WO2017038682A1 - 鋳型核酸の分析方法、標的物質の分析方法、鋳型核酸または標的物質の分析用キット、および鋳型核酸または標的物質の分析用装置 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、
前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、
前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、
前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、
前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする。
前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする。
前記シグナル結合物質は、
前記標的配列または前記相補配列に特異的に結合する物質であり、且つ、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失する物質、または、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生する物質である。
前記フルオロジェニックプローブは、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブ、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブである。
前記フルオロジェニックプライマーは、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプライマー、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプライマーである。
前記分画工程において、前記鋳型核酸と前記核酸増幅試薬とを含む前記サンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する。
前記検出工程が、前記エマルション中のドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する工程である。
流路内に、前記エマルションを通過させ、
前記流路の所定部位において、前記エマルション中の前記ドロップが通過する際に、前記ドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する。
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと、2以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2以上のシグナル発生物質は、同じ蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと、2以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2以上のシグナル発生物質は、異なる蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
前記核酸増幅試薬は、2以上のプライマーセットと非フルオロジェニックプローブとを含み、
前記2以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記シグナル発生物質と、前記非フルオロジェニックプローブとは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する。
前記判別工程において、前記増幅工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。
前記判別工程において、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化鋳型核酸のグリコシル化領域を切断する工程とを含む。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する工程とを含む。
シグナル発生物質を有するプローブであり、且つ、その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプローブ、または、その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプローブである。
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、且つ蛍光共鳴エネルギー移動を伴う。
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、前記複数種のシグナルの空間的な重なりの有無を検出する。
前記検出工程に先立って、さらに、前記標的物質に対する前処理工程を含む。
前記増幅工程において得られた増幅物を、前記検出工程における前記標的物質として使用する。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化標的物質のグリコシル化領域を切断する工程とを含む。
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する工程とを含む。
本発明の鋳型核酸の分析方法は、前述のように、鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする。
(i)1つの分子内の2つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには2つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
(ii)2つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる2つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
(iii)2つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング(溝結合)するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる2つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記(ii)または(iii)の場合において、前記色素分子が、前記(i)記載の分子であることが好ましい。
Bは、天然核酸塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル)骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Eは、
(i)デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
(ii)ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Z11およびZ12は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
L1、L2およびL3は、それぞれ、リンカー(架橋原子または原子団)であり、主鎖長(主鎖原子数)は任意であり、主鎖中に、C、N、O、S、PおよびSiを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、L1、L2およびL3は、互いに同一でも異なっていても良く、
Dは、CR、N、P、P=O、BもしくはSiRであり、Rは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
bは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式(16)および(16b)中、L1およびL2は前記リンカーであり、L3、Dおよびbは存在せず、L1およびL2がBに直接結合していてもよく、
ただし、
式(16)、(17)および(18)中、Eは、前記(i)の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのO原子がS原子で置換されていても良く、
式(16b)、(17b)および(18b)中、Eは、前記(ii)の原子団であり、
式(17)および(17b)中、各Bは、同一でも異なっていても良く、各Eは、同一でも異なっていても良い。
X1およびX2は、S、SeまたはOであり、
n’’は、0または正の整数であり、
R1~R10、R13~R21は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
R11およびR12のうち、一方は、前記式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)および(18b)中のL1もしくはL2に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
R15は、式(7)、(8)または(9)中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
R16は、式(7)、(8)または(9)中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Z11中のX1、X2およびR1~R21と、Z12中のX1、X2およびR1~R21とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
nは、正の整数であり、2~6の範囲であることが特に好ましい。
前記Pyとは、下記式(11)で表記される6員環のうち、1位にEと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがN、C、SまたはO原子で置換された原子団であり、前記N、C、SまたはO原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式(12)で表記される縮合環のうち、9位にEと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがN、C、SまたはO原子で置換された原子団であり、前記N、C、SまたはO原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
前記分画工程では、前記鋳型核酸を含むサンプルを、前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する。前記分画工程において、前記サンプルの分画方法は、特に制限されず、例えば、前記サンプルを滴下することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する方法等があげられる。具体例として、前記分画工程は、例えば、下記(1-1)または(1-2)の工程を含む。
(1-1)前記サンプルから、エマルションを形成する工程
(1-2)表面に複数のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを前記複数のフラクションに分画する工程
前記(1-1)工程では、前記サンプルからエマルションを形成する。前記エマルションにおいて、前記鋳型核酸のフラクションは、前記エマルションにおいて分散された前記サンプルのドロップである。前記エマルションの形成は、前記サンプルの存在下、エマルション形成する非水溶性溶媒と水性溶媒とを接触させて、前記非水溶性溶媒中に複数のドロップを形成することにより行うことができる。前記接触は、例えば、前記非水溶性溶媒に前記水性溶媒を接触させてもよいし、前記水性溶媒に前記非水性溶媒を接触させてもよい。前記形成方法は、例えば、マイクロ流路を活用したドロップレット作成方法(RainDnace 社のRainDrop(登録商標) System、 BIO-RAD社のQX200(商標) AutoDG(商標) Droplet Digital PCR system)等があげられる。前記サンプルは、例えば、非水溶性溶媒に含まれてもよいし、前記水溶性溶媒に含まれてもよい。前記鋳型核酸が、例えば、水溶性溶媒に分散されたサンプルである場合、前記サンプルを前記水溶性溶媒として使用してもよい。前記エマルションの形成は、例えば、一般的なエマルション形成方法が採用できる。前記エマルションの形成方法は、特に制限されず、例えば、エマルション化デバイスを使用できる。前記エマルション化デバイスは、例えば、サンプル用流路、核酸増幅試薬用流路、非水溶性溶媒用流路、これらの連結部、および前記連結部から導出される導出流路を備える流路があげられる。前記エマルション化デバイスを使用する場合、例えば、前記連結部に、前記非水溶性溶媒用流路から、前記非水溶性溶媒が導入され、さらに、前記サンプル用流路から前記サンプルが、前記核酸増幅試薬用流路から前記核酸増幅試薬が、前記非水溶性溶媒が導入された連結部に導入される。そして、例えば、前記連結部でこれらが接触し、これらの混合物がエマルション化され、前記連結部から前記導出流路に前記エマルションとして導出される。前記サンプルおよび前記核酸増幅試薬は、例えば、一方が前記非水溶性溶媒に含まれ、他方が前記水性溶媒に含まれてもよいし、両者が前記非水溶性溶媒または前記水溶性溶媒に含まれてもよい。前記核酸増幅試薬は、前述のように、前記サンプルに含まれてもよい。この場合、前記エマルションは、例えば、サンプル用流路、非水溶性溶媒用流路、これらの連結部および前記連結部から導出される導出流路を備えたエマルション化デバイスを使用し、同様に、形成できる。
前記(1-2)工程では、表面に複数のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを前記複数のフラクションに分画する。前記(1-2)工程で使用するチップは、表面に複数のフラクション形成部を有すればよく、その具体例は、下記(A)チップ、(B)チップまたは(C)チップがあげられる。以下、前記(A)チップを使用した場合、前記(1-2)工程は、(1-2A)工程といい、前記(B)チップを使用した場合、前記(1-2)工程は、(1-2B)工程といい、前記(C)チップを使用した場合、前記(1-2)工程は、(1-2C)工程ともいう。
(A)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部の表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であるチップ
(B)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であるチップ
(C)前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップの凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であるチップ
前記(1-2A)工程は、前記(A)チップを使用する工程である。前記(A)チップにおいて、前記フラクション形成部の表面が、親水性であり、前記フラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。このため、前記チップ表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記サンプルが、親水性である前記鋳型核酸のフラクション形成部に分離され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(1-2B)工程は、前記(B)チップを使用する工程である。前記(B)チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部である。このため、前記チップの表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記チップの凹部である前記鋳型核酸のフラクション形成部に前記サンプルが導入され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記(1-2C)工程は、前記(C)チップを使用する工程である。前記(C)チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部が、前記チップの凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である。このため、前記チップ表面に前記サンプルをアプライすることにより、前記サンプルが、親水性である前記鋳型核酸のフラクション形成部に分離され、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。また、前記(C)チップは、前記フラクション形成部において、凹部および親水性を組合せ、前記フラクション形成部以外の領域において、非凹部および疎水性を組合せることにより、より迅速、且つ、精度よく前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画できる。
前記増幅工程では、前記核酸試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行なう。具体的に、前記増幅工程は、前記非水溶性溶媒を核酸増幅反応の条件に曝すことにより行う。これにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記鋳型核酸および前記核酸増幅試薬を含む鋳型核酸のフラクションついて、前記第1プライマーおよび前記第2プライマーから、それぞれ、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列が増幅される。
前記検出工程では、前記増幅工程後、前記複数のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する。前記シグナルの種類は、特に制限されず、前記シグナル発生物質の種類に基づき、適宜決定できる。前記シグナルの種類は、例えば、蛍光、発光等のシグナルがあげられ、前記検出工程においては、例えば、シグナル強度の測定により、前記増幅の程度を検出できる。本明細書においては、以下、特に示さない限り、前記シグナルとして蛍光シグナルを例にあげるが、これには限定されず、例えば、発光等のシグナルに読み替え可能である。
前記判別工程では、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する。前記判別は、例えば、前記シグナルの有無に基づき、判別してもよいし、シグナル強度に基づき、判別してもよい。後者の場合、前記判別は、例えば、前記シグナル強度の閾値を設定し、前記閾値以上または以下のシグナル強度が検出された鋳型核酸のフラクションを前記増幅フラクションであると判別する。具体例として、前記増幅によりシグナルが発生する場合、前記シグナル強度が前記閾値以上の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションと判別し、前記シグナル強度が前記閾値を未満の前記鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションでないと判別する。
(1)前記鋳型核酸における非修飾塩基Xまたは修飾塩基Xを別の塩基Yに変換する前処理
(2)修飾化核酸への結合物質を使用し、修飾された鋳型核酸の濃縮を行う前処理
(3)非修飾化領域または修飾化領域を切断する前処理
Sensitive measurement of unmethylated repeat DNA sequences by end-specific PCR, Keith N. Rand et al., BioTechniques 2010, 49(4)
Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylation-dependent restriction enzymes, Keith N. Rand et al., Nucleic Acids Research, 2013, 41(1),e15
また、前記増幅工程において、例えば、メチル化シトシン残基を有する鋳型核酸と、変換残基を有する鋳型核酸とに対するマルチプレックス核酸増幅を行ってもよい。
Chem Commun (Camb). Okamoto A, Sugizaki K, Nakamura A, Yanagisawa H, Ikeda S. 2011; 47(40): 11231-3.
また、本発明において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩(バイサルファイト)の併用を利用してヒドロキシメチル化の分析を行う場合、例えば、以下の論文を参照できる。
Bioorganic & Medical Chemistry Letters.Seketsu Fukuzawa, Kazuo Tachibana, Shoji Tajima, Isao Suetake. 2015, 25, 5667-5671
本発明の標的物質の分析方法は、前述のように、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の標的物質の分析方法は、1以上の標的物質を含むサンプルと、各標的物質に対する1以上のフルオロジェニックプローブとを、反応液中で接触させ、前記標的物質と前記フルオロジェニックプローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出することを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の標的物質の分析方法は、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。本発明の標的物質の分析方法によりば、精度よく標的物質を分析できる。
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、前述のように、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。本発明の分析用キットは、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用キットは、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。
本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、前述のように、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とする。本発明の分析用装置は、前記本発明の分析方法を実現することを特徴とすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の鋳型核酸または標的物質の分析用装置は、特に言及しない限り、例えば、前記本発明の鋳型核酸の分析方法等の説明を援用できる。
本発明の鋳型核酸の分析方法により、精度よく分析できることを確認した。
下記参考文献1に記載のヒト309G変異型MDM2遺伝子の配列を有するプラスミドDNAを、RNase Free Waterと混合し、これをサンプル溶液とした。
参考文献1:Enokida Y et al. “Rapid Detection of SNP (c.309T>G) in the MDM2 Gene by the Duplex SmartAmp Method”, PLOS ONE, 2013, Volume 8, Issue 4, e60151
ヒトMDM2遺伝子309G変異検出用の等温増幅反応系に関する下記参考文献1を参照し、実施した。具体的には、まず、下記表3の組成となるよう各種プライマーセットを混合し、プライマーミックスを調製した。下記プライマーミックスにおいて、MDM2.Bf.202-13.M.E8(Eprimer)が、前記シグナル発生物質である。また、下記表4の組成となるように、各成分を混合し、4.4反応分の反応液(14.5 μL×4.4)を調製可能な量のプレミックスを調製した。下記表4に示すように、プレミックスとしては、1反応につき375または750コピー分の鋳型DNAを反応液に含むよう調整した2種類のプレミックスを調製した。
下記表5の組成となるように、前記プレミックスと酵素(ポリメラーゼ)を混合し、反応液を調製した。
本発明の標的物質の分析方法により、複数のプローブを用いて、標的核酸を精度よく分析できることを確認した。
DNAサンプルとして下記表6に示すCase核酸モデルおよびControl核酸モデルを、検出用プローブ(フルオロジェニックプローブ)として、下記表6に示すCase核酸モデル検出用チアゾールオレンジ標識Eprobe(TOプローブ)およびContol核酸モデル検出用チアゾールピンク標識Eprobe(TPプローブ)を準備した。
0.25 μmol/L TOプローブおよび0.25 μmol/L TPプローブとなるよう、各プローブをRNase Free Waterに添加し、TO/TPプローブ混合液を調製した。また、下記表7に示すCase/Control核酸モデル濃度比となるように、前記Case核酸モデルおよび前記Control核酸モデルをRNase Free Waterに添加し、6種類のモデルサンプルを調製した。そして、常温(25℃)で、50μL TO/TPプローブ混合液と、50μL モデルサンプルとをそれぞれ混合した。前記混合後、蛍光スペクトルメーター(JASCO社)を用い、488 nmの励起光で励起した場合の510nmにおける蛍光強度(TO蛍光強度)、および570 nmの励起光で励起した場合の600 nmの蛍光強度(TP蛍光強度)を、それぞれ測定した。また、測定した蛍光強度を規格化するため、Case核酸モデルの終濃度(Ca)とControl核酸モデルの終濃度(Co)との比(Ca/Co)が、0μmol/L/0 μmol/L、0.25 μmol/L/0 μmol/L、または0 μmol/L/0.25 μmol/LのCase/Control核酸モデルを調製し、前記TO蛍光強度および前記TP蛍光強度を測定した。そして、各モデルサンプルについて、下記式(1)および(2)に基づき、TO蛍光変動率およびTP蛍光変動率を算出した。
STO:モデルサンプルのTO蛍光強度
TOmin:Ca/Coが0μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTO蛍光強度
TOmax:Ca/Coが0.25 μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTO蛍光強度
TP蛍光変動率=(STP-TPmin)/(TPmax-TPmin) ・・・(2)
STP:モデルサンプルのTP蛍光強度
TPmin:Ca/Coが0μmol/L/0 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTP蛍光強度
TPmax:Ca/Coが0 μmol/L/0.25 μmol/LのCase/Control核酸モデルのTP蛍光強度
これらの結果を表8に示す。また、図3に、前記表7のCase/control核酸モデル濃度比と、下記表8のTO/TP蛍光変動率比とを比較したグラフを示す。図3において、横軸は、Case/control核酸モデル濃度比であり、縦軸は、TO/TP蛍光変動率比であり、直線および数式は、直線回帰式を示し、R2は、相関係数の2乗値を示す。図3に示すように、前記TO/TP蛍光変動率比は、前記Case/control核酸モデル濃度比と極めて高い相関を示した。これらの結果から、本発明の標的物質の分析方法が、標的核酸を精度よく分析できることがわかった。
前記シグナル発生物質として、前記フルオロジェニックプライマーまたはインターカレーターを使用し、バックグランドシグナルの影響を確認した。
5.6 mmol/L dNTP
80 mmol/L Tris-HCl(pH8)
40 mmol/L (NH4)2SO4
32 mmol/L MgSO4
0.4 % Tween20
120mmol/L CH3COOK
Eprimer FluA_MP1.Br.194-16.E10
ACCACnAGATTTCCAG (配列番号16)
(n:チアゾールオレンジ標識チミン)
前記フルオロジェニックプライマーを用いて、RNA(FluA)の検出を行った。
前記インターカレーターを用いて、RNA(FluA)の検出を行った。
Claims (71)
- 鋳型核酸を含むサンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する分画工程と、
核酸増幅試薬の存在下、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列の増幅を行う増幅工程と、
前記増幅工程後、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出する検出工程と、
前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する判別工程とを含み、
前記核酸増幅試薬は、前記標的配列および前記相補配列を増幅するプライマーセットと、前記増幅によりシグナルを発生または消失するシグナル発生物質とを含み、
前記シグナル発生物質が、配列依存的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、配列依存的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生し、且つシグナルの発生と消失とが可逆的であることを特徴とする、鋳型核酸の分析方法。 - 前記シグナル発生物質が、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプローブを含み、
前記フルオロジェニックプローブが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する、請求項1記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記プライマーセットが、前記シグナル発生物質を有するフルオロジェニックプライマーを含み、
前記フルオロジェニックプライマーは、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを発し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを消失するプライマー、または、
その標的に結合した状態で、前記シグナルを消失し、前記標的と解離した状態で、前記シグナルを発生するプライマーである、請求項1または2記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記フルオロジェニックプライマーが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する、請求項3記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記増幅工程における増幅方法が、等温増幅法およびPCR法の少なくとも一方である、請求項1から5のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記判別工程後、さらに、前記複数の鋳型核酸のフラクションから、前記増幅フラクションを回収する回収工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記判別工程後、さらに、
前記増幅フラクションについて、前記標的配列および前記相補配列の増幅を行う第2の増幅工程を含む、請求項7記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記第2の増幅工程における増幅方法が、等温増幅法およびPCRの少なくとも一方である、請求項8記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記検出工程が、融解曲線解析による検出工程である、請求項1から9のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記検出工程の後、さらに、融解曲線解析による解析工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸を含むサンプルが、前記核酸増幅試薬を含み、
前記分画工程において、前記鋳型核酸と前記核酸増幅試薬とを含む前記サンプルを、複数の鋳型核酸のフラクションに分画する、請求項1から11のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションに前記核酸増幅試薬を含有させる、請求項1から12のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記分画工程が、前記サンプルから、エマルションを形成する工程であり、前記鋳型核酸のフラクションが、前記エマルションにおいて分散された前記サンプルのドロップであり、
前記検出工程が、前記エマルション中のドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する工程である、請求項1から13のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記検出工程において、
流路内に、前記エマルションを通過させ、
前記流路の所定部位において、前記エマルション中の前記ドロップが通過する際に、前記ドロップについて、前記シグナルの発生または消失を検出する、請求項14記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記エマルションが、油中水滴(W/O型)エマルションである、請求項14または15記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記分画工程が、表面に複数の鋳型核酸のフラクション形成部を有するチップに、前記サンプルを分注することによって、前記サンプルを複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である、請求項1から13のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記チップにおいて、前記鋳型核酸のフラクション形成部の表面が、親水性であり、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性であり、
前記分画工程が、前記チップの表面に前記サンプルをアプライし、前記鋳型核酸のフラクション形成部に前記サンプルを分離することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である、請求項17記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記チップにおいて、前記鋳型核酸フラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、
前記分画工程が、前記チップの表面に前記チップの凹部に前記サンプルを導入することにより、前記サンプルを分画する、請求項17記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記チップにおいて、前記鋳型核酸フラクション形成部が、前記チップ表面の凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部の内部表面が、親水性であり、
前記鋳型核酸フラクション形成部以外の領域が、非凹部であり、且つ、前記鋳型核酸のフラクション形成部以外の領域の表面が、疎水性である、請求項17記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記チップの鋳型核酸のフラクション形成部に、前記核酸増幅試薬が配置され、前記分画工程において、前記チップ上の鋳型核酸のフラクション形成部で、前記核酸増幅試薬を含有させる、請求項17から20記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記検出工程が、1以上のチップ上の前記複数の鋳型核酸のフラクションの画像を得る工程であり、
前記判別工程が、前記画像において前記シグナルの発生または消失が検出された前記チップ上の鋳型核酸のフラクションを、前記増幅フラクションであると判別する工程である、請求項17から21記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記分画工程が、前記サンプルを滴下することにより、前記サンプルを前記複数の鋳型核酸のフラクションに分画する工程である、請求項1から22のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記分画工程において、前記複数の鋳型核酸のフラクションの平均体積が、0.0001~5000nLである、請求項1から23のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記サンプルが、2つ以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2つ以上のプライマーセットと、2つ以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2つ以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2つ以上のシグナル発生物質は、同じ蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する、請求項1から24のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記サンプルが、2つ以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2つ以上のプライマーセットと、2つ以上のシグナル発生物質とを含み、
前記2つ以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記2つ以上のシグナル発生物質は、異なる蛍光特性を有し、且つ、それぞれが、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する、請求項1から25のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記サンプルが、2つ以上の鋳型核酸を含み、
前記核酸増幅試薬は、2つ以上のプライマーセットと非フルオロジェニックプローブとを含み、
前記2つ以上のプライマーセットは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列を増幅し、
前記シグナル発生物質と、前記非フルオロジェニックプローブとは、それぞれ、異なる鋳型核酸における前記標的配列および前記相補配列の増幅によりシグナルを発生または消失する、請求項1から26のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - さらに、前記増幅工程前に、前記複数の鋳型核酸のフラクションのそれぞれについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、
前記判別工程において、前記増幅工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する、請求項1から27のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - さらに、前記分画工程前に、前記鋳型核酸を含むサンプルについて、前記標的配列または前記相補配列の増幅を示すシグナルの発生または消失を検出し、
前記判別工程において、前記分画工程前に検出されたシグナルと、前記増幅工程後に検出されたシグナルとを比較することにより、前記複数の鋳型核酸のフラクションのうち、前記増幅を示すシグナルの発生または消失が検出された鋳型核酸のフラクションを、前記標的配列または前記相補配列が増幅された増幅フラクションであると判別する、請求項1から28のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸の修飾の分析であり、
前記分画工程に先立って、さらに、前記鋳型核酸に対する前処理工程を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記鋳型核酸の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、亜硫酸水素塩を用いて前記変換を行う、請求項31記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記鋳型核酸の非メチル化領域またはメチル化領域を切断する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項33記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、メチル化鋳型核酸を濃縮する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法、 - 前記前処理工程において、メチル化DNA結合タンパク質および抗メチル化シトシン抗体の少なくとも一方を用いて、前記少なくとも一方とメチル化鋳型核酸との結合により、前記メチル化鋳型核酸を濃縮する、請求項35記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換する工程である、請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、タングステン酸化剤を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をチミン残基またはチミン誘導体残基に変換する、請求項37記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記前処理工程において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する、請求項37記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化鋳型核酸のグリコシル化領域を切断する工程とを含む、
請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化感受性制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項40記載の鋳型核酸の分析方法。
- 前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化鋳型核酸のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する工程とを含む、
請求項30記載の鋳型核酸の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化ヒドロキシメチル化抗体を用いて、前記抗体と前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸との結合により、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化鋳型核酸を濃縮する、請求項42記載の鋳型核酸の分析方法。
- 1つ以上の標的物質を含むサンプルと、前記標的物質に特異的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失する、または、前記標的物質に特異的に結合した状態で、シグナルを消失し、未結合の状態で、シグナルを発生するフルオロジェニックプローブを各標的物質に対して1つ以上反応液中で接触させ、
前記ターゲット核酸と前記プローブとの結合に伴う、前記フルオロジェニックプローブのシグナルの発生またはシグナルの消失を検出する工程を含むことを特徴とする、標的物質の分析方法。 - 前記標的物質が、核酸または核酸配列である、請求項44記載の標的物質の分析方法。
- 前記フルオロジェニックプローブが、1分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも2つの蛍光性原子団を有する、請求項44または45に記載の標的物質の分析方法。
- 前記検出工程が、前記反応液における1種類以上の前記シグナルの輝度または強度を検出する工程である、請求項44から47のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
- 前記検出工程が、前記反応液における1種類以上の前記シグナルを、前記フルオロジェニックプローブの分子レベルでカウントして検出する工程である、請求項44から48のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質が2種類以上であり、
前記各標的物質に対する2種類以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記検出工程において検出した前記2種類以上の前記フルオロジェニックプローブのシグナル検出値から、各標的物質の濃度比または存在比を算出する工程を含む、請求項44から49のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 - 前記標的物質が2つ以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接し、
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、且つ蛍光共鳴エネルギー移動を伴う、請求項44から50のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 - 前記標的物質が2つ以上であり、少なくとも2種類は、互いに隣接し、
前記各標的物質に対する2つ以上の前記フルオロジェニックプローブを使用し、
前記各フルオロジェニックプローブは、それぞれ、異なる蛍光特性を有するシグナル発生物質を含み、異なる標的物質への結合によりシグナルを発生または消失し、前記複数種のシグナルの空間的な重なりの有無を検出する、請求項44から51のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。 - 前記接触および前記検出において、前記反応液の温度を制御する、請求項44から52のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質が、前記標的物質に特異的に結合する物質と結合した状態の標的物質である、請求項44から53の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質の修飾の分析であり、
前記検出工程に先立って、さらに、前記標的物質に対する前処理工程を含む、請求項44記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程の後であり前記検出工程の前、さらに、前記前処理した標的物質の増幅を行う増幅工程を含み、
前記増幅工程において得られた増幅物を、前記検出工程における前記標的物質として使用する、請求項55記載の標的物質の分析方法。 - 前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記標的物質の非メチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、亜硫酸水素塩を用いて前記変換を行う、請求項57記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記標的物質の非メチル化領域またはメチル化領域を切断する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項59記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、メチル化標的物質を濃縮する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法、 - 前記前処理工程において、メチル化DNA結合タンパク質および抗メチル化シトシン抗体の少なくとも一方を用いて、前記少なくとも一方とメチル化標的物質との結合により、前記メチル化標的物質を濃縮する、請求項61記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、前記標的物質のヒドロキシメチル化シトシン残基を非ヒドロキシメチル化塩基残基に変換する工程である、請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、タングステン酸化剤を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をチミン残基またはチミン誘導体残基に変換する、請求項63記載の標的物質の分析方法。
- 前記前処理工程において、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)および亜硫酸水素塩を用いて、ヒドロシメチル化シトシン残基をウラシル残基またはウラシル誘導体残基に変換する、請求項63記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記ヒドロキシメチル化標的物質のグリコシル化領域を切断する工程とを含む、
請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化感受性制限酵素を用いて前記切断を行う、請求項66記載の標的物質の分析方法。
- 前記標的物質の分析が、前記標的物質のヒドロキシメチル化の分析であり、
前記前処理工程が、
ヒドロキシメチル化標的物質のヒドロキシメチル化領域をグリコシル化する工程と、
前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する工程とを含む、
請求項55または56記載の標的物質の分析方法。 - 前記前処理工程において、グリコシル化ヒドロキシメチル化抗体を用いて、前記抗体と前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質との結合により、前記グリコシル化したヒドロキシメチル化標的物質を濃縮する、請求項68記載の標的物質の分析方法。
- 請求項1から69記載の分析方法を実現することを特徴とする、標的物質の分析用キット。
- 請求項1から69記載の分析方法を実現することを特徴とする、標的物質の分析用装置。
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