JP4873427B2 - 核酸の増幅反応に用いるヘアピンプライマー及びその利用 - Google Patents
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Description
核酸増幅を確認する方法としては、例えば、PCRなどの核酸増幅反応に供した後の反応液を、ポリイミドなどのゲルを用いてゲル電気泳動に供した後、PCR増幅により得られたDNA断片を染色することにより行なう方法がある。
上述したPCRなどの核酸増幅反応において、核酸の増幅が得られたか否かの確認は、煩雑な作業や長時間を要し、高コストであるという問題を有している。
発明者らは、上記課題の解決のため、鋭意検討を行なった。その結果、核酸増幅反応に用いるプライマーの5’末端に、ヘアピン構造を形成し、かつヘアピン構造中にバルジ構造を有するDNA断片を結合したヘアピンプライマーを用いて核酸増幅反応を行なえば、ヘアピンプライマーは相補鎖の伸長によりヘアピン構造が解消され、その結果バルジ構造が消失することを見出し、バルジ構造結合分子を用いて反応前後のバルジ構造の量を検出、比較することで核酸の増幅を容易に確認することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明に係るDNA断片は、ヘアピン構造を形成する一本鎖DNA断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであればよく、これを核酸増幅反応に用いるプライマーの5’末端に結合して用いればよい。
本発明に係るDNA断片が有するバルジ構造の数は、1つのみでもよいが、複数であることが好ましく、さらに好ましくは、2〜4個である。バルジ構造を複数備えることで、後述するバルジ構造結合分子が結合可能な部位が増えるため、高感度な上記ヘアピンプライマーの検出が可能となる。
本発明に係るDNA断片が備えるバルジ構造は、アデニンバルジ構造、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、グアニンバルジ構造のいずれでもよい。
以上に述べた本発明に係るDNA断片の塩基配列の具体例としては、配列番号1〜5に示す塩基配列を挙げることができる。これらの中では、DNAのTCT部分とAA部分の対合によりシトシンバルジ構造が形成されていることから、配列番号1〜4に示す塩基配列が好ましく、さらに好ましくは、シトシンバルジ構造を複数形成する配列番号1〜3に示す塩基配列が好ましい。
本明細書において「ヘアピンプライマー」とは、核酸増幅反応に用いるプライマーの5’末端に、本発明に係るDNA断片を結合させたものが意図される。
本発明に係る核酸増幅確認方法は、本発明に係るヘアピンプライマーを、少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、核酸増幅反応を行なう工程と、バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含めばよい。
反応前ヘアピンプライマー測定工程及び反応後ヘアピンプライマー測定工程は、バルジ構造結合分子を、本発明に係るヘアピンプライマーが有するバルジ構造に結合させて、バルジ構造を検出することにより行なう。
本発明に係るSNP検出方法は、本発明に係る核酸増幅確認方法を用いればよい。
本発明に係るSNP検出方法では、上述した3’末端の位置が検出対象のSNPの位置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いればよい。さらに、上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
当該コンペティタープライマーの3’末端は、検出対象のSNPの位置になるように設計されており、かつ、3’末端には、上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のSNPの位置の塩基に相補的な塩基、又は、上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のSNPの位置の塩基に相補的な塩基、を有することが好ましい。
本発明に係る試薬キットは、少なくとも本発明に係るDNA断片を含めばよい。さらに、本発明に係るDNA断片をキットの使用者が任意に設計した核酸増幅用プライマーの5’末端に結合するためのDNAリガーゼ等の試薬を含んでもよい。
本発明によれば、上述のSNP解析等を、従来の方法に比べて低コストで行なうことができる。
本実施例では、サンプルDNAとして公知のプラスミドであるpUC18(GenBank Accession Number L09136)を、以下に示す条件におけるPCRの鋳型に用いた。
本実施例では、takei2、takei2-2を用いて、シトシンバルジ構造を形成する塩基配列による、バルジ構造結合蛍光分子が発光する蛍光強度の相違について検討した。
本実施例では、PCRサイクル数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を検討した。
本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーと、ヘアピン構造を備えないプライマーとを、それぞれ用いたPCRの結果を比較した。
本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的PCRによる、PCRサイクル数と核酸の増幅効率との関係について検討した。
本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的PCRに、さらにコンペティタープライマーを用いた場合の、PCRサイクル数と核酸の増幅効率との関係について検討した。
Claims (14)
- ヘアピン構造を形成する一本鎖DNA断片の3’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合しているヘアピンプライマーであって、
ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、
上記バルジ構造が複数存在し、
上記バルジ構造がシトシンバルジ構造であることを特徴とするヘアピンプライマー。 - 上記シトシンバルジ構造が、上記一本鎖DNA断片中のチミン−シトシン−チミン配列におけるチミンと、アデニン−アデニン配列におけるアデニンとが、チミン−アデニン塩基対で分子内対合することにより形成されることを特徴とする請求項1に記載のヘアピンプライマー。
- 配列番号1〜5のいずれか1つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求項1に記載のヘアピンプライマー。
- 上記核酸増幅反応は、PCRであることを特徴とする請求項1に記載のヘアピンプライマー。
- 核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、
請求項1に記載のヘアピンプライマーを少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、
核酸増幅反応を行なう工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含むことを特徴とする核酸増幅確認方法。 - 上記バルジ構造結合分子が、ナフチリジン環を有する化合物であることを特徴とする請求項5に記載の核酸増幅確認方法。
- 上記ナフチリジン環を有する化合物が、下記式(1)
で示される2,7‐ジアミノナフチリジン誘導体であることを特徴とする請求項6に記載の核酸増幅確認方法。 - 上記2,7‐ジアミノナフチリジン誘導体が、下記式(2)
- 上記反応前ヘアピンプライマー測定工程は、上記核酸増幅反応液に上記バルジ構造結合分子を添加して行ない、さらに当該核酸増幅反応液をそのまま核酸増幅反応に供することを特徴とする請求項6に記載の核酸増幅確認方法。
- 請求項5〜9のいずれか1項に記載の核酸増幅確認方法を用いることを特徴とするSNP検出方法。
- 上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの3’末端の位置が、検出対象のSNPの位置になるように設計されていることを特徴とする請求項10に記載のSNP検出方法。
- 上記3’末端の位置が検出対象のSNPの位置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いることを特徴とする請求項11に記載のSNP検出方法。
- 上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
当該コンペティタープライマーの3’末端は、検出対象のSNPの位置になるように設計されており、かつ、3’末端には、
上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のSNPの位置の塩基に相補的な塩基、又は、
上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のSNPの位置の塩基に相補的な塩基、を有することを特徴とする請求項12に記載のSNP検出方法。 - 核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも請求項1〜3のいずれか1項に記載のヘアピンプライマーを含むことを特徴とする試薬キット。
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