JP6440997B2 - Ｐｃｒ法およびｐｃｒキット - Google Patents

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Description

本発明は、ＰＣＲ法およびＰＣＲキットに関する。
遺伝子の検出に広く利用されているリアルタイムＰＣＲ（real time polymerase chain reaction）法として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法を挙げることができる。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）法は、非常に感度の高い方法ではあるが、検出に用いるプローブの設計および合成が煩雑であるとともに、検出コストが高いという問題点を有している。
一方、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法は、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光強度が増大する色素を利用する簡便な方法であるが、非特異的に増幅された二本鎖ＤＮＡをも“ポジティブ”として検出してしまうことから、検出エラーが大きいという問題点を有している。更に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法は、検出精度の高いプライマーの設計が難しいという問題点を有している。
上述したＴａｑＭａｎ（登録商標）法およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法の問題点を解決するべく、現在までに、新たなＰＣＲ法が開発されてきた（例えば、特許文献１参照）。
図２６を用いて、特許文献１に記載の技術の基本概念を説明する。
特許文献１に記載の技術は、分子内で二本鎖を形成し得るとともに、当該二本鎖中にシトシンバルジ構造を形成し得るプライマーであって、当該バルジ構造に２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）が結合した時に蛍光を発するプライマーを用いている。なお、シトシンバルジ構造は、対になる相補的なヌクレオチドが存在しないシトシンによって形成される特徴的な構造である。
ＰＣＲ反応が開始される前の時点では、上記プライマー中のシトシンバルジ構造にはＤＡＮＰが結合しており、強い蛍光が発生している（図２６の（ｄ）参照）。
ＰＣＲ反応が開始されると、まず、上記プライマーが鋳型に結合するとともに、当該プライマーを起点として鋳型の相補鎖が伸長される（図２６の（ａ）参照）。
次いで、上記相補鎖と上記鋳型とによって形成されている二本鎖は、高温処理によって、相補鎖からなる一本鎖（以下、一本鎖Ａと呼ぶ）と、鋳型からなる一本鎖とに分離される。
次いで、一本鎖Ａに対して別のプライマー（図２６には、別のプライマーを図示せず）が結合し、当該別のプライマーを起点として一本鎖Ａの相補鎖が伸長される（図２６の（ｂ）参照）。
一本鎖Ａの相補鎖が伸長される過程において、当該相補鎖中に、上記シトシンに対応する相補的なヌクレオチドが形成される。そして、その結果、シトシンバルジ構造が失われることになる（図２６の（ｃ）参照）。
特許文献１に記載の技術では、ＰＣＲ反応が進むにつれてシトシンバルジ構造の数が減少し、その結果、蛍光強度が減少することになる（図２６の（ｄ）参照）。そして、特許文献１に記載の技術では、蛍光強度の低下を観察することによって、ＰＣＲ反応の検出を行っている。
ＷＯ２００８／０２６５８２ Ａ１（２００８年３月６日公開）
しかしながら、上述した従来技術は、十分な検出精度を有する簡便な技術ではあるが、更に高い検出精度と簡便性とを求める要求があった。
例えば、上述した従来技術は、バルジ構造を形成するために長いプライマーを用いる必要があり、その結果、当該プライマーが非特異的に鋳型に結合して非特異的な遺伝子の増幅をもたらす可能性が否定できない。
また、上述した従来技術は、蛍光強度の減少量を測定することによってＰＣＲ反応を検出する方法であるため、ダイナミックレンジが小さく、検出精度が低くなる傾向があった。
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、より検出精度が高く、かつ、簡便なＰＣＲ法およびＰＣＲキットを提供することにある。
本発明のＰＣＲ法は、上記課題を解決するために、第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットと、上記プライマーセットによって増幅される鋳型と、上記第１プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、かつ、上記第１プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第１プローブと、上記バルジ構造に結合することによってシグナルを発するバルジ構造結合分子と、を含む試料をＰＣＲ反応にかける工程を含むことを特徴としている。
本発明のＰＣＲ法では、上記第１プローブは、上記バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドで互いに二本鎖を形成する第１ポリヌクレオチド配列および第２ポリヌクレオチド配列と、上記第１プライマーの一部分と二本鎖を形成する第３ポリヌクレオチド配列と、を有し、上記第３ポリヌクレオチド配列は、上記第１ポリヌクレオチド配列または上記第２ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含んでいることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記第３ポリヌクレオチド配列と上記第１プライマーとによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ１、上記第１ポリヌクレオチド配列と上記第２ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ２、としたときに、Ｔｍ１＞Ｔｍ２であることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記第１プローブは、複数のバルジ構造を形成するものであることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記試料は、更に、上記第２プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、かつ、上記第２プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第２プローブを含むことが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記第２プローブは、上記バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドで互いに二本鎖を形成する第４ポリヌクレオチド配列および第５ポリヌクレオチド配列と、上記第２プライマーの一部分と二本鎖を形成する第６ポリヌクレオチド配列と、を有し、上記第６ポリヌクレオチド配列は、上記第４ポリヌクレオチド配列または上記第５ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含んでいることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記第６ポリヌクレオチド配列と上記第２プライマーとによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ３、上記第４ポリヌクレオチド配列と上記第５ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ４、としたときに、Ｔｍ３＞Ｔｍ４であることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記第２プローブは、複数のバルジ構造を形成するものであることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記バルジ構造は、シトシンバルジ構造、または、チミンバルジ構造であることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、バルジ構造結合分子は、ナフチリジン環を有する化合物であることが好ましい。
本発明のＰＣＲ法では、上記試料は、更に、コンペティタープライマーを含み、上記コンペティタープライマーは、上記鋳型と二本鎖を形成する上記第１プライマー内の領域にて、少なくとも１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されている第７ポリヌクレオチド配列を有するものであることが好ましい。
本発明のＰＣＲキットは、上記課題を解決するために、第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットによって鋳型を増幅するためのＰＣＲキットであって、上記第１プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、上記第１プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第１プローブと、上記バルジ構造に結合することによってシグナルを発するバルジ構造結合分子と、を備えていることを特徴としている。
本発明のＰＣＲキットは、更に、上記第２プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、上記第２プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第２プローブを備えていることが好ましい。
本発明のＰＣＲキットは、更に、上記鋳型と二本鎖を形成する上記第１プライマー内の領域にて、少なくとも１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されている第７ポリヌクレオチド配列を有しているコンペティタープライマーを備えていることが好ましい。
本発明は、増大するシグナル（例えば、蛍光）の強度を検出する技術であるので、減少するシグナルの強度を検出する技術と比較して、ＰＣＲ反応の進捗状況（例えば、ＰＣＲ反応産物の量）を、簡単かつ正確に把握することができるという効果を奏する。
具体的に、本発明は、ＰＣＲ産物を電気泳動する必要がないので、ＰＣＲ反応の進捗状況を簡単に把握することができる。
また、減少するシグナルの強度を検出する技術の場合、既に存在する強いシグナル（換言すれば、高いバックグラウンド）をベースとして、減少するシグナルの強度を測定する。それ故に、当該技術では、減少するシグナルの強度を正確に測定することが難しく、ＰＣＲ反応の進捗状況を正確に把握することが難しい。特に、当該技術では、減少するシグナルの強度が小さい場合には、ＰＣＲ反応の進捗状況を正確に把握することが難しくなる。
一方、本発明の場合、存在しないシグナル（換言すれば、低いバックグラウンド）をベースとして、増大するシグナルの強度を測定する。それ故に、本発明では、増大するシグナルの強度を正確に測定することが容易であり、ＰＣＲ反応の進捗状況を正確に把握することができる。本発明では、増大するシグナルの強度が小さい場合であっても、ＰＣＲ反応の進捗状況を正確に把握することができる。
更に、本発明は、任意の遺伝子に対して、汎用性高く用いることができるという効果を奏する。
具体的に、本発明では、プローブに結合してプローブのバルジ構造を変化させ得るタグを、任意の遺伝子を検出するための任意のプライマーに連結すればよい。それ故に、本発明は、あらゆる遺伝子を対象としたＰＣＲに用いることができる。
本発明は、化学修飾（例えば、蛍光修飾）されたプローブおよびプライマーを用いる必要がないので、これらの合成が容易であるとともに、これらが安価であるという効果を奏する。
本発明は、特別な装置を必要とせず、従来の装置（例えば、ＰＣＲ装置、蛍光検出装置）を用いて実施することができるという効果を奏する。
また、プローブの３’末端を非天然型ＤＮＡでキャップすることにより、プローブが目的としない配列に結合したとしても、当該プローブによってＤＮＡが増幅されることがない。つまり、プローブがプライマーとして機能することを防ぐことができる。例えば、プローブの３’末端をジデオキシリボースにすれば、伸長反応に必要な「−ＯＨ」がないので、プローブがプライマーとして機能することを防ぐことができる。
本発明の基本原理を示す図である。 本発明の実施例に用いたプローブおよびプライマーの構造を示す図である。 本発明の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の実施例における、電気泳動解析の結果を示す写真である。 本発明の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の実施例における、電気泳動解析の結果を示す写真である。 本発明の別の実施例に用いたプローブおよびプライマーの構造を示す図である。 本発明の別の実施例における、電気泳動解析の結果を示す写真である。 本発明の別の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例に用いたプローブおよびプライマーの構造を示す図である。 本発明の別の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例に用いたプローブおよびプライマーの構造を示す図である。 本発明の別の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例において、鋳型の濃度を変化させたときの蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例において、ＰＣＲサイクル数に対して鋳型の濃度をプロットしたグラフである。 本発明の別の実施例における、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた場合の蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例における、ＫＯＤ−ＦＸ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた場合の蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例に用いたプローブおよびプライマーの構造を示す図である。 本発明の別の実施例における、蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例に用いたプローブ、プライマーおよびコンペティタープライマーの構造を示す図である。 本発明の別の実施例における蛍光解析の結果を示すグラフであって、アレルが「Ｇ」の鋳型を用いた場合の蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例における蛍光解析の結果を示すグラフであって、アレルが「Ｔ」の鋳型を用いた場合の蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例における蛍光解析の結果を示すグラフであって、アレルが「Ｇ」の鋳型とアレルが「Ｔ」の鋳型との混合物を用いた場合の蛍光解析の結果を示すグラフである。 本発明の別の実施例における、電気泳動解析の結果を示す写真である。 従来技術の基本原理を示す図である。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。
〔１．本発明の基本原理〕
まず、図１を用いて、本発明の基本原理を説明する。
本発明では、分子内にバルジ構造を形成し得るプローブであって、当該バルジ構造にバルジ構造結合分子が結合した時にシグナル（例えば、蛍光）を発するプローブを用いる（図１のＤＮＡ ｐｒｏｂｅ参照）。
本明細書において「バルジ構造」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の二本鎖領域において、一方の鎖のポリヌクレオチドに余剰のヌクレオチドが存在するために生じるふくらみ（バルジ）を意図する。
例えば、「ＴＣＴ」と「ＡＡ」とが向かい合って二本鎖を形成する場合、「ＴＣＴ」の中の２つの「Ｔ」と「ＡＡ」の中の２つの「Ａ」とがそれぞれ対合して二本鎖を形成する。このとき、２つの「Ｔ」の間に存在する「Ｃ」には対合するヌクレオチドが無いため、当該「Ｃ」が膨らむこととなる。そして、この膨らんだ構造が、バルジ構造である。
なお、上述した例のように、余剰の塩基がＣ（シトシン）であることにより形成されるバルジ構造を、本明細書において「シトシンバルジ構造」と表記する。Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）についても同様に、「アデニンバルジ構造」、「グアニンバルジ構造」、「チミンバルジ構造」と表記する。
ＰＣＲ反応が開始される時点では、上記プローブとプライマー（図１のＤＮＡ−ＴＡＧ参照）とが結合することによってプローブの立体構造が変化し、その結果、プローブ中のバルジ構造が失われている。それ故に、ＰＣＲ反応が開始される時点では、バルジ構造結合分子に由来するシグナルは発生していない（図１の（ｄ）参照）。
ＰＣＲ反応が開始されると、まず、上記プローブとプライマーとの複合体が鋳型に結合するとともに、当該プライマーを起点として鋳型の相補鎖が伸長される（図１の（ａ）参照）。
次いで、上記相補鎖と上記鋳型とによって形成されている二本鎖は、高温処理によって、少なくとも相補鎖を含む鎖（以下、鎖Ｂと呼ぶ）と、鋳型からなる一本鎖とに分離される。
次いで、鎖Ｂに対して別のプライマー（図１には、別のプライマーを図示せず）が結合し、当該別のプライマーを起点として鎖Ｂの相補鎖が伸長される（図１の（ｂ）参照）。
鎖Ｂの相補鎖が伸長される過程において、当該相補鎖中に、プローブ内のプライマー結合領域に対応する相補的なヌクレオチドが形成される。そして、その結果、結合する相手を失ったプローブは、ＰＣＲ反応溶液中に解離することになる（図１の（ｃ）参照）。
ＰＣＲ反応溶液中に解離したプローブは、プローブ分子内の水素結合などを介した相互作用によって、当該プローブ内にバルジ構造を形成し、更に、当該バルジ構造にバルジ構造結合分子が結合する。そして、その結果、シグナル（例えば、蛍光）が発生する（図１の（ｃ）参照）。
本発明では、ＰＣＲ反応が進むにつれて解離したプローブの数（換言すれば、バルジ構造の数）が増加し、その結果、シグナル強度が増加することになる（図１の（ｄ）参照）。そして、本願発明では、シグナル強度の増加を観察することによって、ＰＣＲ反応の検出を行う。なお、本発明では、ダイナミックレンジが大きいので、検出精度の高いＰＣＲ法を実現することができる。
〔２．ＰＣＲ法〕
本実施の形態のＰＣＲ法は、第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットと、当該プライマーセットによって増幅される鋳型と、第１プライマーとの結合状態に応じて構造（具体的には、バルジ構造）が変化する第１プローブと、バルジ構造との結合状態に応じて発するシグナルを変化させるバルジ構造結合分子と、を含む試料をＰＣＲ反応にかける工程を含んでいる。
以下に、各構成について説明する。
〔２−１．第１プローブ〕
第１プローブは、第１プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、かつ、第１プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成するもの（具体的には、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ））である。
つまり、第１プローブは、単独で存在している時には第１プローブ内にバルジ構造を形成し、第１プライマーと二本鎖を形成することによって自身の立体構造が変化して、その結果、バルジ構造が失われるものである。
上記第１プローブは、上述した性質を有するものであればよく、その具体的な塩基配列は限定されない。
更に具体的に、第１プローブは、バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドで互いに二本鎖を形成する第１ポリヌクレオチド配列および第２ポリヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
この場合、第１ポリヌクレオチド配列および第２ポリヌクレオチド配列は、バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドが、完全に相補的であってもよいし、一部が相補的であってもよい。
なお、本明細書において「相補的」とは、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）とが特異的な水素結合を介して向かい合い、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）と特異的な水素結合を介して向かい合う関係を意図する。
より具体的に、第１ポリヌクレオチド配列および第２ポリヌクレオチド配列は、バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドの、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％が相補的であり得る。
上記構成であれば、第１ポリヌクレオチド配列と、第２ポリヌクレオチド配列とが、特異的な水素結合を介して、第１プローブ内で二本鎖を形成することになる。そして、対になるヌクレオチドが存在しない余分なヌクレオチドが、バルジ構造を形成することになる。
第１プローブは、第１プライマーの一部分と二本鎖を形成する第３ポリヌクレオチド配列を有していることが好ましい。
この場合、第１プライマーの一部分および第３ポリヌクレオチド配列は、完全に相補的であってもよいし、一部が相補的であってもよい。
より具体的に、第１プライマーの一部分および第３ポリヌクレオチド配列は、二本鎖を形成するヌクレオチドの、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％が相補的であり得る。
上記構成であれば、第１プローブは、第３ポリヌクレオチド配列を介して、第１プライマーの一部分と二本鎖を形成することができる。そして、第３ポリヌクレオチド配列を介して第１プライマーと二本鎖を形成している時には、第１プローブの立体構造が変化して、第１プライマー内のバルジ構造が失われることになる。なお、第１プローブと二本鎖を形成しない第１プライマーの部分は、第１プライマーが鋳型と二本鎖を形成する時に、機能することになる。
第３ポリヌクレオチド配列は、第１ポリヌクレオチド配列または第２ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含むものであることが好ましい。また、第３ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチド配列または第２ポリヌクレオチド配列の全体を含むものであってもよい。
上記構成であれば、第１プライマーと第３ポリヌクレオチドとが結合して二本鎖を形成すると、既に形成された結合によって、第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列とが結合して二本鎖を形成することを効果的に阻害することができる。その結果、上記構成であれば、シグナルのバックグラウンドを下げることによって、ＰＣＲの検出精度をより高めることができる。
上記第１ポリヌクレオチド配列、第２ポリヌクレオチド配列、および、第３ポリヌクレオチド配列の具体的な塩基配列は特に限定されず、適宜、所望の塩基配列に設計することができる。
例えば、第３ポリヌクレオチド配列と第１プライマーとによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ１、第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ２、としたときに、「Ｔｍ１＞Ｔｍ２」の関係式が成り立つように、上記第１ポリヌクレオチド配列、第２ポリヌクレオチド配列、および、第３ポリヌクレオチド配列の塩基配列を設計することが好ましい。なお、融解温度は、周知の計算プログラム、例えば、ＯｌｉｇｏＣａｌｃを用いて計算することができる（Ｉｎｃ５０ｍＭ Ｎａ＋、「http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html」）。
上記構成であれば、第３ポリヌクレオチド配列と第１プライマーとによって形成される二本鎖の方が、第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖よりも、安定になる。つまり、第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖よりも、第３ポリヌクレオチド配列と第１プライマーとによって形成される二本鎖の方が優先的に形成され、シグナルのノイズが低下する。その結果、後述する実施例でも実証しているように、上記構成であれば、ＰＣＲの検出精度をより高めることができる。
更に具体的に、上記第１ポリヌクレオチド配列、第２ポリヌクレオチド配列、および、第３ポリヌクレオチド配列の塩基配列は、「Ｔｍ１＞Ｔｍ２＞シグナル測定温度」の関係式が成り立つように設計されていることが好ましい。なお、シグナル測定温度（例えば、蛍光測定温度）は特に限定されず、例えば、２５℃または３０℃であり得る。
上記構成であれば、シグナル測定時に第１プローブ内で二本鎖が形成されること（換言すれば、蛍光の発生）を阻害することがないので、ＰＣＲの検出精度をより高めることができる。
また、上記第１ポリヌクレオチド配列、および、第２ポリヌクレオチド配列の塩基配列は、第１プローブ内に１つまたは複数（例えば、２〜４個）のバルジ構造を形成するように設計され得る。シグナルの強度を上げてＰＣＲの検出精度を高めるという観点からは、複数のバルジ構造を形成するように設計されることが、より好ましい。
第１プローブ内に形成されるバルジ構造が複数である場合、隣り合うバルジ構造の間には、好ましくは２〜５個、更に好ましくは３〜４個の塩基が存在することが好ましい。バルジ構造の間の距離が短すぎると、バルジ構造結合分子がバルジ構造の各々に良好に結合できず、シグナル強度が低下する傾向を示す。一方、バルジ構造の間の距離が長すぎると、第１プローブの全長が長くなり、第１プローブの作製コストが高くなる傾向を示す。
第１プローブ内に形成されるバルジ構造としては、特に限定されないが、例えば、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、アデニンバルジ構造、および、グアニンバルジ構造を挙げることができる。
シグナル強度を増してＰＣＲの検出精度を高めるという観点からは、バルジ構造は、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、または、アデニンバルジ構造であることが好ましく、シトシンバルジ構造、または、チミンバルジ構造であることが更に好ましく、シトシンバルジ構造であることが最も好ましい。
バルジ構造に隣接するヌクレオチドの種類は特に限定されないが、アデニン、シトシン、または、チミンが好ましい。バルジ構造結合分子が蛍光を発する分子である場合、バルジ構造にグアニンが隣接すると、蛍光の強度が低下する傾向を示し、バルジ構造にアデニン、シトシンまたはチミンが隣接すると、蛍光の強度が上昇する傾向を示す。
上記第１ポリヌクレオチド配列、および、第２ポリヌクレオチド配列の長さ（換言すれば、ポリヌクレオチドを形成するヌクレオチドの数）は特に限定されないが、例えば、７個〜１７個が好ましく、８個〜１７個がより好ましく、８個〜１２個がより好ましい。例えば、上記第１ポリヌクレオチド配列、および、第２ポリヌクレオチド配列が、１７個のヌクレオチドによって形成されていれば、バルジ構造を３個以上形成することができる。
上記構成であれば、安定したバルジ構造を形成し得るプローブを実現することができるとともに、安価なプローブを実現することができる。
上記第３ポリヌクレオチド配列の長さ（換言すれば、ポリヌクレオチドを形成するヌクレオチドの数）は特に限定されないが、例えば、１７個〜２５個が好ましく、１８個〜２２個がより好ましい。
上記構成であれば、プローブがバルジ構造を形成することを効果的に阻害することができるので、ＰＣＲの検出精度をより高めることができる。
第１プローブは、第１ポリヌクレオチド配列と第２ポリヌクレオチド配列との間に、１個または複数（例えば、３〜７個、好ましくは４個）のヌクレオチドが存在するものであってもよい。ヌクレオチドの種類は特に限定されないが、チミンであることが好ましい。
上記構成であれば、第１プローブの構造を所望の構造（例えば、一本鎖、または、ヘアピン構造）へ効率よく変化させることができる。
第１プローブの３’末端は、非天然型ＤＮＡでキャップされていることが好ましい。上記構成であれば、第１プローブが目的としない配列に結合したとしても、当該第１プローブによってＤＮＡが増幅されることがない。つまり、第１プローブがプライマーとして機能することがないので、第１プローブによる非特異的なＤＮＡ増幅を防ぐことができる。
例えば、第１プローブの３’末端にジデオキシリボースを配置すれば、ジデオキシリボースには、伸長反応に必要な「−ＯＨ」がないので、第１プローブがプライマーとして機能することがない。
〔２−２．プライマーセットおよび鋳型〕
プライマーセットには第１プライマー（例えば、リバースプライマー）および第２プライマー（例えば、フォワードプライマー）が含まれており、当該プライマーセットによって、所望の鋳型が増幅される。
鋳型としては特に限定されず、検出対象に応じて適宜選択され得る。例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液、植物、微生物、などに由来するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を鋳型として用いることができる。勿論、本発明は、これらに限定されない。
第１プライマーは、第１プローブ内の第３ポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する領域と、鋳型と二本鎖を形成する領域と、を備えている。
第１プローブ内の第３ポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する、第１プライマー内の領域は、上述した第３ポリヌクレオチド配列に略相補的または相補的なポリヌクレオチドとして設計され得る。なお、第３ポリヌクレオチド配列の具体的な構成については既に詳細に説明したので、当該説明から、第１プローブ内の第３ポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する、第１プライマー内の領域の具体的な構成も理解され得るであろう。
鋳型と二本鎖を形成する、第１プライマー内の領域は、検出対象に応じて、適宜設計され得る。つまり、鋳型と二本鎖を形成する、第１プライマー内の領域は、鋳型に対して略相補的または相補的なポリヌクレオチドとして設計され得、具体的な構成は限定されない。
第２プライマーは、第１プライマーを起点として伸長されたポリヌクレオチドと二本鎖を形成し得るプライマーであればよく、その具体的な構成は限定されない。第１プライマーを起点として伸長されたポリヌクレオチドの相補鎖が、当該第２プライマーを起点として伸長されることになる。
第２プライマーは、第１プライマーと対になって所望の鋳型を増幅し得るものであればよく、具体的な構成は限定されないが、上述した第１プライマーと同様の構成を備えていることがこのましい。そして、この場合、ＰＣＲ反応の試料は、第２プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、かつ、第２プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第２プローブを含むことが好ましい。
上記構成によれば、第１プローブのみならず、第２プローブによってもシグナルを発生させることができるので、ＰＣＲの検出精度をより高めることができる。
更に具体的に、第２プローブは、バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドで互いに二本鎖を形成する第４ポリヌクレオチド配列および第５ポリヌクレオチド配列と、第２プライマーの一部分と二本鎖を形成する第６ポリヌクレオチド配列と、を有していることが好ましい。
この場合、第６ポリヌクレオチド配列は、第４ポリヌクレオチド配列または第５ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含んでいることが好ましい。
更に、第６ポリヌクレオチド配列と第２プライマーとによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ３、第４ポリヌクレオチド配列と第５ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ４、としたときに、「Ｔｍ３＞Ｔｍ４」の関係式が成り立つことが好ましく、「Ｔｍ１＞Ｔｍ２＞シグナル測定温度」の関係式が成り立つことが更に好ましい。なお、シグナル測定温度は特に限定されず、例えば、２５℃または３０℃であり得る。
第２プライマー、第２プローブ、第４ポリヌクレオチド配列、第５ポリヌクレオチド配列、および、第６ポリヌクレオチド配列の各々は、第１プライマー、第１プローブ、第１ポリヌクレオチド配列、第２ポリヌクレオチド配列、および、第３ポリヌクレオチド配列の各々と同様に構成することができる。
第１プライマー、第１プローブ、第１ポリヌクレオチド配列、第２ポリヌクレオチド配列、および、第３ポリヌクレオチド配列の各々の具体的な構成、換言すれば、第２プライマー、第２プローブ、第４ポリヌクレオチド配列、第５ポリヌクレオチド配列、および、第６ポリヌクレオチド配列の各々の具体的な構成は、既に〔２−１．第１プローブ〕の欄にて説明したので、ここではその説明を省略する。
なお、第２プライマー、第２プローブ、第４ポリヌクレオチド配列、第５ポリヌクレオチド配列、および、第６ポリヌクレオチド配列の各々の具体的な構成は、〔２−１．第１プローブ〕の欄にて説明した構成であればよく、第１プライマーと第２プライマーとが、第１プローブと第２プローブとが、第１ポリヌクレオチド配列と第４ポリヌクレオチド配列とが、第２ポリヌクレオチド配列と第５ポリヌクレオチド配列とが、第３ポリヌクレオチド配列と第６ポリヌクレオチド配列とが、完全に同一の構成であってもよいし、互いに異なる構成であってもよい。
〔２−３．バルジ構造結合分子〕
バルジ構造結合分子は、バルジ構造に結合することによってシグナルを発するものであればよく、具体的な構成は限定されない。
上記バルジ構造結合分子は、例えば、バルジ構造に結合することによって、（ｉ）蛍光を発光する物質、（ｉｉ）発光する蛍光の波長がシフトする物質、または、（ｉｉｉ）蛍光が消光する物質、等を用いることが好ましい。これらの蛍光を検出することで、容易にバルジ構造を検出できる。なお、バルジ構造結合分子として、自身ではシグナルを発する能力がない物質を、シグナルを発する能力を有する物質（例えば、蛍光物質）にて標識化したものを用いることも可能である。
上記バルジ構造結合分子の具体例としては、ナフチリジン環を有する化合物を挙げることができる。
ナフチリジン環を有する化合物は、バルジ構造（特に好ましくは、シトシンバルジ構造、および、チミンバルジ構造）に結合すると、強い蛍光を示す。当該蛍光を検出することによって、簡便にバルジ構造（換言すれば、ＰＣＲ反応の進捗状況）を検出することができる。
更に、ナフチリジン環を有する化合物は、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を阻害しないので、ナフチリジン環を有する化合物を含む試料を、そのままＰＣＲ反応に供することができる。
例えば、一つの反応容器に、ＰＣＲ反応用の試料を調製し、当該試料に予めナフチリジン環を有する化合物を混合する。ＰＣＲ反応を開始する前に、事前に試料の蛍光を測定し、当該試料を、そのままＰＣＲ反応に供する。ＰＣＲ反応の進行に伴って経時的に試料の蛍光を測定することで、バルジ構造の検出を行うことができる。
ナフチリジン環を有する化合物の具体例としては、下記（１）式、つまり、
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基、または、第３級アミン残基を示す。）
にて示される、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体を挙げることができる。
上記第１級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ２を挙げることができる。上記第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ）２ＮＨ（ＣＨ３）等を挙げることができる。上記第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＮＨ２等を挙げることができる。
上記構成の中では、Ｒ１およびＲ２の内、少なくとも一方が第２級アミン残基であることが好ましく、Ｒ１およびＲ２の両方が第２級アミン残基であることがさらに好ましい。当該構成であれば、第２級アミン残基を備えることによって、バルジ構造結合分子とバルジ構造との結合を、より安定化させることができる。
２，７−ジアミノナフチリジン誘導体の具体例としては、下記（２）式、つまり、
にて示される、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを挙げることができる。
２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、バルジ構造に結合すると、発光する蛍光の吸収極大波長がシフトし、当該波長において強い強度の蛍光を発光するため、高感度かつ特異的に、バルジ構造の検出を行うことができる。具体的に、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の条件下において、単独では吸収極大が３７６ｎｍで検出され、シトシンバルジ構造と結合することにより、３９６ｎｍにシフトする。
ナフチリジン環を有する化合物（例えば、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン）は、従来公知の方法により合成すればよい。例えば、日本国公開特許公報「特開２００４−２６２８２７号公報」に記載の方法により合成すればよい。
上記ナフチリジン環を有する化合物の別の具体例としては、下記（３）式、つまり、
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子またはアミノ基であり、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ独立して、１〜６の自然数を示す）
にて示される化合物を挙げることができる。
また、上記バルジ構造結合分子の別の具体例としては、下記（４）式、つまり、
（Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子またはアミノ基であり、ｏ、ｐは、それぞれ独立して、１〜６の自然数を示す）
にて示される化合物を挙げることができる。
〔２−４．コンペティタープライマー〕
本実施の形態のＰＣＲ法では、上述した試料が、更に、コンペティタープライマーを含んでいることが好ましい。上記構成によれば、塩基配列が異なる鋳型を感度よく識別することができるので、本実施の形態のＰＣＲ法を、ＳＮＰの検出などに用いることができる。
図２１（ａ）を用いて、コンペティタープライマーの機能の概要を説明する。
本実施の形態のＰＣＲ法では、試料中に、第１プライマー（図中の「リバースプライマー」）、第２プライマー（図示せず）、第１プローブ（図中の「プローブ」）、鋳型、および、コンペティタープライマーが含まれ得る。
図２１（ａ）では、鋳型の一例として、「Ｇ」または「Ｔ」の一塩基多型を有する鋳型を示す。この場合、例えば、第１プライマーとして、鋳型の一塩基多型の箇所のヌクレオチドと二本鎖を形成するヌクレオチドが「Ｃ」であるプライマーを選択し、コンペティタープライマーとして、鋳型の一塩基多型の箇所のヌクレオチドと二本鎖を形成するヌクレオチドが「Ａ」であるプライマーを選択することができる。
鋳型の一塩基多型の箇所のヌクレオチドが「Ｇ」であれば、コンペティタープライマーよりも第１プライマーの方が、優先的に鋳型と二本鎖を形成することができる。その結果、第１プライマーを用いたＰＣＲ反応が優先的に生じることになる。そして、二本鎖を形成する相手を失ったプローブは、ＰＣＲ反応溶液中に解離してバルジ構造を形成し、当該バルジ構造にバルジ構造結合分子が結合して、シグナル（例えば、蛍光）が発生する。
一方、鋳型の一塩基多型の箇所のヌクレオチドが「Ｔ」であれば、第１プライマーよりもコンペティタープライマーの方が、優先的に鋳型と二本鎖を形成することができる。その結果、コンペティタープライマーを用いたＰＣＲ反応が優先的に生じることになる。この場合、プローブは、二本鎖を形成する相手を失うことがないので、プローブが、ＰＣＲ反応溶液中に解離してバルジ構造を形成することはない。つまり、シグナル（例えば、蛍光）が発生することはない。
なお、第１プライマー、または、コンペティタープライマーの各々がプライマーとして適切に機能したか否かは、ＰＣＲ反応産物を電気泳動に供し、増幅されたＤＮＡを観察することによっても、確認することができる。
上述したように、遺伝子配列の型によって、シグナルが発生するか否かが決まる。それ故に、本実施の形態のＰＣＲ法は、ＳＮＰの検出などに好適に用いることができる。
次いで、コンペティタープライマーの具体的な構成について説明する。
コンペティタープライマーは、鋳型と二本鎖を形成する第１プライマー内の領域にて、少なくとも１つのヌクレオチド（以下、ヌクレオチドＡと呼ぶ）が別のヌクレオチド（以下、ヌクレオチドＢと呼ぶ）に置換されている第７ポリヌクレオチド配列を、少なくとも有するものである。
上述したヌクレオチドＡおよびＢが、例えば、遺伝子の多型（例えば、ＳＮＰ）における置換されているヌクレオチドに対応する。つまり、ヌクレオチドＡが、一方の遺伝子型のＤＮＡ配列に対応し、ヌクレオチドＢが、他方の遺伝子型のＤＮＡ配列に対応する。例えば、図２１（ａ）では、ヌクレオチドＡが「Ｃ」に対応し、ヌクレオチドＢが「Ａ」に対応している。
コンペティタープライマーを構成するヌクレオチドの数は、特に限定されず、第１プライマーの構成、および／または、鋳型の構成に応じて適宜設計すればよい。
第７ポリヌクレオチド内のヌクレオチドＢの数は、特に限定されず、所望の数であり得る。例えば、１〜１０個であってもよいし、１〜５個であってもよいし、１〜３個であってもよいし、１個または２個であってもよいし、１個であってもよい。より精度よくＳＮＰの検出を行うという観点からは、少ないほど好ましい。
第７ポリヌクレオチド内におけるヌクレオチドＢの位置は、特に限定されず、所望の位置であり得る。例えば、ヌクレオチドＢは、第７ポリヌクレオチドの５’末端に配置されていてもよいし、第７ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端との間の任意の位置に配置されていてもよいし、第７ポリヌクレオチドの３’末端に配置されていてもよい。より精度よくＳＮＰの検出を行うという観点からは、第７ポリヌクレオチドの３’末端に配置されていることが好ましい。
コンペティタープライマーは、上述した第７ポリヌクレオチド配列の５’末端に、更に、少なくとも１個（例えば、１〜５個、または、１〜３個）のヌクレオチド（具体的には、鋳型と二本鎖を形成し得る少なくとも１個のヌクレオチド）が連結されたものであることが好ましい。
鋳型と二本鎖を形成する第１プライマー内の領域のヌクレオチドの数と、鋳型と二本鎖を形成するコンペティタープライマー内の領域のヌクレオチドの数とが同じである場合、ＰＣＲ反応のサイクル数が増加するにつれて、本来ＰＣＲ反応に利用されるはずのない第１プライマーがＰＣＲ反応に利用されて、偽陽性のシグナルが発生してしまう。一方、上記構成によれば、このような偽陽性のシグナルの発生を抑制することができる。
上述した説明では、コンペティタープライマーを、第１プライマーと競合するプライマーとして説明した。しかしながら、第２プローブを用いる構成においては、コンペティタープライマーを、第１プライマーと競合するプライマー、第２プライマーと競合するプライマー、または、第１プライマーおよび第２プライマーと競合するプライマーとして構成することも可能である。
〔２−５．ＰＣＲ反応〕
本実施の形態のＰＣＲ法は、上述したプライマーセット、鋳型、プローブ、および、バルジ構造結合分子を含む試料、または、上述したプライマーセット、鋳型、プローブ、バルジ構造結合分子、および、コンペティタープライマーをＰＣＲ反応にかける工程を含んでいる。
更に、本実施の形態のＰＣＲ法は、上記工程の後に、試料に由来するシグナル（例えば、蛍光）を検出する工程を含んでいてもよい。
上記試料をＰＣＲ反応にかける工程は、周知のプロトコールにしたがって、市販のＰＣＲ反応装置を用いて行うことができる。
上記試料のｐＨは、少なくとも試料に由来するシグナルを検出する工程において、好ましくはｐＨが５以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは６．５以上である。また、当該ｐＨの上限は、好ましくは９以下、より好ましくは８以下、より好ましくは７．５以下である。ｐＨが５以上、９以下であれば、ＤＮＡは安定であるため、バルジ構造結合分子は良好にバルジ構造に結合する。これによりシグナルの検出を良好に行なうことができる。
試料中の各プローブの濃度は、二本鎖を形成するプライマーの濃度の０．５倍〜１．０倍であることが好ましく、０．７５倍〜１．０倍であることがより好ましく、１．０倍であることがより好ましい。上記構成であれば、シグナルの検出を良好に行なうことができる。
試料中のバルジ構造結合分子の濃度は、結合するプローブの濃度の２倍〜４０倍であることが好ましく、５倍〜２０倍であることがより好ましく、１０倍であることがより好ましい。上記構成であれば、シグナルの検出を良好に行なうことができる。
試料に由来するシグナルを検出する工程の具体的な構成は、シグナルの種類に応じて適宜選択すればよい。
例えば、バルジ構造結合分子が、バルジ構造に結合したときに発光する蛍光の検出は、これを検出可能である限り限定されるものではないが、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの波長が好ましく、４３０ｎｍ〜４６０ｎｍの波長が更に好ましい。４００ｎｍ〜４８０ｎｍの蛍光波長であれば、バルジ構造結合分子（例えば、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン）がバルジ構造に結合していない場合に生じる蛍光と、バルジ構造に結合している場合に生じる蛍光とを、明確に区別することができる。
〔３．ＰＣＲキット〕
本実施の形態のＰＣＲキットは、第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットによって鋳型を増幅するためのＰＣＲキットであって、第１プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、第１プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第１プローブと、バルジ構造に結合することによってシグナルを発するバルジ構造結合分子と、を備えている。
第１プローブおよびバルジ構造結合分子の詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本実施の形態のＰＣＲキットは、更に、第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットを備えていてもよい。
プライマーセットの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本実施の形態のＰＣＲキットは、更に、第２プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、第２プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第２プローブを備えていてもよい。
第２プローブの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本実施の形態のＰＣＲキットは、更に、鋳型と二本鎖を形成する第１プライマー内の領域にて、少なくとも１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されている第７ポリヌクレオチド配列を有しているコンペティタープライマーを備えていてもよい。
コンペティタープライマーの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本実施の形態のＰＣＲキットは、更に、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ関連試薬・器具（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー、ＰＣＲ用チューブ等）、増幅核酸精製用試薬・器具を含んでもよいし、ＤＮＡ断片を安定的に保持するための試薬や緩衝液、バルジ構造結合分子を安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。
＜１．ＰＣＲ反応産物の電気泳動解析および蛍光解析（バルジ構造の種類についての考察）＞
リバースプライマー、フォワードプライマー、および、プローブの２種類の組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行い、各ＰＣＲ反応産物を電気泳動法によって検出するとともに、各ＰＣＲ反応産物の増加にともなって蛍光強度がどのように変化するか試験を行った。
ＰＣＲ反応に用いたリバースプライマー、フォワードプライマー、および、プローブの組み合わせとしては、以下の２つの組み合わせを用いた。また、ＰＣＲ反応の鋳型としては、ｐＵＣ１８を用い、バルジ構造結合分子としては、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いた。
（Ａ．組み合わせ１）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
５’−GTTGTAAAACGACGGCCAGT−３’ （配列番号１）、
・リバースプライマー（Ｃ−ｂｕｌｇｅ １）：
５’−TCATTACAAAAGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号２）、
・プローブ（Ｃ−ｐｒｏｂｅ １）：
５’−ATCATCTACTTTTGTAATGATCTC−３’ （配列番号３）。
（Ｂ．組み合わせ２）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）、
・リバースプライマー（Ｔ−ｂｕｌｇｅ １）：
５’−GCTATCAAAAGAAGCTATCTATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号４）、
・プローブ（Ｔ−ｐｒｏｂｅ １）：
５’−ATAGATAGCTTCTTTTGATAGCTTCTATCTC−３’ （配列番号５）。
図２を用いて、より詳細に各構成の関係を説明する。
図２（ｂ）に示すように、本実施例のプローブは、「太字の大文字」にて示した塩基配列にて、プローブ内で二本鎖を形成するように設計されている。なお、「下線」にて示した箇所は相補鎖の「Ｃ」または「Ｔ」に対応する塩基が存在しない領域であって、相補鎖の「Ｃ」または「Ｔ」が、バルジ構造を形成する。
つまり、本実施例のプローブ（Ｃ−ｐｒｏｂｅ １）は、プローブ内で１カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブであり、本実施例のプローブ（Ｔ−ｐｒｏｂｅ １）は、プローブ内で２カ所のチミンバルジ構造を形成するプローブである。
図２（ｂ）に示すように、本実施例のリバースプライマーは、「一本下線」にて示した塩基配列にて、プローブと二本鎖を形成し、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。
なお、リバースプライマー（Ｃ−ｂｕｌｇｅ １）とプローブ（Ｃ−ｐｒｏｂｅ １）とが形成する二本鎖の融解温度（Ｔｍ１）は、Ｔｍ１＝４８．２℃であり、プローブ（Ｃ−ｐｒｏｂｅ １）内で形成される二本鎖の融解温度（Ｔｍ２）は、Ｔｍ２＝４２．４℃であった。
一方、リバースプライマー（Ｔ−ｂｕｌｇｅ １）とプローブ（Ｔ−ｐｒｏｂｅ １）とが形成する二本鎖の融解温度（Ｔｍ１）は、Ｔｍ１＝５４．７℃であり、プローブ（Ｔ−ｐｒｏｂｅ １）内で形成される二本鎖の融解温度（Ｔｍ２）は、Ｔｍ２＝４５．３℃であった。
なお、融解温度は、ＯｌｉｇｏＣａｌｃを用いて計算した（Ｉｎｃ５０ｍＭ Ｎａ＋、「http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html」）。
反応溶液としては、上述した０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
ＰＣＲ反応プログラムの進行に伴って反応溶液を採取し、当該反応溶液を、電気泳動解析（具体的には、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミドゲル、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ染色））および蛍光解析にかけた。電気泳動解析は、市販の電気泳動装置およびゲルを用いて行い、蛍光解析は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０（励起波長：４００ｎｍ、発光波長：４５０ｎｍ）を用いて行った。
（Ａ．組み合わせ１）の試験結果を図３および図４に示し、（Ｂ．組み合わせ２）の試験結果を図５および図６に示す。なお、図４および図６中、「Ｂａｎｄ Ａ」にて示すバンドは、ＰＣＲ産物に対応し、「Ｂａｎｄ Ｂ」にて示すバンドは、プローブとリバースプライマーとの複合体に対応し、「Ｂａｎｄ Ｃ」にて示すバンドは、プローブ内で二本鎖を形成しているプローブに対応している。また、図４および図６中、「Ｍ１」は、２０ｂｐのラダーマーカーを示し、「Ｍ２」は、１００ｂｐのラダーマーカーを示している。
図４および６に示すように、プローブが形成するバルジ構造の種類に関わらず、ＰＣＲ反応が進むにつれて、プローブとリバースプライマーとの複合体の量が減少するとともに、ＰＣＲ産物の量、および、プローブ内で二本鎖を形成しているプローブの量が増加することが明らかになった。
そして、図３および図５に示すように、プローブが形成するバルジ構造の種類に関わらず、ＰＣＲ反応が進むにつれて、ＰＣＲ反応溶液の蛍光強度が増すことが明らかになった。
＜２．ＰＣＲ反応産物の電気泳動解析および蛍光解析（バルジ構造の数に関する考察）＞
上述した＜１＞の実施例では、プローブ内で１カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブを用いて試験を行った。本試験では、プローブ内で２カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブを用いて試験を行い、蛍光強度がどのように変化するか検討した。
ＰＣＲ反応に用いたリバースプライマー、フォワードプライマー、および、プローブの配列は、以下のとおりであった。また、ＰＣＲ反応の鋳型としては、ｐＵＣ１８を用い、バルジ構造結合分子としては、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いた。
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
・リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１）：
５’−GTAGATGATAATACGTCACTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号６）、
・プローブ（ＨＰ−３−Ｃ＋２）：
５’−GTGACGTATTATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCTC−３’ （配列番号７）
図７を用いて、より詳細に各構成の関係を説明する。
図７（ｂ）に示すように、本実施例のプローブは、「太字の大文字」にて示した塩基配列にて、プローブ内で二本鎖を形成するように設計されている。なお、「下線」にて示した箇所は相補鎖の「Ｃ」に対応する塩基が存在しない領域であって、相補鎖の「Ｃ」が、バルジ構造を形成する。つまり、本実施例のプローブは、プローブ内で２カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブである。
図７（ｂ）に示すように、本実施例のリバースプライマーは、「一本下線」にて示した塩基配列にて、プローブと二本鎖を形成し、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。
反応溶液としては、上述した０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、電気泳動解析および蛍光解析を行った。
試験結果を、図８および図９に示す。
図８に示すように、ＰＣＲ反応が進むにつれて、プローブとリバースプライマーとの複合体の量が減少するとともに、ＰＣＲ産物の量、および、プローブ内で二本鎖を形成しているプローブの量が増加することが明らかになった。そして、図９に示すように、ＰＣＲ反応が進むにつれて、ＰＣＲ反応溶液の蛍光強度が増すことが明らかになった。
更に、図３と図９とを比較した結果、プローブ内に形成されるバルジ構造の数が多いほど、ＰＣＲの検出感度が増すことが明らかになった。
＜３．リバースプライマーおよびプローブのデザインに関する検討−１＞
リバースプライマーとして、以下の４種類のプライマーを準備した。
なお、以下の４種類のリバースプライマーは、上述したプローブ（ＨＰ−３−Ｃ＋２）と二本鎖を形成する塩基配列の長さが異なっている。
なお、以下の４種類のプライマーの各々と、上述したプローブとが形成する二本鎖の融解温度（Ｔｍ１）は、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ」の場合が、Ｔｍ１＝４６．９℃であり、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１」の場合が、Ｔｍ１＝５０．９℃であり、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋２」の場合が、Ｔｍ１＝５２．３℃であり、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋３」の場合が、Ｔｍ１＝５３．４℃であった。
また、プローブ（ＨＰ−３−Ｃ＋２）内で形成される二本鎖の融解温度（Ｔｍ２）は、Ｔｍ２＝４２．８℃であった（ｍｆｏｌｄにより計算）。
なお、融解温度は、ＯｌｉｇｏＣａｌｃを用いて計算した（Ｉｎｃ５０ｍＭ Ｎａ＋、「http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html」）。
・リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ）：
５’−TAGATGATAATACGTCACTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号８）、
・リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１）：
５’−GTAGATGATAATACGTCACTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号９）、
・リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋２）：
５’−TGTAGATGATAATACGTCACTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１０）、
・リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋３）：
５’−TTGTAGATGATAATACGTCACTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１１）。
図１０を用いて、より詳細に各構成の関係を説明する。
図１０（ｂ）に示すように、本実施例のプローブは、「太字の大文字」にて示した塩基配列にて、プローブ内で二本鎖を形成するように設計されている。なお、「下線」にて示した箇所は相補鎖の「Ｃ」に対応する塩基が存在しない領域であって、相補鎖の「Ｃ」が、バルジ構造を形成する。つまり、本実施例のプローブは、プローブ内で２カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブである。
図１０（ｂ）に示すように、本実施例のリバースプライマーは、「一本下線」にて示した塩基配列にて、プローブと二本鎖を形成し、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。
上述した４種類のリバースプライマー、フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）、プローブ（ＨＰ−３−Ｃ＋２）、鋳型としてｐＵＣ１８、および、バルジ構造結合分子として２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
具体的に、反応溶液としては、０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、蛍光解析を行った。
試験結果を、図１１に示す。なお、図１１に示す試験結果は、「ＰＣＲ ｃｙｃｌｅ」が４０サイクルの時点で蛍光強度が強い順に、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋２」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋３」の試験結果である。
図１１に示すように、何れのリバースプライマーであっても、ＰＣＲ反応が進むにつれてＰＣＲ反応溶液の蛍光強度が増したが、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１」が、最もＰＣＲの検出感度が高かった。
＜４．リバースプライマーおよびプローブのデザインに関する検討−２＞
リバースプライマーとして、以下の８種類のプライマーを準備した。また、新たなプローブを準備した。
なお、以下の８種類のリバースプライマーは、新たなプローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）と二本鎖を形成する塩基配列の長さが異なっている。
なお、以下の８種類のプライマーの各々と、新たなプローブとが形成する二本鎖の融解温度（Ｔｍ１）は、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋３」の場合が、Ｔｍ１＝５４．７℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋２」の場合が、Ｔｍ１＝５３．４℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１」の場合が、Ｔｍ１＝５０．２℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−０」の場合が、Ｔｍ１＝４８．９℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−１」の場合が、Ｔｍ１＝４４．８℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−２」の場合が、Ｔｍ１＝４２．６℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−３」の場合が、Ｔｍ１＝３７．９℃であり、「Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−４」の場合が、Ｔｍ１＝３５．３℃であった。
また、プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）内で形成される二本鎖の融解温度（Ｔｍ２）は、Ｔｍ２＝４２．８℃であった（ｍｆｏｌｄにより計算）。
なお、融解温度は、ＯｌｉｇｏＣａｌｃを用いて計算した（Ｉｎｃ５０ｍＭ Ｎａ＋、「http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html」）。
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋３）：
５’−ACAGACAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１２）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋２）：
５’−CAGACAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１３）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）：
５’−AGACAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１４）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−０）：
５’−GACAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１５）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−１）：
５’−ACAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１６）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−２）：
５’−CAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１７）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−３）：
５’−AAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１８）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ−４）：
５’−AAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号１９）、
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）：
５’−ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCTC−３’ （配列番号２０）
図１２を用いて、より詳細に各構成の関係を説明する。
図１２（ｂ）に示すように、本実施例のプローブは、「太字の大文字」にて示した塩基配列にて、プローブ内で二本鎖を形成するように設計されている。なお、「下線」にて示した箇所は相補鎖の「Ｃ」に対応する塩基が存在しない領域であって、相補鎖の「Ｃ」が、バルジ構造を形成する。つまり、本実施例のプローブは、プローブ内で２カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブである。
図１２（ｂ）に示すように、本実施例のリバースプライマーは、「一本下線」にて示した塩基配列にて、プローブと二本鎖を形成し、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。
上述した８種類のリバースプライマー、フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）、プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）、鋳型としてｐＵＣ１８、および、バルジ構造結合分子として２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
具体的に、反応溶液としては、０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、蛍光解析を行った。
試験結果を、図１３および図１４に示す。
図１３および図１４から明らかなように、「Ｔｍ１＞Ｔｍ２」の関係を満たすプローブとリバースプライマーとの組み合わせの場合、単位ＰＣＲサイクルあたりの蛍光強度の変化量が大きいことが明らかになった。このことは、「Ｔｍ１＞Ｔｍ２」の関係を満たすプローブとリバースプライマーとの組み合わせであれば、ＰＣＲの検出感度がより高くなることを示している。
＜５．鋳型の濃度に関する検討＞
鋳型の濃度を変化させてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応産物の増加にともなって蛍光強度がどのように変化するか試験を行った。
リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１）、フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）、プローブ（ＨＰ−３−Ｃ＋２）、鋳型としてｐＵＣ１８、および、バルジ構造結合分子として２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
具体的に、反応溶液としては、０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１．８μＭ、０．１８μＭ、１８ｐＭ、１．８ｐＭ、０．１８ｐＭ、１８ｆＭまたは１．８ｆＭの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、蛍光解析を行った。
図１５に、各ＰＣＲサイクルにおける蛍光強度の測定結果を示し、図１６に、図１５の蛍光強度２０００（Ａ．Ｕ．）における試験結果に基づいて、ＰＣＲサイクル数に対して鋳型濃度をプロットしたデータを示す。
図１６に示すように、ＰＣＲサイクル数に対して鋳型の濃度をプロットしたデータが、略直線を示すことから、本実施のＰＣＲ法を定量ＰＣＲとして好適に利用できることが明らかになった。
＜６．ポリメラーゼに関する検討＞
複数の種類のポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応産物の増加にともなって蛍光強度がどのように変化するか試験を行った。
リバースプライマー（Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ、Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１、Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋２、または、Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋３）、フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）、プローブ（ＨＰ−３−Ｃ＋２）、鋳型としてｐＵＣ１８、および、バルジ構造結合分子として２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
また、ポリメラーゼとしては、ＰｏｌＩ型のＰＣＲ酵素であるＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＱＵＩＡＧＥＮ株式会社製）、または、α型のＰＣＲ酵素であるＫＯＤ−ＦＸ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ株式会社製）を用いた。
なお、ＰｏｌＩ型のＰＣＲ酵素であるＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｂａｃｔｅｒｉａ由来の酵素であって、３’→５’ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有しておらず、かつ、５’→３’ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性およびＴｄＴ活性を有している酵素である。
一方、α型のＰＣＲ酵素であるＫＯＤ−ＦＸ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ａｒｃｈａｅａ由来の酵素であって、３’→５’ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有しており、かつ、５’→３’ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性およびＴｄＴ活性を有していない酵素である。
具体的に、反応溶液としては、０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、蛍光解析を行った。
図１７に、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの試験結果を示し、図１８に、ＫＯＤ−ＦＸ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの試験結果を示す。
なお、図１７に示す試験結果は、「ＰＣＲ ｃｙｃｌｅ」が３５サイクルの時点で蛍光強度が強い順に、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋２」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋３」の試験結果である。また、図１８に示す試験結果は、「ＰＣＲ ｃｙｃｌｅ」が３５サイクルの時点で蛍光強度が強い順に、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋２」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋３」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ＋１」、「Ｍ１３ＲＶ−ＴＡＧ」の試験結果である。
図１７および図１８から明らかなように、異なるタイプの酵素を用いた場合であっても、ＰＣＲ反応が進むにつれて、ＰＣＲ反応溶液の蛍光強度が増すことが明らかになった。
＜７．プローブと二本鎖を形成するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いる場合に関する試験＞
リバースプライマー、フォワードプライマー、および、プローブの２種類の組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行い、各ＰＣＲ反応産物を電気泳動法によって検出するとともに、各ＰＣＲ反応産物の増加にともなって蛍光強度がどのように変化するか試験を行った。
ＰＣＲ反応に用いたリバースプライマー、フォワードプライマー、および、プローブの組み合わせとしては、以下の２つの組み合わせを用いた。また、ＰＣＲ反応の鋳型としては、ｐＵＣ１８を用い、バルジ構造結合分子としては、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いた。
（Ａ．組み合わせ３）
・フォワードプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ１−Ｍ１３Ｍ３）：
５’−AGACAAAAGTTGTAGATGATTTCAGTTGTAAAACGACGGCCAGT−３’ （配列番号２１）、
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）：
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）。
（Ｂ．組み合わせ４）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）：
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）。
図１９を用いて、より詳細に各構成の関係を説明する。
図１９に示すように、本実施例のプローブは、「太字の大文字」にて示した塩基配列にて、プローブ内で二本鎖を形成するように設計されている。なお、「下線」にて示した箇所は相補鎖の「Ｃ」に対応する塩基が存在しない領域であって、相補鎖の「Ｃ」が、バルジ構造を形成する。つまり、本実施例のプローブは、プローブ内で２カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブである。
図１９に示すように、本実施例のリバースプライマーおよびフォワードプライマーの各々は、「一本下線」にて示した塩基配列にて、プローブと二本鎖を形成し、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。
上記（組み合わせ３）および（組み合わせ４）の場合の反応溶液として、上述した０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
更に、上記（組み合わせ３）の場合の別の反応溶液として、上述した０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、１μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを４０サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、蛍光解析を行った。
試験結果を、図２０に示す。なお、図２０に示す試験結果は、「ＰＣＲ ｃｙｃｌｅ」が４０サイクルの時点で蛍光強度が強い順に、「組み合わせ３にて、１μＭの濃度のプローブを用いた場合」、「組み合わせ４にて、０．５μＭの濃度のプローブを用いた場合」、「組み合わせ３にて、０．５μＭの濃度のプローブを用いた場合」の試験結果である。
図２０に示すように、プローブの濃度が同じである場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方にプローブが結合し得る構成であれば、フォワードプライマーのみにプローブが結合し得る構成と比較して、ＰＣＲ反応を行う前の蛍光強度（換言すれば、バックグラウンド）が大きく減少することが明らかになった。
更に、図２０に示すように、プローブ量が高い場合（例えば、２倍）には、プローブの濃度が低い場合と比較して、ＰＣＲ反応を行う前の蛍光強度（換言すれば、バックグラウンド）が若干高いものの、蛍光強度の変化量（換言すれば、ＰＣＲ反応の前後における蛍光強度の差）が大きくなる（約１．５倍）ことが明らかになった。このことは、プローブ量が高い方が、ＰＣＲの検出感度がより高くなることを示している。
＜８．コンペティタープライマーを用いた遺伝子多型の識別＞
リバースプライマー、フォワードプライマー、および、プローブの２種類の組み合わせ、並びに、リバースプライマー、フォワードプライマー、コンペティタープライマー、および、プローブの２種類の組み合わせ（合計４種類の組み合わせ）を用いてＰＣＲ反応を行い、各ＰＣＲ反応産物を電気泳動法によって検出するとともに、各ＰＣＲ反応産物の増加にともなって蛍光強度がどのように変化するか試験を行った。
上述した４種類の組み合わせの具体的な構成を以下に示す。また、ＰＣＲ反応の鋳型としては、ｐＵＣ１８（アレルが「Ｇ」のもの、アレルが「Ｔ」のもの、または、アレルが「Ｇ」のものとアレルが「Ｔ」のものとの混合物）を用い、バルジ構造結合分子としては、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）を用いた。
（Ａ．組み合わせ５）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）：
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）：
・コンペティタープライマー（ＣＰ−Ａ）：
５’−ACACAGGAAACAGCTATGAA−３’ （配列番号２２）。
（Ｂ．組み合わせ６）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）：
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）。
（Ｃ．組み合わせ７）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ１−Ｔ）：
５’−AGACAAAAGTTGTAGATGATTTCACAGGAAACAGCTATGAA−３’ （配列番号２３）、
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）：
・コンペティタープライマー（ＣＰ−Ｃ）：
５’−CACAGGAAACAGCTATGAC−３’ （配列番号２４）。
（Ｄ．組み合わせ８）
・フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）：
・リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ１−Ｔ）：
・プローブ（Ｓｈｏｒｔ Ｃ＋２）。
図２１を用いて、より詳細に各構成の関係を説明する。
図２１に示すように、本実施例のプローブは、「太字の大文字」にて示した塩基配列にて、プローブ内で二本鎖を形成するように設計されている。なお、「下線」にて示した箇所は相補鎖の「Ｃ」に対応する塩基が存在しない領域であって、相補鎖の「Ｃ」が、バルジ構造を形成する。つまり、本実施例のプローブは、プローブ内で２カ所のシトシンバルジ構造を形成するプローブである。
図２１に示すように、本実施例のリバースプライマーおよびフォワードプライマーの各々は、「一本下線」にて示した塩基配列にて、プローブと二本鎖を形成し、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。
また、本実施例のリバースプライマーは、「二本下線」にて示した塩基配列にて、鋳型と二本鎖を形成するように設計されている。なお、コンペティタープライマー（ＣＰ−Ａ）は、リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）と比較して、鋳型と二本鎖を形成し得るヌクレオチドが１つ多い構成になっている（コンペティタープライマー（ＣＰ−Ａ）の５’末端の「Ａ」参照。）。
上記（組み合わせ６）および（組み合わせ８）の反応溶液として、上述した０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
一方、上記（組み合わせ５）および（組み合わせ７）の反応溶液として、上述した０．５μＭの濃度のフォワードプライマー、０．５μＭの濃度のリバースプライマー、０．５μＭの濃度のプローブ、０．５μＭの濃度のコンペティタープライマー、５μＭの濃度のバルジ構造結合分子、および、１００ｐｇ／μＬの鋳型を含む反応溶液（合計４０μＬ）を用いた。
ＰＣＲ反応プログラムとしては、まず９５℃にて２分間の変性反応を行った後、９５℃にて１０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを３５サイクル行う、ＰＣＲ反応プログラムを用いた。なお、具体的なＰＣＲ反応は、ＴＰ６００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。
次いで、上述した＜１＞の実施例と同様に、電気泳動解析および蛍光解析を行った。
試験結果を、図２２〜図２５に示す。
具体的に、図２２は、アレルが「Ｇ」の鋳型を用いた場合の蛍光解析の結果を示し、図２３は、アレルが「Ｔ」の鋳型を用いた場合の蛍光解析の結果を示し、図２４は、アレルが「Ｇ」の鋳型とアレルが「Ｔ」の鋳型との混合物を用いた場合の蛍光解析の結果を示している。
また、図２５は、電気泳動解析の結果を示している。なお、図２５中、「Ｂａｎｄ Ｄ」にて示すバンドは、リバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ＋１）またはリバースプライマー（Ｓｈｏｒｔ ＴＡＧ１−Ｔ）と、フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）と、によって増幅されたＰＣＲ反応産物に対応し、「Ｂａｎｄ Ｅ」にて示すバンドは、コンペティタープライマー（ＣＰ−Ａ）またはコンペティタープライマー（ＣＰ−Ｃ）と、フォワードプライマー（Ｍ１３Ｍ３）と、によって増幅されたＰＣＲ反応産物に対応している。
図２２〜２５から、コンペティタープライマーを用いれば、塩基配列が異なる鋳型を感度よく識別することができることが明らかになった。
本発明は、各種ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、および、ＲＴ（逆転写）−ＰＣＲ）に利用することができる。

Claims (13)

  1. 第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットと、
    上記プライマーセットによって増幅される鋳型と、
    上記第１プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、かつ、上記第１プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第１プローブと、
    上記バルジ構造に結合することによってシグナルを発するバルジ構造結合分子と、を含む試料をＰＣＲ反応にかける工程を含み、
    上記第１プローブは、対になるヌクレオチドが存在しないヌクレオチドにて、バルジ構造を形成するものであり、
    上記バルジ構造結合分子は、下記（１）式にて示される、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であり、
    （Ｒ １ 、Ｒ ２ は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基、または、第３級アミン残基を示す。）、
    上記第２プライマーは、上記第１プライマーと対になって上記鋳型を増幅するものであり、
    上記ＰＣＲ反応は、（ｉ）上記第１プローブと上記第１プライマーとの複合体が上記鋳型に結合するとともに、当該第１プライマーを起点として上記鋳型の相補鎖が伸長される工程、（ｉｉ）上記相補鎖と上記鋳型とによって形成されている二本鎖が、高温処理によって、少なくとも相補鎖を含む鎖Ｂと、上記鋳型からなる一本鎖とに分離される工程、（ｉｉｉ）上記鎖Ｂに対して上記第２プライマーが結合し、当該第２プライマーを起点として上記鎖Ｂの相補鎖が伸長される工程、（ｉｖ）上記鎖Ｂの相補鎖が伸長される過程において、当該相補鎖中に、上記第１プローブ内の第１プライマー結合領域に対応する相補的なヌクレオチドが形成される工程、および、（ｖ）結合する相手を失った上記第１プローブが、ＰＣＲ反応溶液中に解離してバルジ構造を形成し、当該バルジ構造に上記バルジ構造結合分子が結合する工程を含むことを特徴とするＰＣＲ法。
  2. 上記第１プローブは、上記バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドで互いに二本鎖を形成する第１ポリヌクレオチド配列および第２ポリヌクレオチド配列と、上記第１プライマーの一部分と二本鎖を形成する第３ポリヌクレオチド配列と、を有し、
    上記第３ポリヌクレオチド配列は、上記第１ポリヌクレオチド配列または上記第２ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ法。
  3. 上記第３ポリヌクレオチド配列と上記第１プライマーとによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ１、上記第１ポリヌクレオチド配列と上記第２ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ２、としたときに、Ｔｍ１＞Ｔｍ２であることを特徴とする請求項２に記載のＰＣＲ法。
  4. 上記第１プローブは、複数のバルジ構造を形成するものであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のＰＣＲ法。
  5. 上記試料は、更に、上記第２プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、かつ、上記第２プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第２プローブを含み、
    上記第２プローブは、対になるヌクレオチドが存在しないヌクレオチドにて、バルジ構造を形成するものであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のＰＣＲ法。
  6. 上記第２プローブは、上記バルジ構造を形成するヌクレオチド以外のヌクレオチドで互いに二本鎖を形成する第４ポリヌクレオチド配列および第５ポリヌクレオチド配列と、上記第２プライマーの一部分と二本鎖を形成する第６ポリヌクレオチド配列と、を有し、
    上記第６ポリヌクレオチド配列は、上記第４ポリヌクレオチド配列または上記第５ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含んでいることを特徴とする請求項５に記載のＰＣＲ法。
  7. 上記第６ポリヌクレオチド配列と上記第２プライマーとによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ３、上記第４ポリヌクレオチド配列と上記第５ポリヌクレオチド配列とによって形成される二本鎖の融解温度をＴｍ４、としたときに、Ｔｍ３＞Ｔｍ４であることを特徴とする請求項６に記載のＰＣＲ法。
  8. 上記第２プローブは、複数のバルジ構造を形成するものであることを特徴とする請求項５〜７の何れか１項に記載のＰＣＲ法。
  9. 上記バルジ構造は、シトシンバルジ構造、または、チミンバルジ構造であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載のＰＣＲ法。
  10. 上記試料は、更に、コンペティタープライマーを含み、
    上記コンペティタープライマーは、上記鋳型と二本鎖を形成する上記第１プライマー内の領域にて、少なくとも１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されている第７ポリヌクレオチド配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載のＰＣＲ法。
  11. 第１プライマーおよび第２プライマーを含むプライマーセットによって鋳型を増幅するためのＰＣＲキットであって、
    上記第１プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、上記第１プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第１プローブと、
    上記バルジ構造に結合することによってシグナルを発するバルジ構造結合分子と、を備えており、
    上記第１プローブは、対になるヌクレオチドが存在しないヌクレオチドにて、バルジ構造を形成するものであり、
    上記バルジ構造結合分子は、下記（１）式にて示される、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であり、
    （Ｒ １ 、Ｒ ２ は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基、または、第３級アミン残基を示す。）、
    上記第２プライマーは、上記第１プライマーと対になって上記鋳型を増幅するものであることを特徴とするＰＣＲキット。
  12. 更に、上記第２プライマーと二本鎖を形成することによってバルジ構造が失われ、上記第２プライマーとの二本鎖から解離することによってバルジ構造を形成する、第２プローブを備えており、
    上記第２プローブは、対になるヌクレオチドが存在しないヌクレオチドにて、バルジ構造を形成するものであることを特徴とする請求項１１に記載のＰＣＲキット。
  13. 更に、上記鋳型と二本鎖を形成する上記第１プライマー内の領域にて、少なくとも１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されている第７ポリヌクレオチド配列を有しているコンペティタープライマーを備えていることを特徴とする請求項１１または１２に記載のＰＣＲキット。
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