JP2021097703A - 鋳型核酸の分析方法、標的物質の分析方法、鋳型核酸または標的物質の分析用キット、および鋳型核酸または標的物質の分析用装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】精度に優れる鋳型核酸の分析方法、標的物質の分析方法、鋳型核酸または標的物質の分析用キット、ならびに鋳型核酸または標的物質の分析用装置を提供する。【解決手段】鋳型核酸の分析方法は、鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程と、を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、鋳型核酸の分析方法、標的物質の分析方法、鋳型核酸または標的物質の分析用キット、および鋳型核酸または標的物質の分析用装置の分析方法に関する。
遺伝子の解析において、プライマーを用いた鋳型核酸の増幅、および、得られた増幅産物の検出または得られた増幅産物とプローブとのハイブリダイズの検出を利用する分析方法が、広く汎用されている。また、前記分析には、鋳型核酸の増幅反応を検出するプローブ、前記増幅産物にインターカレートする物質、前記増幅産物にハイブリダイズすることにより、蛍光を発生または消失するプローブ等が使用されている。この方法によれば、例えば、標的配列の有無の分析(定性分析)、前記標的配列の量の分析(定量分析)、前記標的配列における多型部位のタイピング等を行うことができる。前記タイピングでは、例えば、前記多型部位の塩基の種類(例えば、野生型か変異型か)、接合型(ホモ接合型かヘテロ接合型か)等が決定できる。
しかしながら、前記鋳型核酸の増幅を利用した遺伝子解析においては、前記鋳型核酸以外の核酸配列の増幅および増幅バイアスが生じることがあるため、特異性、定量性、感度等に問題があった。また、医療分野においては、サンプル中の微量の鋳型核酸を検出する必要がある。このため、より精度に優れる遺伝子解析方法が求められている。
そこで、本発明は、より精度に優れる鋳型核酸の分析方法、標的物質の分析方法、鋳型核酸または標的物質の分析用キット、および鋳型核酸または標的物質の分析用装置を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、
核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、
前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、
前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、
前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、
前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする。
核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、
前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、
前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、
前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、
前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする。
本発明の標的物質の分析方法は、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、
前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする。
前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。
本発明によれば、前記鋳型核酸を精度よく分析できる。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記シグナル発生物質が、前記シグナル発生物質を有するシグナル結合物質を含み、
前記シグナル結合物質は、
前記標的配列または前記相補配列に特異的に結合する物質であり、且つ、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失する物質、または、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生する物質である。
前記シグナル結合物質は、
前記標的配列または前記相補配列に特異的に結合する物質であり、且つ、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失する物質、または、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生する物質である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記シグナル発生物質が、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプローブを含み、
前記フルオロジェニックプローブは、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブ、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブである。
前記フルオロジェニックプローブは、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブ、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブである。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記フルオロジェニックプローブが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸が、前記鋳型核酸に特異的に結合する物質と結合した状態の鋳型核酸である。前記鋳型核酸と、前記鋳型核酸に特異的に結合する物質との結合は、例えば、前記結合物質の特異性に基づく結合でもよいし、前記結合物質の特異性に基づかない結合でもよい。後者は、例えば、前記鋳型核酸によりラベル化された前記結合物質等があげられる。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記プライマーセットが、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプライマーを含み、
前記フルオロジェニックプライマーは、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプライマー、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプライマーである。
前記フルオロジェニックプライマーは、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプライマー、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプライマーである。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記フルオロジェニックプライマーが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記増幅工程における増幅方法が、等温増幅法およびPCR法の少なくとも一方である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記判別工程後、さらに、前記複数の鋳型核酸のフラクションから、前記増幅フラクションを回収する回収工程を含む。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記判別工程後、さらに、前記増幅フラクションについて、前記標的配列および前記相補配列の増幅を行う第2の増幅工程を含む。前記第2の増幅工程における増幅方法が、例えば、等温増幅法およびPCRの少なくとも一方である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記検出工程が、融解曲線解析による検出工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記検出工程の後、さらに、融解曲線解析による解析工程を含む。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸を含むサンプルが、前記核酸増幅試薬を含み、
前記分画工程において、前記鋳型核酸と前記核酸増幅試薬とを含む前記サンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する。
前記分画工程において、前記鋳型核酸と前記核酸増幅試薬とを含む前記サンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションに前記核酸増幅試薬を含有させる。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記分画工程が、前記サンプルから、エマルションを形成する工程であり、前記鋳型核酸のフラクションが、前記エマルションにおいて分散された前記サンプルのドロップであり、
前記検出工程が、前記エマルション中のドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する工程である。
前記検出工程が、前記エマルション中のドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記検出工程において、
流路内に、前記エマルションを通過させ、
前記流路の所定部位において、前記エマルション中の前記ドロップが通過する際に、前記ドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する。
流路内に、前記エマルションを通過させ、
前記流路の所定部位において、前記エマルション中の前記ドロップが通過する際に、前記ドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記エマルションが、油中水滴(W/O型)エマルションである。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記分画工程が、表面に複数の鋳型核酸のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部の表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であり、前記分画工程が、前記チップの表面に前記サンプルをアプライし、前記鋳型核酸のフラクション形成部に前記サンプルを分離することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記チップにおいて、前記鋳型核酸フラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、前記分画工程が、前記チップの表面に前記チップの凹部に前記サンプルを導入することにより、前記サンプルを分画する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記チップにおいて、前記鋳型核酸フラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記チップの鋳型核酸のフラクション形成部に、前記核酸増幅試薬が配置され、前記分画工程において、前記チップ上の鋳型核酸のフラクション形成部で、前記核酸増幅試薬を含有させる。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記検出工程が、1以上のチップ上の前記複数の鋳型核酸のフラクションの画像を得る工程であり、前記判別工程が、前記画像において前記シグナルの発生または消失が検出された前記チップ上の鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションであると判別する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記分画工程が、前記サンプルを滴下することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションの平均体積が、0.0001〜5000nLである。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記サンプルが、2以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと、2以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2以上のシグナル発生物質は、同じ蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと、2以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2以上のシグナル発生物質は、同じ蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記サンプルが、2以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと、2以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2以上のシグナル発生物質は、異なる蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと、2以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2以上のシグナル発生物質は、異なる蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記サンプルが、2以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと非フルオロジェニックプローブとを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記シグナル発生物質と、前記非フルオロジェニックプローブとは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと非フルオロジェニックプローブとを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記シグナル発生物質と、前記非フルオロジェニックプローブとは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、さらに、前記増幅工程前に、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、
前記判別工程において、前記増幅工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。
前記判別工程において、前記増幅工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、さらに、前記分画工程前に、前記鋳型核酸を含むサンプルについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、
前記判別工程において、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。
前記判別工程において、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸の修飾の分析であり、前記増幅工程に先立って、さらに、前記鋳型核酸に対する前処理工程を含む。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、鋳型核酸のメチル化の分析であり、前記前処理工程が、前記鋳型核酸の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、亜硫酸水素塩を用いて前記変換を行う。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、前記前処理工程が、前記鋳型核酸の非メチル化領域またはメチル化領域を切断する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、制限酵素を用いて前記切断を行う。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、前記前処理工程が、メチル化鋳型核酸を濃縮する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、メチル化DNA結合タンパク質および抗メチル化シトシン抗体の少なくとも一方を用いて、前記少なくとも一方とメチル化鋳型核酸との結合により、前記メチル化鋳型核酸を濃縮する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、前記前処理工程が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換する工程である。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、タングステン酸化剤を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をチミン残基またはチミン誘導体残基に変換する。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する。
本発明の鋳型鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化鋳型核酸のグリコシル化領域を切断する工程とを含む。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化鋳型核酸のグリコシル化領域を切断する工程とを含む。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、グリコシル化感受性制限酵素を用いて前記切断を行う。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する工程とを含む。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する工程とを含む。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、グリコシル化ヒドロキシメチル化抗体を用いて、前記抗体と前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸との結合により、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質が、核酸または核酸配列である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記フルオロジェニックプローブは、
シグナル発生物質を有するプローブであり、且つ、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブ、または、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブである。
シグナル発生物質を有するプローブであり、且つ、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブ、または、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブである。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記シグナル発生物質が、フルオロジェニックである。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記フルオロジェニックプローブが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記検出工程が、前記反応液における1種類以上の前記シグナルの輝度または強度を検出する工程である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記検出工程が、前記反応液における1種類以上の前記シグナルを、前記フルオロジェニックプローブの分子レベルでカウントして検出する工程である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質が2つ以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接し、
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、且つ蛍光共鳴エネルギー移動を伴う。
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、且つ蛍光共鳴エネルギー移動を伴う。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質が2つ以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接し、
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、前記複数種のシグナルの空間的な重なりの有無を検出する。
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、前記複数種のシグナルの空間的な重なりの有無を検出する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記接触および前記検出において、前記反応液の温度を制御する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質が、前記標的物質に特異的に結合する物質と結合した状態の標的物質である。前記標的物質と、前記標的物質に特異的に結合する物質との結合は、例えば、前記結合物質の前記標的物質に対する特異性に基づく結合でもよいし、前記結合物質の前記標的物質に対する特異性に基づかない結合でもよい。後者は、例えば、前記標的物質によりラベル化された前記結合物質等があげられる。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、前記標的物質の修飾の分析であり、
前記検出工程に先立って、さらに、前記標的物質に対する前処理工程を含む。
前記検出工程に先立って、さらに、前記標的物質に対する前処理工程を含む。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程の後であり前記検出工程の前、さらに、前記前処理した標的物質の増幅を行う増幅工程を含み、
前記増幅工程において得られた増幅物を、前記検出工程における前記標的物質として使用する。
前記増幅工程において得られた増幅物を、前記検出工程における前記標的物質として使用する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、標的物質のメチル化の分析であり、前記前処理工程が、前記標的物質の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する工程である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、亜硫酸水素塩を用いて前記変換を行う。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、前記前処理工程が、前記標的物質の非メチル化領域またはメチル化領域を切断する工程である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、制限酵素を用いて前記切断を行う。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、前記前処理工程が、メチル化標的物質を濃縮する工程である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、メチル化DNA結合タンパク質および抗メチル化シトシン抗体の少なくとも一方を用いて、前記少なくとも一方とメチル化標的物質との結合により、前記メチル化標的物質を濃縮する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、前記前処理工程が、前記標的物質のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換する工程である。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、タングステン酸化剤を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をチミン残基またはチミン誘導体残基に変換する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化標的物質のグリコシル化領域を切断する工程とを含む。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化標的物質のグリコシル化領域を切断する工程とを含む。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、グリコシル化感受性制限酵素を用いて前記切断を行う。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する工程とを含む。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する工程とを含む。
本発明の標的物質の分析方法は、例えば、前記前処理工程において、グリコシル化ヒドロキシメチル化抗体を用いて、前記抗体と前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質との結合により、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する。
本発明において、「分画」とは、前記鋳型核酸を含むサンプル(以下、「サンプル」ともいう。)を、複数の画分に分割して区画することを意味する。本発明において、「フルオロジェニック」とは、例えば、標的物質に特異的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、標的物質に特異的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生することをいい、シグナルの発生と消失とが可逆的であることを意味する。前記標的物質については、後述する。前記標的物質が核酸の場合、「フルオロジェニック」とは、例えば、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生することをいい、シグナルの発生と消失とが可逆的であることを意味する。前記配列は、例えば、前記標的物質である核酸の配列を意味する。
本発明において、プローブは、前記標的物質に特異的に結合する物質であればよく、具体例として、核酸、抗体、アフィボディー、アプタマー等あげられる。前記標的物質が核酸の場合、前記プローブは、例えば、標的物質の配列に相補的な核酸プローブ、抗体、アフィボディー、アプタマー等があげられる。
以下、本発明について具体例をあげて説明するが、本発明は、以下の説明により限定されない。なお、特に言及しない限り、以下の分析方法において、各工程の例示は、例えば、それぞれ他の工程の例示と互いに組合せ可能である。
<鋳型核酸の分析方法>
本発明の鋳型核酸の分析方法は、前述のように、鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、前述のように、鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする。
本発明の分析方法は、前記分画工程において、前記鋳型核酸を含むサンプルを、前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画し、前記増幅工程後の前記検出工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の分析方法は、前記鋳型核酸を含むサンプルを複数の鋳型核酸のフラクションに分画することにより、例えば、前記サンプル中の複数の鋳型核酸を別個の鋳型核酸のフラクションに分画後、前記標的配列および前記相補配列を増幅し、さらに、各鋳型核酸のフラクションについて、フルオロジェニックな前記シグナル発生物質を用いて前記増幅を検出する。このため、本発明の分析方法によれば、例えば、前記サンプルに含まれる鋳型核酸の濃度が、通常の遺伝子解析法では検出できないほど低濃度であっても、前記サンプルを複数のフラクションに分画することで、前記鋳型核酸を含む鋳型核酸のフラクションでは、前記鋳型核酸を濃縮できる。このため、本発明の分析方法によれば、前記鋳型核酸を精度よく分析できる。さらに、本発明の分析方法は、フルオロジェニックな前記シグナル発生物質を用いるため、高い特異性で鋳型核酸を検出できるため、前記鋳型核酸をより精度よく分析できる。
本発明の適用範囲は、前記標的配列または前記相補配列の増幅の検出を利用する鋳型核酸の分析であればよく、鋳型核酸の分析内容は、特に制限されない。前記増幅の検出は、例えば、前記増幅産物の検出でもよいし、前記増幅産物とプローブとの会合またはその会合体の解離の検出でもよい。
本発明における「配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失」、または、「配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生」とは、例えば、直接的な配列依存でも間接的な配列依存でもよい。前者は、例えば、後述するフルオロジェニックプローブまたはフルオロジェニックプライマー等のように、シグナル発生物質そのものが配列依存的に結合することによる、シグナルの消失または発生があげられ、後者は、例えば、非フルオロジェニックプローブまたは非フルオロジェニックプライマー等が配列依存的に結合し、これに伴い、インターカレーター等のシグナルが消失または発生することがあげられる。
本発明における鋳型核酸の分析としては、第1の例として、前記鋳型核酸の有無の分析(定性分析)または量の分析(定量分析)があげられる。この場合、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列を増幅させ、得られた増幅産物、または得られた増幅産物と前記プローブとの会合もしくは前記会合体の解離を検出することで、前記鋳型核酸の有無または量を分析できる。
第2の例として、前記鋳型核酸における核酸変異部位に存在する核酸変異の分析、いわゆるタイピングが例示できる。前記核酸変異部位は、例えば、一塩基多型等の多型部位である。前記核酸変異の分析は、具体例として、前記核酸変異部位における野生型と変異型との判別、前記核酸変異部位における異なる変異型の判別、ホモ接合体とヘテロ接合体との判別等があげられる。この場合、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列を増幅させ、得られた増幅物と前記プローブとの会合または前記会合体の解離を検出し、前記会合または前記解離が生じる条件(例えば、温度、pH、変性剤濃度、塩濃度等)から、前記核酸変異部位をタイピングできる。
本発明の分析方法において、前記標的配列は、前記鋳型配列における任意部位を含む領域の配列であり、前記相補配列は、前記標的配列に対して相補的な配列である。本発明の分析方法において、前記標的配列および前記相補配列は、前記増幅工程において増幅される。前記任意部位は、特に制限されない。
本発明をタイピングに適用する場合、前記任意部位は、例えば、核酸変異部位である。前記核酸変異部位は、例えば、鋳型核酸における、検出目的の核酸変異が存在する部位である。この場合、前記標的配列は、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位を含む領域の配列であり、前記相補配列は、前記標的配列に対して相補的な配列である。
本発明の分析方法において、前記サンプルは、特に制限されず、鋳型核酸または後述する標的物質が含まれる可能性があるサンプルを適用できる。前記標的物質は、例えば、各種核酸であり、DNA、RNA等があげられる。前記サンプルは、例えば、生体由来、飲食品由来、環境由来等のサンプルがあげられる。前記生体は、特に制限されず、例えば、ヒト;ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギおよびウマ等の非ヒト哺乳類;鳥類;魚類等の動物の生体があげられる。前記生体由来サンプルとしては、例えば、生体内の体液、組織、細胞等があげられる。前記体液としては、例えば、全血、血球、血漿、血清等の血液、房水等の眼球内液、リンパ液、脳脊髄液、涙、汗、精液、唾液、粘液、尿、鼻水、鼻腔ぬぐい液(スワブ)等があげられる。前記組織としては、例えば、硝子体等の眼球内組織、腫瘍等の病原を有する組織等があげられる。また、前記細胞細胞としては、例えば、腫瘍等の病原細胞等があげられる。前記飲食品由来サンプルは、例えば、飲料、食品、食品原料等があげられ、本発明は、例えば、感染、食中毒検査等に利用できる。前記環境由来サンプルは、例えば、水、海水、淡水、河川水、海水、湖水、地下水、下水、生活排水、土壌、大気、食品加工場、調理場等における付着物等があげられる。前記サンプルは、例えば、鋳型核酸、後述する標的物質を含む。前記サンプルの由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。
本発明の分析方法において、前記鋳型核酸は、例えば、核酸サンプル等があげられる。前記核酸サンプルは、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前者の場合、例えば、前記一本鎖核酸が前記鋳型核酸となる。後者の場合、例えば、前記二本鎖核酸を構成する一対の一本鎖核酸のうち、いずれの一本鎖核酸を、前記標的配列を含む鋳型核酸に設定してもよい。具体的には、前記一対の一本鎖核酸のうち、例えば、センス鎖を、前記標的配列を含む鋳型核酸に設定してもよいし、アンチセンス鎖を、前記標的配列を有する鋳型核酸に設定してもよい。
前記鋳型核酸は、例えば、DNA、RNA等の核酸があげられる。前記核酸は、例えば、前記サンプル由来の核酸である。前記サンプル由来のDNAは、例えば、前記サンプルに含まれるDNAでもよいし、前記サンプルに含まれるRNAから逆転写により生成されたcDNAでもよい。前記サンプルに含まれるRNAは、例えば、トータルRNA、mRNA等があげられる。前記核酸は、例えば、ct腫瘍DNA(循環腫瘍DNA)、ctRNA(循環腫瘍RNA)等でもよい。
本発明の分析方法において、前記鋳型核酸は、例えば、前記核酸以外の物質を含む鋳型核酸の複合体でもよい。具体的に、前記鋳型核酸の複合体は、例えば、さらに、標的物質と、前記標的物質に特異的に結合する結合物質とを含んでもよい。この場合、前記結合物質は、例えば、前記鋳型核酸と直接的に結合しており、前記鋳型核酸で標識化された結合物質ということもできる。前記直接的な結合は、例えば、共有結合である。前記標的物質は、特に制限されず、例えば、後述の説明を援用できる。また、前記結合物質は、例えば、前記標的物質に特異的に結合できる物質であればよく、具体的には、前記プローブの説明を援用できる。前記鋳型核酸の複合体は、例えば、前記標的物質を含むサンプルを、前記鋳型核酸で標識化された結合物質と接触させることにより形成できる。前記鋳型核酸が前記鋳型核酸の複合体である場合、前記鋳型核酸は、例えば、人工的に設計された配列を有するDNAであることが好ましい。
本発明において、前記サンプルに含まれる鋳型核酸の種類は、1以上であればよく、例えば、2以上、5以上、20以上であり、その上限は、特に制限されず、例えば、200以下、100以下、50以下であり、その範囲は、例えば、1〜200、2〜100、5〜50である。
本発明の分析方法において、前記核酸増幅試薬は、例えば、後述する前記増幅工程における増幅方法に基づき、適宜決定できる。具体的に、前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含む。前記プライマーセットの種類は、特に制限されず、例えば、前記鋳型核酸の種類の例示を援用できる。前記プライマーセットの種類は、例えば、前記鋳型核酸の種類と同じ数でもよいし、異なる数でもよい。前記サンプルが2以上の鋳型核酸を含む場合、前記プライマーセットは、例えば、1つのプライマーセットで、2以上の鋳型核酸を増幅できるよう設計してもよい。前記核酸増幅試薬が2以上のプライマーセットを含む場合、各プライマーセットは、それぞれ、同じ鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅してもよいし、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅してもよいが、後者が好ましい。
前記プライマーセットについて、具体的に説明する。以下、前記プライマーセットにおいて、前記標的配列を合成するプライマーを、「第1プライマー」ともいい、前記相補配列を合成するプライマーを「第2プライマー」ともいう。
本発明の分析方法において、前記第1プライマーおよび前記第2プライマーは、それぞれ、プライマーの3’端からプライミングするポリメラーゼが、前記標的配列および前記相補配列を合成する。前記第1プライマーおよび前記第2プライマーは、例えば、前記鋳型核酸の配列に応じて適宜設定できる。
前記第1プライマーおよび前記第2プライマーの設定は、例えば、図1が参照できる。図1は、前記鋳型核酸と前記第1プライマーおよび前記第2プライマーとの関係を示す概略図である。図1において、白抜き領域は、前記鋳型核酸の対応箇所と同じ配列であることを意味し、黒塗領域は、前記鋳型核酸の対応箇所と相補の配列であることを意味する(以下、同様)。図1に示すように、前記第1プライマーは、例えば、前記鋳型核酸における任意部位(例えば、前記核酸変異部位)の上位領域と同じ配列を有する。前記第1プライマーの配列は、例えば、前記同じ配列のみでもよいし、前記同じ配列と他の配列とを含んでもよい。後者の場合、前記第1プライマーは、その3’末端領域に、前記同じ配列が配置されていることが好ましい。前記第2プライマーは、例えば、前記鋳型核酸における任意部位(例えば、前記核酸変異部位)の下流領域に相補な配列を有する。前記第2プライマーの配列は、例えば、前記相補な配列のみでもよいし、前記相補な配列と他の配列とを含んでもよい。後者の場合、前記第2プライマーは、その3’末端領域に、前記相補な配列が配置されていることが好ましい。前記核酸増幅試薬が2以上のプライマーセットを含む場合、前記2以上プライマーセットの前記第1プライマーおよび前記第2プライマーは、それぞれ、同じ配列に対して相補な配列でもよいし、異なる配列に対して相補な配列でもよいが、後者が好ましい。
本発明の分析方法において、前記シグナル発生物質は、フルオロジェニックであればよい。前記シグナル発生物質は、例えば、前記標的配列または前記相補配列に特異的に結合する結合物質に付加されていることが好ましい。すなわち、前記シグナル発生物質は、前記シグナル発生物質を有するシグナル結合物質や、前記シグナル発生物質を有するプライマーとして使用することが好ましい。前記核酸増幅試薬が2以上のシグナル発生物質を含む場合、各シグナル発生物質は、同じ種類のシグナル発生物質でもよいし、異なる種類のシグナル発生物質でもよい。前記シグナル発生物質の種類は、特に制限されず、例えば、前記鋳型核酸の種類の例示を援用できる。前記シグナル発生物質の種類は、例えば、前記鋳型核酸の種類および/または前記プライマーセットの種類と同じ数でもよいし、前記鋳型核酸の種類および/または前記プライマーセットの種類と異なる数でもよい。前記サンプルが2以上の鋳型核酸を含む場合、前記シグナル発生物質は、例えば、1つのシグナル発生物質で、2以上の鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失してもよい。前記核酸増幅試薬が2以上のシグナル発生物質を含む場合、各シグナル発生物質は、例えば、同じ蛍光特性を有してもよいし、異なる蛍光特性を有してもよく、2以上の鋳型核酸をより簡便に分析できることから、後者が好ましい。前記蛍光特性は、例えば、励起波長、蛍光波長等があげられる。前記同じ蛍光特性は、例えば、同じ励起波長および蛍光波長を有することを意味する。前記異なる蛍光特性は、例えば、異なる励起波長または蛍光波長を有することを意味する。また、前記核酸増幅試薬が2以上のシグナル発生物質を含む場合、各シグナル発生物質は、2以上の鋳型核酸をより簡便に分析できることから、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失することが好ましい。前記核酸増幅試薬が2以上のシグナル発生物質を含む場合、前記シグナルの発生または消失については、例えば、FRET(Fluorescence resonance energy transfer)を利用してもよいし、FRETを利用しなくてもよい。
前記シグナル発生物質を有するシグナル結合物質は、例えば、前記標的配列または前記相補配列に特異的に結合する物質等があげられる。前記シグナル発生物質を有するシグナル結合物質は、例えば、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失する物質でもよいし、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生する物質でもよい。具体的に、前記シグナル発生物質を有するシグナル結合物質は、例えば、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプローブ等があげられる。この場合、前記フルオロジェニックプローブは、例えば、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発生し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブでもよいし、前記標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブであってもよい。
前記フルオロジェニックプローブが有する前記シグナル発生物質は、前述のように、フルオロジェニックであればよく、具体的には、蛍光消光現象を示す物質、エトキシン効果を示す蛍光原子団等があげられる。前記フルオロジェニックプローブは、具体例として、蛍光消光現象を示す物質を有するプローブ(Quenching phenomenon probe(以下、「Qプローブ」ともいう。))、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光原子団を有するプローブ(以下、「Eプローブ」ともいう。)、モレキュラービーコン(Molecular Beacon)等があげられる。前記核酸増幅試薬が2以上のフルオロジェニックプローブを含む場合、各フルオロジェニックプローブは、同じ種類のフルオロジェニックプローブでもよいし、異なる種類のフルオロジェニックプローブでもよい。
前記フルオロジェニックプローブは、前記任意部位を含む前記標的配列にハイブリダイズするプローブでもよいし、前記相補配列にハイブリダイズするプローブでもよい。前記プローブは、例えば、前記鋳型核酸の配列に応じて適宜設定できる。前記核酸増幅試薬が2以上のフルオロジェニックプローブを含む場合、各フルオロジェニックプローブは、同一の配列にハイブリダイズするプローブでもよいし、異なる配列にハイブリダイズするプローブでもよいが、後者が好ましい。前者のプローブは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズする配列を含む。前記プローブの配列は、前記ハイブリダイズする配列のみでもよいし、前記ハイブリダイズする配列と他の配列とを含んでもよい。後者のプローブは、例えば、前記相補配列にハイブリダイズする配列を含む。前記プローブの配列は、前記ハイブリダイズする配列のみでもよいし、前記ハイブリダイズする配列と他の配列とを含んでもよい。
前記プローブの設定は、例えば、前記図1が参照できる。図1は、前記鋳型核酸と前記プローブとの関係を示す概略図である。図1に示すように、前記プローブが、前記標的配列にハイブリダイズするプローブ(Tseq用プローブ)の場合、例えば、前記鋳型核酸における任意部位N(例えば、前記核酸変異部位)を含む領域に相補的な配列を含むように設計できる。前記Tseq用プローブにおいて、前記鋳型核酸の任意部位Nに対応する箇所は、任意部位Nに相補的なNcを有する。また、前記プローブが、前記相補配列にハイブリダイズするプローブ(Cseq用プローブ)の場合、例えば、前記鋳型核酸における任意部位(例えば、前記核酸変異部位)を含む領域と同じ配列を含むように設計できる。
本発明の分析方法をタイピングに適用する場合、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位の塩基は、例えば、野生型に設定してもよいし、変異型に設定してもよいし、複数の変異型が存在する場合は、いずれの変異型に設定してもよい。
本発明の分析方法をタイピングに適用する場合、前記プローブは、例えば、タイピング用プローブということもできる。前記プローブは、例えば、以下に示す第1形態および第2形態があげられる。前記第1形態は、前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とフルマッチの場合で、解離温度または会合温度が異なり、その解離温度または会合温度により、前記核酸変異部位の核酸変異を検出できるプローブである。前記第1形態のプローブによれば、前記解離温度または前記会合温度から、前記プローブが前記核酸変異部位とミスマッチかフルマッチかを判断できるため、その結果、前記核酸変異部位の塩基が、目的の変異か否か(例えば、変異型か野生型か)を検出できる。前記プローブが、例えば、変異型の前記核酸変異部位にフルマッチするプローブmtの場合、前記プローブmtは、前記核酸変異部位がミスマッチとなる野生型標的配列wtよりも、前記核酸変異部位がフルマッチとなる変異型標的配列mtに対して強い会合力を示す。このため、前記プローブmtと前記変異型標的配列mtとの会合温度は、前記プローブmtと前記野生型標的配列wtとの会合温度よりも、高くなる。
また、前記第2形態は、前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とそれとはTm(融解温度:Melting Temperature)値が異なるミスマッチの場合で、解離温度または会合温度が異なり、その解離温度または会合温度により、前記核酸変異部位の核酸変異を検出できるプローブである。前記第2形態のプローブによれば、前記解離温度または前記会合温度から、前記プローブが前記核酸変異部位といずれのミスマッチであるかを判断できるため、その結果、前記核酸変異部位の塩基が、目的の変異か否か(例えば、変異型か野生型か)を検出できる。
前記Eプローブは、前述のように、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光原子団を有するプローブである。前記Eプローブは、例えば、特許第4370385号公報、国際公開公報WO2014/013954号パンフレットを参照できる。
前記Eプローブを構成するプローブの塩基配列において、前記2つの蛍光原子団の結合位置は、特に制限されず、任意の位置とできる。前記結合位置は、例えば、前記プローブ内の同一塩基または互いに隣接する2つの塩基等があげられる。前記2つの蛍光原子団は、例えば、直接的に前記プローブに結合してもよいし、間接的に前記プローブに結合してもよい。後者の場合、前記2つの蛍光原子団は、例えば、リンカーを介して前記プローブに結合している。
前記Eプローブは、2個の蛍光性原子団(例えば、チアゾールオレンジやその類似物)が導入されたプローブであり、1本鎖の場合は、2個の蛍光性原子団がエキシプレックスを形成するエキシトン効果により、蛍光をほとんど発しないが、標的とハイブリダイズさせると、2個の蛍光性原子団がお互いに離れ、エキシトン効果を解消することによって大きく蛍光を発するという性質を持つ。なお、「Eプローブ」は、株式会社ダナフォームの商品名(「Eprobe」は登録商標)であるが、本発明における「Eプローブ」は、「Eプローブ」または「Eprobe」の商品名を付された商品と同一であっても、同一でなくても良い。
前記Eプローブは、例えば、3’末端が、伸長不可なように修飾されてもよく、具体的には、例えば、3’末端をリンカーOH基で化学修飾したものでもよい。
前記Eプローブにおいて、前記エキシトン効果を示す蛍光性原子団は、
(i)1つの分子内の2つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには2つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
(ii)2つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる2つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
(iii)2つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる2つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記(ii)または(iii)の場合において、前記色素分子が、前記(i)記載の分子であることが好ましい。
(i)1つの分子内の2つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには2つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
(ii)2つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる2つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
(iii)2つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる2つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記(ii)または(iii)の場合において、前記色素分子が、前記(i)記載の分子であることが好ましい。
前記Eプローブにおいて、核酸分子の構造は、例えば、下記式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)または(18b)で表される構造を少なくとも1つ含む標識核酸であっても良い。また、これらの互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩も、本発明における標識核酸に含まれる。以下、蛍光性を示す原子団Z11およびZ12を有する、下記各式で表される構造を、「標識構造」ということがある。また、前記標識構造を含む前記標識核酸を「標識プローブ」ということがある。
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)および(18b)中、
Bは、天然核酸塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル)骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Eは、
(i)デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
(ii)ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Z11およびZ12は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
L1、L2およびL3は、それぞれ、リンカー(架橋原子または原子団)であり、主鎖長(主鎖原子数)は任意であり、主鎖中に、C、N、O、S、PおよびSiを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、L1、L2およびL3は、互いに同一でも異なっていても良く、
Dは、CR、N、P、P=O、BもしくはSiRであり、Rは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
bは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式(16)および(16b)中、L1およびL2は前記リンカーであり、L3、Dおよびbは存在せず、L1およびL2がBに直接結合していてもよく、
ただし、
式(16)、(17)および(18)中、Eは、前記(i)の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのO原子がS原子で置換されていても良く、
式(16b)、(17b)および(18b)中、Eは、前記(ii)の原子団であり、
式(17)および(17b)中、各Bは、同一でも異なっていても良く、各Eは、同一でも異なっていても良い。
Bは、天然核酸塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル)骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Eは、
(i)デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
(ii)ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Z11およびZ12は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
L1、L2およびL3は、それぞれ、リンカー(架橋原子または原子団)であり、主鎖長(主鎖原子数)は任意であり、主鎖中に、C、N、O、S、PおよびSiを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、L1、L2およびL3は、互いに同一でも異なっていても良く、
Dは、CR、N、P、P=O、BもしくはSiRであり、Rは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
bは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式(16)および(16b)中、L1およびL2は前記リンカーであり、L3、Dおよびbは存在せず、L1およびL2がBに直接結合していてもよく、
ただし、
式(16)、(17)および(18)中、Eは、前記(i)の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのO原子がS原子で置換されていても良く、
式(16b)、(17b)および(18b)中、Eは、前記(ii)の原子団であり、
式(17)および(17b)中、各Bは、同一でも異なっていても良く、各Eは、同一でも異なっていても良い。
前記式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)および(18b)中、L1、L2およびL3の主鎖長(主鎖原子数)は、それぞれ2以上の整数であることが好ましい。L1、L2およびL3の主鎖長(主鎖原子数)は、上限は特に制限されないが、例えば100以下であり、より好ましくは30以下であり、特に好ましくは10以下である。
Z11およびZ12は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である。これにより、標的配列と結合したときの蛍光色素周りの環境変化、例えば、二重らせん構造となったときの蛍光の増大が大きく、標的配列をいっそう効果的に検出することができる。
Z11およびZ12は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であればよく、特に制限されない。Z11およびZ12は、例えば、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基であることがより好ましい。また、その他の公知の色素から誘導される基も、適宜用いることができる。DNA等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素は、数多く報告されている。典型的な例では、エチジウムブロミドがDNAの二重らせん構造にインターカレーションして強い蛍光を示すことが知られており、DNA検出に多用されている。また、ピレンカルボキシアミドやプロダンのような微視的極性に応じて蛍光強度を制御できる蛍光色素も知られている。また、前記チアゾールオレンジは、ベンゾチアゾール環とキノリン環をメチン基で連結した蛍光色素であり、通常微弱な蛍光を示すが、二重らせん構造をもつDNAにインターカレーションすることによって強い蛍光発光を与えるようになる。その他、例えば、フルオレセインやCy3等の色素も挙げられる。
式(7)〜(9)中、
X1およびX2は、S、SeまたはOであり、
n’’は、0または正の整数であり、
R1〜R10、R13〜R21は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
R11およびR12のうち、一方は、前記式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)および(18b)中のL1もしくはL2に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
R15は、式(7)、(8)または(9)中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
R16は、式(7)、(8)または(9)中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Z11中のX1、X2およびR1〜R21と、Z12中のX1、X2およびR1〜R21とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
X1およびX2は、S、SeまたはOであり、
n’’は、0または正の整数であり、
R1〜R10、R13〜R21は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
R11およびR12のうち、一方は、前記式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)および(18b)中のL1もしくはL2に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
R15は、式(7)、(8)または(9)中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
R16は、式(7)、(8)または(9)中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Z11中のX1、X2およびR1〜R21と、Z12中のX1、X2およびR1〜R21とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
前記式(7)〜(9)中、R1〜R21において、前記低級アルキル基が、炭素数1〜6の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数1〜6の直鎖または分枝アルコキシ基であることがさらに好ましい。
前記式(7)〜(9)中、R11およびR12において、前記連結基が、炭素数2以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)および(18b)中のL1もしくはL2に結合することがさらに好ましい。前記ポリメチレンカルボニル基の炭素数は、その上限は特に制限されないが、例えば100以下、好ましくは50以下、より好ましくは30以下、特に好ましくは10以下である。
前記式(19)および(20)中、X1は−S−又は−O−を示す。R1からR10、R13およびR14はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、又はアミノ基を示す。R11及びR12の一方は、前記式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)および(18b)中のL1およびL2に結合する連結基を示し、R11及びR12の他方は水素原子、または低級アルキル基を示す。
上記各化学式中、
nは、正の整数であり、2〜6の範囲であることが特に好ましい。
nは、正の整数であり、2〜6の範囲であることが特に好ましい。
前記式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)および(18b)中、Bは、天然核酸塩基骨格を有していても良いが、前述の通り、人工核酸塩基骨格を有していてもよい。例えば、Bが、Py(ピリミジン環)、Py der.、Pu(プリン環)、またはPu der.で表される構造であることが好ましい。ただし、
前記Pyとは、下記式(11)で表記される6員環のうち、1位にEと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがN、C、SまたはO原子で置換された原子団であり、前記N、C、SまたはO原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式(12)で表記される縮合環のうち、9位にEと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがN、C、SまたはO原子で置換された原子団であり、前記N、C、SまたはO原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
前記Pyとは、下記式(11)で表記される6員環のうち、1位にEと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがN、C、SまたはO原子で置換された原子団であり、前記N、C、SまたはO原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式(12)で表記される縮合環のうち、9位にEと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがN、C、SまたはO原子で置換された原子団であり、前記N、C、SまたはO原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
また、前記Eプローブにおける前記核酸分子は、例えば、下記化学式106、110、113、117、120、122、123、124または114−2で表されるヌクレオチド構造、またはそれらの幾何異性体、立体異性体もしくは塩である構造を少なくとも一つ含んでいても良い。
上記化学式106、110、113、117、120、122、123、124および114−2中、リンカー長nは、正の整数であり、2〜6の範囲であることが好ましい。
前記Eプローブに含まれる前記標識構造の数は、特に限定されないが、例えば、1〜100個程度、1〜20個程度である。また、前記Eプローブにおいて、前記標識構造が含まれる部位も特に制限されない。
前記プローブは、例えば、天然ヌクレオチド残基、非ヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド残基および非天然主骨格のいずれから構成されてもよく、いずれか一種類でもよいし、いずれか二種類でもよいし、前記三種類を含んでもよいし、前記四種類を含んでもよい。前記非天然主骨格は、特に制限されず、例えば、LNA、PNAおよび修飾型リン酸ジエステル結合をもつ核酸等があげられる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、特に制限されず、S化ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基が硫黄原子(S)を含んでもよいし、硫黄原子(S)で修飾されてもよい。
前記プローブの基本骨格は、特に制限されず、例えば、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、修飾オリゴヌクレオシド、ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、修飾ポリヌクレオシド、DNA、修飾DNA、RNA、修飾DNA、LNA、PNA(ペプチド核酸)、または、これらキメラ分子のいずれであっても良いし、その他の構造であっても良い。また、前記核酸の基本骨格は、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。前記核酸がプローブの場合、例えば、塩基対結合を形成し得るものであればよく、核酸試料や標的核酸配列の場合、例えば、相補鎖合成のための鋳型として機能すればよい。このため、前記核酸は、例えば、部分的に、または、全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であってもよい。前記核酸を構成する人工塩基としては、例えば、2-amino-6-(N,N-dimethylamino)purinepyridin-2-one、5-methylpyridin-2-one、2-amino-6-(2-thienyl)purine、pyrrole-2-carbaldehyde、9-Methylimidazo[(4,5)-b]pyridine、5-iodo-2-oxo(1H)pyridine 2-oxo-(1H)pyridine、2-amino-6-(2-thiazolyl)purine、7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine等があげられるが、これには限定されない。
本発明の分析方法において、「ヌクレオチド」とは、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよく、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれか一方から構成されてもよいし、両者を含んでもよい。前記プローブにおいて、核酸の構成塩基数は、特に制限されない。核酸という用語は、一般に、ポリヌクレオチドという用語と同義である。オリゴヌクレオチドという用語は、一般に、ポリヌクレオチドの中でも、特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。一般には、例えば、2〜100塩基長、より一般的には2〜50塩基長程度のポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」と呼ぶが、これらの数値に限定されるものではない。ポリヌクレオチドという用語は、第1の分析方法において、例えば、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびに、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、S-オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。
前記PNA(ペプチド核酸)は、一般に、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、ペプチド主鎖で置換された構造を有する。前記ペプチド主鎖としては、例えば、アミド結合によって結合したN−(2−アミノエチル)グリシンの反復単位があげられる。PNAのペプチド主鎖に結合させる塩基としては、例えば、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ウラシル、5−メチルシトシン、チオウラシルおよび2,6−ジアミノプリン等の天然に存在する塩基、ブロモチミン、アザアデニンおよびアザグアニン等の人工塩基があげられるが、これに限定されない。
前記LNAは、一般に、糖−リン酸骨格において、リボースの2’位の酸素原子と4’位の炭素原子との間がメチレン架橋で結合された、2つの環状構造を持つ核酸である。LNAを含むオリゴヌクレオチドがDNAとアニールすると、二本鎖のコンフォメーションが変化し、熱安定性が上昇する。LNAは、通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、例えば、オリゴヌクレオチドの設計条件によって、より確実、強固なハイブリダイゼーションが可能となる。
前記プローブに含まれる塩基数は、特に限定されず、例えば、5〜100程度、6〜50程度、6〜25程度である。
前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプライマーセットは、例えば、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプライマーでもよいし、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプラマーでもよい。
前記フルオロジェニックプライマーが有する前記シグナル発生物質は、前述のように、フルオロジェニックであればよく、具体的には、蛍光消光現象を示す物質、エトキシン効果を示す蛍光原子団等があげられる。前記フルオロジェニックプライマーは、具体例として、蛍光消光現象を示す物質を有するプライマー(Quenching phenomenon primer(以下、「Qプライマー」ともいう。))、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光原子団を有するプライマー(以下、「Eプライマー」ともいう。)等があげられる。
前記Eプライマーは、前述のように、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光原子団を有するプライマーである。前記Eプライマーの説明は、特に言及しない限り、「Eプローブ」を「Eプライマー」に、「プローブ」を「プライマー」に読み替えて、Eプローブの説明を援用できる。前記Eプライマーに含まれる前記標識構造の数は、特に限定されないが、例えば、1〜100個程度、1〜20個程度である。また、前記Eプライマーにおいて、前記標識構造が含まれる部位も特に制限されない。
前記プライマーに含まれる塩基数は、特に限定されず、例えば、5〜100程度、6〜50程度、6〜25程度である。
本発明の分析方法において、前記核酸増幅試薬は、例えば、その他の試薬を含んでもよい。前記その他の試薬は、例えば、非フルオロジェニックプローブ、ポリメラーゼ等の酵素、増幅用のモノマー核酸(dNTP)等があげられる。前記核酸増幅試薬は、例えば、前記鋳型核酸を含むサンプルに予め含有させてもよいし、前記分画工程において前記鋳型核酸を含むサンプルに含有させてもよいし、前記分画工程において、前記鋳型核酸のフラクションに含有させてもよいし、前記分画工程後、前記増幅工程前に、前記鋳型核酸のフラクションに含有させてもよい。なお、前記鋳型核酸を含むサンプルが、前記核酸増幅試薬を含有する場合、後述する分画工程において、前記鋳型核酸と前記核酸増幅試薬とを含むサンプルを前記複数のフラクションに分画してもよい。
前記非フルオロジェニックプローブは、前記鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失するプローブである。前記非フルオロジェニックプローブは、フルオロジェニックでないプローブであり、例えば、前記フルオロジェニックプローブでないプローブがあげられる。具体的に、前記非フルオロジェニックプローブは、例えば、前記TaqMan(登録商標)プローブ、サイクリングプローブ、Alexa Fluor(登録商標)プローブ、Qdot(登録商標)等の蛍光物質で標識された蛍光標識プローブ等があげられる。本発明の分析方法において、前記非フルオロジェニックプローブに代えて、例えば、SYBR(登録商標) Green等のインターカレーターを用いてもよい。前記非フルオロジェニックプローブのハイブリダイズする位置および配列は、例えば、前記フルオロジェニックプローブにおけるハイブリダイズする位置および配列の説明を援用できる。前記核酸増幅試薬が非フルオロジェニックプローブを含む場合、前記非フルオロジェニックプローブの種類は、特に制限されず、例えば、前記鋳型核酸の種類の例示を援用できる。前記非フルオロジェニックプローブの種類と前記シグナル発生物質の種類との合計の数は、例えば、前記鋳型核酸の種類と同じであることが好ましい。前記核酸増幅試薬が非フルオロジェニックプローブを含む場合、前記シグナル発生物質と、前記非フルオロジェニックプローブとは、同じ鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失してもよいし、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失してもよいが、2以上の鋳型核酸をより簡便に分析できることから、後者が好ましい。
前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクッションの平均体積は、特に制限されず、例えば、0.0001〜5000 nL、0.0001〜2000 nL、0.005〜2000 nL、0.005〜1000 nL、0.01〜1000 nL、0.05〜500 nL、0.1〜500 nL、0.2〜500 nL、0.5〜500 nL、0.5〜200 nL、0.5〜100 nL、1〜100 nL、1〜50 nL、2〜50 nL、5〜50 nLである。
本発明の分析方法において、各工程は、例えば、反応液中で行われることが好ましい。前記反応液は、例えば、増幅方法等の種類に応じて、適宜、必要な試薬を含んでもよい。
1.分画工程
前記分画工程では、前記鋳型核酸を含むサンプルを、前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する。前記分画工程において、前記サンプルの分画方法は、特に制限されず、例えば、前記サンプルを滴下することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する方法等があげられる。具体例として、前記分画工程は、例えば、下記(1−1)または(1−2)の工程を含む。
(1−1)前記サンプルから、エマルションを形成する工程
(1−2)表面に複数のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを前記複数のフラクションに分画する工程
前記分画工程では、前記鋳型核酸を含むサンプルを、前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する。前記分画工程において、前記サンプルの分画方法は、特に制限されず、例えば、前記サンプルを滴下することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する方法等があげられる。具体例として、前記分画工程は、例えば、下記(1−1)または(1−2)の工程を含む。
(1−1)前記サンプルから、エマルションを形成する工程
(1−2)表面に複数のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを前記複数のフラクションに分画する工程
(1−1)工程
前記(1−1)工程では、前記サンプルからエマルションを形成する。前記エマルションにおいて、前記鋳型核酸のフラクションは、前記エマルションにおいて分散された前記サンプルのドロップである。前記エマルションの形成は、前記サンプルの存在下、エマルション形成する非水溶性溶媒と水性溶媒とを接触させて、前記非水溶性溶媒中に複数のドロップを形成することにより行うことができる。前記接触は、例えば、前記非水溶性溶媒に前記水性溶媒を接触させてもよいし、前記水性溶媒に前記非水性溶媒を接触させてもよい。前記形成方法は、例えば、マイクロ流路を活用したドロップレット作成方法(RainDnace 社のRainDrop(登録商標) System、 BIO-RAD社のQX200(商標) AutoDG(商標) Droplet Digital PCR system)等があげられる。前記サンプルは、例えば、非水溶性溶媒に含まれてもよいし、前記水溶性溶媒に含まれてもよい。前記鋳型核酸が、例えば、水溶性溶媒に分散されたサンプルである場合、前記サンプルを前記水溶性溶媒として使用してもよい。前記エマルションの形成は、例えば、一般的なエマルション形成方法が採用できる。前記エマルションの形成方法は、特に制限されず、例えば、エマルション化デバイスを使用できる。前記エマルション化デバイスは、例えば、サンプル用流路、核酸増幅試薬用流路、非水溶性溶媒用流路、これらの連結部、および前記連結部から導出される導出流路を備える流路があげられる。前記エマルション化デバイスを使用する場合、例えば、前記連結部に、前記非水溶性溶媒用流路から、前記非水溶性溶媒が導入され、さらに、前記サンプル用流路から前記サンプルが、前記核酸増幅試薬用流路から前記核酸増幅試薬が、前記非水溶性溶媒が導入された連結部に導入される。そして、例えば、前記連結部でこれらが接触し、これらの混合物がエマルション化され、前記連結部から前記導出流路に前記エマルションとして導出される。前記サンプルおよび前記核酸増幅試薬は、例えば、一方が前記非水溶性溶媒に含まれ、他方が前記水性溶媒に含まれてもよいし、両者が前記非水溶性溶媒または前記水溶性溶媒に含まれてもよい。前記核酸増幅試薬は、前述のように、前記サンプルに含まれてもよい。この場合、前記エマルションは、例えば、サンプル用流路、非水溶性溶媒用流路、これらの連結部および前記連結部から導出される導出流路を備えたエマルション化デバイスを使用し、同様に、形成できる。
前記(1−1)工程では、前記サンプルからエマルションを形成する。前記エマルションにおいて、前記鋳型核酸のフラクションは、前記エマルションにおいて分散された前記サンプルのドロップである。前記エマルションの形成は、前記サンプルの存在下、エマルション形成する非水溶性溶媒と水性溶媒とを接触させて、前記非水溶性溶媒中に複数のドロップを形成することにより行うことができる。前記接触は、例えば、前記非水溶性溶媒に前記水性溶媒を接触させてもよいし、前記水性溶媒に前記非水性溶媒を接触させてもよい。前記形成方法は、例えば、マイクロ流路を活用したドロップレット作成方法(RainDnace 社のRainDrop(登録商標) System、 BIO-RAD社のQX200(商標) AutoDG(商標) Droplet Digital PCR system)等があげられる。前記サンプルは、例えば、非水溶性溶媒に含まれてもよいし、前記水溶性溶媒に含まれてもよい。前記鋳型核酸が、例えば、水溶性溶媒に分散されたサンプルである場合、前記サンプルを前記水溶性溶媒として使用してもよい。前記エマルションの形成は、例えば、一般的なエマルション形成方法が採用できる。前記エマルションの形成方法は、特に制限されず、例えば、エマルション化デバイスを使用できる。前記エマルション化デバイスは、例えば、サンプル用流路、核酸増幅試薬用流路、非水溶性溶媒用流路、これらの連結部、および前記連結部から導出される導出流路を備える流路があげられる。前記エマルション化デバイスを使用する場合、例えば、前記連結部に、前記非水溶性溶媒用流路から、前記非水溶性溶媒が導入され、さらに、前記サンプル用流路から前記サンプルが、前記核酸増幅試薬用流路から前記核酸増幅試薬が、前記非水溶性溶媒が導入された連結部に導入される。そして、例えば、前記連結部でこれらが接触し、これらの混合物がエマルション化され、前記連結部から前記導出流路に前記エマルションとして導出される。前記サンプルおよび前記核酸増幅試薬は、例えば、一方が前記非水溶性溶媒に含まれ、他方が前記水性溶媒に含まれてもよいし、両者が前記非水溶性溶媒または前記水溶性溶媒に含まれてもよい。前記核酸増幅試薬は、前述のように、前記サンプルに含まれてもよい。この場合、前記エマルションは、例えば、サンプル用流路、非水溶性溶媒用流路、これらの連結部および前記連結部から導出される導出流路を備えたエマルション化デバイスを使用し、同様に、形成できる。
前記非水溶性溶媒は、例えば、油、ミネラルオイル、クロロホルム、芳香族化合物等があげられる。前記非水溶性溶媒は、1種類を単独で使用してもよいし、2種類以上を併用してもよい。
前記水溶性溶媒は、例えば、水、緩衝液、水溶性高分子溶液等があげられる。前記水溶性溶媒は、1種類を単独で使用してもよいし、2種類以上を併用してもよい。
前記(1−1)工程において、前記接触させる非水溶性溶媒(N)と水溶性溶媒(A)との体積比(N:A)は、例えば、1:0.00001〜2、1:0.0001〜1、1:0.001〜0.5である。
前記(1−1)工程において形成される前記エマルションが、例えば、油中水滴(W/O型)エマルションである。前記エマルション中のドロップの平均体積は、例えば、0.0001〜50000nL、0.001〜500 nL、0.01〜50 nLである。前記エマルション中のドロップの個数は、複数であればよく、例えば、2〜1000000000個、1000〜1000000000個、10000〜1000000000個である。前記ドロップに含まれる前記鋳型核酸および前記核酸増幅試薬の濃度は、特に制限されない。前記ドロップにおける前記鋳型核酸の濃度は、例えば、0〜5000 μg/L、0〜500 μg/L、0〜50 μg/Lである。
(1−2)工程
前記(1−2)工程では、表面に複数のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを前記複数のフラクションに分画する。前記(1−2)工程で使用するチップは、表面に複数のフラクション形成部を有すればよく、その具体例は、下記(A)チップ、(B)チップまたは(C)チップがあげられる。以下、前記(A)チップを使用した場合、前記(1−2)工程は、(1−2A)工程といい、前記(B)チップを使用した場合、前記(1−2)工程は、(1−2B)工程といい、前記(C)チップを使用した場合、前記(1−2)工程は、(1−2C)工程ともいう。
(A)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部の表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であるチップ
(B)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であるチップ
(C)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップの凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であるチップ
前記(1−2)工程では、表面に複数のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを前記複数のフラクションに分画する。前記(1−2)工程で使用するチップは、表面に複数のフラクション形成部を有すればよく、その具体例は、下記(A)チップ、(B)チップまたは(C)チップがあげられる。以下、前記(A)チップを使用した場合、前記(1−2)工程は、(1−2A)工程といい、前記(B)チップを使用した場合、前記(1−2)工程は、(1−2B)工程といい、前記(C)チップを使用した場合、前記(1−2)工程は、(1−2C)工程ともいう。
(A)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部の表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であるチップ
(B)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であるチップ
(C)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップの凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であるチップ
(1−2A)工程
前記(1−2A)工程は、前記(A)チップを使用する工程である。前記(A)チップにおいて、前記フラクション形成部の表面が、親水性であり、前記フラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。このため、前記チップ表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記サンプルが、親水性である前記鋳型核酸のフラクション形成部に分離され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(1−2A)工程は、前記(A)チップを使用する工程である。前記(A)チップにおいて、前記フラクション形成部の表面が、親水性であり、前記フラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。このため、前記チップ表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記サンプルが、親水性である前記鋳型核酸のフラクション形成部に分離され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(A)チップにおいて、前記フラクション形成部は、例えば、前記チップの基板に対して、親水性物質を含む溶媒および疎水性物質を含む溶媒を前記基板に塗布することにより形成できる。また、前記基板が親水性または疎水性である場合、前記フラクション形成部は、それぞれ、前記疎水性物質を含む溶媒および前記親水性物質を含む溶媒を前記基板に塗布することにより形成できる。前記親水性物質および疎水性物質は、特に制限されず、公知の物質を使用できる。前記(A)チップにおいて、前記フラクション形成部の数は、特に制限されず、1以上であればよい。前記フラクション形成部が複数の場合、前記フラクション形成部間の距離は、例えば、各鋳型核酸のフラクションの大きさにより適宜設定でき、具体的には、各鋳型核酸のフラクションが接触しない距離があげられる。
(1−2B)工程
前記(1−2B)工程は、前記(B)チップを使用する工程である。前記(B)チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部である。このため、前記チップの表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記チップの凹部である前記鋳型核酸のフラクション形成部に前記サンプルが導入され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(1−2B)工程は、前記(B)チップを使用する工程である。前記(B)チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部である。このため、前記チップの表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記チップの凹部である前記鋳型核酸のフラクション形成部に前記サンプルが導入され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(B)チップにおいて、前記フラクション形成部は、例えば、前記チップの基板を切削等することにより形成できる。前記(B)チップにおいて、前記フラクション形成部の数は、特に制限されず、1以上であればよい。前記フラクション形成部の凹部の内積は、特に制限されず、例えば、前記鋳型核酸のフラクッションの平均体積に応じて適宜設定できる。
(1−2C)工程
前記(1−2C)工程は、前記(C)チップを使用する工程である。前記(C)チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップの凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。このため、前記チップ表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記サンプルが、親水性である前記鋳型核酸のフラクション形成部に分離され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。また、前記(C)チップは、前記フラクション形成部において、凹部および親水性を組合せ、前記フラクション形成部以外の領域において、非凹部および疎水性を組合せることにより、より迅速、且つ、精度よく前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(1−2C)工程は、前記(C)チップを使用する工程である。前記(C)チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップの凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。このため、前記チップ表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記サンプルが、親水性である前記鋳型核酸のフラクション形成部に分離され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。また、前記(C)チップは、前記フラクション形成部において、凹部および親水性を組合せ、前記フラクション形成部以外の領域において、非凹部および疎水性を組合せることにより、より迅速、且つ、精度よく前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(C)チップにおいて、前記フラクション形成部の形成方法、数、内積等の説明は、前記(A)チップおよび前記(B)チップの説明を援用できる。
前記(1−2)工程において、前記チップの鋳型核酸のフラクション形成部に、前記核酸増幅試薬が配置され、前記分画工程において、前記チップ上の鋳型核酸フラクション形成部で、前記核酸増幅試薬を含有させてもよい。また、前記(1−2)工程において使用する前記チップの数は、特に制限されず、前記分画工程において分画する前記鋳型核酸のフラクションの数に応じて適宜設定できる。具体的に、前記(1−2)工程において使用する前記チップの数は、1枚でもよいし、2枚以上でもよい。
2.増幅工程
前記増幅工程では、前記核酸試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行なう。具体的に、前記増幅工程は、前記非水溶性溶媒を核酸増幅反応の条件に曝すことにより行う。これにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記鋳型核酸および前記核酸増幅試薬を含む鋳型核酸のフラクションついて、前記第1プライマーおよび前記第2プライマーから、それぞれ、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列が増幅される。
前記増幅工程では、前記核酸試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行なう。具体的に、前記増幅工程は、前記非水溶性溶媒を核酸増幅反応の条件に曝すことにより行う。これにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記鋳型核酸および前記核酸増幅試薬を含む鋳型核酸のフラクションついて、前記第1プライマーおよび前記第2プライマーから、それぞれ、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列が増幅される。
本発明の分析方法において、前記増幅工程における増幅方法は、例えば、等温増幅方法、非等温増幅法があげられる。前記等温増幅方法は、例えば、SmartAmp法(NATURE METHODS (2007) VOL.4 NO.3 p257、特許第3897805号)、SDA(SDA;strand displacement amplification、特公平7−114718号公報)、改良SDA法(米国特許第5824517号、国際公開第99/09211号、国際公開第95/25180号)、核酸配列増幅法(NASBA;nucleic acid sequence based amplification、日本国特許第2650159号公報)、LAMP法(Lamp;Loop-Mediated Isothermal Amplification、日本国特許第3313358号、Nucleic Acids Research,2000,Vol.28,No.12,e63)、ICAN法(ICAN;Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第02/16639号)、自立複製法(3SR;self-sustainedsequence replication)法、TMA(transcription-mediated amplification)法、Invader法、RCA(rolling cycle amplification)法等があげられる。前記等温増幅の工程および条件は、特に制限されず、従来の等温増幅反応の工程および等温増幅反応の条件が採用できる。前記非等温増幅法は、例えば、PCR法があげられる。前記非等温増幅の工程および条件は、特に制限されず、従来の非等温増幅反応の工程および非等温増幅反応の条件が採用できる。また、後述するように、例えば、前記鋳型核酸のメチル化修飾またはヒドロキシメチル化修飾等の修飾を分析する場合、前記増幅法は、例えば、ESPCR(end-specific PCR)法、HDCR(helper-dependent chain reaction)法等でもよい。前記ESPCR法およびHDCR法の工程ならびに条件は、特に制限されず、従来の工程および条件が採用できる。
本発明の増幅方法は、前述のように、前記増幅工程における鋳型核酸がcDNAの場合、例えば、さらに、RNAから逆転写によりcDNAを生成する逆転写工程を有してもよい。この場合、例えば、前記RNAは、前記逆転写工程における逆転写反応の鋳型核酸であり、前記逆転写工程で得られたcDNAは、前記増幅工程における増幅反応の鋳型核酸となる。前記RNAは、前述のように、例えば、前記生体試料に含まれるRNAがあげられる。
3.検出工程
前記検出工程では、前記増幅工程後、前記複数のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する。前記シグナルの種類は、特に制限されず、前記シグナル発生物質の種類に基づき、適宜決定できる。前記シグナルの種類は、例えば、蛍光、発光等のシグナルがあげられ、前記検出工程においては、例えば、シグナル強度の測定により、前記増幅の程度を検出できる。本明細書においては、以下、特に示さない限り、前記シグナルとして蛍光シグナルを例にあげるが、これには限定されず、例えば、発光等のシグナルに読み替え可能である。
前記検出工程では、前記増幅工程後、前記複数のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する。前記シグナルの種類は、特に制限されず、前記シグナル発生物質の種類に基づき、適宜決定できる。前記シグナルの種類は、例えば、蛍光、発光等のシグナルがあげられ、前記検出工程においては、例えば、シグナル強度の測定により、前記増幅の程度を検出できる。本明細書においては、以下、特に示さない限り、前記シグナルとして蛍光シグナルを例にあげるが、これには限定されず、例えば、発光等のシグナルに読み替え可能である。
前記検出工程において、前記増幅を示すシグナルの検出は、前述のように、例えば、前記プライマーを用いて得られた増幅産物の検出でもよいし、前記プライマーを用いて得られた増幅産物とプローブとの会合またはその会合体の解離の検出でもよい。前者の場合、前記シグナルの検出は、例えば、二本鎖の形成または解離の検出があげられる。前記二本鎖の形成または解離の検出方法は、特に制限されない。後者の場合、前記増幅を示すシグナルの検出は、例えば、前記プローブと前記増幅産物とについて、温度変化、pH変化、変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う会合、またはその会合体の解離の検出があげられる。一般的に、配列が相補関係にある一対の一本鎖核酸は、前記各種変化に伴って、会合(二本鎖の形成)し、また、解離(二本鎖から一本鎖への解離)することが知られている。前記検出工程において、前記温度変化、pH変化、前記変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う会合またはその会合体の解離を検出する方法は、特に制限されず、例えば、融解曲線解析による検出方法等があげられる。
前記検出工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションについて、前記シグナルを検出する方法は、特に制限されず、前記シグナルの種類に応じて適宜決定できる。前記検出方法は、例えば、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡、蛍光スペクトルメーター等を用いた検出があげられる。また、前記シグナルの検出感度が向上し、前記鋳型核酸をより精度よく分析できることから、前記鋳型核酸のフラクション中の一分子ごとの蛍光強度を測定できる高精度な検出方法を用いても良い。前記高精度検出方法は、例えば、蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy、FCS)、蛍光強度分布解析法(Fluorecscence Intensity Distribution Analysis、FIDA)、蛍光偏光強度分布解析法(FIDA polarization、FIDA−PO)、走査分子計数法(Scanning single−molecule counting、SSMC)等があげられる。
前記分画工程が前記(1−1)工程の場合、前記検出工程では、前記エマルション中のドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する。前記シグナルの検出方法は、特に制限されず、例えば、流路内を通過するエマルションを検出する方法、前記エマルションを平面状に展開し、検出する方法等があげられる。
前記流路内を通過するエマルションを検出する場合、前記検出工程は、前記流路内に、前記エマルションを通過させ、前記流路の所定部位において、前記エマルション中のドロップが通過する際に、前記ドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出することが好ましい。前記流路において、前記所定部位は、任意の位置に設定できる。前記流路の形および長さは、特に制限されない。前記流路の内径は、特に制限されず、例えば、前記ドロップの平均径があげられる。前記流路は、例えば、全体が一定の内径であってもよいし、異なる内径であってもよい。前記流路は、例えば、少なくとも前記所定部位の内径が、前記ドロップが1個ずつ通過する流路であってもよい。前記流路をこのような内径とすることで、例えば、前記所定部位において、前記複数のドロップをそれぞれ検出できるため、鋳型核酸をより精度よく分析できる。
また、前記流路内を通過するエマルションを検出する場合、本発明の分析方法は、前記検出工程において、さらに、回収工程により、前記増幅が検出されたドロップ(増幅フラクション)を回収してもよい。また、前記回収工程においては、さらに、前記増幅が検出されなかったドロップを回収してもよい。具体的に、前記検出工程において、前記増幅が検出されたドロップと前記増幅が検出されなかったドロップとを回収する場合、前記流路は、上流側から下流側に向かって、第1流路と、前記第1流路の下流側末端から分岐する第2流路および第3流路とを有する。前記第1流路は、前記検出工程に供する前記非水溶性溶媒が通過する流路であり、前記第2流路は、前記検出工程において前記増幅が検出された前記ドロップが通過する流路であり、前記第3流路は、前記検出工程において前記増幅が検出されなかった前記ドロップが通過する流路である。また、前記第1流路は、その下流側末端領域に、前記所定部位、および、前記増幅が検出された前記ドロップと前記増幅が検出されなかった前記ドロップとを回収する回収工程を有し、前記検出工程において、前記第1流路の前記所定部位を通過した前記ドロップは、前記増幅が検出されると、前記回収工程によって前記第2流路に導入され、前記増幅が検出されないと、前記回収工程によって前記第3流路に導入される。前記第1の分析方法は、前記流路をこのような構成として、前記回収工程により、前記増幅が検出された前記ドロップと前記増幅が検出されなかった前記ドロップとを回収することができ、例えば、前記増幅が検出された前記ドロップについて、再分析等を行うことが可能となり、鋳型核酸をより精度よく分析できる。前記下流側末端領域において、前記所定部位および前記回収工程は、前記回収工程が、前記ドロップにおける前記増幅の検出に基づき、前記ドロップを回収できるように配置されていればよく、例えば、前記下流末端領域において、前記所定部位が、前記回収工程に対して前記第1流路の上流側に配置されている。
前記検出工程において、前記増幅が検出されたドロップと前記増幅が検出されなかったドロップとの回収方法は、特に制限されず、公知の液滴の回収方法が採用できる。前記回収方法は、例えば、前記ドロップを吸引し、回収する方法、前記ドロップを荷電し、前記荷電により回収する方法があげられる。前記回収工程は、例えば、前記ドロップをプラスに荷電させてもよいし、マイナスに荷電させてもよい。前記荷電により回収する場合、前記回収工程は、例えば、前記第1流路に導入される前記ドロップ、または前記第1流路に導入された前記ドロップを荷電する荷電手段があげられる。後者の場合、前記回収工程は、例えば、前記所定部位を通過した前記ドロップを荷電する荷電手段があげられる。そして、この場合、前記第2流路は、プラス極およびマイナス極のいずれか一方の極を有し、前記第3流路は、他方の極を有し、前記検出工程において、前記第1流路の前記所定部位を通過した前記ドロップは、前記増幅が検出されると、前記回収工程によって前記第2流路とは逆の荷電がなされて前記第2流路に導入され、前記増幅が検出されないと、前記回収工程によって前記第3流路とは逆の荷電がなされて前記第3流路に導入される。また、前記回収工程は、前記ドロップをプラスおよびマイナスの一方に荷電させてもよい。この場合、前記第2流路および前記第3流路は、それぞれ、プラス極またはマイナス極に荷電される極を有し、前記回収工程によって荷電され、前記第1流路の前記所定部位を通過した前記ドロップは、前記増幅が検出されると、前記第2流路は、前記ドロップと逆の荷電がなされて、前記ドロップは前記第2流路に導入され、前記増幅が検出されないと、前記第3流路は、前記ドロップと逆の荷電がなされて、前記ドロップは前記第3流路に導入される。
前記エマルションを平面状に展開し、検出する場合、前記検出工程は、前記エマルションを平面状に展開後、前記平面状に展開されたエマルション中のドロップの画像を得ることが好ましい。前記ドロップの画像は、例えば、蛍光顕微鏡等の公知の撮像手段により得ることができる。
前記分画工程が前記(1−2)工程の場合、前記検出工程では、1以上のチップ上の前記複数の鋳型核酸のフラクションの画像を得る。前記複数の鋳型核酸のフラクションの画像は、例えば、前述の撮像手段により得ることができる。
前記サンプルが2以上の鋳型核酸を含む場合、前記検出工程では、各鋳型核酸について、増幅を示すシグナルの発生または消失を別々に検出してもよいし、一部の鋳型核酸について、示すシグナルの発生または消失を同時に検出し、残部の鋳型核酸について、シグナルの発生または消失を別々に検出してもよいし、全ての鋳型核酸について、シグナルの発生または消失を同時に検出してもよい。具体的に、前記サンプルが2以上の鋳型核酸を含む場合、例えば、各鋳型核酸について、シグナルを発生または消失するシグナル発生物質を検出することにより、各鋳型核酸の増幅を検出できる。
前記核酸増幅試薬が非フルオロジェニックプローブを含む場合、前記検出工程では、例えば、前記非フルオロジェニックプローブのシグナルの発生または消失を検出することにより、前記鋳型核酸の増幅を検出できる。
本発明において、前記検出工程は、例えば、前記増幅工程中に行なってもよい。この場合、前記増幅工程中に、例えば、経時的に1回以上、前記シグナルの発生または消失を検出してもよい。
4.判別工程
前記判別工程では、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。前記判別は、例えば、前記シグナルの有無に基づき、判別してもよいし、シグナル強度に基づき、判別してもよい。後者の場合、前記判別は、例えば、前記シグナル強度の閾値を設定し、前記閾値以上または以下のシグナル強度が検出された鋳型核酸のフラクションを前記増幅フラクションであると判別する。具体例として、前記増幅によりシグナルが発生する場合、前記シグナル強度が前記閾値以上の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別し、前記シグナル強度が前記閾値を未満の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションでないと判別する。
前記判別工程では、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。前記判別は、例えば、前記シグナルの有無に基づき、判別してもよいし、シグナル強度に基づき、判別してもよい。後者の場合、前記判別は、例えば、前記シグナル強度の閾値を設定し、前記閾値以上または以下のシグナル強度が検出された鋳型核酸のフラクションを前記増幅フラクションであると判別する。具体例として、前記増幅によりシグナルが発生する場合、前記シグナル強度が前記閾値以上の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別し、前記シグナル強度が前記閾値を未満の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションでないと判別する。
また、前記検出工程において、前記ドロップの画像を得た場合、前記判別工程は、前記画像において前記シグナルの発生または消失が検出された前記エマルション中のドロップを、前記増幅フラクションであると判別する。前記検出工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションの画像を得た場合、前記判別工程は、前記画像において前記シグナルの発生または消失が検出された前記チップ上の鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションであると判別する。前記判別は、例えば、前記シグナルの有無に基づき、判別してもよいし、シグナル強度に基づき、判別してもよい。
前記サンプルが2以上の鋳型核酸を含む場合、前記判別工程では、1の鋳型核酸の増幅が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別してもよいし、2以上の鋳型核酸の増幅が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別してもよいし、全ての鋳型核酸の増幅が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別してもよい。
前記核酸増幅試薬が非フルオロジェニックプローブを含む場合、前記判別工程では、例えば、前記非フルオロジェニックプローブのシグナル発生または消失を検出することにより、前記鋳型核酸の増幅が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別してもよい。
本発明の分析方法において、使用するシグナル発生物質、分画工程および増幅工程の組合せは、特に制限されず、例えば、下記表1における(i)〜(xii)の組合せがあげられる。下記表1において、前記(i)〜(xii)の組合せで使用するシグナル発生物質、分画工程および増幅工程は、丸で示している。
本発明の分析方法は、前記鋳型核酸が、前記標的物質と前記結合物質とを含む鋳型核酸の複合体である場合、前記分画工程に先立ち、前記標的物質を含むサンプルと、前記鋳型核酸で標識化された結合物質とを接触させることにより、前記鋳型核酸の複合体を形成する複合体形成工程を含んでもよい。また、前記鋳型核酸が、前記標的物質と前記結合物質とを含む鋳型核酸の複合体である場合、後述する判定工程で得られた結果に基づき、例えば、前記標的物質の有無の判定(定性分析)、前記標的物質の量の判定(定量分析)等を行なってもよい。
本発明の分析方法は、例えば、さらに、前記増幅工程前に、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、前記判別工程において、前記増幅工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別してもよい。また、本発明の分析方法は、前記分画工程前に、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、前記判別工程において、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別してもよい。本発明の分析方法は、例えば、前記分画工程前または前記増幅工程前に検出されたシグナルを用いて、前記判別工程において、前記増幅フラクションを判別することにより、前記判別にあたりバックグラウンドによる影響を除けるため、前記鋳型核酸をより精度よく分析できる。具体的に、前記増幅によりシグナルが発生し、前記シグナル強度の閾値を設定し、判別する場合、前記増幅工程後に検出されたシグナル強度から前記増幅工程前または前記分画工程前に検出されたシグナル強度を引いたシグナル強度の差分を用いて、判別できる。より具体的には、前記シグナル強度の差分が前記閾値以上の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別し、前記シグナル強度の差分が前記閾値を未満の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションでないと判別する。
本発明の分析方法において、使用するシグナル発生物質、分画工程、増幅工程および検出工程の組合せは、特に制限されず、例えば、下記表2における(i−1)〜(xii−3)の組合せがあげられる。下記表2において、前記(i−1)〜(xii−3)の組合せで使用するシグナル発生物質、分画工程、増幅工程および検出工程は、丸で示している。
本発明の分析方法は、例えば、前記検出工程の後、さらに、融解曲線解析による解析工程を含んでもよい。本発明の分析方法は、例えば、フルオロジェニックであるシグナル発生物質と融解曲線解析による解析工程とを組合せることにより、前記標的配列または前記相補配列が増幅をより特異的に、且つ精度よく分析できるため、より精度よく前記鋳型核酸を分析できる。
本発明の分析方法は、例えば、前記判別工程の後、さらに、前記判別工程において前記標的配列または前記相補配列の増幅が検出された増幅フラクションを回収する回収工程を有してもよい。本発明の分析方法は、前記回収工程を含むことにより、例えば、前記増幅が検出された前記増幅フラクションについて、再分析等を行うことが可能となり、鋳型核酸をより精度よく分析できる。前記回収工程は、例えば、前記回収手段により実施できる。
前記判別工程において、前記ドロップの画像から前記標的配列または前記相補配列の増幅を判別した場合、前記回収工程は、前記平面状に展開したエマルションから、前記増幅フラクションと判別されたドロップを回収する。また、前記判別工程において、前記複数の鋳型フラクションの画像から前記標的配列または前記相補配列の増幅を判別した場合、前記回収工程は、前記チップから、前記増幅フラクションと判別された前記鋳型核酸のフラクションを回収する。前記回収工程は、例えば、公知の溶液回収装置等が使用できる。
本発明の分析方法は、前記回収工程を含む場合、さらに、前記増幅フラクションについて、前記標的配列および前記相補配列の増幅を行なう第2の増幅工程を含むことが好ましい。本発明の分析方法は、前記第2の増幅工程を含むことにより、例えば、前記増幅フラクションのシグナルを増幅することが可能となるため、鋳型核酸をより精度よく分析できる。前記第2の増幅工程は、例えば、前記増幅工程と同様に実施できる。
本発明の分析方法は、例えば、さらに、前記検出工程における検出結果に基づいて、前記鋳型核酸を判定する判定工程を含んでもよい。ここで、前記鋳型核酸の判定とは、特に制限されないが、例えば、前述のように、前記鋳型核酸の有無の判定(定性分析)、前記鋳型核酸の量の判定(定量分析)、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位における前記核酸変異部位の塩基の種類の判定(タイピング)があげられる。前記サンプルが2以上の鋳型核酸を含む場合、前記判定工程では、1の鋳型核酸を判定してもよいし、2以上の鋳型核酸を判定してもよいし、全ての鋳型核酸を判定してもよい。また、前記核酸増幅試薬が非フルオロジェニックプローブを含む場合、前記検出結果は、例えば、前記シグナル発生物質の検出による検出結果に加え、前記非フルオロジェニックプローブの検出による検出結果を用いて、前記鋳型核酸を判定してもよい。また、前記分画工程前または前記増幅工程前に、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出している場合、前記判定工程は、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後の検出工程において検出されたシグナルとを用いて、前記鋳型核酸を判定してもよい。
本発明の分析方法において、前記サンプル中の鋳型核酸は、例えば、分析の目的に応じて、前処理を施してもよい。前記前処理は、例えば、前記増幅工程よりも前に行われ、具体的には、前記分画工程に先立って行われてもよいし、前記分画工程後であって前記増幅工程前に行われてもよい。後者の場合は、例えば、前処理に必要な試薬を、前記フラクション内に導入する等の対応があげられる。前記前処理は、例えば、前記分画工程に先立って行われることが好ましい。すなわち、本発明の分析方法において、前記サンプル中の鋳型核酸に前処理を施した後、前記分画工程、続いて、増幅工程を行うことが好ましい。
本発明の分析方法において、前記鋳型核酸の修飾を分析する場合、前記前処理工程において、前記鋳型核酸に前処理を施すことが好ましい。前記修飾は、例えば、メチル化、ヒドロキシメチル化等があげられる。前記鋳型核酸の修飾を分析する場合、前記前処理としては、例えば、下記(1)〜(3)等の方法が例示できる。
(1)前記鋳型核酸における非修飾塩基Xまたは修飾塩基Xを別の塩基Yに変換する前処理
(2)修飾化核酸への結合物質を使用し、修飾された鋳型核酸の濃縮を行う前処理
(3)非修飾化領域または修飾化領域を切断する前処理
(1)前記鋳型核酸における非修飾塩基Xまたは修飾塩基Xを別の塩基Yに変換する前処理
(2)修飾化核酸への結合物質を使用し、修飾された鋳型核酸の濃縮を行う前処理
(3)非修飾化領域または修飾化領域を切断する前処理
前記(1)の場合、例えば、鋳型核酸における特定部位の塩基Xが非修飾であれば、前記特定部位は塩基Yへ変換されるが、前記特定部位の塩基Xが修飾されていれば、前記特定部位は塩基Yに変換されない。また、例えば、鋳型核酸における特定部位の塩基Xが修飾されていれば、前記特定部位は塩基Yへ変換されるが、前記特定部位の塩基Xが非修飾であれば、前記特定部位は塩基Yに変換されない。このため、変換の違いにより、鋳型核酸における修飾を分析できる。
前記(2)の場合、例えば、特定部位の塩基Xが修飾された核酸に結合する結合物質を用い、前記結合物質と修飾化鋳型核酸とを結合させることで、鋳型核酸の中でも、修飾化された鋳型核酸を濃縮することができる。この濃縮化された鋳型核酸を用いることで、鋳型核酸における修飾を分析できる。
前記(3)の場合、例えば、非修飾領域の切断であれば、修飾化鋳型核酸は切断されず、非修飾化鋳型核酸は切断され、修飾領域の切断であれば、修飾化鋳型核酸は切断され、非修飾化鋳型核酸は切断されない。また、例えば、修飾領域の切断であれば、非修飾化鋳型核酸は切断されず、修飾化鋳型核酸は切断され、非修飾領域の切断であれば、非修飾化鋳型核酸は切断され、修飾化鋳型核酸は切断されない。このような切断の有無により、鋳型核酸における修飾を分析できる。
まず、具体例として、鋳型核酸のメチル化の分析を行う場合の前処理について例示する。
前記(1)の場合、前記前処理工程において、例えば、前記鋳型核酸の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基(以下、変換残基ともいう)に変換することが好ましい。前記変換処理に使用する試薬は、特に制限されず、例えば、亜硫酸水素塩等が使用できる。前記前処理工程に続く各工程は、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記増幅工程の後、前記検出工程として、例えば、融解曲線解析を行ってもよいし、また、前記増幅工程において、例えば、メチル化シトシン残基を有する鋳型核酸と、変換残基を有する鋳型核酸とに対するマルチプレックス核酸増幅を行った後、前記検出工程を行ってもよい。
前記(3)の場合、前記前処理工程において、例えば、前記鋳型核酸の非メチル化領域またはメチル化領域を切断することが好ましい。前記切断に使用する試薬は、特に制限されず、例えば、制限酵素が使用できる。前記制限酵素は、例えば、所定の配列について、非メチル化であれば切断でき、メチル化を受けると切断できなくなるメチル化感受性制限酵素、所定の配列について、メチル化を受けると切断できるメチル化依存性制限酵素等が使用できる。前記制限酵素は、例えば、いずれか一方を使用してもよいし、両方を使用してもよい。前記非メチル化領域を切断する場合、前記制限酵素は、例えば、メチル化領域よりも有意に非メチル化領域を切断する制限酵素であり、非メチル化領域に対して依存性(またはメチル化領域に対して感受性)の制限酵素が好ましい。前記メチル化領域を切断する場合、前記制限酵素は、例えば、非メチル化領域よりも有意にメチル化領域を切断する制限酵素であり、メチル化領域に対して依存性(または非メチル化領域に対して感受性)の制限酵素が好ましい。前記メチル化シトシン感受性制限酵素は、例えば、AatII、ApaI、BstUI等があげられる。前記メチル化シトシン依存性制限酵素は、例えば、MspJI、GlaI等があげられる。前記前処理工程に続く各工程は、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記増幅工程として、例えば、前記ESPCR法、前記HDCR法、キメラプライマーおよびブロッカー等を使用する増幅法等を行った後、前記検出工程を行ってもよいし、また、前記増幅工程において、例えば、マルチプレックス核酸増幅を行った後、前記検出工程を行ってもよい。本発明において、非メチル化領域またはメチル化領域の切断を利用してメチル化の分析を行う場合、例えば、以下の論文を参照できる。
Sensitive measurement of unmethylated repeat DNA sequences by end-specific PCR, Keith N. Rand et al., BioTechniques 2010, 49(4)
Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylation-dependent restriction enzymes, Keith N. Rand et al., Nucleic Acids Research, 2013, 41(1),e15
また、前記増幅工程において、例えば、メチル化シトシン残基を有する鋳型核酸と、変換残基を有する鋳型核酸とに対するマルチプレックス核酸増幅を行ってもよい。
Sensitive measurement of unmethylated repeat DNA sequences by end-specific PCR, Keith N. Rand et al., BioTechniques 2010, 49(4)
Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylation-dependent restriction enzymes, Keith N. Rand et al., Nucleic Acids Research, 2013, 41(1),e15
また、前記増幅工程において、例えば、メチル化シトシン残基を有する鋳型核酸と、変換残基を有する鋳型核酸とに対するマルチプレックス核酸増幅を行ってもよい。
前記(2)の場合、前記前処理工程において、例えば、メチル化鋳型核酸を濃縮することが好ましい。前記濃縮の方法は、特に制限されず、例えば、前記メチル化鋳型核酸に結合する結合物質を使用し、前記結合物質と前記メチル化鋳型核酸との結合により、濃縮することができる。前記結合物質としては、例えば、メチル化DNA結合タンパク質、抗メチル化シトシン抗体等があげられる。前記メチル化DNA結合タンパク質は、例えば、MECP2等があげられる。前記前処理工程に続く各工程は、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記増幅工程の後、前記検出工程において例えば、融解曲線解析を行ってもよいし、また、前記増幅工程において、例えば、マルチプレックス核酸増幅を行った後、前記検出工程を行ってもよい。本発明において、前記メチル化DNA結合タンパク質を利用してメチル化の分析を行う場合、例えば、MIRA(Methylated CpG Island Recovery Assay)を行うことができる。また、本発明において、前記抗メチル化シトシン抗体を利用してメチル化の分析を行う場合、例えば、MeDIP(Methylated DNA Immunoprecipitation)を行うことができる。
つぎに、具体例として、鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析を行う場合の前処理について例示する。
前記(1)の場合、前記前処理工程において、例えば、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換することが好ましい。前記ヒドロキシメチル化シトシンは、例えば、5−ヒドロキシメチル化シトシン残基である。前記非ヒドロキシメチル化塩基残基は、例えば、チミン残基またはチミン誘導体残基でもよいし、ウラシル残基またはウラシル誘導体残基でもよい(以下、変換残基ともいう)。前記変換処理に使用する試薬は、特に制限されない。具体例として、チミン残基またはチミン誘導体残基に変換する場合、例えば、タングステン酸化剤等が使用でき、前記タングステン酸化剤としては、例えば、ペルオキソタングステン二核錯体があげられる。また、ウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する場合、例えば、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩(バイサルファイト)を併用することができる。前記前処理工程に続く各工程は、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記増幅工程の後、前記検出工程として、例えば、融解曲線解析を行ってもよいし、また、前記増幅工程において、例えば、メチル化シトシン残基を有する鋳型核酸と、変換残基を有する鋳型核酸とに対するマルチプレックス核酸増幅を行った後、前記検出工程を行ってもよい。本発明において、タングステン酸化剤を利用してヒドロキシメチル化の分析を行う場合、例えば、以下の論文を参照できる。
Chem Commun (Camb). Okamoto A, Sugizaki K, Nakamura A, Yanagisawa H, Ikeda S. 2011; 47(40): 11231-3.
また、本発明において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩(バイサルファイト)の併用を利用してヒドロキシメチル化の分析を行う場合、例えば、以下の論文を参照できる。
Bioorganic & Medical Chemistry Letters.Seketsu Fukuzawa, Kazuo Tachibana, Shoji Tajima, Isao Suetake. 2015, 25, 5667-5671
Chem Commun (Camb). Okamoto A, Sugizaki K, Nakamura A, Yanagisawa H, Ikeda S. 2011; 47(40): 11231-3.
また、本発明において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩(バイサルファイト)の併用を利用してヒドロキシメチル化の分析を行う場合、例えば、以下の論文を参照できる。
Bioorganic & Medical Chemistry Letters.Seketsu Fukuzawa, Kazuo Tachibana, Shoji Tajima, Isao Suetake. 2015, 25, 5667-5671
前記(3)の場合、前記前処理工程は、例えば、ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、前記ヒドロキシメチル化鋳型核酸のグリコシル化領域を切断する工程とを含むことが好ましい。グリコシル化工程において、例えば、5−ヒドロキシメチル化シトシン(5−hmC)を、グリコシル化5−hmCとする。グリコシル化は、例えば、β−グリコシルトランスフェラーゼを使用して行うことができる。前記切断に使用する試薬は、特に制限されず、例えば、制限酵素が使用できる。前記制限酵素は、例えば、所定の配列について、非グリコシル化であれば切断でき、グリコシル化を受けると切断できなくなるグリコシル化感受性制限酵素、所定の配列について、グリコシル化を受けると切断できるグリコシル化依存性制限酵素等が使用できる。前記制限酵素は、例えば、いずれか一方を使用してもよいし、両方を使用してもよい。前記制限酵素は、例えば、非グリコシル化領域よりも有意にグリコシル化領域を切断する制限酵素であり、グリコシル化領域に対して依存性(またはグリコシル化領域に対して感受性)の制限酵素が好ましい。前記グリコシル化5−hmCに感受性の制限酵素としては、例えば、MspI、HaeIII等があげられる。前記前処理工程に続く各工程は、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記増幅工程として、例えば、前記ESPCR法、前記HDCR法、キメラプライマーおよびブロッカー等を使用する増幅法等を行った後、前記検出工程を行ってもよいし、また、前記増幅工程において、例えば、マルチプレックス核酸増幅を行った後、前記検出工程を行ってもよい。また、前記増幅工程において、例えば、メチル化シトシン残基を有する鋳型核酸と、変換残基を有する鋳型核酸とに対するマルチプレックス核酸増幅を行ってもよい。
前記(2)の場合、前記前処理工程は、例えば、ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する工程とを含むことが好ましい。前記グリコシル化工程は、例えば、前記(3)と同様である。前記濃縮の方法は、特に制限されず、例えば、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸に結合する結合物質を使用し、前記結合物質と前記グリコシル化したメチル化鋳型核酸との結合により、濃縮することができる。前記結合物質としては、例えば、グリコシル化したヒドロキシメチル化DNAに対する結合タンパク質または抗体があげられる。前記抗体は、例えば、抗グリコシル化5−hmC抗体があげられる。前記前処理工程に続く各工程は、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記増幅工程の後、前記検出工程において、例えば、融解曲線解析を行ってもよいし、また、前記増幅工程において、例えば、マルチプレックス核酸増幅を行った後、前記検出工程を行ってもよい。
<標的物質の分析方法>
本発明の標的物質の分析方法は、前述のように、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の標的物質の分析方法は、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出することを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の標的物質の分析方法は、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。本発明の標的物質の分析方法によりば、精度よく標的物質を分析できる。
本発明の標的物質の分析方法は、前述のように、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の標的物質の分析方法は、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出することを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の標的物質の分析方法は、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。本発明の標的物質の分析方法によりば、精度よく標的物質を分析できる。
前記標的物質は、特に制限されず、例えば、核酸、タンパク質、糖、脂質等があげられる。前記標的物質が核酸の場合、前記標的物質は、例えば、ターゲット核酸ということもできる。前記ターゲット核酸は、例えば、前述の鋳型核酸があげられる。前記標的物質は、例えば、前記標的物質に特異的に結合する物質と結合した状態の標的物質であってもよい。前記フルオロジェニックプローブは、例えば、前述のフルオロジェニックプローブがあげられ、前記フルオロジェニックプローブを構成するプローブは、前述のように、前記標的物質に特異的に結合する物質であればよく、具体例として、核酸、抗体、アフィボディー、アプタマー等あげられる。以下、前記標的物質が核酸である場合を例にあげて説明するが、前記標的物質の説明は、以下の例において、「ターゲット核酸」を、「標的物質」に読み替えて、その説明を援用できる。
前記反応液に含まれる前記ターゲット核酸の量は、特に制限されず、例えば、100 ng以下である。また、前記反応液の体積は、特に制限されず、例えば、2 nL以下である。
前記サンプルと前記フルオロジェニックプローブとの接触は、例えば、前記サンプルに前記フルオロジェニックプローブを添加することにより接触させてもよいし、前記フルオロジェニックプローブに、前記サンプルを添加することにより接触させてもよいし、前記水性溶媒に、前記フルオロジェニックプローブと、前記サンプルとを添加することにより接触させてもよい。
前記シグナルの発生またはシグナルの消失の検出は、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法の検出工程における検出方法により実施できる。具体例として、前記検出は、例えば、前記反応液における1種類以上の前記シグナルの輝度または強度の検出、前記反応液における1種類以上の前記シグナルを、前記フルオロジェニックプローブの分子レベルでカウントする検出等があげられる。前記分子レベルのカウントは、例えば、前述の高精度検出方法等があげられる。
前記接触および検出において、前記反応液の温度は、特に制限されず、例えば、前記ターゲット核酸および前記フルオロジェニックプローブの種類に応じて適宜設定できる。前記反応液の温度は、例えば、前記接触および検出において、制御されてもよい。
本発明の標的物質の分析方法は、前記標的物質が核酸の場合、例えば、微量の前記ターゲット核酸を検出できることから、前記ターゲット核酸に対する増幅反応工程を含まなくてもよい。
本発明の標的物質の分析方法は、前記ターゲット核酸が2種類以上である場合、前記各ターゲット核酸に対する2種類以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、前記検出工程において検出した前記2種類以上の前記フルオロジェニックプローブのシグナル検出値から、各ターゲット核酸の濃度比または存在比を算出する工程を含んでもよい。前記シグナル検出値は、例えば、前記シグナルの輝度、強度等があげられる。前記シグナル検出値から、前記ターゲット核酸の濃度または量を算出する方法は、特に制限されず、例えば、標準サンプルから作成した検量線から算出する方法等があげられる。
前記ターゲット核酸が2種類以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接する場合、前記各ターゲット核酸に対する2以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、且つ、異なる前記ターゲット核酸への結合によりシグナルを発生または消失することが好ましい。この場合、前記シグナルの発生または消失は、例えば、FRETを利用してもよいし、利用しなくてもよい。
<鋳型核酸または標的物質の分析用キット>
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、前述のように、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。本発明の分析用キットは、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、前述のように、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。本発明の分析用キットは、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。
<鋳型核酸または標的物質の分析用装置>
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、前述のように、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。本発明の分析用装置は、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、前述のように、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。本発明の分析用装置は、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
[実施例1]
本発明の鋳型核酸の分析方法により、精度よく分析できることを確認した。
本発明の鋳型核酸の分析方法により、精度よく分析できることを確認した。
(1)DNAサンプル
下記参考文献1に記載のヒト309G変異型MDM2遺伝子の配列を有するプラスミドDNAを、RNase Free Waterと混合し、これをサンプル溶液とした。
参考文献1:Enokida Y et al. "Rapid Detection of SNP (c.309T>G) in the MDM2 Gene by the Duplex SmartAmp Method", PLOS ONE, 2013, Volume 8, Issue 4, e60151
下記参考文献1に記載のヒト309G変異型MDM2遺伝子の配列を有するプラスミドDNAを、RNase Free Waterと混合し、これをサンプル溶液とした。
参考文献1:Enokida Y et al. "Rapid Detection of SNP (c.309T>G) in the MDM2 Gene by the Duplex SmartAmp Method", PLOS ONE, 2013, Volume 8, Issue 4, e60151
(2)試薬調製
ヒトMDM2遺伝子309G変異検出用の等温増幅反応系に関する下記参考文献1を参照し、実施した。具体的には、まず、下記表3の組成となるよう各種プライマーセットを混合し、プライマーミックスを調製した。下記プライマーミックスにおいて、MDM2.Bf.202-13.M.E8(Eprimer)が、前記シグナル発生物質である。また、下記表4の組成となるように、各成分を混合し、4.4反応分の反応液(14.5 μL×4.4)を調製可能な量のプレミックスを調製した。下記表4に示すように、プレミックスとしては、1反応につき375または750コピー分の鋳型DNAを反応液に含むよう調整した2種類のプレミックスを調製した。
ヒトMDM2遺伝子309G変異検出用の等温増幅反応系に関する下記参考文献1を参照し、実施した。具体的には、まず、下記表3の組成となるよう各種プライマーセットを混合し、プライマーミックスを調製した。下記プライマーミックスにおいて、MDM2.Bf.202-13.M.E8(Eprimer)が、前記シグナル発生物質である。また、下記表4の組成となるように、各成分を混合し、4.4反応分の反応液(14.5 μL×4.4)を調製可能な量のプレミックスを調製した。下記表4に示すように、プレミックスとしては、1反応につき375または750コピー分の鋳型DNAを反応液に含むよう調整した2種類のプレミックスを調製した。
(3)分析
下記表5の組成となるように、前記プレミックスと酵素(ポリメラーゼ)を混合し、反応液を調製した。
下記表5の組成となるように、前記プレミックスと酵素(ポリメラーゼ)を混合し、反応液を調製した。
つぎに、2種類の反応液について、それぞれ14.5μL採取し、チップ(QuantStudio 3D Digital PCR Chip、Applied Biosystems)に導入することにより、約20000万個のフラクションに分画した。前記分画後、60℃のヒートブロックに前記チップを配置し、各フラクションについて、前記鋳型DNAにおける標的配列およびその相補配列を30分間増幅した。前記増幅後、光学測定装置(QuantStudio 3D Digital PCR Instrument、Applied Biosystems社)を用いて、前記チップにおいて、各フラクションの蛍光シグナルを検出した。得られたデータについて、解析ソフト(QuantStudio 3DAnalysis Suite、Applied Biosystems社)を用いて、リファレンス色素(ROX)陽性、且つEprimer由来蛍光シグナル陽性のフラクション数をカウントし、前記反応液に含まれる前記鋳型DNAのコピー数の測定値を算出した。なお、各フラクションについて、ROXを測定値することでチップ内の微小な各凹型の反応容器内に反応試薬が正しく充填(フラクション形成)されているかを確認した。
また、比較例1の分析方法として、2種類の反応液について、それぞれ14.5 μLを3反応分採取し、分画せずにPCRチューブに導入した。つぎに、前記チューブについて、サーマルサイクラー(StepOne(商標) Real-Time PCR System、Applied Biosystems社)を用いて、60℃の条件下で経時的にシグナルの検出を行うことで、反応開始時間から所定シグナル強度が得られるまでの検出時間を測定した。
この結果を図2に示す。図2において、(A)は、実施例1の分析方法における鋳型DNAの仕込みコピー数を375または750コピー/反応とした時の鋳型DNAコピー数の測定値を示す図であり、(B)は、比較例1の分析方法における鋳型DNAの仕込みコピー数を375または750コピー/反応とした時の検出時間を示す図である。図2(A)において、縦軸は、鋳型DNAのコピー数の測定値を示し、図2(B)において、縦軸は、前記検出時間を示す。図2(A)および(B)において、バーは、左から、鋳型DNAの仕込みコピー数が375コピー/反応と750コピー/反応の時の各反応系の結果を示す。図2(B)に示すように、比較例1の分析方法では、前記反応液中の鋳型DNAの仕込みコピー数を2倍量としても、検出時間に有意な差がなかった。これに対し、図2(A)に示すように、実施例1の分析方法では、前記反応液中の鋳型DNAの仕込みコピー数を2倍量とすると、前記鋳型DNAのコピー数の測定値は、2.13倍となり、前記鋳型DNAの仕込みコピー数と相関を示した。これらの結果から、本発明の鋳型核酸の分析方法によれば、例えば、標的とする鋳型核酸の濃度が1000コピー以下のような低濃度であり、分画工程を経ない比較例1の分析方法ではコピー数の比較ができない場合においても、精度よく鋳型核酸を分析できることがわかった。
[実施例2]
本発明の標的物質の分析方法により、複数のプローブを用いて、標的核酸を精度よく分析できることを確認した。
本発明の標的物質の分析方法により、複数のプローブを用いて、標的核酸を精度よく分析できることを確認した。
(1)DNAサンプルおよび検出用プローブ
DNAサンプルとして下記表6に示すCase核酸モデルおよびControl核酸モデルを、検出用プローブ(フルオロジェニックプローブ)として、下記表6に示すCase核酸モデル検出用チアゾールオレンジ標識Eprobe(TOプローブ)およびContol核酸モデル検出用チアゾールピンク標識Eprobe(TPプローブ)を準備した。
DNAサンプルとして下記表6に示すCase核酸モデルおよびControl核酸モデルを、検出用プローブ(フルオロジェニックプローブ)として、下記表6に示すCase核酸モデル検出用チアゾールオレンジ標識Eprobe(TOプローブ)およびContol核酸モデル検出用チアゾールピンク標識Eprobe(TPプローブ)を準備した。
(2)実験方法
0.25 μmol/L TOプローブおよび0.25 μmol/L TPプローブとなるよう、各プローブをRNase Free Waterに添加し、TO/TPプローブ混合液を調製した。また、下記表7に示すCase/Control核酸モデル濃度比となるように、前記Case核酸モデルおよび前記Control核酸モデルをRNase Free Waterに添加し、6種類のモデルサンプルを調製した。そして、常温(25℃)で、50μL TO/TPプローブ混合液と、50μL モデルサンプルとをそれぞれ混合した。前記混合後、蛍光スペクトルメーター(JASCO社)を用い、488 nmの励起光で励起した場合の510nmにおける蛍光強度(TO蛍光強度)、および570 nmの励起光で励起した場合の600 nmの蛍光強度(TP蛍光強度)を、それぞれ測定した。また、測定した蛍光強度を規格化するため、Case核酸モデルの終濃度(Ca)とControl核酸モデルの終濃度(Co)との比(Ca/Co)が、0μmol/L/0 μmol/L、0.25 μmol/L/0 μmol/L、または0 μmol/L/0.25 μmol/LのCase/Control核酸モデルを調製し、前記TO蛍光強度および前記TP蛍光強度を測定した。そして、各モデルサンプルについて、下記式(1)および(2)に基づき、TO蛍光変動率およびTP蛍光変動率を算出した。
0.25 μmol/L TOプローブおよび0.25 μmol/L TPプローブとなるよう、各プローブをRNase Free Waterに添加し、TO/TPプローブ混合液を調製した。また、下記表7に示すCase/Control核酸モデル濃度比となるように、前記Case核酸モデルおよび前記Control核酸モデルをRNase Free Waterに添加し、6種類のモデルサンプルを調製した。そして、常温(25℃)で、50μL TO/TPプローブ混合液と、50μL モデルサンプルとをそれぞれ混合した。前記混合後、蛍光スペクトルメーター(JASCO社)を用い、488 nmの励起光で励起した場合の510nmにおける蛍光強度(TO蛍光強度)、および570 nmの励起光で励起した場合の600 nmの蛍光強度(TP蛍光強度)を、それぞれ測定した。また、測定した蛍光強度を規格化するため、Case核酸モデルの終濃度(Ca)とControl核酸モデルの終濃度(Co)との比(Ca/Co)が、0μmol/L/0 μmol/L、0.25 μmol/L/0 μmol/L、または0 μmol/L/0.25 μmol/LのCase/Control核酸モデルを調製し、前記TO蛍光強度および前記TP蛍光強度を測定した。そして、各モデルサンプルについて、下記式(1)および(2)に基づき、TO蛍光変動率およびTP蛍光変動率を算出した。
TO蛍光変動率=(STO−TOmin)/(TOmax−TOmin) ・・・(1)
STO:モデルサンプルのTO蛍光強度
TOmin:Ca/Coが0μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTO蛍光強度
TOmax:Ca/Coが0.25 μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTO蛍光強度
TP蛍光変動率=(STP−TPmin)/(TPmax−TPmin) ・・・(2)
STP:モデルサンプルのTP蛍光強度
TPmin:Ca/Coが0μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTP蛍光強度
TPmax:Ca/Coが0 μmol/L/0.25 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTP蛍光強度
STO:モデルサンプルのTO蛍光強度
TOmin:Ca/Coが0μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTO蛍光強度
TOmax:Ca/Coが0.25 μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTO蛍光強度
TP蛍光変動率=(STP−TPmin)/(TPmax−TPmin) ・・・(2)
STP:モデルサンプルのTP蛍光強度
TPmin:Ca/Coが0μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTP蛍光強度
TPmax:Ca/Coが0 μmol/L/0.25 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTP蛍光強度
(3)結果
これらの結果を表8に示す。また、図3に、前記表7のCase/control核酸モデル濃度比と、下記表8のTO/TP蛍光変動率比とを比較したグラフを示す。図3において、横軸は、Case/control核酸モデル濃度比であり、縦軸は、TO/TP蛍光変動率比であり、直線および数式は、直線回帰式を示し、R2は、相関係数の2乗値を示す。図3に示すように、前記TO/TP蛍光変動率比は、前記Case/control核酸モデル濃度比と極めて高い相関を示した。これらの結果から、本発明の標的物質の分析方法が、標的核酸を精度よく分析できることがわかった。
これらの結果を表8に示す。また、図3に、前記表7のCase/control核酸モデル濃度比と、下記表8のTO/TP蛍光変動率比とを比較したグラフを示す。図3において、横軸は、Case/control核酸モデル濃度比であり、縦軸は、TO/TP蛍光変動率比であり、直線および数式は、直線回帰式を示し、R2は、相関係数の2乗値を示す。図3に示すように、前記TO/TP蛍光変動率比は、前記Case/control核酸モデル濃度比と極めて高い相関を示した。これらの結果から、本発明の標的物質の分析方法が、標的核酸を精度よく分析できることがわかった。
[実施例3]
前記シグナル発生物質として、前記フルオロジェニックプライマーまたはインターカレーターを使用し、バックグランドシグナルの影響を確認した。
前記シグナル発生物質として、前記フルオロジェニックプライマーまたはインターカレーターを使用し、バックグランドシグナルの影響を確認した。
標的物質1分子を検出する場合、標的物質1分子から、検出限界を上回るシグナルを得るために、例えば、標的分子が大量に存在する場合と比較して、長時間の増幅反応が行われる。そこで、フルオロジェニックプライマーまたはインターカレーターを用い、増幅方法として、逆転写(RT)-SmartAamp法を採用し、増幅時間の増加に伴う、バックグラウンドシグナルの上昇を確認した。
(4×反応バッファー#6)
5.6 mmol/L dNTP
80 mmol/L Tris-HCl(pH8)
40 mmol/L (NH4)2SO4
32 mmol/L MgSO4
0.4 % Tween20
120mmol/L CH3COOK
5.6 mmol/L dNTP
80 mmol/L Tris-HCl(pH8)
40 mmol/L (NH4)2SO4
32 mmol/L MgSO4
0.4 % Tween20
120mmol/L CH3COOK
(フルオロジェニックプライマー)
Eprimer FluA_MP1.Br.194-16.E10
ACCACnAGATTTCCAG (配列番号16)
(n:チアゾールオレンジ標識チミン)
Eprimer FluA_MP1.Br.194-16.E10
ACCACnAGATTTCCAG (配列番号16)
(n:チアゾールオレンジ標識チミン)
逆転写(RT)-SmartAamp法によるFluA検出用の前記プライマーミックスを使用した。反応液は、標的物質(FluA)は未添加となるように、前記反応液組成1または前記反応組成2にしたがって調製した(それぞれn=3)。そして、QuantStudio 3D デジタルPCR システム(ABI社製)の溶液分画用チップに、前記反応液を供し、67℃で所定時間(0、20、40、または60分間)反応させた後、前記反応液を常温にまで冷却した。冷却後、前記反応液を含むチップについて、前記フルオロジェニックプライマーによるシグナルまたはインターカレーター(SYBR Green)によるシグナルを、前記システムで定量した。
これらの結果を、図4および図5に示す。図4は、前記システムで定量した各チップ(実験1、2、3)の経時的なシグナルのイメージ画像であり、(A)は、インターカレーター(SYBR Green)を使用した結果であり、A1、A2、A3は、3つの反応液それぞれの結果であり、(B)は、フルオロジェニックプライマー(Eprimer)を使用した結果であり、B1、B2、B3は、3つの反応液それぞれの結果である。なお、イメージ画像は、反応時間(0min)よりも、色が濃いくなると、非依存的増幅が生じ、シグナルが発生していることを意味する。また、図5は、各反応時間における前記反応液の蛍光から算出した測定濃度(μL)を示すグラフであり、丸のプロットが、インターカレーター(SYBR Green)を使用した結果であり、四角のプロットが、フルオロジェニックプライマー(Eprimer)を使用した結果である。
図4(A)に示すように、インターカレーターを使用した場合、反応時間40分および60分になると、反応時間0分よりもイメージ画像の色が濃くなっていたが、反応時間20分では、反応時間0分とほとんど差がなかった。また、その測定結果を示す図5においても、反応時間40分をこえると、測定濃度が増加したが、反応時間20分では、殆ど増加は見られなかった。このことから、インターカレーターを使用した場合、例えば、反応時間を20分程度とすることにより、十分にバックグラウントを抑制できることがわかった。
フルオロジェニックプライマーを使用した場合は、図4に示すように、増幅反応の時間が経過しても、イメージ画像は、反応時間0分と同じであり、非特異的な増幅による蛍光シグナルが発生していないことがわかった。また、その測定結果を示す図5のグラフにおいても、増幅反応時間が経過しても、蛍光シグナルの増加はほとんどみらず、60分を経過しても、測定値は10コピー/μLを上回ることはなかった。これらの結果から、フルオロジェニックプライマーによれば、例えば、発生するシグナルを増加させるために、さらに増幅時間を長くしても、バックグラウンドのシグナルを十分に抑制できることがわかった。
[実施例4]
前記フルオロジェニックプライマーを用いて、RNA(FluA)の検出を行った。
前記フルオロジェニックプライマーを用いて、RNA(FluA)の検出を行った。
前記実施例3の反応液(反応液組成1)に、所定コピー数(0、1500、または3000コピー)のFluA/RNA(PLoS ONE 2012, 7(1), e30236)を混合した以外は、同様にして、67℃で所定時間(0、20、40分間)の増幅反応とシグナル測定に基づく濃度の測定を行った(n=1)。そして、反応開始時のコピー数を1500コピーおよび3000コピーとした反応液の測定値から、反応開始時のコピー数0の反応液の測定値を差し引いて、補正値を求めた。
これらの結果を、図6に示す。図6は、各反応時間における前記反応液の蛍光から算出した補正後の測定濃度(コピー/μL)を示すグラフである。反応開始時のコピー数が1500コピーおよび3000コピーのいずれにおいても、反応時間40分で、測定値が大きく上昇し、最大値に達し、反応開始時のコピー数が3000コピーの反応液は、40分の時点で、反応開始時のコピー数が1500コピーの反応液と比べて、1.7倍を示した。
[実施例5]
前記インターカレーターを用いて、RNA(FluA)の検出を行った。
前記インターカレーターを用いて、RNA(FluA)の検出を行った。
前記インターカレーターを用いた前記実施例3の反応液(反応液組成2)に、所定コピー数(0、または3000コピー)のFluA/RNA(PLoS ONE 2012, 7(1), e30236)を混合した以外は、同様にして、67℃で所定時間(0、20分間)の増幅反応とシグナル測定に基づく濃度の測定を行った(n=1)。
これらの結果を、図7に示す。図7は、各反応時間における前記反応液の蛍光から算出した測定濃度(コピー/μL)を示すグラフである。反応開始時のコピー数が0コピーの反応液は、反応開始から20分後においても、ほとんど測定値は殆ど増加しなかったが、応開始時のコピー数が3000コピーの反応液は、反応開始から反応時間20分の間に、測定値が大きく上昇した。
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。また、本明細書で引用する特許文献および学術文献等の文献に記載の内容は、全て引用により本明細書に取り込むものとする。
この出願は、2015年8月28日に出願された日本出願特願2015−169833および2016年5月13日に出願された日本出願特願2016−096998を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
本発明によれば、鋳型核酸を精度よく分析できる。
Claims (71)
- 鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、
核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、
前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、
前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、
前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、
前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする、鋳型核酸の分析方法。 - 前記シグナル発生物質が、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプローブを含み、
前記フルオロジェニックプローブが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する、請求項1記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記プライマーセットが、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプライマーを含み、
前記フルオロジェニックプライマーは、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプライマー、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプライマーである、請求項1または2記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記フルオロジェニックプライマーが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する、請求項3記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記増幅工程における増幅方法が、等温増幅法およびPCR法の少なくとも一方である、請求項1から5のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記判別工程後、さらに、前記複数の鋳型核酸のフラクションから、前記増幅フラクションを回収する回収工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記判別工程後、さらに、
前記増幅フラクションについて、前記標的配列および前記相補配列の増幅を行う第2の増幅工程を含む、請求項7記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記第2の増幅工程における増幅方法が、等温増幅法およびPCRの少なくとも一方である、請求項8記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記検出工程が、融解曲線解析による検出工程である、請求項1から9のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記検出工程の後、さらに、融解曲線解析による解析工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸を含むサンプルが、前記核酸増幅試薬を含み、
前記分画工程において、前記鋳型核酸と前記核酸増幅試薬とを含む前記サンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する、請求項1から11のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションに前記核酸増幅試薬を含有させる、請求項1から12のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記分画工程が、前記サンプルから、エマルションを形成する工程であり、前記鋳型核酸のフラクションが、前記エマルションにおいて分散された前記サンプルのドロップであり、
前記検出工程が、前記エマルション中のドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する工程である、請求項1から13のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記検出工程において、
流路内に、前記エマルションを通過させ、
前記流路の所定部位において、前記エマルション中の前記ドロップが通過する際に、前記ドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する、請求項14記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記エマルションが、油中水滴(W/O型)エマルションである、請求項14または15記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記分画工程が、表面に複数の鋳型核酸のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である、請求項1から13のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部の表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であり、
前記分画工程が、前記チップの表面に前記サンプルをアプライし、前記鋳型核酸のフラクション形成部に前記サンプルを分離することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である、請求項17記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記チップにおいて、前記鋳型核酸フラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、
前記分画工程が、前記チップの表面に前記チップの凹部に前記サンプルを導入することにより、前記サンプルを分画する、請求項17記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記チップにおいて、前記鋳型核酸フラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である、請求項17記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記チップの鋳型核酸のフラクション形成部に、前記核酸増幅試薬が配置され、前記分画工程において、前記チップ上の鋳型核酸のフラクション形成部で、前記核酸増幅試薬を含有させる、請求項17から20記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記検出工程が、1以上のチップ上の前記複数の鋳型核酸のフラクションの画像を得る工程であり、
前記判別工程が、前記画像において前記シグナルの発生または消失が検出された前記チップ上の鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションであると判別する工程である、請求項17から21記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記分画工程が、前記サンプルを滴下することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である、請求項1から22のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションの平均体積が、0.0001〜5000nLである、請求項1から23のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記サンプルが、2つ以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2つ以上のプライマーセットと、2つ以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2つ以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2つ以上のシグナル発生物質は、同じ蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する、請求項1から24のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記サンプルが、2つ以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2つ以上のプライマーセットと、2つ以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2つ以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2つ以上のシグナル発生物質は、異なる蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する、請求項1から25のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記サンプルが、2つ以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2つ以上のプライマーセットと非フルオロジェニックプローブとを含み、
前記2つ以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記シグナル発生物質と、前記非フルオロジェニックプローブとは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する、請求項1から26のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - さらに、前記増幅工程前に、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、
前記判別工程において、前記増幅工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する、請求項1から27のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - さらに、前記分画工程前に、前記鋳型核酸を含むサンプルについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、
前記判別工程において、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する、請求項1から28のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸の修飾の分析であり、
前記分画工程に先立って、さらに、前記鋳型核酸に対する前処理工程を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記鋳型核酸の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、亜硫酸水素塩を用いて前記変換を行う、請求項31記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記鋳型核酸の非メチル化領域またはメチル化領域を切断する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項33記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、メチル化鋳型核酸を濃縮する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法、 - 前記前処理工程において、メチル化DNA結合タンパク質および抗メチル化シトシン抗体の少なくとも一方を用いて、前記少なくとも一方とメチル化鋳型核酸との結合により、前記メチル化鋳型核酸を濃縮する、請求項35記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、タングステン酸化剤を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をチミン残基またはチミン誘導体残基に変換する、請求項37記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記前処理工程において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する、請求項37記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化鋳型核酸のグリコシル化領域を切断する工程とを含む、
請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化感受性制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項40記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する工程とを含む、
請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化ヒドロキシメチル化抗体を用いて、前記抗体と前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸との結合により、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する、請求項42記載の鋳型核酸の分析方法。
- 1つ以上の標的物質を含むサンプルと、前記標的物質に特異的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、前記標的物質に特異的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生するフルオロジェニックプローブを各標的物質に対して1つ以上反応液中で接触させ、
前記ターゲット核酸と前記プローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする、標的物質の分析方法。 - 前記標的物質が、核酸または核酸配列である、請求項44記載の標的物質の分析方法。
- 前記フルオロジェニックプローブが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する、請求項44または45に記載の標的物質の分析方法。
- 前記検出工程が、前記反応液における1種類以上の前記シグナルの輝度または強度を検出する工程である、請求項44から47のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
- 前記検出工程が、前記反応液における1種類以上の前記シグナルを、前記フルオロジェニックプローブの分子レベルでカウントして検出する工程である、請求項44から48のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質が2種類以上であり、
前記各標的物質に対する2種類以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記検出工程において検出した前記2種類以上の前記フルオロジェニックプローブのシグナル検出値から、各標的物質の濃度比または存在比を算出する工程を含む、請求項44から49のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 - 前記標的物質が2つ以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接し、
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、且つ蛍光共鳴エネルギー移動を伴う、請求項44から50のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 - 前記標的物質が2つ以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接し、
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、前記複数種のシグナルの空間的な重なりの有無を検出する、請求項44から51のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 - 前記接触および前記検出において、前記反応液の温度を制御する、請求項44から52のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質が、前記標的物質に特異的に結合する物質と結合した状態の標的物質である、請求項44から53の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質の修飾の分析であり、
前記検出工程に先立って、さらに、前記標的物質に対する前処理工程を含む、請求項44記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程の後であり前記検出工程の前、さらに、前記前処理した標的物質の増幅を行う増幅工程を含み、
前記増幅工程において得られた増幅物を、前記検出工程における前記標的物質として使用する、請求項55記載の標的物質の分析方法。 - 前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記標的物質の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、亜硫酸水素塩を用いて前記変換を行う、請求項57記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記標的物質の非メチル化領域またはメチル化領域を切断する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項59記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、メチル化標的物質を濃縮する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法、 - 前記前処理工程において、メチル化DNA結合タンパク質および抗メチル化シトシン抗体の少なくとも一方を用いて、前記少なくとも一方とメチル化標的物質との結合により、前記メチル化標的物質を濃縮する、請求項61記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記標的物質のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、タングステン酸化剤を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をチミン残基またはチミン誘導体残基に変換する、請求項63記載の標的物質の分析方法。
- 前記前処理工程において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する、請求項63記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化標的物質のグリコシル化領域を切断する工程とを含む、
請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化感受性制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項66記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する工程とを含む、
請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化ヒドロキシメチル化抗体を用いて、前記抗体と前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質との結合により、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する、請求項68記載の標的物質の分析方法。
- 請求項1から69記載の分析方法を実現することを特徴とする、標的物質の分析用キット。
- 請求項1から69記載の分析方法を実現することを特徴とする、標的物質の分析用装置。
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