JP6300263B2 - 核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法 - Google Patents
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Description
項1. 下記第1工程及び第2工程を含むことを特徴とする、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法:
第1工程:被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程;
ここで、前記(i)リガンドが、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドであり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第2工程:前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。
項2. 前記被検核酸試料がRNAを含む試料であり、RNAの四重螺旋構造を配列特異的に検出する、項1に記載の検出方法。
項3. 前記(i)リガンドが、チオフラビンT、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにN―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも1種である、項1又は2に記載の検出方法。
項4. 前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の3’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の5’末端の塩基をn位とした場合にn−1位〜n−25位である、項1〜3のいずれかに記載の検出方法。
項5. 前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の5’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の3’末端の塩基をn位とした場合にn+1位〜n+25位である、項1〜3のいずれかに記載の検出方法。
項6. 前記(ii)核酸プローブに含まれる塩基数が5〜20個である、項1〜5のいずれかに記載の検出方法。
項7. 前記(i)リガンドがチオフラビンTであり、(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質がROXである、項1〜6のいずれかに記載の検出方法。
項8. 核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出するための検出キットであって、
(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。
本発明の検出方法は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法であって、被検核酸試料に対して(i)特定のリガンドと(ii)特定の核酸プローブを接触させる第1工程、及び蛍光エネルギー移動を測定する第2工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の検出方法について詳述する。
図1に示すように、RNAやDNA等の核酸鎖において、グアニジンに富む塩基配列部分がグアニン四量体(G−quartet)を形成して四重螺旋構造(G−quadruplex)を形成することが知られている。本発明の検出方法では、核酸鎖における四重螺旋構造を配列特異的に検出する。
本発明では、リガンドとして、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質を使用する。
本発明では、検出対象となる特定の核酸鎖に結合する蛍光標識核酸プローブを使用する。
本発明では、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が蛍光エネルギー移動を起すことによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出される。即ち、本発明では、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質は、それぞれ蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にあるものが選択して使用される。
本発明の検出方法における第1工程では、被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる。被検核酸試料に、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖が含まれている場合には、当該核酸鎖の四重螺旋構造部分に前記(i)リガンドが結合し、且つ当該核酸鎖の四重螺旋構造の近傍にある塩基配列に前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズした状態になる(図2に示す状態)。このような状態で、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖と、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブとが複合化することにより、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の間で蛍光エネルギー移動が生じる状態になる。なお、図2には、便宜上、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖としてVEGFのmRNAの部分配列(総塩基数34、5’末端側から1〜18位の塩基配列において四重螺旋構造を形成)、前記(i)リガンドとしてチオフラビンT、前記(ii)核酸プローブとしてROX標識されたDNAプローブ(総塩基数15、前記核酸鎖の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)を使用した場合の模式図が示されている。
本発明の検出方法における第2工程では、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させた状態で、前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する。前述するように、被検核酸試料に検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」が含まれている場合には、蛍光エネルギー移動が生じるので、当該蛍光エネルギー移動を測定することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に定性的又は定量的に求めることが可能になる。
本発明の検出キットは、前記「1.核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法」を実施するために使用されるキットであって、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブを含むことを特徴とする。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖1:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号1:5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、5’末端側から1〜15位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸鎖2:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号2:5'-AGAAGAGAAGGAAGA-3'、四重螺旋構造の形成なし)
核酸プローブ1:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号3:5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号1の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)
核酸プローブ2:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号4:5'-TCTTCCTTCTCTTCT-3'、配列番号2の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
(条件1:実施例)
反応溶液中に、20μMの核酸鎖1、20μMの核酸プローブ1、及び10μMのリガンドを添加して混合した後に、0〜90℃温度領域における260nmにおける吸光度(260nmにおけるUV溶解曲線)と、0〜90℃温度領域における295nmにおける吸光度(295nmにおけるUV溶解曲線)を、紫外可視近赤外分光光度計(UV-1800、島津製作所社製)を用いて測定した。
(条件2:コントロール1)
反応溶液中に、20μMの核酸鎖2、20μMの核酸プローブ2、及び10μMのリガンドを添加して混合した後、前記条件1と同様に、260nmにおけるUV溶解曲線を測定した。
(条件3:コントロール2)
反応溶液中に、20μMの核酸鎖1、及び10μMのリガンドを添加して混合した後、前記条件1と同様に、295nmにおけるUV溶解曲線を測定した。
得られた結果を図3に示す。図3から明らかなように、核酸鎖1、核酸プローブ1及びリガンドを共存させた場合(条件1)では、核酸鎖2、核酸プローブ2及びリガンドを共存させた場合(条件2)とは260nmにおけるUV溶解曲線が異なっているが融解挙動が見られた。更に、核酸鎖1及びリガンドを共存させた場合(条件3)とは295nmにおけるUV溶解曲線が異なっていたが、融解挙動が見られた。260nmにおけるUV溶解挙動と295nmにおけるUV溶解挙動は、二重螺旋構造の熱変性と四重螺旋構造の熱変性を示している。即ち、本実験結果から、核酸鎖1、核酸プローブ1及びリガンドを共存させることによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖と、リガンドと、核酸プローブによって複合体が形成されていることが示された。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖1:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号1:5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、5’末端側から1〜15位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ1:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号3:5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号1の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に1μMの核酸鎖1及び10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、及び1.0μMとなるように核酸プローブ1を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して450nm〜750nmの蛍光強度を測定した。
得られた結果を図4に示す。図4に示されているように、核酸プローブ1の添加量を増やすほど、リガンドであるチオフラビンTの蛍光強度(485nm)が減少し、核酸プローブ1に使用されているROX蛍光強度(601nm)が増加する傾向が確認された。即ち、本結果から、核酸鎖1、核酸プローブ1及びリガンドが複合体を形成し、リガンドであるチオフラビンTから核酸プローブ1のROXに蛍光エネルギー移動が生じ、チオフラビンTの蛍光強度の低下とROXの蛍光強度の上昇が起こったことが明らかとなった。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖1:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号1:5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、5’末端側から1〜15位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ1:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号3:5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号1の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に0又は1μMの核酸鎖1、及び0又は10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、0、0.003、0.1、0.3、及び1.0μMとなるように核酸プローブ1を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して593nmの蛍光強度を測定した。
得られた結果を図5に示す。図5に示されているように、核酸鎖1及びリガンドのいずれか一方又は双方を塩化しなかった場合には、ROXの蛍光波長に対応する593nmの蛍光強度の上昇は観察されなかったが、核酸鎖1、リガンド及び核酸プローブ1が添加されたされた場合には、593nmの蛍光強度の著しい上昇が認められた。即ち、本結果から、核酸プローブ1が核酸鎖1に配列特異的に結合することによって、リガンドであるチオフラビンTから核酸プローブ1のROXに蛍光エネルギー移動が生じていることが明らかとなった。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖3:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号5:5'-GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGUCCCGGCGGGGCGGAG-3'、5’末端側から1〜20位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ3:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号6:5'-CTCCGCCCCGCCGGG-3'、配列番号5の5’末端側から22〜36位の塩基配列に対する相補鎖)
核酸プローブ4:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号7:5'-CTCCGAAAAACCGGG-3'、配列番号5の5’末端側から22〜26及び32〜36位の塩基配列に対して相補的な塩基配列であるが、配列番号5の5’末端側から27〜31位塩基配列に対しては非相補的(ミスマッチ)な塩基配列である)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に1μMの核酸鎖3及び10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、及び1.0μMとなるように核酸プローブ3又は核酸プローブ4を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して450nm〜750nmの蛍光強度を測定した。
得られた結果を図6に示す。図6に示されているように、核酸鎖3及びリガンドの存在下で、核酸鎖3に対して相補的な配列を有する核酸プローブ3を添加した場合には、核酸プローブ3の添加量の増加に伴って、リガンドであるチオフラビンTの蛍光波長に対応する485nmの蛍光強度の低下、及びROXの蛍光波長に対応する593nmの蛍光強度の上昇が認められた。一方、核酸鎖3及びリガンドの存在下で、核酸鎖3に対してハイブリダイズできない核酸プローブ4を添加した場合には、核酸プローブ4の添加量を増加させても、チオフラビンTの蛍光強度の減少とROXの蛍光強度の上昇は共に認められなかった。即ち、本結果から、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖を配列特異的に検出可能になることが明らかとなった。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖4:NRASのmRNAの部分配列(配列番号8:5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、5’末端側から1〜18位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸鎖5:BCL2のmRNAの部分配列(配列番号9:5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、5’末端側から17〜41位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ3:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号6:5'-CTCCGCCCCGCCGGG-3'、配列番号5の5’末端側から22〜36位の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に1μMの核酸鎖4又は核酸鎖5、及び10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、及び1.0μMとなるように核酸プローブ3を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して450nm〜750nmの蛍光強度を測定した。
得られた結果を図7に示す。図7から明らかなように、核酸鎖4及び核酸鎖5のいずれの場合でも、核酸プローブ3の添加量を増加させても、チオフラビンTの蛍光強度の減少とROXの蛍光強度の上昇は共に認められなかった。即ち、本結果から、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用しない場合には、蛍光エネルギー移動が生じないことが確認された。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖4:NRASのmRNAの部分配列(配列番号8:5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、5’末端側から1〜18位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸鎖5:BCL2のmRNAの部分配列(配列番号9:5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、5’末端側から17〜41位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ5:5’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号10:5'-CATGCGGCAGGCCGC-3'、配列番号8の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)
核酸プローブ6:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号11:5'-GAGAAAGAAGAGGAG-3'、配列番号9の5’末端側から1〜15位の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に1μMの核酸鎖4、及び10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、及び1.0μMとなるように核酸プローブ5を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して450nm〜750nmの蛍光強度を測定した。
得られた結果を図8に示す。図8から明らかなように、NRASのmRNAの部分配列である核酸鎖4、及びBCL2のmRNAの部分配列である核酸鎖5のいずれの場合でも、当該核酸鎖に相補的な配列を有する核酸プローブとリガンド(チオフラビンT)を添加した場合に、核酸プローブの添加量の増加に伴って、チオフラビンTの蛍光強度の減少とROXの蛍光強度の上昇が認められ、蛍光エネルギー移動が生じたことが確認された。即ち、本結果からも、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖を配列特異的に検出可能になることが明らかとなった。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖1:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号1:5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、5’末端側から1〜15位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸鎖4:NRASのmRNAの部分配列(配列番号8:5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、5’末端側から1〜18位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸鎖5:BCL2のmRNAの部分配列(配列番号9:5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、5’末端側から17〜41位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ1:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号3:5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号1の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)
核酸プローブ5:5’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号10:5'-CATGCGGCAGGCCGC-3'、配列番号8の5’末端側から20〜34位の塩基配列に対する相補鎖)
核酸プローブ6:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号11:5'-GAGAAAGAAGAGGAG-3'、配列番号9の5’末端側から1〜15位の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に1μMの核酸鎖1、核酸鎖4又は核酸鎖5、及び10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、1μMの核酸プローブ1、核酸プローブ5又は核酸プローブ6を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して、485nmの蛍光強度(ドナー蛍光物質の蛍光強度)を測定した。また、核酸プローブを添加しないこと以外は、上記と同様の条件で、485nmの蛍光強度(ドナー蛍光物質の蛍光強度)を測定した。次いで、下記算出式に基づいて、FRET効率を求めた。
FRET効率=1−(FDA/FD)
FDA:アクセプター蛍光物質(核酸プローブ)存在下でのドナー蛍光物質の蛍光強度
FD:アクセプター蛍光物質(核酸プローブ)非存在下でのドナー蛍光物質の蛍光強度
得られた結果を図9に示す。図9に示されているように、核酸鎖と当該核酸鎖にハイブリダイズ可能な核酸プローブの組み合わせの場合においてのみ、高いFRET効率が認められた。即ち、本結果からも、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的な検出が可能になることが明らかとなった。
1.実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖6:VEGFのmRNAの部分配列(配列番号12:5'-GCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGUGCUAGCUCGGGCCGGGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAGUGGCGACUCGGCGCUCGGAA-3'、5’末端側から52〜69位の塩基配列で四重螺旋構造を形成)
核酸プローブ1:3’末端がROXで標識されたDNAプローブ(配列番号3:5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号12の5’末端側から71〜85位の塩基配列に対する相補鎖)
リガンド:チオフラビンT
反応溶液:100mMのKClを含む50mMのMES-LiOH緩衝液(pH7)
反応溶液中に1μMの核酸鎖6、及び10μMのリガンドを添加して、95℃で5分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、0.5℃/分の冷却速度で25℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、及び1.0μMとなるように核酸プローブ1を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ(Varioskan Flash)にて450nmの励起光を照射して450nm〜750nmの蛍光強度を測定した。
得られた結果を図10に示す。図10に示されているように、核酸鎖が長鎖RNAであっても、当該核酸鎖にハイブリダイズ可能な核酸プローブとリガンド(チオフラビンT)を共存させることにより、蛍光エネルギー移動が生じることが確認された。即ち、本結果から、比較的長い核酸鎖を検出対象としても、四重螺旋構造を配列特異的に検出できることが明らかとなった。
Claims (7)
- 下記第1工程及び第2工程を含むことを特徴とする、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法:
第1工程:被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程;
ここで、前記(i)リガンドが、チオフラビンT、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにN―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも1種であり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第2工程:前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。 - 前記被検核酸試料がRNAを含む試料であり、RNAの四重螺旋構造を配列特異的に検出する、請求項1に記載の検出方法。
- 前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の3’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の5’末端の塩基をn位とした場合にn−1位〜n−25位である、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の5’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の3’末端の塩基をn位とした場合にn+1位〜n+25位である、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記(ii)核酸プローブに含まれる塩基数が5〜20個である、請求項1〜4のいずれかに記載の検出方法。
- 前記(i)リガンドがチオフラビンTであり、(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質がROXである、請求項1〜5のいずれかに記載の検出方法。
- 核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出するための検出キットであって、
(i)チオフラビンT、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにN―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも1種からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。
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