300nM) | 0 | 0 | ||
| 12)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 13)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5209 | 5215 | ||
| 14)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 27708 | 27606 | ||
| 15)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 35339 | 7631 | 35190 | 7584 |
| 16)human gDNA(302拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 39743 | 39816 | ||
| 17)BG gDNA(100拷贝)+hgDNA(302拷贝+bglIR-WT25C* | 42781 | 3038 | 42705 | 2889 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
表8续
| 样品 | Genexus氩激光器@PMT32在65分钟之后的荧光 | 减去对照 | Genexus氩激光器@PMT32在24小时之后的荧光 | 减去对照 |
| 1)YOYO-1(500nM) | 0 | 0 | ||
| 2)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 3)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5521 | 5706 | ||
| 4)bglIR-WT25C(3.2pmtole/80ul)(反义) | 14435 | 11225 | ||
| 5)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 16383 | 1948 | 11571 | 346 |
| 6)YOYO-1(400nM) | 0 | 0 | ||
| 7)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 8)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5709 | 5996 | ||
| 9)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 21053 | 20366 | ||
| 10)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 24368 | 3315 | 22730 | 2364 |
| 11)YOYO-1(300nM) | 0 | 0 | ||
| 12)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul) | 0 | 0 | ||
| 13)human gDNA(302拷贝/80ul) | 5119 | 5011 | ||
| 14)bglIR-WT25C(3.2pmole/80ul)(反义) | 27517 | 29294 | ||
| 15)B.globigii gDNA(100拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 35074 | 7557 | 35604 | 6310 |
| 16)human gDNA(302拷贝/80ul)+bglIR-WT25C* | 39480 | 41000 | ||
| 17)BG gDNN(100拷贝+hgDNA(302拷贝+bglIR-WT25C* | 42644 | 3164 | 45031 | 4031 |
*探针与基因组DNA混合，然后加入YOYO-1。反应混合物被保温5分钟，然后照射。
序列表
<110>英詹尼斯公司(Ingeneus Inc.)
<120>基因组分析(Genomic Assay)
<130>SCT071337-47
<150>US 60/612,670
<151>2004-09-24
<160>33
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>491
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
gcagagtacc tgaaacagga agtattttaa atattttgaa tcaaatgagt taatagaatc
60
tttacaaata agaatataca cttctgctta ggatgataat tggaggcaag tgaatcctga
120
gcgtgatttg ataatgacct aataatgatg ggttttattt ccagacttca cttctaatga
180
tgattatggg agaactggag ccttcagagg gtaaaattaa gcacagtgga agaatttcat
240
tctgttctca gttttcctgg attatgcctg gcaccattaa agaaaatatc atctttggtg
300
tttcctatga tgaatataga tacagaagcg tcatcaaagc atgccaacta gaagaggtaa
360
gaaactatgt gaaaactttt tgattatgca tatgaaccct tcacactacc caaattatat
420
atttggctcc atattcaatc ggttagtcta catatattta tgtttcctct atgggtaagc
480
tactgtgaat g
491
<210>2
<211>20
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Claims (69)
1.在基因组样品中检测核酸序列的方法，该方法包括：
提供含有双链体核酸的靶核酸序列的基因组样品；
提供含有探针核酸序列的探针；
提供含有基因组样品、探针、杂交促进试剂和标记物的杂交混合物；
将杂交混合物保温以提供含有靶核酸序列、探针和标记物的复合物的保温混合物；
用能够有效刺激至少一些标记物发射能量的射线照射保温混合物；以及
从荧光信号检测探针是否与靶核酸序列完全配对，从而检测核酸序列是否存在于基因组样品中，
其中检测在提供杂交混合物后60分钟内完成，并且本方法的进行不需要使双链体核酸变性，也不需要对双链体核酸进行PCR扩增。
2.权利要求1的方法，其中检测的是单核苷酸多态性或多核苷酸多态性。
3.权利要求1的方法，其中使用一个以上的所述探针检测基因组样品中一个以上的所述核酸序列。
4.权利要求3的方法，其中被检测的是单倍体。
5.权利要求1的方法，其中检测从中获得基因组样品的生物体或细胞的形态学状态，该形态学状态包括与发育阶段有关的信息和与疾病状态有关的信息中的至少一种。
6.权利要求1的方法，其中的基因组样品含有少于700个拷贝的靶核酸序列。
7.权利要求6的方法，其中的基因组样品含有大约150个到大约300个拷贝的靶核酸序列。
8.权利要求6的方法，其中的基因组样品基本上由单个细胞的内含物构成。
9.权利要求1的方法，其中的检测在生物细胞中进行。
10.权利要求1的方法，其中的基因组样品的长度大于5kb。
11.权利要求1的方法，其中的基因组样品在整个方法过程中没有被消化。
12.权利要求1的方法，其中的靶核酸序列属于病原体，该病原体存在于或以前存在于从中获得了基因组样品的生物体或细胞中。
13.权利要求1的方法，其中的探针如果是单一的，是长度为15到30个碱基的单链核酸或核酸类似物。
14.权利要求1的方法，其中的杂交促进试剂是嵌入性标记物。
15.权利要求14的方法，其中的嵌入性标记物包括二聚体花青染料。
16.权利要求15的方法，其中的嵌入性标记物由YOYO-1组成。
17.权利要求1的方法，其中的标记物是也构成杂交促进试剂的嵌入性荧光团。
18.权利要求1的方法，其中的杂交促进试剂是kosmotrope。
19.权利要求1的方法，其中的杂交促进试剂是选自以下化合物的阳离子：(CH3)4NCl、(CH3)3N·HCl、NaCl、Na2SO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4。
20.权利要求1的方法，其中的标记物是非嵌入性荧光团。
21.权利要求1的方法，其中的保温时间是从1到10分钟，并且方法在少于15分钟的时间内完全执行。
22.权利要求1的方法，其中的杂交混合物在整个保温时期内维持在20到40℃的温度。
23.权利要求1的方法，其中探针的至少一个碱基通过Watson-Crick互补碱基相互作用和/或同源碱基相互作用与靶的碱基或碱基对结合，从而使复合物成为三链体。
24.权利要求1的方法，其中探针的至少一个碱基通过Watson-Crick互补碱基相互作用和/或同源碱基相互作用与靶的碱基或碱基对结合，从而使复合物成为四链体。
25.权利要求1的方法，其中探针和靶核酸序列不仅仅作为服从Watson-Crick碱基配对规则的反向平行的链结合在一起。
26.权利要求1的方法，其中的射线是能量密度大约为84W/cm2/sec的激光束。
27.权利要求1的方法，其中的荧光信号与参比荧光信号进行比较，以确定探针是否与靶核酸序列完全配对。
28.权利要求1的方法，其中的检测包括监测荧光信号随时间的变化以确定探针是否与靶核酸序列完全配对，以及其中荧光信号随时间增加表明完全配对，而荧光信号随时间减小表明缺少完全配对。
29.权利要求1的方法，其中的探针以靶饱和量提供到杂交混合物中，该靶饱和量是超过靶浓度的探针浓度，标记物以复合物饱和量提供到杂交混合物中，该复合物饱和量是标记物浓度，在高于该浓度时，来自背景信号的信号差异变化的第一速度小于标记物浓度变化的第二速度。
30.权利要求1的方法，其中探针具有能够有效地最适化能量转移或迁移的长度。
31.权利要求30的方法，其中来自背景信号的荧光信号的差异被靶内嵌入的标记物和靶-探针中嵌入的标记物之间的能量转移或能量迁移所最大化。
32.权利要求30的方法，其中的探针的长度为20-30个碱基或碱基对。
33.权利要求1的方法，其中探针的长度被选择成能够使荧光信号的强度最大化。
34.权利要求1的方法，其中的探针以靶饱和量提供到杂交混合物中，标记物以复合物饱和量提供到杂交混合物中，并且探针具有能够有效地最适化能量转移或迁移的长度。
35.权利要求1的方法，其中含有缓冲液和水的预备混合物被施加电荷，以有效地增加方法的灵敏度，至少一部分预备混合物随后被加入到杂交混合物中。
36.权利要求1的方法，其中的基因组样品在探针、杂交促进试剂和标记物之后加入到杂交混合物中。
37.权利要求1的方法，其中杂交促进试剂或标记物被最后加入到杂交混合物中。
38.权利要求1的方法，其中的基因组样品是纯化的、半纯化的、未纯化的或稀释的。
39.权利要求1的方法，其中基因组样品中的基因产物的表达水平被测定，或至少两个基因组样品中的基因产物的表达被比较。
40.权利要求1的方法，其中的杂交混合物还含有多个与基因组样品中邻近靶核酸序列的序列结合的探针。
41.权利要求1的方法，其中的探针含有发射淬灭剂和至少一种标记物。
42.权利要求1的方法，其中的探针被至少一种连接基团所修饰。
43.权利要求1的方法，其中的标记物包括FET、FRET、能量迁移或氧化还原组。
44.权利要求1的方法，其中的标记物含有量子点。
45.权利要求1的方法，其中检测了核酸序列的重复、插入或缺失。
46.权利要求1的方法，其中的检测在不同的杂交混合物条件下被重复。
47.权利要求1的方法，其中从中获得基因组样品的生物体或细胞的癌症或疾病状态被检测，或生物体的怀孕状态被确定。
48.权利要求1的方法，其中的基因组样品从人类的组织、口腔细胞、血液、流体、痰液、尿液或粪便样品中获得，并用适合于识别基因组样品来源的分子识别标签进行标记。
49.权利要求1的方法，其中探针被提供在选自以下的支持物上：珠子、平板、膜、薄膜、微孔、电极、柱子和毛细管。
50.权利要求1的方法，其中的探针被提供在银岛膜上。
51.用于实施权利要求1的方法的试剂盒，该试剂盒包含：
探针；
杂交促进试剂；和
标记物。
52.权利要求51的试剂盒，还包含了其内提供杂交混合物的容器。
53.权利要求52的试剂盒，其中的容器适合于收集痰液，或试剂盒还包含了痰液收集装置。
54.权利要求52的试剂盒，其中的容器含有适合于识别基因组样品来源的分子识别标签。
55.权利要求51的试剂盒，其中的探针被提供在选自以下的支持物上：珠子、平板、膜、薄膜、微孔、电极、柱子和毛细管。
56.权利要求55的试剂盒，其中的支持物是银岛膜。
57.权利要求51的试剂盒，其中的探针是单链的并含有发夹结构，也可以是双链的。
58.权利要求51的试剂盒，其中的标记物包括二聚体花青染料。
59.权利要求51的试剂盒，其中的标记物和杂交促进试剂由YOYO-1组成。
60.权利要求51的试剂盒，其中的杂交促进试剂是选自以下的至少一种化合物：(CH3)4NCl、(CH3)3N·HCl、NaCl、Na2SO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4。
61.在基因组样品中检测核酸序列的方法，该方法包括：
提供含有单链或双链核酸的靶核酸序列的基因组样品；
提供含有探针核酸序列的探针；
提供含有基因组样品、探针、杂交促进试剂和标记物的杂交混合物；
将杂交混合物保温以提供含有靶核酸序列、探针和标记物的复合物的保温混合物；
对保温混合物施加有效地从杂交混合物中引发信号的能量；以及
从信号检测探针是否与靶核酸序列完全配对，从而检测核酸序列是否存在于基因组样品中，
其中检测在提供杂交混合物后60分钟内完成，并且本方法的进行不需要使双链体核酸变性，也不需要对双链体核酸进行PCR扩增。
62.权利要求61的方法，其中在保温步骤之后和施加能量步骤之前，在能够使探针从靶核酸序列上解离的条件下对保温混合物进行进一步保温，并且其中的检测步骤包括从信号中确定探针是否从靶核酸序列上以及确定保温条件，从而确定探针是否与靶核酸序列完全配对。
63.权利要求1的方法，其中在保温步骤之后和施加能量步骤之前，在能够使探针从靶核酸序列上解离的条件下对保温混合物进行进一步保温，并且其中的检测步骤包括从信号中确定探针是否从靶核酸序列上解离以及确定保温条件，从而确定探针是否与靶核酸序列完全配对。
64.权利要求1的方法，其中的探针含有一个或多个部分，至少一个部分的长度是5到30个碱基。
65.权利要求1的方法，其中的分离步骤在照射步骤之前进行。
66.权利要求1的方法，还包括提供至少一种阻断探针以抑制探针与基因组样品中的非靶序列结合的步骤。
67.权利要求1的方法，其中的复合物起光子结构的作用，用于收集光子能量并将能量转移到发射信号的标记物上。
68.权利要求1的方法，其中所述方法的步骤被重复一次以上，以提供一种以上的杂交混合物和一种以上的荧光信号，前提是每种杂交混合物是通过将基因组样品、探针、杂交促进试剂和标记物按照不同的次序混合而形成的。
69.权利要求1的方法，其中的检测包括监测荧光信号的荧光各向异性随时间的变化，以确定探针是否与靶核酸序列完全配对。
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