KR101551985B1 - 모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물, 핵산, 표지 물질, 핵산 검출 방법 및 키트 - Google Patents

모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물, 핵산, 표지 물질, 핵산 검출 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 예컨대, 핵산의 이중 나선 구조를 효과적으로 검출 가능한 표지 물질을 제공한다. 모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물로서, 상기 구조가 하기 식 (1), (1b) 또는 (1c)로 표시되는 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염을 제공한다. 예컨대, B는 핵산 염기 골격을 갖는 원자단이고, E는 데옥시리보스 골격, 리보스 골격, 혹은 이들 중 어느 하나로부터 유도되는 구조를 갖는 원자단, 또는 펩티드 구조 혹은 펩토이드 구조를 갖는 원자단이며, Z11 및 Z12는, 각각, 수소 원자, 보호기, 또는 형광성을 나타내는 원자단이고, 동일하더라도 상이하더라도 좋다.

Description

모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물, 핵산, 표지 물질, 핵산 검출 방법 및 키트{COMPOUND HAVING STRUCTURE DERIVED FROM MONONUCLEOSIDE OR MONONUCLEOTIDE, NUCLEIC ACID, LABELING SUBSTANCE, AND METHOD AND KIT FOR DETECTION OF NUCLEIC ACID}
본 발명은, 모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물, 핵산, 표지 물질, 핵산 검출 방법 및 키트에 관한 것이다.
병의 유전자 진단이나, 유전자의 발현 해석 등에서는, 어떤 특정 서열을 갖는 핵산을 검출해야 한다. 그 때문에 형광을 이용한 방법이 잘 이용되고, 예컨대, DNA에 1종류의 형광 색소를 공유 결합으로 연결한 형광 프로브가, 표지 물질로서 종종 이용된다.
이러한 표지 물질(형광 프로브)의 문제점으로서, 예컨대, 상보적인 핵산과 이중 나선 형성하지 않은 경우도 형광을 발하는 것을 들 수 있다. 프로브만의 형광을 소광할 목적에서는 FRET을 이용하는 방법이 유효하지만(비특허 문헌 1∼4 등), 2 종류의 형광 색소를 도입하는 비용 등의 문제가 있다.
또한, DNA나 RNA와 상호 작용하여 형광 강도가 증가하는 형광 색소로서 시아닌 색소의 일종인 티아졸오렌지가 알려져 있다. 티아졸오렌지를 DNA에 공유 결합으 로 연결하여 형광 프로브의 제작을 시도한 예는 있지만, 푸린 염기를 포함하는 단일쇄 DNA와의 상호 작용에 의해서도 강한 형광을 발하기 때문에(비특허 문헌 5), 이중 나선 형성 시의 형광 강도의 증가가 작아져, 성공적이라고는 말할 수 없다(비특허 문헌 6 및 7).
[비특허 문헌 1] Tyagi, S., Kramer, F. R. (1996) Nat. Biotechnol. 14, 303-308.
[비특허 문헌 2] Nazarenko, I. A., Bhatnagar, S. K., Hohman, R. J. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2516-2521.
[비특허 문헌 3] Gelmini, S., Orlando, C., Sestini, R., Vona, G., Pinzani, P., Ruocco, L., Pazzagli, M. (1997) Clin. Chem. 43, 752-758.
[비특허 문헌 4] Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, S. P., Brown, T., Little, S. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 804-807.
[비특허 문헌 5] Biopolymers 1998, 46, 39-51.
[비특허 문헌 6] Analytica Chimica Acta 2002, 470, 57-70.
[비특허 문헌 7] Chemistry-A European Journal 2006, 12, 2270-2281.
따라서, 본 발명은, 예컨대, 핵산의 이중 나선 구조를 효과적으로 검출 가능한 표지 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 화합물은, 모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물로서, 상기 구조가 하기 식 (1), (1b) 또는 (1c)으로 표시되는 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염이다.
Figure 112009057492774-pct00001
상기 화학식 (1), (1b) 및 (1c) 중,
B는 천연 핵산 염기(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실) 골격 또는 인공 핵산 염기 골격을 갖는 원자단이고,
E는,
(i) 데옥시리보스 골격, 리보스 골격, 혹은 이들 중 어느 하나로부터 유도되는 구조를 갖는 원자단, 또는
(ii) 펩티드 구조 혹은 펩토이드 구조를 갖는 원자단이며,
Z11 및 Z12는 각각, 수소 원자, 보호기, 또는 형광성을 나타내는 원자단이고, 동일하더라도 상이하더라도 좋으며,
Q는,
E가 상기 (i)의 원자단인 경우에는, O이고,
E가 상기 (ii)의 원자단인 경우에는, NH이며,
X는,
E가 상기 (i)의 원자단인 경우에는, 수소 원자, 산으로 탈보호하는 것이 가능한 수산기의 보호기, 인산기(모노포스페이트기), 이인산기(디포스페이트기), 또는 삼인산기(트리포스페이트기)이고,
E가 상기 (ii)의 원자단인 경우에는, 수소 원자 또는 아미노기의 보호기이며,
Y는,
E가 상기 (i)의 원자단인 경우에는, 수소 원자, 수산기의 보호기, 또는 포스포로아미다이트기이고,
E가 상기 (ii)의 원자단인 경우에는, 수소 원자 또는 보호기이며,
L1, L2 및 L3은 각각, 링커(가교 원자 또는 원자단)이고, 주쇄 길이(주쇄 원자수)는 임의적이고, 주쇄 중에, C, N, O, S, P 및 Si를 각각 포함하고 있더라도 포함하고 있지 않더라도 좋으며, 주쇄 중에, 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 이미노기, 에테르 결합, 티오에테르 결합 및 티오에스테르 결합을 각각 포함하고 있더라도 포함하고 있지 않더라도 좋고, L1, L2 및 L3은 서로 동일하더라도 상이하더라도 좋으며,
D는, CR, N, P, P=O, B 혹은 SiR이고, R은 수소 원자, 알킬기 또는 임의 치환기이며,
b는, 단일 결합, 이중 결합 혹은 삼중 결합이거나,
또는, 상기 화학식 (1) 중, L1 및 L2는 상기 링커이고, L3, D 및 b는 존재하지 않으며, L1 및 L2가 B에 직접 결합하고 있더라도 좋고,
상기 화학식 (1b) 중, T는,
E가 상기 (i)의 원자단인 경우에는, 인산 가교(PO4 -)이며, 1 이상의 산소 원자(O)가 유황 원자(S)로 치환되어 있더라도 좋고,
E가 상기 (ii)의 원자단인 경우에는, NH이다.
또한, 본 발명의 핵산은, 하기 화학식 (16), (16b), (17), (17b), (18) 또는 (18b)로 표시되는 구조를 적어도 하나 포함하는 핵산, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염이다. 또, 본원 명세서 중, 화학식[예컨대, 하기 화학식 (16), (16b), (17), (17b), (18) 및 (18b)] 중의 괄호 내로부터 외를 향해 결합손이 늘어나 있고, 괄호의 외측에 있어서 상기 결합손에 별표가 부가하고 있을 때에는, 상기 별표는, 그 결합손에 어떠한 원자 또는 원자단이 결합하고 있는 것을 나타낸다.
Figure 112009057492774-pct00002
Figure 112009057492774-pct00003
Figure 112009057492774-pct00004
Figure 112009057492774-pct00005
Figure 112009057492774-pct00006
Figure 112009057492774-pct00007
화학식 (16), (16b), (17), (17b), (18) 및 (18b) 중,
B, E, Z11, Z12, L1, L2, L3, D 및 b는, 각각, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)와 동일한 구조이고,
단,
화학식 (16), (17) 및 (18) 중, E는, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)에서의 상기 (i)의 원자단이고, 인산 가교 중의 적어도 하나의 O 원자가 S 원자로 치환되어 있더라도 좋으며,
화학식 (16b), (17b) 및 (18b) 중, E는, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)에서의 상기 (ii)의 원자단이고,
화학식 (17) 및 (17b) 중, 각 B는, 동일하더라도 상이하더라도 좋고, 각 E는, 동일하더라도 상이하더라도 좋다.
또한, 본 발명의 표지 물질은,
(i) 하나의 분자 내의 두개의 평면 화학 구조가 동일 평면 내가 아니라, 어떤 일정한 각도를 가지고 존재하지만, 그 분자가 핵산에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩(홈 결합)할 때에는 두개의 평면 화학 구조가 동일 평면 내에 배열되도록 배치함으로써 형광 발광이 생기는 표지 물질이거나,
(ii) 2개 이상의 색소 분자가 병행으로 집합되기 때문에 생기는 엑시톤 효과에 의해 형광 발광을 나타내지 않지만, 이들의 분자가 핵산에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩할 때에는, 상기 집합 상태가 풀림으로써 형광 발광이 생기는 2개 이상의 색소 분자군으로 이루어지는 표지 물질이거나, 또는,
(iii) 2개 이상의 색소 분자가 병행으로 집합되기 때문에 생기는 엑시톤 효과에 의해 형광 발광을 나타내지 않지만, 이들의 분자가 핵산에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩할 때에는, 상기 집합 상태가 풀림으로써 형광 발광이 생기는 2개 이상의 색소 분자의 화학 구조를 동일 분자 내에 갖는 것을 특징적 화학 구조로 하는 복합체 표지 물질이다.
또한, 본 발명의 핵산 검출 방법은,
(I) 표지 모노뉴클레오티드 또는 표지 올리고뉴클레오티드인 본 발명의 표지 물질을 기질로 해서 핵산 합성을 행하고, 상기 형광성을 나타내는 원자단 또는 색소 분자 구조가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 비교함으로써 핵산 합성을 검출하는 공정을 포함하는, 핵산 검출 방법,
(II) 단일쇄 핵산인 본 발명의 표지 물질을 제1 핵산으로 하고, 상기 제1 핵산과 상보적인 서열 또는 그것에 유사한 서열을 갖는 제2 핵산을 하이브리드화하여 핵산 합성을 행하여, 상기 형광성을 나타내는 원자단 또는 색소 분자 구조가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 비교함으로써, 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산의 하이브리드화를 검출하는 공정을 포함하는, 핵산 검출 방법,
(III) 단일쇄 핵산인 본 발명의 표지 물질을 제1 핵산으로 하고, 상기 제1 핵산과 상보적인 서열 또는 그것에 유사한 서열을 갖는 제2 핵산을 하이브리드화하여 핵산 합성을 행하여, 상기 형광성을 나타내는 원자단 또는 색소 분자 구조가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 비교함으로써, 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산과의 하이브리드화를 검출하는 공정을 포함하는, 핵산 검출 방법,
또는,
(IV) 상기 제1 핵산, 상기 제2 핵산의 서열, 혹은 이들의 서열에 상보적인 서열, 또는, 이들의 서열에 상보적인 서열에 유사한 서열을 가지고, 또한, 본 발명의 표지 물질 또는 복합체 표지 물질로 표지된 또는 표지되어 있지 않은 제3 핵산을 이용함으로써, 삼중쇄 핵산 또는 핵산 유사체의 형성을 검출하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법
이다.
또한, 본 발명의 키트는, 핵산 합성 수단과, 표지 물질과, 형광 강도 측정 수단을 포함하고, 상기 표지 물질은, 상기 본 발명의 표지 물질이다.
본 발명의 화합물 및 핵산은, 상기한 구조를 가짐으로써, 예컨대, 핵산의 이중 나선 구조를 효과적으로 검출 가능한 표지 물질로서 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예컨대, 상기 화학식 (1), (1b), (1c), (16), (16b), (17), (17b), (18) 또는 (18b)에 있어서, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 화합물 또는 핵산은, 상기 본 발명의 표지 물질로서 적합하다. 또한, Z11 및 Z12가 수소 원자 또는 보호기인 화합물 또는 핵산은, 상기 표지 물질의 합성 원료 혹은 합성 중간체로서 이용할 수 있다. 단, 본 발명의 화합물 및 핵산의 용도는 이들에 한정되지 않고, 어떠한 용도에 이용하더라도 좋다.
도 1은 본 발명의 원리를 모식적으로 도시하는 도면이다.
도 2는 실시예의 화합물에서의 1H와 13CNMR 스펙트럼을 도시하는 도면이다.
도 3은 실시예의 다른 화합물에서의 1H와 13CNMR 스펙트럼을 도시하는 도면이다.
도 4는 정제한 DNA 올리고머 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'의 MALDI TOF 매스 스펙트럼을 나타낸다. 화살표가 정제한 생성물 유래의 매스 피크(4101.9)이다. 분자량 계산값 4102.8(C134H176N52O76P12)에서 [M-H]-의 계산값은 4101.8로 일치한다.
도 5는 DNA 올리고머 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'와 비오틴 유도체의 반응 생성물의 MALDI TOF 매스 스펙트럼을 나타낸다. 화살표가 정제한 생성물 유래의 매스피크(4554.3)이다. 분자량 계산값 4555.4(C134H176N52O76P12)에서 [M-H]-의 계산값은 4554.4로 일치한다.
도 6은 실시예의 화합물(색소로 표지한 DNA)의 1HNMR 스펙트럼(DMSO-d6)을 나타낸다.
도 7은 도 6의 화합물(색소로 표지한 DNA)의 역상 HPLC의 차트를 나타낸다.
도 8은 도 6의 화합물(색소로 표지한 DNA)의 MALDI TOF MASS 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 실시예의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 UV 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 488 nm의 여기광을 이용한 경우의, 도 9의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 510 nm의 여기광을 이용한 경우의, 도 9의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 다른 실시예의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 UV 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 도 12의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 또한 그 외의 실시예에 있어서의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 UV 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 도 14의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 또한 그 외의 실시예에 있어서의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 UV 스펙트럼을 나타낸다.
도 17은 도 16의 형광 프로브가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때 3개 샘플의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 18은 실시예에서의 여러 종류의 형광 프로브의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 19는 실시예에서의 다른 형광 프로브의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 20은 실시예의 형광 프로브의 흡수 스펙트럼을, 여러 가지의 온도 및 농도로 측정한 흡수 스펙트럼도이다.
도 21은 실시예의 형광 프로브를 하이브리드화시킨 이중쇄의 CD 스펙트럼도이다.
도 22는 실시예에서의 다른 형광 프로브의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 23은 실시예에서의 다른 형광 프로브를 하이브리드화시켜 이중쇄로 했을 때의 형광 발광을 도시하는 도면이다.
도 24는 실시예에서의 다른 형광 프로브의 흡수 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 도시하는 도면이다.
도 25는 실시예의 형광 프로브와 하이브리드화한 RNA쇄를 RNase H에 의해 소 화했을 때의 형광 변화를 도시하는 도면이다.
도 26은 실시예의 형광 프로브에 대한 상보적 DNA쇄의 농도비를 변화시켜 형광 발광 강도의 변화를 관측한 도면이다.
도 27은 실시예의 블로팅 분석에서의 형광 발광 상태를 도시하는 도면이다.
도 28은 실시예의 형광 프로브를 세포에 도입했을 때의 미분간섭 측정사진이다.
도 29는 실시예의 형광 프로브를 세포에 도입했을 때의 형광 관찰 시의 사진이다.
도 30은 도 28과 도 29의 중복을 나타내는 사진이다.
도 31A는 실시예에서의 다른 형광 프로브를 세포에 도입했을 때의 형광 관찰 시의 사진이다.
도 31B는 실시예에서의 다른 형광 프로브를 세포에 도입했을 때의 형광 관찰 시의 사진이다.
도 32는 도 28∼도 30과 동일한 프로브를 세포 핵심으로 주입한 후의 형광의 경시 변화를 도시하는 도면이다.
도 33은 실시예에서의 다른 형광 프로브를 세포에 도입했을 때의 형광 관찰 사진이다.
다음으로, 본 발명의 실시형태에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.
[본 발명의 화합물, 핵산 및 표지 물질]
본 발명의 화합물 및 핵산은, 상기 화학식으로 표시되는 이외에는, 특별히 제한되지 않는다. 전술한 바와 같이, 그 용도도 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 상기 본 발명의 표지 물질, 또는 그 합성 원료 혹은 합성 중간체로서 이용할 수 있다. 본 발명의 화합물, 핵산 및 표지 물질에 대해, 보다 상세하게는, 예컨대 이하와 같다.
본 발명의 화합물에 있어서, 상기 화학식 (1), (1b) 및 (1c) 중,
E는, 예컨대, DNA, 수식 DNA, RNA, 수식 DNA, LNA, 또는 PNA(펩티드 헥산)의 주쇄 구조를 갖는 원자단인 것이 바람직하다.
또한, 상기 화학식 (1) 및 (1c) 중,
Figure 112009057492774-pct00008
로 표시되는 원자단이, 하기 화학식 (2)∼(4) 중 어느 하나에 표시되는 원자단이며,
Figure 112009057492774-pct00009
상기 화학식 (1b) 중,
Figure 112009057492774-pct00010
로 표시되는 원자단이, 하기 화학식 (2b)∼(4b) 중 어느 하나에 표시되는 원자단인 것이 바람직하다.
Figure 112009057492774-pct00011
상기 화학식 (2)∼(4) 및 (2b)∼(4b) 중,
A는, 수소 원자, 수산기, 알킬기, 또는 전자 흡인기이고,
M 및 J는, 각각, CH2, NH, O 또는 S이며, 동일하더라도 상이하더라도 좋고,
B, X 및 Y는, 각각, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)와 동일하고,
상기 화학식 (2), (3), (2b) 및 (3b)에 있어서, 인산 가교 중의 O 원자는, 하나 이상이 S 원자로 치환되어 있더라도 좋다.
E는 예컨대, DNA, 수식 DNA, RNA, 또는 수식 RNA의 주쇄 구조를 갖는 원자단 인 것이, 합성의 용이함 등의 관점에서 바람직하지만, LNA, 또는 PNA(펩티드 핵산)의 주쇄 구조를 갖는 원자단이어도 좋다.
상기 화학식 (2) 및 (2b) 중,
A에 있어서, 예컨대, 상기 알킬기가 메톡시기이고, 상기 전자 흡인기가 할로겐인 것이 바람직하다.
상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c) 중,
L1, L2 및 L3의 주쇄 길이(주쇄 원자수)가 각각 2 이상의 정수인 것이 바람직하다. L1, L2 및 L3의 주쇄 길이(주쇄 원자수)는 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 100 이하이고, 더욱 바람직하게는 30 이하이며, 특히 바람직하게는 10 이하이다.
본 발명의 화합물은, 예컨대, 하기 화학식 (5), (6), (6b) 또는 (6c)로 표시되는 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염인 것이 바람직하다.
Figure 112009057492774-pct00012
상기 화학식 (5), (6), (6b) 및 (6c) 중,
l, m 및 n은 임의적이고, 동일하더라도 상이하더라도 좋으며,
B, E, Z11, Z12, X, Y 및 T는, 상기 화학식 (1) 및 (1b)와 동일하다.
상기 화학식 (5), (6), (6b) 및 (6c) 중,
l, m 및 n이 각각, 2 이상의 정수인 것이 바람직하다. l, m 및 n의 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 100 이하이고, 더욱 바람직하게는 30 이하이며, 특히 바람직하게는 10 이하이다.
본 발명의 화합물에 있어서, Z11 및 Z12는, 엑시톤 효과를 나타내는 원자단인 것이 바람직하다. 이에 따라, 예컨대, 이중 나선 구조가 되었을 때의 형광의 증대가 크고, 이중 나선 구조를 한층 더 효과적으로 검출할 수 있다. 단, 본 발명의 화합물에서는, Z11 및 Z12가, 엑시톤 효과를 나타내는 원자단이 아니더라도, 또한, 형광성을 나타내는 원자단(색소)이 1분자 중에 1개만 도입되어 있어도, 이중 나선 구조를 효과적으로 검출하는 것은 가능하다.
Z11 및 Z12는, 예컨대, 전술한 바와 같이, 형광성을 갖는 원자단인 것이 바람직하다. 상기 형광성을 갖는 원자단은, 특별히 제한되지 않는다. Z11 및 Z12는, 예컨대 각각 독립적으로, 티아졸오렌지, 옥사졸옐로우, 시아닌, 헤미시아닌, 그 외의 시아닌 색소, 메틸레드, 아조 색소 또는 이들의 유도체로부터 유도되는 기인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 그 외의 공지의 색소로부터 유도되는 기도, 적절하게 이용할 수 있다. DNA 등의 핵산에 결합함으로써 형광 강도를 변화시키는 형광 색소는, 다수 보고되어 있다. 전형적인 예에서는, 에티듐브롬화물이 DNA의 이중 나선 구조에 인터켈레이션하여 강한 형광을 나타내는 것이 알려져 있고, DNA 검출에 많이 사용되고 있다. 또한, 피렌카르복시아미드나 프로단과 같은 미시적 극성에 따라 형광 강도를 제어할 수 있는 형광 색소도 알려져 있다. 또한, 상기 티아졸오렌지는, 벤조티아졸환과 퀴놀린 사이를 메틴기로 연결한 형광 색소이고, 통상 미약한 형광을 나타내지만, 이중 나선 구조를 갖는 DNA에 인터켈레이션함으로써 강한 형광 발광을 부여하게 된다. 기타, 예컨대, 플루오레세인이나 Cy3 등의 색소도 들 수 있다.
또한, Z11 및 Z12는, 예컨대, 각각 독립적으로, 하기 화학식 (7)∼(9) 중 어느 하나로 표시되는 원자단인 것이 더욱 바람직하다.
Figure 112009057492774-pct00013
Figure 112009057492774-pct00014
Figure 112009057492774-pct00015
화학식 (7)∼(9) 중,
X1 및 X2는, 각각 S 또는 O이고, 동일하더라도 상이하더라도 좋으며,
n은 0 또는 양의 정수이고,
R1∼R10, R13∼R21은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기, 또는 아미노기이며,
R11 및 R12 중, 한쪽은, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c) 중의 L1 혹은 L2, 상기 화학식 (5), (6), (6b) 또는 (6c) 중의 NH에 결합하는 연결기이고, 다른쪽은 수소 원자 또는 저급 알킬기이며,
R15는, 화학식 (7), (8) 또는 (9) 중에 복수 존재하는 경우에는, 동일하더라도 상이하더라도 좋고,
R16은, 화학식 (7), (8) 또는 (9) 중에 복수 존재하는 경우에는, 동일하더라도 상이하더라도 좋으며,
Z11 중의 X1, X2 및 R1∼R21과, Z12 중의 X1, X2 및 R1∼R21은 서로 동일하더라도 상이하더라도 좋다.
화학식 (7)∼(9) 중,
R1∼R21에 있어서, 상기 저급 알킬기가, 탄소수 1∼6의 직쇄 또는 분지 알킬기이고, 상기 저급 알콕시기가 탄소수 1∼6의 직쇄 또는 분지 알콕시기인 것이 더욱 바람직하다.
화학식 (7)∼(9) 중,
R11 및 R12에 있어서, 상기 연결기가 탄소수 2 이상의 폴리메틸렌카르보닐기이고, 카르보닐기 부분에서 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c) 중의 L1 혹은 L2, 상기 화학식 (5), (6), (6b) 또는 (6c) 중의 NH에 결합하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 폴리메틸렌카르보닐기의 탄소수는 그 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 100 이하, 바람직하게는 50 이하, 더욱 바람직하게는 30 이하, 특히 바람직하게는 10 이하이다.
Z11 및 Z12는, 상기 화학식 (7)∼(9)로 표시되는 경우에는, 예컨대 각각 독립적으로, 하기 화학식 (19) 또는 (20)으로 나타내는 기인 것이 더욱 바람직하다.
Figure 112009057492774-pct00016
Figure 112009057492774-pct00017
화학식 (19) 및 (20) 중, X1은 -S- 또는 -O-를 나타낸다. R1에서 R10, R13 및 R14는 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기, 또는 아미노기를 나타낸다. R11 및 R12의 한쪽은, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c) 중의 L1 혹은 L2, 상기 화학식 (5), (6), (6b) 또는 (6c) 중의 NH에 결합하는 연결기를 나타내고, R11 및 R12의 다른쪽은 수소 원자, 또는 저급 알킬기를 나타낸다.
본 발명의 화합물은, 예컨대, 하기 화학식 (10)으로 표시되는 구조를 갖는 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염이어도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00018
화학식 (10) 중,
E, Z11, Z12, Q, X 및 Y는, 상기 화학식 1과 동일하다.
상기 화학식 (1), (1b) 및 (1c) 중, B는 천연 핵산 염기 골격을 갖고 있어도 좋지만, 전술한 바와 같이, 인공 핵산 염기 골격을 갖고 있더라도 좋다.
예컨대, B는 Py, Py der., Pu, 또는 Pu der.로 나타내는 구조인 것이 바람직하다.
단,
상기 Py란, 하기 화학식 (11)로 표시되는 6원환 중, 1위치에 E와 결합하는 공유 결합손을 가지고, 5위치에 링커부와 결합하는 공유 결합손을 갖는 원자단이며,
상기 Py der.이란, 상기 Py의 6원환의 전체 원자의 적어도 하나가 N, C, S 또는 O 원자로 치환된 원자단이고, 상기 N, C, S 또는 O 원자는, 적절하게, 전하, 수소 원자 또는 치환기를 갖고 있더라도 좋으며,
상기 Pu란, 하기 화학식 (12)로 표시되는 축합환 중, 9위치에 E와 결합하는 공유 결합손을 가지고, 8위치에 링커부와 결합하는 공유 결합손을 갖는 원자단이며,
상기 Pu der.이란, 상기 Pu의 5원환의 전체 원자의 적어도 하나가 N, C, S 또는 O 원자로 치환된 원자단이고, 상기 N, C, S 또는 O 원자는, 적절하게, 전하, 수소 원자 또는 치환기를 갖고 있더라도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00019
본 발명의 화합물은, 예컨대, 하기 화학식 (13) 또는 (14)로 표시되는 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염이어도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00020
Figure 112009057492774-pct00021
상기 화학식 (13) 및 (14) 중, E, Z11, Z12, Q, X 및 Y는, 상기 화학식 (1)과 동일하고, Py, Py der., Pu 및 Pu der.는 전술한 정의와 같다.
본 발명의 화합물이 포스포로아미다이트기를 갖는 경우, 상기 포스포로아미다이트기는 예컨대, 하기 화학식 (15)로 표시되는 것이 바람직하다.
-P(OR22)N(R23)(R24) (15)
화학식 (15) 중, R22는 인산기의 보호기이고, R23 및 R24는 알킬기, 또는 아릴기이다.
상기 화학식 (15)에 있어서, R22가 시아노에틸기이고, R23 및 R24에 있어서, 상기 알킬기가 이소프로필기이며, 상기 아릴기가 페닐기인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 화합물에 있어서, 예컨대, 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물이, 하기 화학식 (21)로 표시되는 화합물이어도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00022
상기 화학식 (21) 중, A는 수소 원자 또는 수산기를 나타낸다. 바람직하게는, A는 수소 원자이다. B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실의 잔기를 나타낸다. 예컨대, 아데닌 및 구아닌은, 8위치에서 이중 결합과 결합하고, 시토신, 티민 또는 우라실은 5위치에서 이중 결합과 결합하고 있다. Z11 및 Z12는 각각 독립 적으로, 형광성을 나타내는 원자단, 수소 원자, 또는 아미노기의 보호기를 나타내고, 티아졸오렌지 유도체, 또는 옥사졸옐로우 유도체의 잔기가 특히 바람직하다. X는, 수소 원자, 산으로 탈보호할 수 있는 수산기의 보호기, 혹은 모노포스페이트기, 디포스페이트기 또는 트리포스페이트기를 나타낸다. Y는, 수소 원자, 수산기의 보호기, 또는 포스포로아미다이트기이다.
상기 화학식 (21)로 표시되는 화합물은, 예컨대, 하기 화학식 (22)로 표시되는 것이 더욱 바람직하다.
Figure 112009057492774-pct00023
화학식 (22) 중, A는 수소 원자 또는 수산기를 나타낸다. Z11 및 Z12는 각각 독립적으로, 형광성을 나타내는 원자단, 수소 원자, 또는 아미노기의 보호기를 나타내고, 티아졸오렌지 유도체, 또는 옥사졸옐로우 유도체의 잔기가 특히 바람직하다. X는, 수소 원자, 산으로 탈보호할 수 있는 수산기의 보호기, 혹은 모노포스페이트기, 디포스페이트기 또는 트리포스페이트기를 나타낸다. Y는, 수소 원자, 수산 기의 보호기, 또는 포스포로아미다이트기이다.
상기 화학식 (21) 또는 (22)의 화합물에 있어서, Z11 및 Z12가 수소 원자, 또는 아미노기의 보호기인 경우에는, 한 분자 중에 2개의 아미노기(또는 보호된 아미노기)를 갖기 때문에, 이들의 아미노기를 이용하여 1 분자 중에 2 분자의 표지 분자를 도입할 수 있다. 예컨대, 형광 물질, 화학 발광 물질 등을 결합하여, 표지 핵산을 제조함으로써, 핵산 검출의 감도를 향상시키는 것이 가능하다. 또한 Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 경우와 같이, 특정한 형광 물질로 표지함으로써, 핵산의 검출을 간편하게 행하는 것도 가능하다.
또한, 상기 화학식 (21) 또는 (22)의 화합물에 있어서, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 화합물은, 2분자의 형광성 분자, 예컨대, 티아졸오렌지 유도체 또는 옥사졸옐로우 유도체로 수식한 뉴클레오티드이다. 이러한 화합물을 포함하는 단일쇄 핵산으로 이루어지는 프로브는, 엑시톤 커플링에 의한 소광이 야기됨으로써, 프로브뿐인 상태에서는 형광은 매우 약하지만, DNA 또는 RNA와 하이브리드화함으로써 강한 형광 발광을 나타낸다. 즉, 예컨대, 티아졸오렌지 유도체 또는 옥사졸옐로우 유도체의 형광은, 그 변형된 구조에 의해 강하게 억제되어 있지만, 티아졸오렌지 유도체 또는 옥사졸옐로우 유도체는, DNA에 결합함으로써, 구조의 변형이 해소·고정화되어, 강한 형광을 나타내게 된다. 형광은, 예컨대, 488 nm, 514 nm의 Ar 레이저를 사용하여 여기함으로써 검출할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.
상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)로 표시되는 본 발명의 화합물은, 예컨대, 핵산(폴리뉴클레오티드)의 합성에 제공할 수 있다. 즉, 본 발명의 화합물은, 핵산의 표지 물질(핵산 라벨화 시약)로서 이용할 수 있다. 예컨대, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)로 표시되는 본 발명의 화합물을 뉴클레오티드기질로서 이용하여, 단일 핵산을 주형으로 한 핵산 합성 반응을 행함으로써, 혹은, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)로 표시되는 본 발명의 화합물을 이용하여 단일쇄 핵산을 화학 합성(예컨대, 핵산 자동 합성기를 이용한 포스포로아미다이트법 등의 화학 합성법)함으로써, 한 분자 중에 본 발명의 상기 화합물을 적어도 1분자 이상 포함하는 핵산을 제조할 수 있다. 이때, 상기 원자단 Z11 및 Z12는 각각, 형광성을 나타내는 원자단이어도 좋지만, 수소 원자 또는 보호기이어도 좋다.
본 발명의 핵산 구조는, 전술한 바와 같이, 하기 화학식 (16), (16b), (17), (17b), (18) 또는 (18b)로 표시되는 구조를 적어도 하나 포함하는 구조이다. 또한, 이들의 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염도, 본 발명의 핵산에 포함된다.
Figure 112009057492774-pct00024
Figure 112009057492774-pct00025
Figure 112009057492774-pct00026
Figure 112009057492774-pct00027
Figure 112009057492774-pct00028
Figure 112009057492774-pct00029
화학식 (16), (16b), (17), (17b), (18) 및 (18b) 중,
B, E, Z11, Z12, L1, L2, L3, D 및 b는, 각각, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)로 나타내는 구조이고,
단,
화학식 (16), (17) 및 (18) 중, E는, 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)에서 의 상기 (i)의 원자단이고, 인산 가교 중의 적어도 하나의 O 원자가 S 원자로 치환되어 있더라도 좋으며,
화학식 (16b), (17b) 및 (18b) 중, E는 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)에서의 상기 (ii)의 원자단이고,
화학식 (17) 및 (17b) 중, 각 B는, 동일하더라도 상이하더라도 좋으며, 각 E는, 동일하더라도 상이하더라도 좋다.
상기 화학식 (16), (17), (16b), (17b), (18) 및 (18b) 중,
Z11 및 Z12는, 각각, 형광성을 나타내는 원자단이고, 동일하더라도 상이하더라도 좋다.
본 발명의 핵산의 기본 골격은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, DNA, 수식 DNA, RNA, 수식 DNA, LNA, 또는 PNA(펩티드 헥산)의 어느 쪽이어도 좋고, 그 외의 구조라도 좋다. 또한, 본 발명의 핵산의 염기수는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 10 bp로부터 10 kb 정도이고, 바람직하게는 10 bp로부터 1 kb 정도이다. 또한, 본 발명의 핵산이 올리고뉴클레오티드인 경우에는, 그 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 10 bp∼100 bp 정도이고, 더욱 바람직하게는 10 bp∼50 bp 정도이며, 더욱 바람직하게는 10 bp∼30 bp 정도이다.
본 발명의 핵산에 포함되는 상기 화학식 (1), (1b) 또는 (1c)의 화합물의 수는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 1개∼100개 정도, 바람직하게는 1개∼20개 정도이다.
본 발명의 화합물 또는 핵산은, 예컨대, 하기 화학식 (23)∼(25) 중 어느 하나에 표시되는 구조를 갖고 있더라도 좋다. 이에 따라, 예컨대, 색소를 도입한 형광 프로브로서 바람직하게 이용할 수 있다. 단, 형광 프로브로서 적합한 본 발명의 화합물은, 이들에 한정되지 않는다.
Figure 112009057492774-pct00030
화학식 (23)에 있어서, 염기 B에는, 2개의 색소(Fluo)가 연결되어 있다. 염기 B가 링커와 결합하는 부위는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 피리미딘 4위치, 5위치 혹은 6위치, 푸린 2위치, 3위치, 6위치, 7위치 혹은 8위치 중 1개소에서 링커에 연결되어 있다. 링커는, 1개소의 염기 접속 부위를 가지고, 도중에서 2개 이상으로 분기되어, 말단에서 색소와 연결된다. 염기 혹은 색소와의 연결 방법은, 이중 결합이나 삼중 결합에 대한 금속 촉매 반응이나 환형성 축합 반응이나 마이켈 부가 반응 등에 의해 형성되는 결합 외에도, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 이민 형성 반응 등에 의해 형성되는 결합을 이용할 수 있다. 링커에 대해서는, 길이(l, m, n)는 자유이고, 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 아민, 이민, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 티오 에스테르 결합 등을 포함하더라도 좋다. 또한, 이량화에 따라 야기되는 엑시톤 효과를 방해하지 않는 것이 바람직하다. 분기부(X)는 탄소, 규소, 질소, 인, 붕소의 각 원자이고, 양자화(예컨대 NH+) 또는 산화(예컨대 P=O)가 일어나 있더라도 좋다. 색소는 이량화에 따라 엑시톤 효과를 나타내는 것을 이용하는 것이 바람직하고, 링커와 접속하는 개소는 색소의 어느 부분이어도 좋다. 화학식 (23) 중에서는, DNA의 부분 구조인 디옥시리보스뉴클레오티드를 나타내고 있지만, 그 대신에 핵산 골격이 리보뉴클레오티드(RNA) 외에, 2'O-메틸 RNA나 2'-플루오로 DNA 등의 당수식 핵산, 포스포로티오에이트 핵산 등의 인산 수식 핵산, PNA나 LNA(BNA) 등의 기능성 핵산이어도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00031
화학식 (24) 중, 염기 B에는, 2개의 색소(Fluo)가 연결되어 있다. 염기 B와 링커의 결합 개소는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 피리미딘 4위치, 5위치 혹은 6위치, 푸린 2위치, 3위치, 6위치, 7위치 혹은 8위치 중 2개소에서 링커에 연결되어 있다. 2개의 링커는 각각 1개소의 염기 접속 부위를 가지고, 다른 하나의 말 단에서 색소와 연결한다. 염기 혹은 색소와의 연결 방법은, 이중 결합이나 삼중 결합에 대한 금속 촉매 반응이나 환형성 축합 반응이나 마이켈 부가 반응 등에 의해 형성되는 결합 외에도, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 이민 형성 반응 등에 의해 형성되는 결합을 이용할 수 있다. 링커에 대해서는, 길이(l, m)는 자유이고, 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 아민, 이민, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 티오에스테르 결합 등을 포함하더라도 좋다. 또한, 이량화에 따라 야기되는 엑시톤 효과를 방해하지 않는 것이 바람직하다. 색소는 이량화에 따라 엑시톤 효과를 나타내는 것을 이용하는 것이 바람직하고, 링커와 접속하는 개소는 색소의 어느 부분이어도 좋다. 화학식 (24)중에서는, DNA의 부분 구조인 디옥시리보스뉴클레오티드를 나타내고 있지만, 그 대신에 핵산 골격이 리보뉴클레오티드(RNA) 외에, 2'O-메틸 RNA나 2'-플루오로 DNA 등의 당수식 핵산, 포스포로티오에이트 핵산 등의 인산 수식 핵산, PNA나 LNA(BNA) 등의 기능성 핵산이어도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00032
화학식 (25)에 있어서는, 연속하는 뉴클레오티드의 각 염기(B1, B2)에 각각 1개의 색소(Fluo)가 연결되어 있다. 각 염기가 링커와 결합하는 개소는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 피리미딘 4위치, 5위치 혹은 6위치, 푸린 2위치, 3위치, 6위치, 7위치 혹은 8위치 중 1개소에서 링커에 연결되어 있다. 2개의 링커는 각각 1개소의 염기 접속 부위를 가지고, 다른 하나의 말단에서 색소와 연결한다. 염기 혹은 색소와의 연결 방법은, 이중 결합이나 삼중 결합에 대한 금속 촉매 반응이나 환형성 축합 반응이나 마이켈 부가 반응 등에 의해 형성되는 결합 외에도, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 이민 형성 반응 등에 의해 형성되는 결합을 이용할 수 있다. 링커에 대해서는, 길이(l, m)는 자유이고, 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 아민, 이민, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 티오에스테르 결합 등을 포함하더라도 좋다. 또한, 이량화에 따라 야기되는 엑시톤 효과를 방해하지 않는 것이 바람직하다. 색소는 이량화에 따라 엑시톤 효과를 나타내는 것을 이용하는 것이 바람직하고, 링커와 접속하는 개소는 색소의 어느 부분이어도 좋다. 화학식 (25) 중에서는, DNA의 부분 구조인 디옥시리보스뉴클레오티드를 나타내고 있지만, 그 대신에 핵산 골격이 리보뉴클레오티드(RNA) 외에, 2'O-메틸 RNA나 2'-플루오로 DNA 등의 당수식 핵산, 포스포로티오에이트 핵산 등의 인산 수식 핵산, PNA나 LNA(BNA) 등의 기능성 핵산이어도 좋다.
또한, 본 발명의 화합물 또는 핵산에 호변 이성체 또는 입체 이성체(예: 기하 이성체, 배좌 이성체 및 광학 이성체) 등의 이성체가 존재하는 경우에는, 어느 쪽의 이성체도 본 발명에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 핵산의 염은, 산부가 염이어도 좋지만, 염기부가 염이어도 좋다. 또한, 상기 산부가염을 형성하는 산은 무기산이라도 유기산이더라도 좋고, 상기 염기부가염을 형성하는 염기는 무기 염기이더라도 유기 염기이더라도 좋다. 상기 무기산으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 황산, 인산, 불화수소산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 차아불소산, 차아염소산, 차아브롬산, 차아요오드산, 아불소산, 아염소산, 아브롬산, 아요오드산, 불소산, 염소산, 브롬산, 요오드산, 과불소산, 과염소산, 과브롬산 및 과요오드산 등을 들 수 있다. 상기 유기산도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 옥살산, p-브로모벤젠술폰산, 탄산, 호박산, 시트르산, 안식향산 및 초산 등을 들 수 있다. 상기 무기 염기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 수산화암모늄, 알칼리금속수산화물, 알칼리토류금속수산화물, 탄산염 및 탄산수소염 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 예컨대, 수산화나 트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 수산화칼슘 및 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 상기 유기 염기도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 에탄올아민, 트리에틸아민 및 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 등을 들 수 있다. 이들의 염의 제조 방법도 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 상기 전자 공여체·수용체 연결 분자에, 상기와 같은 산이나 염기를 공지의 방법에 의해 적절하게 부가시키는 등의 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 치환기 등에 이성체가 존재하는 경우에는 어떤 이성체라도 좋고, 예컨대, 「나프틸기」라고 하는 경우에는, 1-나프틸기이더라도 2-나프틸기이더라도 좋다.
또한, 본 발명에 있어서, 알킬기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기 및 tert-부틸기 등을 들 수 있고, 알킬기를 구조 중에 포함되는 기(알킬아미노기, 알콕시기 등)에 있어서도 동일하다. 또한, 퍼플루오로알킬기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기 및 tert-부틸기 등으로부터 유도되는 퍼플루오로알킬기를 들 수 있고, 퍼플루오로알킬기를 구조 중에 포함하는 기(퍼플루오로알킬술포닐기, 퍼플루오로아실기 등)에 있어서도 동일하다. 본 발명에 있어서, 아실기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 이소부티릴기, 발레릴기, 이소발레릴기, 피바로일기, 헥사노일기, 시클로헥사노일기, 벤조일기, 에톡시카르보닐기 등을 들 수 있고, 아실기를 구조 중에 포함하는 기(아실옥시기, 알카노일옥시기 등)에 있어서도 동일하다. 또한, 본 발명에 있어서, 아실기의 탄소수에는 카르보닐탄소를 포함하여, 예컨대, 탄소수 1의 알카노일기(아실기)는 포르밀기를 가리키는 것으로 한다. 또한, 본 발명에 있어서, 「할로겐」이란, 임의의 할로겐원소를 가리키지만, 예컨대, 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 아미노기의 보호기로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 트리플루오로아세틸기, 포르밀기, C1-6알킬-카르보닐기(예컨대 아세틸, 에틸카르보닐 등), C1-6알킬-술포닐기, tert-부틸옥시카르보닐기(이하, Boc라고도 칭함), 벤질옥시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기, 플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 아릴카르보닐기(예컨대 페닐카르보닐, 나프틸카르보닐 등), 아릴술포닐기(예컨대 페닐술포닐, 나프틸술포닐 등), C1-6알킬옥시-카르보닐기(예컨대, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐 등), C7-10아랄킬-카르보닐기(예컨대 벤질카르보닐 등), 메틸기, 아랄킬기(예컨대 벤질, 디페닐메틸, 트리틸기 등) 등이 이용된다. 이들의 기는 1∼3개의 할로겐 원자(예컨대 불소, 염소, 브롬 등), 니트로기 등으로 치환되어 있더라도 좋고, 그 구체예로서는, p-니트로벤질옥시카르보닐기, p-클로로벤질옥시카르보닐기, m-클로로벤질옥시카르보닐기, p-메톡시벤질옥시카르보닐기 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 수산기의 보호기(산으로 탈보호하는 것이 가능한 것을 포함함)로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 디메톡시트리틸기, 모노메톡시트리틸기, 픽실기 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 핵산으로서 특히 바람직한 것은, 예컨대, 후술한 실시예에 기재된 화합물 또는 핵산이고, 특히 화학물(핵산) 102∼106, 110, 113, 114, 116∼118, 120, 121, 122, 123, 124, ODN1, ODN2, ODN3, ODN4, ODN5, ODN6, ODN7, ODN8, ODN9, ODN10, ODN(anti4.5S) 및 ODN(antiB1) 및 이들의 기하 이성체, 입체 이성체 및 염이다. 특히, 화합물 110, 113, 114, 116∼118, 120, 121, 122, 123, 124, ODN1, ODN2, ODN3, ODN4, ODN5, ODN6, ODN7, ODN8, ODN9, ODN10, ODN(anti4.5S) 및 ODN(antiB1)은, 티아졸오렌지와 DNA가 독특한 구조로 공유 결합되어 있는 것에 의해, 핵산 검출 감도 등이 특히 우수하다. 또한, 티아졸오렌지 구조를 1분자 중에 2개 포함하는 화합물 110, 113, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 124, ODN1, ODN2, ODN3, ODN4, ODN5, ODN9, ODN(anti4.5S) 및 ODN(antiB1)은, 단일쇄 상태의 형광을 억제하고, 상보적인 DNA나 RNA와의 이중 나선 형성에 의해 형광 강도가 증가하는 단일쇄 DNA의 형광 프로브로서, 한층 더 효과적으로 이용할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 표지 물질은, 전술한 바와 같이,
(i) 하나의 분자 내의 두개의 평면 화학 구조가 동일 평면 내가 아닌, 어떤 일정한 각도를 가지고 존재하지만, 그 분자가 핵산에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩할 때에는 두개의 평면 화학 구조가 동일 평면 내에 배열되도록 배치함으로써 형광 발광이 생기는 표지 물질이거나,
(ii) 2개 이상의 색소 분자가 병행으로 집합되기 때문에 생기는 엑시톤 효과에 의해 형광 발광을 나타내지 않지만, 이들의 분자가 핵산에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩할 때에는, 상기 집합 상태가 풀림으로써 형광 발광이 생기는 2개 이상의 색소 분자군으로 이루어지는 표지 물질이거나, 또는,
(iii) 2개 이상의 색소 분자가 병행으로 집합되기 때문에 생기는 엑시톤 효 과에 의해 형광 발광을 나타내지 않지만, 이들의 분자가 핵산에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩할 때에는, 상기 집합 상태가 풀림으로써 형광 발광이 생기는 2개 이상의 색소 분자의 화학 구조를 동일 분자 내에 갖는 것을 특징적 화학 구조로 하는 복합체 표지 물질이다.
상기 (ii) 또는 (iii)의 경우에 있어서, 상기 색소 분자가, 상기 (i)에 기재된 분자인 것이 바람직하다. 또한, 상기 (iii)의 경우에 있어서, 표지되어야 하는 핵산에 결합하고 있는 링커 분자에, 분지 구조를 취하도록 한층 더 링커 분자를 통해, 또는, 한층 더 링커 분자를 통하지 않고 직접적으로, 2개 이상의 색소 분자가 결합한 구조를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 표지 물질은, 상기 원자단 Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 또는 이들의 염, 또는, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인, 상기 본 발명의 핵산, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염인 것이 바람직하다. 예컨대, 본 발명의 화합물 또는 핵산에 있어서, Z11 및 Z12가, 엑시톤 효과를 나타내는 원자단이기 때문에, 이중 나선 구조로 되었을 때의 형광의 증대가 커지고, 이중 나선 구조를 한층 더 효과적으로 검출할 수 있다. 단, 본 발명의 화합물 또는 핵산에 있어서는, Z11 및 Z12가, 엑시톤 효과를 나타내는 원자단이 아니더라도, 또한, 형광성을 나타내는 원자단(색소)이 1분자 중에 1개만 도입되어 있더라도, 핵산 등의 표지 물질로서 사용 가능하고, 이중 나선 구조를 효과적으로 검출할 수도 있다. 본 발명의 표지 물질의 형태로서는, 예컨대, 단일쇄 핵산인 형광 프로브의 형태가 있지만, 이에 한정되지 않고, 표지 모노뉴클레오티드, 표지 올리고뉴클레오티드, 이중쇄 핵산 등, 어떠한 형태이더라도 좋다.
또한, 본 발명의 표지 물질은, 예컨대,
표지 모노뉴클레오티드, 표지 올리고뉴클레오티드, 표지 핵산 또는 표지 핵산 유사체인 표지 물질로서,
상기 (i)∼(iii) 중 어느 하나에 기재된 표지 물질, 또는, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염, 또는 Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 핵산, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은, 이들의 염으로 표지된 표지 물질이다.
혹은, 본 발명의 표지 물질은, 예컨대,
표지 모노뉴클레오티드, 표지 올리고뉴클레오티드, 표지 핵산 또는 표지 핵산 유사체인 표지 물질로서,
모노뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산 또는 핵산 유사체 내의 하나 또는 그 이상의 염기 분자 또는 주쇄 구성 분자에 결합하고 있는 링커 분자를 통해, 상기 (i)∼(iii) 중 어느 하나에 기재한 표지 물질, 또는, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염, 또는, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 핵산, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염으로 표지된 표지 물질이다.
혹은, 본 발명의 표지 물질은, 예컨대,
표지 모노뉴클레오티드, 표지 올리고뉴클레오티드, 표지 핵산 또는 표지 핵산 유사체인 표지 물질로서,
모노뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산 또는 핵산 유사체 내의 하나 또는 그 이상의 염기 분자의 피리미딘핵 5위치의 탄소 원자 또는 푸린핵 8위치의 탄소 원자에 결합하고 있는 링커 분자를 통해, 상기 (i)∼(iii) 중 어느 하나에 기재한 표지 물질, 또는, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염, 또는, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 핵산, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염으로 표지된 표지 물질이다.
[본 발명의 화합물 및 핵산의 제조 방법]
본 발명의 화합물 및 핵산의 제조 방법은, 특별히 제한되지 않고, 공지의 합성 방법(제조 방법)을 적절하게 이용할 수 있다. 일례로서, 상기 화학식 (21)로 표시되는 화합물인 경우에는, 하기 화학식 (26)으로 표시되는 화합물의 카르복실기를 활성화한 후, 트리스(2-아미노에틸)아민을 반응시키는 공정; 아미노기를 보호하는 공정: 및 상기에서 얻어진 화합물 중에 존재하는 수산기를 보호기로 보호하는 반응과, 얻어진 화합물 중에 존재하는 수산기에 인산 또는 포스포로아미다이트기를 부 가하는 반응을 행하는 공정을 포함하는 제조 방법에 의해 제조하더라도 좋다.
Figure 112009057492774-pct00033
상기 화학식 (26) 중, A는 수소 원자 또는 수산기를 나타낸다. B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실의 잔기를 나타낸다.
본 발명의 화합물 또는 핵산의 제조에 응용할 수 있는 제조 방법(합성 방법)으로서는, 예컨대, 이하의 방법이 있다. 즉, 우선, DNA의 간편한 라벨화법으로서, DNA 중의 활성 아미노기와 라벨화제 중의 활성화된 카르복실기를 완충 용액 내에서 반응시키는 방법이 널리 이용되고 있다. 이 방법은, 본 발명의 화합물 또는 핵산의 어느 쪽의 제조에도 응용 가능하고, 특히, 링커 또는 색소의 도입에 응용할 수 있다. 아미노기의 도입법으로서는, GLEN RESEARCH 사가 판매하고 있는 Amino modifier 포스포로아미다이트를 이용하는 방법 등이 있다.
상기 원자단 Z11 및 Z12는 예컨대, 보호기로부터 수소 원자로 변환하고(보호기를 제거함), 또한, 수소 원자로부터, 형광성을 갖는 원자단(색소)으로 치환할 수 있다. 보호기를 제거하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지의 방법을 적절하게 이용할 수 있다. 형광성을 갖는 원자단(색소)으로 치환하는 방법도 특별히 제한되지 않고, 예컨대, Z11 및 Z12가 수소 원자인 본 발명의 화합물 또는 핵산과, 형광성 분자(색소)를 적절하게 반응시키면 좋다. 예컨대, Z11 및 Z12의 적어도 한쪽이 활성 아미노기이면, 형광성 분자(색소)와 반응하기 쉽기 때문에 바람직하며, Z11 및 Z12의 양쪽이 활성 아미노기인 것이 더욱 바람직하다. 형광성 분자(색소)도 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 상기 화학식 (7)∼(9) 중 어느 하나로 표시되는 화합물(단, R11 및 R12의 어느 한 쪽이, 수소 원자 혹은 저급 알킬기, 또는 카르복시폴리메틸렌기인 것)이더라도 좋다. 또한, 핵산(폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오시드)인 경우, 보호기를 제거하는 공정 및 형광성을 갖는 원자단(색소)으로 치환하는 공정은, 중합(핵산 합성) 전이더라도 좋고, 후이더라도 좋다. 예컨대, 합성 공정에서 색소 부분이 손상을 받는 것을 방지하는 관점에서, 중합(핵산 합성)의 후에 형광성을 갖는 원자단(색소)을 도입하는 것이 바람직하다.
색소로서는, 전술한 바와 같이, 특별히 제한되지 않고, 모든 색소가 사용가능하지만, 예컨대, 시아닌 색소가 바람직하고, 티아졸오렌지가 특히 바람직하다. 시아닌 색소는, 예컨대, 헤테로 원자를 갖는 2개의 복소환이 메틴 링커로 연결된 화학 구조를 이루고 있다. 복소환의 종류나 메틴 링커의 길이를 바꾸는 것, 또는 복소환에의 치환기 도입 등에 의해, 여러 가지의 여기·발광 파장의 형광 색소를 합성하는 것이 가능하다. 또한, DNA 도입을 위한 링커 도입도 비교적 용이하다. 또한, 티아졸오렌지는 수중에서는 거의 형광을 내지 않지만, DNA 또는 RNA와 상호 작용함으로써 강한 형광을 발한다. 핵산과의 상호 작용에 의해, 색소 분자간의 상호 작용이 억제되는 점, 그리고 색소 분자의 2개의 복소환 사이의 메틴 링커 주위의 회전이 억제되는 점이 형광 강도의 증가로 이어진다고 생각하고 있다. 또한, 티아졸오렌지 색소의 사용 방법에 대해서는, 잘 알려져 있지만, 예컨대, H. S. Rye, M. A. Quesada, K. Peck, R. A. Mathies and A. N. Glazer, High-sensitivity two-color detection of double-stranded DNA with a confocal fluorescence gel scanner using ethidium homodimer and thiazole orange, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 327-33; 및 L. G. Lee, C. H. Chen and L. A. Chiu, Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis, Cytometry, 1986, 7, 508-17을 참조하여 이용할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 핵산의 기본 골격은, 전술한 바와 같이, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, DNA, 수식 DNA, RNA, 수식 DNA, LNA, 또는 PNA(펩티드 헥산)의 어느 하나이더라도 좋고, 그 외의 구조이더라도 좋다. DNA, 수식 DNA, RNA, 또는 수식 RNA를 기본 골격으로 하는 쪽이 합성이 용이하고, 색소로의 치환(색소 분자의 도입) 등도 하기 쉽기 때문에 바람직하다. LNA 또는 PNA에 색소 분자를 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지의 방법을 적절하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, Analytical Biochemistry 2000, 281, 26-35. Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. (2000) Anal Biochem. 281, 26-35.Hrdlicka, P. J., Babu, B. R., Sorensen, M. D., Harrit, N., Wengel, J. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127, 13293-13299. 등을 참조할 수 있다.
DNA, 수식 DNA, RNA, 또는 수식 RNA를 기본 골격으로 하는 핵산의 합성 방법은 잘 알려져 있고, 예컨대, 소위 포스포로아미다이트법 등에 의해 합성할 수 있다. 그 원료가 되는 포스포로아미다이트 시약도, 공지의 방법으로 간편하게 합성할 수 있다. 본 발명의 핵산이 DNA, 특히 짧은 올리고 DNA인 경우, 예컨대, DNA 자동합성기 등으로 간편하게 합성할 수 있다. 또한, 예컨대, PCR 등에 의해, 장쇄형의 핵산(DNA) 등을 합성할 수도 있다. DNA와 색소 분자와의 결합 개소는, 전술한 바와 같이 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 티미딘의 5위치가 특히 바람직하다. 티미딘의 5위치로부터 여러 가지의 치환기를 늘린 뉴클레오티드 유도체의 삼인산은 DNA 폴리머라제에 의한 도입 효율이 비교적 좋은 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 예컨대, 본 발명의 핵산이, 짧은 올리고 DNA인 경우뿐만 아니라, 장쇄 DNA인 경우에도 간편한 합성이 가능하다.
특히, 예컨대, 티아졸오렌지를 이용한, 단일쇄 DNA인 본 발명의 형광 프로브(표지 물질)는 예컨대, (1) DNA 자동 합성기로 합성한 DNA에 완충 용액 내에서 색소를 붙이는 것만으로 제조할 수 있고, 합성적으로 용이하며, (2) 효소적으로 제조한 장쇄 DNA와 색소를 반응시킴으로써 장쇄의 형광 프로브의 제작도 가능하다는 등의 이점을 갖고 있다. 또한, 예컨대, 500 nm 부근의 비교적 장파장의 광으로 여기할 수 있다.
[핵산의 검출 방법 및 키트]
본 발명의 핵산의 검출 방법은, 전술한 바와 같이,
(I) 표지 모노뉴클레오티드 또는 표지 올리고뉴클레오티드인 본 발명의 표지 물질을 기질로서 핵산 합성을 행하여, 상기 형광성을 나타내는 원자단 또는 색소 분자 구조가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 비교함으로써 핵산 합성을 검출하는 공정을 포함하는 핵산 검출 방법,
(II) 단일쇄 핵산인 본 발명의 표지 물질을 제1 핵산으로 하고, 상기 제1 핵산과 상보적인 서열 또는 그와 유사한 서열을 갖는 제2 핵산을 하이브리드화시켜 핵산 합성을 행하며, 상기 형광성을 나타내는 원자단 또는 색소 분자 구조가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 비교함으로써, 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산의 하이브리드화를 검출하는 공정을 포함하는 핵산 검출 방법,
(III) 단일쇄 핵산인 본 발명의 표지 물질을 제1 핵산으로 하고, 상기 제1 핵산과 상보적인 서열 또는 그와 유사한 서열을 갖는 제2 핵산을 하이브리드화시켜 핵산 합성을 행하며, 상기 형광성을 나타내는 원자단 또는 색소 분자 구조가 인터 켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에 있어서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에 있어서의 형광 강도를 비교함으로써, 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산의 하이브리드화를 검출하는 공정을 포함하는, 핵산 검출 방법,
또는,
(IV) 상기 제1 핵산, 상기 제2 핵산의 서열, 혹은 이들의 서열에 상보적인 서열, 또는, 이들의 서열에 상보적인 서열과 유사한 서열을 가지고, 또한, 본 발명의 표지 물질 또는 복합체 표지 물질로 표지된 또는 표지되지 않은 제3 핵산을 이용함으로써, 삼중쇄 핵산 또는 핵산 유사체의 형성을 검출하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법,
이다. 바람직하게는, (a) 상기 제1 핵산 중의 1분자의 염기 상에 2분자 이상의 색소 분자가 1개의 링커를 통해 결합하고 있거나, (b) 상기 제1 핵산 중의 1분자의 염기 상에 2분자 이상의 색소 분자가 2개 이상의 링커를 통해 결합하고 있거나, 혹은 (c) 상기 제1 핵산 중의 인접하는 2분자의 염기 상에 2분자 이상의 색소분자가 1개 이상의 링커를 통해 결합하고 있다.
상기 핵산 합성은, 예컨대, 효소적 수법에 의해 행하는 것이 바람직하지만, 그 외의 방법에 의해 행하더라도 좋다. 또한, 이들 본 발명의 핵산의 검출 방법은, Z11 및 Z12가 형광성을 나타내는 원자단인 상기 본 발명의 화합물, 그 호변 이성체 혹은 입체 이성체, 혹은 이들의 염, 또는 상기 본 발명의 핵산의 구조를 일부에 갖는 표지 핵산을 이용하여, 이중쇄 또는 삼중쇄 핵산을 검출하는 것이 바람직하다.
다음으로, 본 발명의 키트는, 전술한 바와 같이, 핵산 합성 수단과, 표지 물질과, 형광 강도 측정 수단을 포함하고, 상기 표지 물질이, 상기 본 발명의 표지 물질이다. 즉, 본 발명의 키트는, 상기 표지 물질이, 상기 본 발명의 표지 물질이기 때문에, 핵산을 고감도로 검출하는 것 등이 가능하다. 이 이외에는, 본 발명의 키트는 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 핵산 합성 수단은 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 공지의 자동 핵산 합성기 등이더라도 좋다. 또한, 상기 형광 강도 측정 수단도 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 공지의 형광 측정기 등이더라도 좋다.
본 발명의 키트는, 상기 본 발명의 핵산 검출 방법에 이용하는 것이 바람직하지만, 여기에 제한되지 않고, 어떠한 용도에 이용하더라도 좋다. 또한, 본 발명의 키트는, 예컨대, 연구용, 임상용 또는 진단용 키트로서 이용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 핵산 검출 방법 또는 키트에 대해, 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 핵산 검출 방법 및 키트는, 이하의 설명에 한정되지 않는다.
본 발명의 핵산 검출 방법에서는, 전술한 바와 같이, 본 발명의 표지 물질을 이용한다. 이 경우, 본 발명의 표지 물질은, 형광성을 갖는 원자단(색소)을 1분자당 1개만 갖고 있더라도 좋지만, 2개 이상 갖는 것이 바람직하다. 이에 따라, 예컨 대, 상기 형광성을 갖는 원자단(색소)이 엑시톤 효과를 갖게 된다. 엑시톤 효과에 따르면, 예컨대, 단일쇄 상태에서의 형광 강도를 억제하고, 이중 나선 구조를 한층 더 효과적으로 검출 가능하다. 또한, 엑시톤 효과(exciton coupling)란 예컨대, 복수의 색소가 병행으로 집합하고, H 회합체(H-aggregate)를 형성함으로써, 거의 형광 발광을 나타내지 않게 되는 효과이다. 이 효과는, 색소의 여기 상태가, Davydov splitting에 의해 2개의 에너지 레벨로 분열되고, 상위 에너지 레벨로의 여기→ 하위 에너지 레벨로의 내부 변환(internal conversion)→ 발광이 열적으로 금지, 라는 이유로 생성된다고 생각된다. 단, 이러한 설명은, 본 발명에 어떠한 제한도 하지 않는다. 엑시톤 효과가 일어날 수 있는 것은, H 회합체를 형성한 색소의 흡수 밴드가 단일의 색소의 흡수 밴드보다 짧은 파장에 나타나는 것으로 확인할 수 있다. 이러한 효과를 나타내는 색소로서는, 예컨대, 전술한 티아졸오렌지와 그 유도체, 옥사졸옐로우와 그 유도체, 시아닌과 그 유도체, 헤미시아닌과 그 유도체, 메틸레드와 그 유도체, 그외 일반적인 시아닌 색소, 아조 색소라고 불리는 색소군을 들 수 있다.
이들의 색소는, 이중 나선을 형성한 DNA-DNA 이중쇄나 DNA-RNA 이중쇄, 혹은 포스포티오에이트 핵산이나 PNA(펩티드 핵산)나 LNA(BNA)와 같은 인공 핵산과 DNA 혹은 RNA에 의해 형성되는 이중쇄에 인터켈레이션에 의해 결합되기 쉽다. 이들과 같은 색소 복수개를 프로브에 도입해 두면, 통상의 단일쇄 상태(즉 하이브리드화 전의 프로브만의 상태)에서는 엑시톤 효과에 의해 강하게 소광되지만, 표적의 DNA 혹은 RNA와 하이브리드화하면 회합체가 해제되어 각각의 색소가 뿔뿔이 이중쇄에 인터켈레이션된다. 이때 색소 사이에 전자적 상호 작용은 없기 때문에 엑시톤 효과는 생기지 않고, 강한 형광 발광을 나타낸다. 이때의 색소의 흡수 밴드는, 단일 색소의 흡수 밴드와 동일하고, 색소간에 엑시톤 효과가 생기지 않는 것을 나타낸다. 또한, 색소가 이중쇄에 인터켈레이션했을 때에, 색소가 원래 갖고 있는 구조 상의 비틀림이 해소되기 때문에, 형광 발광을 더욱 강하게 한다.
따라서, 예컨대, 복수개의 색소에 의해 엑시톤 효과를 나타내도록 프로브를 설계함으로써, 목적 서열의 하이브리드화에 의해 매우 명확한 형광의 온 및 오프가 가능하게 된다. 또한, 프로브 서열에 1분자의 색소만이 결합되는 것만으로는, 엑시톤 효과는 나타나지 않지만, 예컨대, 이중쇄 형성에 의한 색소의 인터켈레이션이 색소의 구조를 평탄화하는 등의 이유에 의해, 단일쇄일 때보다 강한 형광을 발휘하는 것도 가능하다. 또한, 2분자 이상의 색소가 결합되어 있더라도 각각의 색소가 전자적 상관이 나타나지 않는 거리에까지 떨어져 있는 경우에는, 엑시톤 효과는 나타나지 않는다. 즉, 엑시톤 효과가 발휘되기 위해서는, 2분자 이상의 색소가 충분히 근접할 수 있는 거리에 배치되도록 본 발명의 화합물 또는 핵산의 분자 상에 결합되어야 한다. 즉, 본 발명의 화합물 또는 핵산을 형광 프로브로서 이용하는 경우, 프로브 내의 하나의 뉴클레오티드에 2개 이상의 색소를 결합하거나, 연속하는 2개 이상의 뉴클레오티드에 하나씩의 색소를 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 검출 방법은, 예컨대, 도 1에 의해 개념적으로 나타낼 수 있다. 도 1(A)(좌측의, 「Non-hybrid」라고 기재한 도)는 엑시톤 효과에 의해 소광한 프로브를 나타내고, 도 1(B)(우측의, 「Hybrid」라고 기재한 도)는 이중쇄 형성에 의해 인터켈레이션하여, 형광 발광하는 프로브를 나타낸다. 도면 중, 부호 1은 본 발명의 핵산(형광 프로브)를 나타낸다. 2는 형광성을 나타내는 원자단(색소)을 나타낸다. 1'는, 핵산(형광 프로브)(1)에 대한 상보쇄를 나타낸다. 3은 1과 1'로 형성된 이중쇄 핵산을 나타낸다. 또한, 도의 상부는 전자 천이도이다. 「Allowed」는 허용 천이인 것을 나타낸다. 「Forbidden」은 금지 천이인 것을 나타낸다. 「Emissive」는 형광 발광 가능한 것을 나타낸다. 「Non-emissive」는 이론 상, 형광 발광 불가능인 것을 나타낸다. 즉, 단일쇄 상태[도 1(A)]에서는, 기저 상태의 색소(2)가 회합하는 것으로, 엑시톤 커플링 이론에 의해 상호 작용하고, 상기 색소 회합체의 여기 상태가 2개의 에너지 레벨로 분리하여 발광이 억제되는 것으로 생각된다. 저에너지 레벨에서의 발광은, 이론적으로는 금지이기 때문에, 회합체의 단일항 여기 상태는, 낮은 방사 상태에 멈춘다. 한편, 하이브리드화하여 이중쇄를 형성하면[도 1(B)], 색소(2)가 이중쇄 핵산(3)에 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩하여 엑시톤 커플링이 해소되기 때문에, 형광이 생성된다고 생각된다. 단, 도 1은 본 발명에 따른 핵산 검출 기구의 일례를 개념적으로 나타내는 모식도이고, 본 발명은, 도 1 및 그 설명에 의해 어떠한 한정도 없다. 엑시톤 효과에서는, 2개의 색소간 거리를 제어함으로써, 형광 발광을 컨트롤할 수 있다. 이 시스템을, 서열을 판별하기 위한 DNA에 부착함으로써, 서열 선택적인 형광 발광을 얻을 수 있다. 본 발명의 핵산 검출 방법 또는 키트에서는, 예컨대, 시료의 아래쪽으로부터 가시광을 조사함으로써 하이브리드화의 검출을 행할 수 있고, 육안으로도 명확하게 판별할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 검출 방법 또는 키트에서는, 예컨대, 형광셀·마이크로플레 이트·겔·모세관·플라스틱 튜브 등의 용기 중에서 하이브리드화가 관찰 가능하다. 또한, 본 발명의 핵산 검출 방법 또는 키트에서는, 예컨대, 표적 핵산과 혼합한 직후로부터 하이브리드화를 관측 가능하다.
본 발명의 표지 물질, 핵산 검출 방법 또는 키트에 따르면, 예컨대, 리얼 타임 PCR이나 세포 내라고 한 세정이 어려운 환경에서도, 서열 특이적인 핵산의 형광 검출이 용이해진다. 보다 구체적으로는, 예컨대, 하기 (1)∼(7)과 같이 응용할 수 있다. 또, 이하에 있어서, 「본 발명의 프로브」란, 상기 본 발명의 표지 물질의 일종인 형광 프로브를 말한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 핵산 검출 방법 및 키트에는, 본 발명의 표지 물질을 이용한다. 또한, 하기 (1)∼(7)은 예시이고, 본 발명의 표지 물질, 핵산 검출 방법 또는 키트는, 이들의 설명에 의해 하등 제한되지 않는다.
(1) 본 발명의 프로브는, 액상에서의 동종 분석(96구멍 마이크로플레이트 또는 모세관 등을 사용)에서 사용할 수 있다.
(2) 본 발명의 프로브는, PCR 프로브로서 사용할 수 있다. DNA 증폭 반응 중에서의 증폭 곡선의 검출(리얼 타임 PCR), TaqMan 프로브 대신에 저비용 수법으로서 응용할 수 있다. 프라이머의 표지, 혹은 내부 표지 프로브로서 사용할 수 있다.
(3) 본 발명의 프로브는, DNA 칩에서의 포착 프로브 혹은 표지 프로브로서 사용할 수 있다. 하이스루풋으로 시약이 불필요한 시스템이고, 표지 과정·세정 과정이 불필요하다. 인위적으로 생기는 오차를 크게 회피할 수 있다. 유리나 그 대신에 고상 담체 소재(금, ITO, 구리 등의 기판, 다이아몬드나 플라스틱 등 다수의 검체를 접착하는 것이 가능한 소재)에 있어서의 동시 다항목(하이스루풋)적인 해석이 가능하다.
(4) 본 발명의 프로브는, 비드, 섬유, 또는 히드로겔에 고정화할 수 있다. 반액체·반고체의 환경 하에서 유전자를 검출할 수 있다. 액체와 같은 측정 환경을 가지면서, 고체와 같이 운반하는 것이 가능하다.
(5) 본 발명의 프로브는, 블로팅(서던 블롯, 노던 블롯, 도트 블롯 등)용의 프로브로서 사용할 수 있다. 원하는 유전자 단편만을 발광시켜 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 하이브리드화 조작 후, 세정이 불필요하다.
(6) 본 발명의 프로브는, 세포 내 핵산의 검출·추적을 위한 프로브로서 사용할 수 있다. 이에 따라, 세포 내의 DNA/RNA의 시공간적 해석이 가능하게 된다. 형광 현미경이나 셀 소터를 사용할 수 있다. DNA의 표지, RNA에의 전사·스플라이싱의 추적, RNAi의 기능 해석 등에 응용할 수 있다. 본 발명의 방법에서는, 세정의 필요가 없기 때문에, 생세포의 기능 추적에 적합하다.
(7) 본 발명의 프로브는, 형광 in situ 하이브리드화(FISH)의 프로브로서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해, 조직의 염색 등을 행할 수 있다. 본 발명의 방법에서는, 세정의 필요가 없기 때문에, 인위적으로 생기는 오차가 작다. 즉, 본 발명의 프로브는, 표적 생체 분자를 인식하지 않을 때는 형광을 발하지 않는 형광 색소로서 작동하기 때문에, 이것을 이용하면, 번잡한 세정 공정을 필요로 하지 않는 바이오이미징을 확립할 수 있다. 이 점은, 고신뢰성, 저노동력으로 리얼 타임인 형광 관측으로 이어진다.
또한, 본 발명의 형광 프로브(표지 물질)의 효과로서는, 종래의 단일쇄 상태소광형 형광 프로브(분자 비컨 등)와 비교하여, 예컨대, 이하의 이점을 예로 들 수 있다. 단, 이들도 예시로서, 본 발명에 어떠한 제한도 하지 않는다.
(1) 색소를 1종류밖에 이용하지 않는 경우, 합성이 용이하다.
(2) 본 발명의 DNA 프로브(표지 물질)의 말단이 프리인 경우, PCR 프로브로서 사용하기 쉽다.
(3) 헤어핀 구조 등 특수한 고차 구조를 형성할 필요가 없기 때문에, 스템 서열 등 서열 인식에 관여하지 않는 서열을 필요로 하지 않는다(쓸데없는 서열이 없고, 서열의 구속도 없음).
(4) 프로브의 복수의 개소(바라는 장소)에 형광 색소를 도입할 수 있다.
(5) 색소 구조를 1분자 내에 2개 이상 포함하는 경우, 색소간의 위치 관계가 구속되어 있기 때문에, S/N 비(하이브리드화 전후의 형광 강도비)가 크다.
본 발명의 프로브의 형광 강도는, 예컨대, 결합한 색소 부분의 엑시톤 상호 작용의 컨트롤에 의해, 효과적으로 변화시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 특히, 엑시톤 상호 작용을 이용한 어프로치에 따르면, on-off 프로브로서 기능하기 위해 충분히 높은 소광 성능을 얻을 수 있고, 또한, 예컨대 전술한 바와 같이, 종래의 분석과 비교하여 명확하게 상이한 많은 이점을 얻을 수 있다. 이러한 on-off 형광 뉴클레오티드의 디자인은, 예컨대, 세정을 필요로 하지 않는 바이오이미징 분석의 확립을 위해 매우 중요하다. 엑시톤 효과를 이용한 프로브가 나타내는 광물리적 성질은 매우 특징적일뿐만 아니라, DNA 시퀀싱(서열 결정), 제노타이핑(유전자형 해석 ), DNA 구조 천이의 모니터링 및 유전자 발현 관측을 위한 신규인 형광 DNA 프로브의 디자인에 적합하다.
또한, 본 발명의 프로브(핵산)를 이용하면, 예컨대, 표적 핵산 서열을 정량함으로써, 상기 서열의 증폭·분해·단백질 결합 등의 현상이 생성된 것을 바로 검출하고, 이들의 현상량을 정량할 수도 있다. 이 검출 및 정량은 이하의 설명에 의해 가능해지지만, 이 설명은 예시이고, 본 발명을 한정하는 것이 아니다. 즉, 우선, 본 발명의 프로브(핵산)가 상기 표적 핵산 서열과 일정한 물질량비로 하이브리드화하여, 이중쇄를 형성한다. 형성되는 이중쇄의 물질량은, 상기 표적 핵산 서열의 물질량과 정비례하기 때문에, 상기 이중쇄의 형광 강도를 측정하는 것으로, 표적 핵산 서열을 검출하고, 그 물질량을 정량할 수 있다. 이 경우에 있어서, 본 발명의 프로브(핵산)는 형광 발광이 억제되어 있기 때문에, 상기 이중쇄의 형광 강도 측정을 방해하지 않고, 정확한 측정이 가능해진다.
[실시예]
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되지 않는다. 또한, 이하에 있어서 「ODN」이란, 올리고 DNA(DNA 올리고머)를 의미하는 것으로 한다.
[측정 조건 등]
시약, 용매는 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용했다. 비오틴의 N-히드록시숙신이미딜에스테르는 PIERCE 사의 것을 사용했다. 화합물 정제용의 실리카겔은 Wako 겔 C-200(와코 순약)을 사용했다. 1H, 13C, 및 31PNMR 스펙트럼은, JEOL(니혼덴시 가부시키가이샤)의 JNM-α400(상품명)에 의해 측정했다. 커플링 정수(J값)는 헤르츠(Hz)로 표시하고 있다. 케미컬 시프트는, ppm으로 표시하고, 내부 표준에는, 디메틸설폭시드(δ= 2.48 in 1HNMR, δ= 39.5 in 13CNMR) 및 메탄올(δ= 3.30 in 1HNMR, δ= 49.0 in 13CNMR)을 이용했다. 31PNMR 측정에는, 외부 표준으로서 H3PO4(δ= 0.00)를 이용했다. ESI 매스 스펙트럼은, Bruker사의 Bruker Daltonics APEC-II(상품명)를 이용하여 측정했다. DNA 자동 합성기는 Applied Biosystems사의 392 DNA/RNA synthesizer(상품명)를 사용했다. 역상 HPLC는, 길슨 사의 장치 Gilson Chromatograph, Model 305(상품명)와 켐코사의 CHEMCO BOND5-ODS-H 분취용 컬럼(상품명, 10× 150 mm)을 이용하여 분리를 행하고, UV 검출기 Model 118(상품명)에 의해, 파장 260 nm에서 검출했다. DNA의 질량은 MALDI-TOF MS에 의해 측정했다. MALDI-TOF MS는, Appplied Biosystems 사의 Perseptive Voyager Elite(상품명)를 이용하여, 가속 전압 21 kV, 네가티브 모드로 측정하고, 매트릭스로서는 2', 3', 4'-트리히드록시아세토페논을 이용하여, T8([M. H]. 2370.61) 및 T17([M. H]. 5108.37)을 내부 표준으로서 이용했다. UV 및 형광 스펙트럼은 가부시키가이샤 시마즈 세이사쿠쇼의 Shimadzu UV-2550(상품명) 분광 광도계와, RF-5300 PC(상품명) 형광 분광 광도계를 각각 이용하여 측정했다. 형광 수명은, 가부시키가이샤 호리바 세이사쿠쇼의 소형 고성능 형광 수명 측정기기 HORIBA JOBIN YVON FluoroCube(상품 명)에, NanoLED-05A(상품명)를 장비하여 측정했다. 이중쇄 핵산의 융점(Tm)의 측정은, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0) 내에 있어서, 최종 이중쇄 농도 2.5 μM에서 행했다. 시료의 흡광도는 파장 260 nm에서 측정하고, 10℃로부터 90℃의 범위에서, 0.5℃/min의 속도로 가열하면서 추적했다. 이에 따라 관측된 특성으로부터, 최초 변화가 생성된 온도를 융점(Tm)으로 했다.
흡수 스펙트럼, 형광 스펙트럼 및 CD 스펙트럼 측정은, 특별히 기재하지 않는 한, 스트랜드 농도 2.5 ㎛(단일쇄 또는 이중쇄)에서, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0) 중, 광로 길이 1 cm의 측정셀을 이용하여 행했다. 여기 및 형광 발광의 대역폭은 1.5 nm였다. 형광 양자 수율(ΦF)은 9, 10-디페닐안트라센을 대조 물질로서 이용하여, 에탄올 중에서의 9,10-디페닐안트라센의 양자 수율 ΦF= 0.95에 기초하여 산출했다. 발광 스펙트럼의 면적은 계측 소프트웨어를 이용한 적분에 의해 산출했다. 양자 수율(ΦF)은 하기 식 (1)에 의해 산출했다.
ΦF(S)/ΦF(R)= [A(S)/A(R)]× [(Abs)(R)/(Abs)(S)]× [n(S) 2/n(R) 2] (1)
상기 식 (1) 중, ΦF(S)는 시료(Sample)의 형광 양자 수율이고, ΦF(R)은 대조 물질(Reference)의 형광 양자 수율이다. A(S)는 시료의 형광 스펙트럼 면적이고, A(R)은 대조 물질의 형광 스펙트럼 면적이다. (Abs)(S)는 여기 파장에서의 시료 용액의 광학 밀도이고, (Abs)(R)은 여기 파장에서의 대조 물질 용액의 광학 밀도이다. n(S)는 시료 용액의 굴절율로서, n(R)은 대조 물질 용액의 굴절율이며, n(S)= 1.333 및 n(R)= 1.383으로 계산했다.
[실시예 1∼3]
하기 반응식 1에 따라, 2개의 활성 아미노기가 각각 트리플루오로아세틸기로 보호된 화합물 102 및 화합물 103을 합성(제조)하고, 포스포로아미다이트 104를 더 합성했다.
Figure 112009057492774-pct00034
반응식 1
반응 시약과 반응 조건
(a) (i) N-히드록시숙신이미드, EDC/DMF, (ii) 트리스(2-아미노에틸)-아민/CH3CN, (iii) CF3COOEt, Et3N; (b) DMTrCl/피리딘; (c) 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로아미다이트, 1H-테트라졸/CH3CN.
상기 반응식 1에 대해, 보다 상세하게는 이하와 같다.
[실시예 1: 2-[2-[N,N-비스(2-트리플루오로아세트아미드에틸)]-아미노에틸]카르바모일-(E)-비닐)-2'-데옥시우리딘(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine, 화합물 102)의 합성]
출발 원료의 (E)-5-(2-카르복시비닐)-2'-데옥시우리딘((E)-5-(2-carboxyvinyl)-2'-deoxyuridine, 화합물 101)은 문헌 [Tetrahedron 1987, 43, 20, 4601-4607]에 따라 합성했다. 즉, 우선, 430 mg의 초산팔라듐(II)(FW 224.51)과 1.05 g의 트리페닐포스핀(FW 262.29)에 71 mL의 1,4-디옥산을 첨가하고, 또한 7.1 mL의 트리에틸아민(FW 101.19, d= 0.726)을 첨가하여, 70℃로 가열 교반했다. 반응 용액이 적갈색으로부터 흑갈색으로 변화되면 14.2 g의 2'-데옥시-5-요오드우리딘(FW 354.10)과 7.0 mL의 아크릴산메틸(FW 86.09, d= 0.956)을 1,4-디옥산에 현탁시킨 것을 첨가하여, 125℃로 1시간 가열 환류시켰다. 그 후, 뜨거울 동안에 여과하여, 메탄올로 잔류물을 세정하고, 여과액을 회수했다. 그 여과액으로부터 용매를 감압 증류제거한 후, 실리카겔 컬럼으로 생성물을 정제했다(5-10％ 메탄올/디클로로메탄). 모은 분획의 용매를 감압 증류제거하여, 남은 백색 고체를 감압 하에 건조했다. 그 건조 고체에 약 100 mL의 초순수를 첨가하고, 3.21 g의 수산화나트륨(FW 40.00)을 첨가하여, 25℃로 철야 교반했다. 그 후, 진한 염산을 첨가하여 용액을 산성으로 하여, 생성된 침전을 여과, 초순수로 세정하고, 감압 하에서 건조했다. 이에 따라, 목적 화합물(화합물 101) 8.10 g(수율 68％)을 백색 분말로서 얻었 다. 또한, 상기 백색 분말이 목적 화합물 101인 것은, 1HNMR 측정값이 문헌값과 일치하는 것으로써 확인했다. 또한, 13CNMR 측정값을 이하에 기재한다.
(E)-5-(2-카르복시비닐)-2'-데옥시우리딘(화합물 101):
13CNMR(DMSO-d6): δ168.1, 161.8, 149.3, 143.5, 137.5, 117.8, 108.4, 87.6, 84.8, 69.7, 60.8, 40.1.
다음으로, 1.20 g의 (E)-5-(2-카르복시비닐)-2'-데옥시우리딘 101(분자량 298.25)과 925 mg의 N-히드록시숙신이미드(분자량 115.09)와 1.54 g의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(분자량 191.70)를 교반자가 들어간 가지 플라스크에 넣고, 20 mL의 DMF를 첨가하여, 25℃로 16시간 교반했다. 약 1 mL의 초산을 첨가하고, 300 mL의 염화메틸렌과 100 mL의 초순수를 첨가하여, 심하게 교반했다. 물층을 제외하고, 100 mL의 초순수를 더 첨가하여, 동일하게 2회 세정했다. 생성된 침전물을 여과하여, 염화메틸렌으로 세정하고, 감압 하에서 건조했다. 여과액으로부터 용매를 증류제거하고, 생성된 침전에 염화메틸렌을 첨가하여, 침전을 상기와 같이 회수했다. 회수한 침전을 전부 모아, 그것을 80 mL의 아세토니트릴에 현탁시켜, 심하게 교반했다. 거기에 3.0 mL의 트리스(2-아미노에틸)아민(분자량 146.23, d= 0976)을 단숨에 첨가하여, 25℃로 10분간 더 교반했다. 그 후, 4.8 mL의 트리플루오로초산에틸(분자량 142.08, d= 1.194)을 첨가하고, 5.6mL의 트리에틸아민(분자량 101.19, d= 0.726)을 더 첨가하여, 25℃로 3시간 교반했다. 용매를 증 류제거하여, 실리카겔 컬럼으로 정제했다(5-10％ MeOH/CH2Cl2). 용매를 증류제거하여, 소량의 아세톤에 용해시켜, 에테르를 첨가했더니 백색 침전이 생겼다. 여과, 에테르로 세정 후, 감압 하에 건조하고, 884 mg(33.5％)의 목적 물질(화합물 102)을 얻었다.
또한, 원료, 용매 등의 사용량, 반응 시간 및 공정을 약간 변화시키는 외에는 상기와 동일하게 합성한 바, 수율을 37％까지 향상시킬 수 있었다. 즉, 597 mg(2.0 mmol)의 (E)-5-(2-카르복시비닐)-2'-데옥시우리딘 101(분자량 298.25)과 460 mg(4.0 mmol)의 N-히드록시숙신이미드(분자량 115.09)와 (767 mg, 4.0 mmol)의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드히드로 염화물(분자량 191.70)을 교반자가 들어 간 가지 플라스크에 넣고, 5.0 mL의 DMF를 첨가하여, 25℃로 3시간 교반했다. 약 0.5 mL의 초산을 첨가하고, 100 mL의 염화메틸렌과 100 mL의 초순수를 첨가하여, 심하게 교반했다. 생성된 침전을 여과하여, 물로 세정하고, 감압 하에 철야 건조시켰다. 얻어진 백색의 잔류물을 50 mL의 아세토니트릴에 현탁시켜, 심하게 교반했다. 여기에 3.0 mL(20 mmol)의 트리스(2-아미노에틸)아민(분자량 146.23, d= 0.976)을 일시에 첨가하여, 25℃로 10분간 더 교반했다. 그 후, 4.8 mL의 트리플루오로초산에틸(분자량 142.08, d= 1.194)을 첨가하고, 또한 5.6 mL(40 mmol)의 트리에틸아민(분자량 101.19, d= 0.726)을 첨가하여, 25℃로 16시간 교반했다. 용매를 증류제거하여, 실리카겔 컬럼으로 정제했다(5-10％ MeOH/CH2Cl2). 용매를 증류제거하여, 소량의 아세톤에 용해시켜, 에테르를 첨가했더니 백색 침전이 생겼다. 여과, 에테르로 세정 후, 감압 하에 건조하여, 453 mg(37％)의 목적 물질(화합물 102)을 백색 분말로서 얻었다. 이하에, 화합물 102의 기기 분석값을 나타낸다. 또한, 도 2에 1HNMR 스펙트럼을 나타낸다.
2-[2-[N,N-비스(2-트리플루오로아세트아미드에틸)]-아미노에틸]카르바모일-(E)-비닐)-2'-데옥시우리딘(화합물 102):
1HNMR(CD3OD):δ8.35(s, 1H), 7.22(d, J= 15.6 Hz, 1H), 7.04(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.26(t, J= 6.6 Hz, 1H), 4.44-4.41(m, 1H), 3.96-3.94(m, 1H), 3.84(dd, J= 12.2, 2.9 Hz, 1H), 3.76(dd, J= 12.2, 3.4 Hz, 1H), 3.37-3.30(m, 6H), 2.72-2.66(m, 6H), 2.38-2.23(m, 2H). 13CNMR(CD3OD):δ169.3, 163.7, 159.1(q, J= 36.4 Hz), 151.2, 143.8, 134.3, 122.0, 117.5(q, J= 286Hz), 110.9, 89.1, 87.0, 71.9, 62.5, 54.4, 53.9, 41.7, 38.9, 38.7. HRMS(ESI) calcd for C22H29F6N6O8([M+ H]+) 619.1951, found 619.1943.
[실시예 2: 5'-O-디메톡시트리틸-(2-[2-[N,N-비스(2-트리플루오로아세타미드에틸)]-아미노에틸]카르바모일-(E)-비닐)-2'-데옥시우리딘(5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine, 화합물 103)의 합성]
화합물 102의 5'-수산기를 DMTr기로 보호하여, 화합물 103을 얻었다. 즉, 우 선, 618 mg의 화합물 102(분자량 618.48)과 373 mg의 4,4'-디메톡시트리틸염화물(분자량 338.83)을 교반자가 들어간 가지 플라스크에 넣고, 10 mL의 피리딘을 첨가하여, 25℃로 16시간 교반했다. 소량의 물을 첨가하여, 용매를 증류제거하고, 실리카겔 컬럼으로 정제했다(2-4％ MeOH, 1％ Et3N/CH2Cl2). 목적 화합물 103을 포함하는 분획의 용매를 증류제거하고, 735.2 mg(79.8％)의 목적 물질(화합물 103)을 얻었다. 이하에, 화합물 103의 기기 분석값을 나타낸다. 또한, 도 3에, 1HNMR 스펙트럼을 나타낸다.
5'-O-(디메톡시트리틸)-(2-[2-[N,N-비스(2-트리플루오로아세타미드에틸)]-아미노에틸]카르바모일-(E)-비닐)-2'-데옥시우리딘(화합물 103):
1HNMR(CD3OD): δ7.91(s, 1H), 7.39-7.11(m, 9H), 7.02(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.93(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.80-6.78(m, 4H), 6.17(t, J= 6.6 Hz, 1H), 4.38-4.35(m, 1H), 4.06-4.04(m, 1H), 3.68(s, 6H), 3.32-3.22(m, 8H), 2.66-2.55(m, 6H), 2.40(ddd, J= 13.7, 5.9, 2.9 Hz, 1H), 2.33-2.26(m, 1H). 13CNMR(CD3OD): δ168.9, 163.7, 160.1, 159.1(q, J= 36.9 Hz), 151.0, 146.1, 143.0, 137.0, 136.9, 134.1, 131.24, 131.16, 129.2, 128.9, 128.0, 122.5, 117.5(q, J= 286.7 Hz), 114.2, 110.9, 88.1, 87.9, 87.6, 72.6, 65.0, 55.7, 54.2, 53.9, 41.7, 38.9, 38.6. HRMS(ESI) calcd for C43H47F6N6O10([M+ H]+) 921.3258, found 921.3265.
[실시예 3: 5'-O-(디메톡시트리틸)-(2-[2-[N,N-비스(2-트리플루오로아세타미드에틸)]-아미노에틸]카르바모일-(E)-비닐)-2'-데옥시우리딘3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포로아미다이트(5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine, 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, 화합물 104)의 합성]
188 mg(0.20 mmol)의 화합물 103(분자량 920.85)을 CH3CN과 공비시켜, 28.6 mg(0.40 mmol)의 1H-테트라졸(분자량 70.05)을 첨가하고, 진공 펌프로 밤새 흡인 건조했다. 이 건조물에 5.1 mL의 CH3CN을 첨가하여 시약을 용해 후, 교반하고, 194 ㎕(0.60 mmol)의 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로아미다이트(분자량 301.41, d= 0.949)를 단숨에 첨가하여 25℃로 2시간 교반했다. 50 mL의 초산에틸과 50 mL의 포화 중조수를 혼합한 것을 첨가하고, 분액하여, 유기층을 포화식염수로 세정 후, 황산마그네슘으로 건조했다. 황산마그네슘을 여과에 의해 제거한 후, 용매를 증류제거했다. 이 분액에 의한 조생성물을 CH3CN 공비 후, 수율 100％로 생성물(화합물 104)을 얻었다고 가정하여 0.1 M의 CH3CN 용액으로 해서, DNA 합성에 사용했다. 또한, 화합물 104를 얻을 수 있는 것은, 상기 조생성물의 31PNMR(CDCl3)과 HRMS(ESI)에서 확인했다. 이들의 값을 이하에 나타낸다.
화합물 104:
31PNMR(CDCl3) δ149.686, 149.430; HRMS(ESI) calcd for C52H64F6N8O11P([M+ H]+) 1121.4336, found 1121.4342.
[실시예 4: DNA 올리고머 합성]
Figure 112009057492774-pct00035
반응식 2
화합물 104를 이용한 DNA 자동 합성기에 의한 올리고 DNA 합성은 1μ㏖ 스케일로 통상의 포스포로아미다이트법(DMTr OFF)에 의해 행하고, 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(13량체, X의 구조는 화학식 105와 같음)라는 서열(서열 번호 1)의 DNA 올리고머를 합성했다. 탈보호는, 농암모니아수(28 질량％)에 의해, 55℃로 16시간 행했다. 스피드백으로 암모니아를 휘발시키고, 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨 후, 추출한 DNA 올리고머를 역상 HPLC에 의해 분석하고, 약 10.5분에 나타난 피크를 정제했다[CHEMCOBOND 5-ODS-H(상품명)10×150 mm, 3 mL/min, 5-30％ CH3CN/50 mM TEAA 완충액 pH 7(20분), 260 nm에서 검출]. 정제한 생성물은 MALDI TOF 매스의 네가티브 모드에 의해 분자량을 측정하고, 상기 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'라는 서열(13량체, X의 구조는 화학식 105와 같음)에서 예상되는 분자량(C134H176N52O76P12에 기초하 는 계산값 4102.8)을 갖는 것이 확인되었다([M-H]_의 실측치 4101.9, 계산값 4101.8). 도 4에, MALDI TOF 매스의 스펙트럼을 나타낸다.
또한, 농암모니아수에 의한 탈보호를 55℃에서 4시간 행한 후 또한 25℃에서 16시간 행하는 것과, 역상 HPLC에서 TEAA(트리에틸아민아세테이트) 완충액(pH 7)의 농도를 0.1 M로 하는 것과, 역상 HPLC에서의 전개 시간을 30분 이상으로 하는 것 외에는 상기와 동일하게 하여 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(13량체, X의 구조는 화학식 105와 같음)를 합성할 수 있었다. 또한, 동일한 방법으로, 표 1에 나타내는 각 ODN의 원료가 되는 DNA(화학식 105로 표시되는 뉴클레오티드를 포함함)를 합성할 수 있었다.
합성한 각 DNA의 농도를 결정하기 위해, 정제한 각 DNA를, 소장 알칼리 포스파타아제(50 U/mL), 뱀독액 포스포디에스테라아제(0.15 U/mL) 및 P1 뉴클레아제(50 U/mL)에 의해, 25℃로 16시간 걸려 완전 소화(消化)했다. 얻어진 소화액을, CHEMCOBOND 5-ODS-H(상품명) 컬럼(4.6×150 mm)의 HPLC로 해석했다. 그 때, 전개액으로서는 0.1 M TEAA(pH 7.0)를 이용하고, 유속은 1.0 mL/min으로 했다. 상기 합성한 DNA의 농도는 dA, dC, dG 및 dT을 각각 0.1 mM 농도로 포함하는 표준 용액의 피크 면적과 비교하여 결정했다. 또한, 상기 합성한 DNA는 MALDI TOF 매스 스펙트럼에 의해서도 확인했다. 이하에, 그 질량 분석값을 나타낸다. 또한, [105]는 그 위치에, 화학식 105로 표시되는 뉴클레오티드가 삽입되어 있는 것을 나타낸다.
CGCAAT[105]TAACGC, calcd for C134H177N52O76P12([M+H]+) 4103.8, found 4107.0;
TTTTTT[105]TTTTTT, calcd for C138H187N30O90P12([M+H]+) 4077.8, found 4076.9;
TGAAGGGCTT[105]TGAACTCTG, calcd for C205H265N77O122P19([M+H]+) 6348.2, found 6348.7;
GCCTCCT[105]CAGCAAATCC[105]ACCGGCGTG, calcd for C285H376N108O169P27([M+H]+) 8855.0, found 8854.8;
CCTCCCAAG[105]GCTGGGAT[105]AAAGGCGTG, calcd for C289H376N116O168P27([M+H]+) 8999.1, found 9002.2.
[실시예 5: 2개의 아미노기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 올리고머의 비오틴 수식]
Figure 112009057492774-pct00036
반응식 3
합성한 DNA 올리고머5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(화합물 105, X로서 상기 화합물 105를 사용)와 비오틴의 N-히드록시숙신이미딜에스테르를 반응시킴으로써 2개의 아미노기를 2개의 비오틴으로 라벨화했다(상기 반응식 3). 즉, 우선, 30 ㎕의 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(화합물 105, 스트랜드 농도 320 ㎛)와 10 ㎕의 Na2CO3/NaHCO3 완충액(1 M, pH 9.0)과 60 ㎕의 H2O를 혼합하고, 비오틴의 N-히드록시숙신이미딜에스테르 DMF 용액(20 mM) 100 ㎕를 첨가하여, 잘 혼합했다. 25℃로 16시간 정치한 후, 800 ㎕의 H2O를 첨가하고, 0.45 ㎛의 필터에 통과시켜, 역상 HPLC에서 약 14분에 나타난 피크를 정제했다[CHEMCOBOND 5-ODS-H 10×150 mm, 3 mL/min, 5-30％ CH3CN/50 mM TEAA 완충액(20분), 260 nm에서 검출]. 이 HPLC 정제에 의해 얻어진 생성물을 MALDI TOF 매스의 네가티브 모드에 의해 측정한 바, 4554.3에 피크가 보였다. 이 피크값은, 2개의 아미노기에 2개의 비오틴 분자가 반응한 목적 생성물 106의 분자량 4555.4(C154H204N56O80P12S2에 의한 계산값)로부터 구한 [M-H]-의 계산값 4554.4와 일치했다. 도 5에 MALDI TOF 매스의 스펙트럼을 나타낸다.
이 화합물 106(단일쇄 상태)을 이용하여 이중쇄 DNA 및 RNA를 합성하고, 단일쇄 상태와 이중쇄 상태의 형광 강도를 비교했다. 그 결과, 단일쇄 상태에서는 DNA 형광 프로브(화합물 106)의 형광 발광은 억제되고, 상보적인 핵산과 이중 나선을 형성했을 때에 강하게 형광 발광하는 것이 확인되었다.
이하의 실시예 6∼13에서는, 하기 화학식의 b 및 c에서 나타낸 카르복시메틸렌 링커를 갖는 티아졸오렌지 유도체를 합성하고, 이들을 N-히드록시숙신에스테르로서 활성화하여, 활성인 아미노기를 갖는 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드)와 반 응시킴으로써, 형광성을 갖는 여러 가지의 올리고뉴클레오티드(형광 DNA 프로브)를 조제했다. 즉, 색소로부터 전개된 메틸렌 링커의 길이와, 티미딘의 5위치로부터 전개된 아미노기를 포함하는 링커를 여러 가지로 바꾼 다양한 올리고뉴클레오티드(형광 DNA 프로브)를 제조했다. 그 결과, 어떠한 다양한 형광 DNA 프로브에 있어서도, 단일쇄 상태의 DNA 형광 프로브의 형광 발광을 억제하고, 상보적인 핵산과 이중 나선을 형성했을 때에 강하게 형광 발광시키는 것이 가능했다. 또한, 하기 화학식 b 및 c중, n은 링커 길이(가교 원자수)를 표시한다.
Figure 112009057492774-pct00037
[실시예 6: 티아졸오렌지로부터 유도되는 구조를 1분자 중에 2개소 갖는 화합물의 합성]
Figure 112009057492774-pct00038
반응식 4
상기 반응식 4와 같이, 티아졸오렌지로부터 유도되는 구조를 1분자 중에 2개소 갖는 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110를 합성했다. 보다 상세하게는, 이하와 같다.
티아졸오렌지 유도체 107의 합성은 Organic Letters 2000, 6, 517-519를 참고하여 하기 반응식 5와 같이 행했다.
Figure 112009057492774-pct00039
반응식 5
(1) N-메틸퀴놀리늄 요오다이드(화합물 111)의 합성
우선, N-메틸퀴놀리늄요오다이드(화합물 111)를 상기 문헌의 기재에 따라 합성했다. 구체적으로는, 무수디옥산 42 mL 중에, 퀴놀린 2.4 mL와 요오드화메틸 4 mL를 첨가하여, 150℃로 1시간 교반한 후, 여과에 의해 침전물을 모아, 에테르 및 석유에테르로 세정, 건조하여, N-메틸퀴놀리늄요오다이드(화합물 111)를 얻었다.
(2) 3-(4-카르복시부틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드(화합물 112)의 합성
8 mL의 2-메틸벤조티아졸(FW149.21, d= 1.173)과 9.4 g의 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)(FW181.03)을 110℃에서 16시간 교반했다. 조생성물을 실온에서 냉각하고, 생성된 고체를 메탄올 20 mL에 현탁시켜, 에테르 40 mL를 더 첨가했다. 생성된 침전을 여과하여, 디옥산으로 2-메틸벤조티아졸의 냄새가 없어질 때까지 세정하고, 에테르로 더 세정하고, 감압 하에 건조하여 9.8 g의 백색 분말을 얻었다. 이 백색 분말의 1HNMR를 측정한 바, 2위치가 알킬화된 목적물 3-(4-카르복시부틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드(화합물 112)와, 2위치가 알킬화되어 있지 않은 3-(4-카르복시부틸)-벤조티아졸륨브로미드의 혼합물이었다. 프로톤의 피크비는 알킬화되어 있지 않은 것:알킬화된 것= 10:3이었다. 이 조생성물을, 그대로 다음 반응에 이용했다.
(3) 1-메틸-4-[{3-(4-카르복시부틸)-2(3H)-벤조티아졸리덴}메틸]퀴놀리늄 브로미드(화합물 107)의 합성
상기 (2)에서 얻어진, 3-(4-카르복시부틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드(화합물 112)을 포함하는 조생성물 2.18g과, 700 mg의 N-메틸퀴놀리늄요오다이드(화합물 111)(FW 271.10)를, 3.6 mL의 트리에틸아민(FW 101.19, d= 0.726) 존재 하, 10 mL의 염화메틸렌 중에서, 25℃로 2시간 교반했다. 그 후, 에테르 50 mL를 첨가하여, 생성된 침전을 여과하고, 에테르로 세정하여, 감압 하에 건조했다. 그 침전을 초순수 50 mL에 현탁시켜, 여과하고, 초순수로 세정하여, 감압 하에 건조했다. 또한 상기 침전을 아세토니트릴 50 mL에 현탁시켜, 여과하고, 아세토니트릴로 세정하여, 감압 하에 건조시켜서 307.5 mg의 적색 분말을 얻었다(수율 25.3％). 이 적색 분말이 목적물(화합물 107)인 것은 1HNMR 스펙트럼을 문헌값과 대비하여 확인했다.
또한, 3-(4-카르복시부틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드(화합물 112) 및 1-메틸-4-[{3-(4-카르복시부틸)-2(3H)-벤조티아졸리덴}메틸]퀴놀리늄브로미드(화합물 107)은, 이하와 같이 하더라도 합성할 수 있었다. 즉, 우선, 11.7 mL(92 mmol)의 2-메틸벤조티아졸(FW 149.21, d= 1.173)과 13.7 g(76 mmol)의 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)(FW 181.03)을 150℃에서 1시간 교반했다. 조생성물을 실온으로 냉각하여, 생성된 고체를 메탄올 50 mL에 현탁시키고, 또한 에테르 200 mL를 첨가했다. 생성된 침전을 여과하여, 에테르로 세정하고, 감압 하에 건조하여 19.2 g의 담자색 분말을 얻었다. 이 분말은, 목적 화합물 112(3-(4-카르복시부틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드)와 2-메틸벤조티아졸륨브로미드의 혼합물이었다. 이 혼합물을 1HNMR(in DMSO-d6) 측정하여, 8.5 ppm의 피크(목적화합물 112 유래)와, 8.0 ppm의 피크(2-메틸벤조티아졸륨브로미드 유래)와의 피크 면적비로부터, 목적 화합물 112의 수량을 9.82 g(14 mmol, 32％)으로 산출했다. 이 혼합물(조생성물)은 정제하지 않고서 다음 반응에 사용했다. 또한, 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)을 4-브로모부티르산(4-브로모부탄산)으로 바꾸는 외에는 동일한 방법으로 링커(카르복실기에 연결한 폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=3의 3-(4-카르복시프로필)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드을 합성한 바, 수율 4％로 얻어졌다. 또한, 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)을 6-브로모헥산산으로 바꾸는 외에는 동일한 방법으로 링커(카르복실기에 연결한 폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=5의 3-(4-카르복시펜틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드을 합성한 바, 수율 35％로 얻어졌다. 또한, 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)을 7-브로모헵탄산으로 바꾸는 외에는 동일한 방법으로 링커(카르복실기에 연결한 폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=6의 3-(4-카르복시프로필)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드을 합성한 바, 수율 22％로 얻어졌다.
다음으로, 화합물 112(3-(4-카르복시부틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드)와 2-메틸벤조티아졸륨브로미드을 포함하는 상기 혼합물(조생성물) 3.24 g에, 1.36g(5.0 mmol)의 N-메틸퀴놀리늄요오다이드(화합물 111)(FW 271.10), 7.0 mL(50 mmol)의 트리에틸아민(FW 101.19, d= 0.726) 및 100 mL의 염화메틸렌을 첨가하여, 투명한 용액을 얻었다. 이 용액을, 25℃로 16시간 교반했다. 그 후, 용매를 감압 증류제거했다. 잔류물에 아세톤(200 mL)을 첨가하여, 얻어진 침전을 여과하고, 아세톤으로 세정했다. 그렇게 하여 얻어진 잔류물을 감압 건조하고, 건조 후의 적색 잔류물을 증류수(50 mL)로 세정했다. 이것을 또한 여과하여, 증류수로 세정하고, 감압하에 건조시켜, 목적물(화합물 107)을 적색 분말로서 얻었다(654 mg, 1.39 mmol, 28％). 이 적색 분말이 목적물(화합물 107)인 것은, 1HNMR 스펙트럼을 문헌값과 대비하여 확인했다. 이하에, 1HNMR 및 13CNMR(DMSO-d6)의 피크값과, HRMS(ESI)의 측정값을 나타낸다. 또한, 도 6에 화합물 107의 1HNMR 스펙트럼(DMSO-d6)을 나타낸다.
화합물 107: 1HNMR(DMSO-d6): δ8.74(d, J= 8.3 Hz, 1H), 8.51(d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.94-7.89(m, 3H), 7.74-7.70(m, 1H), 7.65(d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.55-7.51(m, 1H), 7.36-7.32(m, 1H), 7.21(d, J= 7.3 Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 4.47(t, J= 7.1 Hz, 2H), 4.07(s, 3H), 2.22(t, J= 6.6 Hz, 1H), 1.77-1.63(m, 4H); 13CNMR(DMSO-d6, 60℃) δ174.6, 158.8, 148.4, 144.5, 139.5, 137.6, 132.7, 127.9, 126.8, 125.5, 124.1, 123.7, 123.6, 122.4, 117.5, 112.6, 107.6, 87.4, 45.6, 42.0, 35.5, 26.2, 22.3; HRMS(ESI) calcd for C23H23N2O2S([M. Br]+) 391.1480, found 391.1475.
또한, 링커(카르복실기에 연결한 폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=3의 4-((3-(3-카르복시프로필)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드를, 상기 3-(4-카르복시프로필)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드과 2-메틸벤조티아졸륨브로미드의 혼합물로부터 상기 화합물 107과 동일한 방법으로 합성한 바, 수율 43％로 얻어졌다. 이하에, 기기 분석값을 나타낸다.
4-((3-(3-카르복시프로필)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드:
1HNMR(DMSO-d6) δ8.85(d, J= 8.3 Hz, 1H), 8.59(d, J= 7.3 Hz, 1H), 8.02.7.93(m, 3H), 7.78.7.70(m, 2H), 7.61.7.57(m, 1H), 7.42.7.38(m, 1H), 7.31(d, J= 6.8 Hz, 1H), 7.04(s, 1H), 4.47(t, J= 8.1 Hz, 2H), 4.13(s, 3H), 2.52.2.48(m, 2H), 1.99.1.92(m, 2H); 13CNMR(DMSO-d6, 60℃) δ174.3, 158.9, 148.6, 144.5, 139.5, 137.7, 132.7, 127.9, 126.7, 125.6, 124.1, 124.0, 123.7, 122.5, 117.5, 112.5, 107.6, 87.7, 45.6, 42.0, 31.6, 22.4; HRMS(ESI) calcd for C22H21N2O2S([M. Br]+)377.1324, found 377.1316.
또한, 링커(카르복실기에 연결한 폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=5의 4-((3-(3-카 르복시펜틸)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드를, 상기 3-(4-카르복시펜틸)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드과 2-메틸벤조티아졸륨브로미드의 혼합물로부터 상기 화합물 107과 동일한 방법으로 합성한 바, 수율 26％로 얻어졌다. 이하에, 기기 분석값을 나타낸다.
4-((3-(3-카르복시펜틸)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드:
1HNMR(DMSO-d6) δ8.70(d, J= 8.3 Hz, 1H), 8.61(d, J= 6.8 Hz, 1H), 8.05.8.00(m, 3H), 7.80.7.73(m, 2H), 7.60.7.56(m, 1H), 7.41.7.35(m, 2H), 6.89(s, 1H), 4.59(t, J= 7.3 Hz, 2H), 4.16(s, 3H), 2.19(t, J= 7.3 Hz, 1H), 1.82.1.75(m, 2H), 1.62.1.43(m, 4H); 13CNMR(DMSO-d6, 60℃) δ174.5, 159.0, 148.6, 144.7, 139.7, 137.8, 132.9, 127.9, 126.9, 125.2, 124.2, 123.8, 123.6, 122.6, 117.8, 112.6, 107.7, 87.4, 45.6, 42.1, 36.0, 26.3, 25.9, 24.9; HRMS(ESI) calcd for C24H25N2O2S([M. Br]+) 405.1637, found 405.1632.
또한, 링커(카르복실기에 연결한 폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=6의 4-((3-(3-카르복시헥실)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드를, 상기 3-(4-카르복시헥실)-2-메틸벤조티아졸륨브로미드과 2-메틸벤조티아졸륨브로미드의 혼합물로부터 상기 화합물 107과 동일한 방법으로 합성한 바, 수율 22％로 얻어졌다. 이하에, 기기 분석값을 나타낸다.
4-((3-(3-카르복시헥실)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드:
1HNMR(DMSO-d6) δ8.72(d, J= 8.3 Hz, 1H), 8.62(d, J= 6.8 Hz, 1H), 8.07.8.01(m, 3H), 7.81.7.75(m, 2H), 7.62.7.58(m, 1H), 7.42.7.38(m, 2H), 6.92(s, 1H), 4.61(t, J= 7.3 Hz, 2H), 4.17(s, 3H), 2.18(t, J= 7.3 Hz, 1H), 1.82.1.75(m, 2H), 1.51.1.32(m, 6H); 13CNMR(DMSO-d6, 60℃) δ174.0, 159.1, 148.6, 144.7, 139.8, 137.8, 132.9, 127.9, 126.8, 125.0, 124.2, 123.8, 123.6, 122.6, 118.0, 112.7, 107.8, 87.4, 45.5, 42.1, 33.4, 27.9, 26.4, 25.5, 24.1; HRMS(ESI) calcd for C25H27N2O2S([M. Br]+) 419.1793, found 419.1788.
(4) N-히드록시숙신이미딜에스테르 109의 합성
9.4 mg(20μ㏖)의 1-메틸-4-[{3-(4-카르복시부틸)-2(3H)-벤조티아졸리덴}메틸]퀴놀리늄브로미드(화합물 107)(FW 471.41), 4.6 mg(40 μ㏖)의 N-히드록시숙신이미드(화합물 108)(FW 115.09) 및 7.6 mg(40 μ㏖)의 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염)(FW 191.70)을, 1 mL의 DMF 중에서 25℃로 16시간 교반하여, 색소(화합물 107)의 카르복시기가 활성화된 N-히드록시숙신이미딜에스테르(화합물 109)를 얻었다. 이 반응 생성물은, 정제하지 않고, 반응 용액(색소 20 mM)을 그대로 올리고머 DNA(올리고뉴클레오티드) 105와의 반응에 사용했다.
또한, 원료로서, 화합물 107 대신에 링커(폴리메틸렌쇄)의 탄소수를 변화시 킨 화합물을 이용하는 외에는 상기 화합물 109과 동일한 방법으로, 링커(폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=3의 4-((3-(4-(숙신이미딜옥시)-4-옥소부틸)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드를 합성했다. 또한, 동일하게, 링커(폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=5의 4-((3-(4-(숙신이미딜옥시)-4-옥소헥실)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드와, 링커(폴리메틸렌쇄)의 탄소수 n=6의 4-((3-(4-(숙신이미딜옥시)-4-옥소헵틸)벤조[d]티아졸-2(3H)-일리딘)메틸)-1-메틸퀴놀리늄브로미드를 합성했다.
(5) 2분자의 티아졸오렌지로 수식된 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110의 합성
두개의 활성 아미노기를 갖는 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 105는 상기 실시예 4와 동일하게, DNA 자동 합성기에 의해 통상의 방법으로 합성했다. 화합물 105의 서열은, 실시예 4와 동일하게 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(X는, 상기 화합물 105)를 이용했다. 다음으로, 이 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 105를, N-히드록시숙신이미딜에스테르(화합물 109)와 반응시켜, 티아졸오렌지로부터 유도되는 구조를 1분자 중에 2개소 갖는 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110를 합성했다. 즉, 우선, 30 ㎕의 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(화합물 105, 스트랜드 농도 320 ㎛)와 10 ㎕의 Na2CO3/NaHCO3 완충액(1 M, pH 9.0)과 60 ㎕의 H2O를 혼합하고, N-히드록시숙신이미딜에스테르(화합물 109)의 DMF 용액(20 mM) 100 ㎕를 첨가하여, 잘 혼합했다. 25℃로 16시간 정치한 후, 800 ㎕의 H2O를 첨가하고, 0.45 ㎛의 필터에 통과시켜, 역상 HPLC에서 약 14.5분에 나타난 피크를 정제했다[CHEMCOBOND 5-ODS-H 10× 150 mm, 3 mL/min, 5-30％ CH3CN/50 mM TEAA 완충액(20분), 260 nm에서 검출]. 도 7에, 역상 HPLC의 그래프를 나타낸다. 화살표의 피크에서 표시되는 분획을 분취·정제했다. 이 HPLC 정제에 의해 얻어진 생성물을 MALDI TOF 매스의 네가티브 모드에 의해 측정한 바, 4848.8에 피크가 보여, DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110인 것이 확인되었다. 도 8에, DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110의 MALDI TOF MASS 스펙트럼을 나타낸다. 도 8 중, 화살표는, 상기 정제한 생성물 유래의 매스 피크(4848.8)이다. 이 피크값은 정전하를 2개 갖는 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110의 분자 M(C180H220N56O78P12S2)로부터 3개의 프로톤이 빠진 [M2+-3H+]_의 계산값 4848.8과 일치했다. 또한, 좌우의 피크는 표준 물질로서 첨가한 DNA의 T8량체와 T18량체 유래의 피크이다.
[실시예 7: DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110의, 형광 프로브로서의 사용]
실시예 6에 정제한 DNA 올리고머(올리고뉴클레오티드) 110(색소가 2분자 붙은 DNA)을 탈염하고, 동결 건조한 후, 수용액으로 하여, UV 흡수에 의해 농도를 결정했다(X는, T와 근사). 그 후, 스트랜드 농도 2.5 ㎛, 인산 완충액 50 mM(pH 7.0), 그리고 NaCl 100 mM의 조건으로, 형광 프로브(DNA 올리고머 110)가 단일쇄 상태일 때, DNA-DNA 이중 나선일 때, 그리고 DNA-RNA 이중 나선일 때의 각각에 대해 UV 측정을 행했다. 도 9에, 이들 3개의 샘플의 스펙트럼을 나타낸다. 도 9 중, 점선은 형광 프로브 단일쇄 상태의 스펙트럼을 나타내고, 굵은 선은 DNA-DNA 이중 나선의 스펙트럼을 나타내며, 세선은 DNA-RNA 이중 나선의 스펙트럼을 나타낸다. 도시한 바와 같이, 이중 나선을 형성함으로써 500 nm 부근의 UV 흡수의 극대 파장이 이동했다. 또, 도 9 및 다른 모든 UV 흡수 스펙트럼도에 있어서, 횡축은 파장(nm)을 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.
다음으로, 동일하게 스트랜드 농도 2.5 ㎛, 인산 완충액 50 mM(pH 7.0), 그리고 NaCl 100mM의 조건으로, 488 nm의 여기광(대역폭 1.5 nm)에 의해 여기한 후에 형광 측정을 행했다. 도 10에, 형광 프로브(형광 DNA 올리고머)가 단일쇄 상태일 때(점선), DNA-DNA 이중 나선일 때(굵은 선), 그리고 DNA-RNA 이중 나선(세선)의 3개의 샘플의 스펙트럼을 각각 나타낸다. 도시한 바와 같이, 단일쇄 상태의 형광 프로브의 530 nm의 형광 강도와 비교하면, DNA-DNA에서는 15배, DNA-RNA에서는 22배의 형광 강도의 증가가 보였다. 또, 도 10 및 다른 모든 형광 발광 스펙트럼도, 및 여기 스펙트럼도에 있어서, 횡축은 파장(nm)을 나타내고, 종축은 발광 강도를 나타낸다.
또한, 488 nm의 여기광 대신에 510 nm의 여기광을 이용하더라도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 도 11에, 그 스펙트럼을 나타낸다.
[실시예 8: 링커의 길이를 여러 가지로 변화시킨 화합물의 합성 및 형광 프로브로서의 사용]
하기 화학식 113으로 표시되는 화합물(DNA 올리고머)을, 링커 길이(n)를 여러 가지로 변화시켜 합성했다. 합성은 원료의 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산) 을, 링커 길이에 맞춰 탄소수(쇄길이)를 바꾼 화합물로 하는 외에는 상기 실시예 1∼4 및 6과 동일하게 행했다. 본 실시예에서는 하기 화학식 113의 화합물의 서열은 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(X는, 색소 도입 부분)로 했다. 또한 각각을 실시예 7과 동일하게 형광 프로브로서 사용하여, 형광 측정에 의해 성능을 평가했다. 그 결과, 이하에 나타내는 링커의 길이 범위 내이면, 프로브 단일쇄에 비해 약 10배 가까이 또는 그 이상의 형광 증대가, 표적 핵산과의 하이브리드화에 의해 얻어지는 것이 확인되었다. 또한, 프로브와 표적 핵산에 의해 얻어지는 이중쇄는, 천연 서열의 이중쇄보다 높은 열적 안정성을 나타냈다.
Figure 112009057492774-pct00040
[표 1]
UV의
λmax(nm) 및 형광 계수		 형광의
λmax(nm)		 양자
수율
φF 		이중쇄/
단일쇄
형광
강도비
Ids/Iss 		Tm(℃)
n=3 프로브 단일쇄 480(117000)
510(93800)		 537 0.0193 - 없음
프로브-DNA 이중쇄 505(145000) 529 0.137 7.1 66
프로브-RNA 이중쇄 506(139000) 529 0.161 8.3 54
n=4 프로브 단일쇄 479(156000)
509(104000)		 537 0.0105 - 없음
프로브-DNA 이중쇄 509(179000) 529 0.110 10.5 65
프로브-RNA 이중쇄 509(171000) 529 0.116 11.0 52
n=5 프로브 단일쇄 480(139000)
510(107000)		 538 0.0131 - 없음
프로브-DNA 이중쇄 508(172000) 529 0.123 9.4 67
프로브-RNA 이중쇄 508(162000) 529 0.126 9.6 51
n=6 프로브 단일쇄 479(139000)
509(93300)		 536 0.0122 - 없음
프로브-DNA 이중쇄 509(164000) 528 0.122 10.0 65
프로브-RNA 이중쇄 511(162000) 530 0.129 10.6 52
5'-d(CGCAATTTAACGC)-3'/5'-d(GCGTTAAATTGCG)-3' Tm(℃) 58
5'-d(CGCAATTTAACGC)-3'/5'-r(GCGUUAAAUUGCG)-3' Tm(℃) 46
측정 조건: 프로브(화합물 113) 2.5 ㎛, 인산 완충액 50 mM(pH 7.0), NaCl 100mM, 상보쇄 2.5 ㎛
형광의 극대 파장은 488 nm(1.5 nm 폭)의 광으로 여기한 경우의 값.
양자 수율은 9, 10-디페닐안트라센을 참조 물질로서 계산했다.
도 12에, 실시예 8에 있어서의 링커 길이(n)= 4일 때의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 점선이 단일쇄, 실선이 DNA-DNA쇄, 쇄선이 DNA-RNA쇄의 스펙트럼이다. 400 nm∼600 nm에서의 흡수에 주목하면, 단일쇄 상태일 때의 흡수 밴드가 하이브리드화 후의 흡수 밴드에 비해 단파장측에 나타나 있고, 단일쇄 상태에서의 색소 이량체에 의한 H 회합체의 형성을 명확하게 나타내고 있다.
또한, 도 13에, 실시예 8에 있어서의 링커 길이(n)= 4일 때의 여기 스펙트럼 과 형광 발광 스펙트럼을 함께 나타낸다. 도 13 중, 좌측(단파장측)의 곡선이 여기 스펙트럼을 나타내고, 우측(장파장측)의 곡선이 형광 발광 스펙트럼을 나타낸다. 또한, 도 13 중, 범례의 괄호 안은, 여기 스펙트럼에서는 참조하는 형광 발광의 파장(형광의λmax), 형광 발광 스펙트럼으로서는 여기 파장을 각각 나타내고 있다. 발광 강도는, 여기 스펙트럼 및 형광 발광 스펙트럼 모두, 단일쇄가 가장 약하고, DNA-DNA쇄는 그보다도 강하며, DNA-RNA쇄가 가장 강하다. 여기 스펙트럼으로부터, 형광 발광에 관여하는 흡수는, 도 12에 있어서의 장파장측의 흡수 밴드만이고, 단파장측의 흡수는 형광 발광에 관여하지 않는 것을 알 수 있었다. 즉, 엑시톤 효과에 의한 형광 발광 제어가 작동하고 있는 것을 명확하게 나타나고 있다. 따라서, 형광 발광은, 하이브리드화 후에 강하고, 단일쇄 상태에서는 매우 약하다. 이에 따라, 하이브리드화 전후의 상태를 명확하게 구별할 수 있다.
[실시예 9]
하기 화학식 114에 표시되는, 1분자 중에 색소 구조 1개만을 포함하는 화합물(DNA 올리고머)을, 링커 길이(n)를 여러 가지로 변화시켜 합성했다. 합성은, 원료의 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)을, 링커 길이에 맞춰 탄소수(쇄길이)를 바꾼 화합물로 하는 것과, 화합물 102 합성에 있어서 트리스(2-아미노에틸)아민 대신에 비스(2-아미노에틸)메틸아민을 이용하는 것 외에는 상기 실시예 1∼4 및 6과 동일하게 행했다. n=3, 4, 5, 6의 화합물을 각각 동일한 방법으로 합성할 수 있다.
Figure 112009057492774-pct00041
보다 구체적으로는, 하기 반응식과 같이 합성했다. 하기 반응식은 n=4의 경우이지만, n이 다른 수치인 경우도 동일하게 합성했다.
Figure 112009057492774-pct00042
[(E)-5-(3-(2-(N-메틸-N-(2-(2,2,2-트리플루오로아세타미드)에틸)아미노)에 틸아미노)-3-옥소프로피-1-에닐)-2'-데옥시우리딘((E)-5-(3-(2-(N-Methy-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1-enyl)-2'-deoxyuridine)(화합물 102')의 합성]
1.19 g(4.0 mmol)의(E)-5-(2-카르복시비닐)-2'-데옥시우리딘 101(분자량298.25)과 921 mg(8.0 mmol)의 N-히드록시숙신이미드(분자량 115.09)와 1.53 g(8.0 mmol)의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(분자량 191.70)를 교반자가 들어간 가지 플라스크에 넣고, 1.0 mL의 DMF를 첨가하여, 25℃로 8시간 교반했다. 약 1 mL의 초산을 첨가하고, 250 mL의 염화메틸렌과 250 mL의 초순수를 첨가하여, 심하게 교반했다. 생성된 침전을 여과하여, 물로 세정하고, 감압하에 철야 건조했다. 얻어진 백색 잔류물을 100 mL의 아세토니트릴에 현탁시켜, 심하게 교반했다. 여기에 2.34 g(20 mmol)의 N-메틸-2,2'-디아미노디에틸아민(분자량 146.23, d= 0.976)을 단숨에 첨가하여, 25℃로 10분간 더 교반했다. 그 후, 4.8 mL(40 mmol)의 트리플루오로초산에틸(분자량 142.08, d= 1.194), 5.6 mL(40 mmol)의 트리에틸아민(분자량 101.19, d= 0.726) 및 50 mL의 에탄올을 첨가하여, 25℃로 16시간 교반했다. 얻어진 혼합물로부터 용매를 감압 증류제거하여, 실리카겔 컬럼으로 정제했다(10-20％ MeOH/CH2Cl2). 목적물을 포함하는 분획으로부터 용매를 감압 증류제거하여, 소량의 아세톤에 용해시켜, 에테르를 첨가했더니 백색 침전이 생겼다. 여과, 에테르로 세정 후, 감압 하에 건조하여, 750 mg(76％)의 목적 물질(화합물 102')을 백색 분말로서 얻었다. 이하에, 기기 분석값을 나타낸다.
화합물 102':
1HNMR(CD3OD) δ8.29(s, 1H), 7.17(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.97(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.21(t, J= 6.3 Hz, 1H), 4.40.4.36(m, 1H), 3.92.3.90(m, 1H), 3.80(dd, J= 11.7, 2.9 Hz, 1H), 3.72(dd, J= 11.7, 3.4 Hz, 1H), 3.37.3.25(m, 5H), 2.60.2.53(m, 5H), 2.33.2.19(m, 5H); 13CNMR(CD3OD) δ169.2, 158.7(q, J= 36.4 Hz), 151.2, 143.7, 143.6, 134.1, 122.2, 117.5(q, J= 286.2 Hz), 111.0, 89.2, 87.0, 72.1, 62.6, 57.4, 56.7, 42.4, 41.8, 38.5, 38.3; HRMS(ESI) calcd for C19H27F3N5O7([M+ H]+) 494.1863, found 494.1854.
[(E)-5-(3-(2-(N-메틸-N-(2-(2,2,2-트리플루오로아세타미드)에틸)아미노)에틸아미노)-3-옥소프로피-1-에닐)-5'O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시우리딘 3'O-(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트((E)-5-(3-(2-(N-Methyl-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1-enyl)-5'O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyuridine 3'O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidite)(화합물 104')의 합성]
우선, 296 mg(0.60 mmol)의 화합물 102'(분자량 494.19)과 224 mg(0.66 mmol)의 4,4'-디메톡시트리틸염화물(분자량 338.83)을 교반자가 들어간 가지 플라스크에 넣고, 4 mL의 피리딘을 첨가하여, 25℃로 2시간 교반했다. 1 mL의 물을 첨가하여, 용매를 감압 증류제거하고, 실리카겔 컬럼으로 정제했다(1.5％ MeOH 및 1 ％ Et3N/CH2Cl2). 목적으로 하는 102'의 트리틸화물(104'의 중간체)을 포함하는 분획을 농축하여, 잔류물에 포화탄산수소나트륨 수용액을 첨가했다. 그 혼합물을 초산에틸로 추출하고, 포화 식염수로 세정하고 감압 하에 건조하여, 백색 거품형의 트리틸화물(366 mg, 77％)을 얻었다.
1HNMR(CD3OD) δ7.94(s, 1H), 7.42.7.17(m, 9H), 7.01(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.95(d, J= 15.6 Hz, 1H), 6.86.6.83(m, 4H), 6.21(t, J= 6.3 Hz, 1H), 4.41.4.38(m, 1H), 4.09.4.06(m, 1H), 3.75(s, 6H), 3.40.3.30(m, 6H), 2.59(t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.53(t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.46.2.31(m, 5H); 13CNMR(CD3OD) δ169.2, 158.7(q, J= 36.4 Hz), 151.2, 143.7, 143.6, 134.1, 122.2, 117.5(q, J= 286.2 Hz), 111.0, 89.2, 87.0, 72.1, 62.6, 57.4, 56.7, 42.4, 41.8, 38.5, 38.3; HRMS(ESI) calcd for C40H45F3N5O9([M+ H]+) 796.3169, found 796.3166.
상기 102'의 트리틸화물 159 mg(0.20 mmol)(분자량 920.85) 및 1H-테트라졸 28.6 mg(0.40 mmol)(분자량 70.05)을 바닥이 둥근 플라스크 내에 넣어, 진공 펌프로 밤새 흡인 건조했다. 여기에 4.0 mL의 CH3CN을 첨가하여 시약을 용해 후, 교반하고, 191 ㎕(0.60 mmol)의 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로아미다이트(분자량 301.41, d= 0.949)를 단숨에 첨가하여 25℃로 2시간 교반했다. TLC에서 반응 수료를 확인 후, 포화 중조수를 첨가하여, 초산에틸로 추출하고, 유기층을 포화식염수로 세정 후, 황산마그네슘으로 건조했다. 황산마그네슘을 여과에 의해 제거한 후, 용매를 감압 증류제거할 목적 화합물 104'을 포함하는 조생성물을 얻었다. 이 조생성물은 정제하지 않고서 그대로 DNA 합성에 사용했다. 또한, 화합물 104'를 얻은 것은, 상기 조생성물의 31PNMR(CDCl3)과 HRMS(ESI)에서 확인했다. 이들의 값을 이하에 나타낸다.
화합물 104':
31PNMR(CDCl3) δ149.686, 149.393; HRMS(ESI) calcd for C49H61F3N7O10P([M+ H]+) 996.4248, found 996.4243.
DNA105'의 합성은, 상기 화합물 105와 동일하게 하여 행했다. 이하에, 기기 분석값을 나타낸다.
DNA105':
CGCAAT[105']TAACGC, calcd for C133H174N51O76P12([M+H]+) 4074.8, found 4072.0; CGCAAT[105'][105']AACGC, calcd for C140H187N54O77P12([M+H]+) 4230.0, found 4228.9.
티아졸오렌지를 도입한 DNA114의 합성은, 상기 화합물 113과 동일하게 하여 행했다. 이하에, 기기 분석값을 나타낸다.
CGCAAT[114](4)TAACGC, calcd for C156H194N53O77P12S(M+)4447.3, found 4445.6; CGCAAT[114](4)[114](4) AACGC, calcd for C186H228N58O79P12S2([M. H]+) 4976.0, found 4976.9.
합성한 DNA 올리고머(ODN) 중, 5'-d(CGCAAT[114](n)TAACGC)-3'의 서열을 갖는 ODN(색소 1개만을 포함하는 프로브)에 대해, 실시예 7 및 8과 동일하게 형광 거동을 관측했다. 하기 표 2, 도 14 및 도 15에, 그 결과를 나타낸다. 도 14는 흡수 스펙트럼(점선이 단일쇄, 실선이 DNA-DNA쇄, 쇄선이 DNA-RNA쇄의 스펙트럼임)을 나타내고, 도 15는 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타낸다. 도 15 중, 좌측(단파장측)의 곡선이 여기 스펙트럼을 나타내고, 우측(장파장측)의 곡선이 형광 발광 스펙트럼을 나타낸다. 또한, 도 15 중, 범례의 파장은, 여기 스펙트럼에서는 참조하는 형광 발광의 파장(형광의λmax), 형광 발광 스펙트럼에서는 여기 파장을 각각 도시하고 있다. 발광 광도는 여기 스펙트럼 및 형광 발광 스펙트럼 모두 단일쇄가 가장 약하고, DNA-DNA 쇄는 그보다 강하며, DNA-RNA 쇄가 가장 강했다. 도시한 바와 같이, 화합물 114는 색소 구조를 1분자 중에 1개만 가지고, H 회합체를 형성하지 않기 때문에, 엑시톤 효과가 생기지 않는다(흡수 스펙트럼에서 단파장측에의 시프트가 관찰되지 않음). 따라서, 단일쇄 상태에서의 형광 소광은 색소 구조를 2개 갖는 화합물과 비교하여 약하고, 이중쇄와 단일쇄의 형광 강도비 Ids/Iss는 비교적 작다. 그러나, 이중쇄 형성에 의한 색소의 인터켈레이션이 색소의 구조를 평탄화하기 때문에, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 단일쇄보다도 이중쇄 상태쪽이 큰 형광 강도를 얻을 수 있었다. 또한, 단일쇄에 있어서, 여기 파장을 488 nm에서 UV 흡수 스펙트럼에 있어서의 λmax(λmax가 2개 있을 때는 장파장측)로 바꾼 바, 양자 수율ΦF= 0.120이라는 측정 결과를 얻을 수 있었다. 또한, DNA-DNA 이중쇄에 있어서, 여기 파장을 488 nm에서 UV 흡수 스펙트럼에 있어서의 λmax(λmax가 2개 있을 때는 장파장측)로 바꾼 바, 양자 수율ΦF= 0.307, 이중쇄와 단일쇄의 형광 강도비 Ids/Iss= 3.4라는 측정 결과를 얻을 수 있었다.
[표 2]
UV의 λmax(nm)
및 형광 계수		 형광의
λmax(nm)		 양자
수율		 비 Tm(℃)
n=4 단일쇄 515(123000) 532 0.0681 - 없음
DNA-DNA 이중쇄 509(125000) 526 0.180 2.64 65
DNA-RNA 이중쇄 511(125000) 527 0.244 3.58 55
측정 조건: 프로브 2.5 ㎛, 인산 완충액 50 mM(pH 7.0), NaCl 100 mM, 상보쇄 2.5 ㎛
형광의 극대 파장은 488 nm(1.5 nm 폭)의 광으로 여기한 경우의 값이다.
양자 수율은 9,10-디페닐안트라센을 참조 물질로서 계산했다.
[실시예 10]
색소로서, 상기 화합물 107 대신에 하기 화학식 115로 표시되는 화합물을 이용하는 외에는 실시예 9와 동일하게 하여, 1분자 중에 색소 구조 1개만을 포함하는 화합물(DNA 올리고머)을 합성했다. 합성은 링커 길이(n)를 1∼4까지 여러 가지로 변화시켜 행했다. 서열은, 상기 화합물 105과 동일하게 5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(X 는, 색소 도입 부분)으로 했다.
Figure 112009057492774-pct00043
하기 화합물 116은 n=2인 경우이다. 화합물 116에 대해 실시예 7∼9와 동일하게 형광 강도를 평가한 바, DNA-RNA 이중쇄인 경우에, 단일쇄와 비교하여 형광 강도의 증가가 보였다.
Figure 112009057492774-pct00044
[형광 수명 측정]
실시예 8(색소 2개) 및 실시예 9(색소 1개)의 DNA 올리고머(올리고뉴클레오 티드)에 대해, 단일쇄 DNA의 경우와 이중쇄 DNA의 경우로, 각각 형광 수명을 측정했다. 측정 대조의 DNA 올리고머는, 하기 서열 중 X의 개소에 색소 도입 뉴클레오티드가 들어가 있다.
5'-d(CGCAATXTAACGC)-3' (서열 번호 1)
5'-d(GCGTTAAATTGCG)-3' (서열 번호 2)
하기 표 3에, 상기 형광 수명 측정의 결과를 나타낸다. 표 중, T는 형광 수명(ns)이다. CHISQ는, 측정 오차이다. T1은 여기 종료 직후부터의 경과 시간을 나타낸다. T2는 실시예 8의 색소 2개 프로브에서는, 시간(T1)이 경과 후, 더 경과한 시간을 나타내고, 실시예 9의 색소 1개 프로브에서는, 여기 종료 직후로부터의 경과 시간을 나타낸다. T3은 시간(T2)이 경과 후, 더 경과한 시간을 나타낸다. 표 중, 「％」로 표시된 수치는 시간 T1, T2 또는 T3이 각각 경과하는 동안에 있어서의 형광 감쇠율(여기 종료 직후의 형광 강도를 100％로 함)이고, 각각의 프로브(DNA 올리고머)에 대해, 합계는 100％가 된다. 표 3에 나타내는 바와 같이, 색소 2개를 포함하는 프로브(실시예 8) 단일쇄 상태로 매우 짧은 소광 과정(여기 후 0.0210 ns에서 형광 감쇠율 81.54％)이 있고, 엑시톤 효과의 존재를 나타내고 있다. 다른 케이스에서는 보이지 않는다. 이 2개의 색소로 표지한 ODN의 단일쇄 상태에서의 형광 소광은 형광 강도의, 하이브리드화의 특이적이고 또한 날카로운 변화에 있어서, 열쇠가 되는 역할을 한다. 또한, 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 형광 소광 특성은 이차 또는 삼차함수 특성에 일치했다. 또한, 하기 표 3의 색소 2개 이중쇄에 대해 재차 동일한 조건으로 측정(단, T1 측정은 생략)한 바, T2= 2.05 에서의 형광 감쇠율 44％, T3= 4.38에서의 형광 감쇠율 56％, T= 3.33(ns), CHISQ= 1.09이고, 하기 표 3과 매우 가까운 값을 얻을 수 있었다. 즉, 본 실시예의 프로브는 이 형광 수명 측정에 있어서의 재현성이 우수한 것을 알 수 있다.
[표 3]
색소 1개 단일쇄 색소 1개 이중쇄 색소 2개 단일쇄 색소 2개 이중쇄
T1 - - 0.0210 ns
(81.54 %)		 0.551 ns
(2.73 %)
T2 0.934 ns
(39.19 %)		 1.58 ns
(24.63 %)		 1.28 ns
(8.99 %)		 2.33 ns
(50.30 %)
T3 3.12 ns
(60.81 %)		 3.60 ns
(75.37 %)		 3.76 ns
(9.48 %)		 4.57 ns
(46.97 %)
T 2.26 3.10 0.489 3.33
CHISQ 1.32 0.96 1.11 1.04
스트랜드 2.5 ㎛
인산 완충액 50 mM(pH 7.0)
NaCl 100mM
455nm(prompt)600 nm(decay)로 측정했다.
[실시예 11]
색소로서, 상기 화합물 107 대신에 하기 화학식 115'으로 표시되는 화합물을 이용하는 외에는 실시예 8과 동일하게 하여, 하기 화학식 117로 표시되는 DNA 올리고머를 합성했다. n=3, 4, 5, 6의 화합물을, 각각 동일한 방법으로 합성할 수 있었다. 또한, 실시예 8과 동일하게 하여 형광 프로브로서 사용하고, 형광 측정에 의해 성능을 평가했다. 하기 표 4에 그 결과를 나타낸다. 표 4에 나타내는 바와 같이, 화합물 117은 실시예 8의 DNA 올리고머(화합물 113)와는 흡수대가 상이하지만, 동일하게 양호한 엑시톤 효과를 나타냈다. 이것은, 본 발명에 있어서, 흡수대가 상이 한 형광 프라이머를 이용하여 멀티 컬러로서의 검출이 가능한 것을 나타낸다.
Figure 112009057492774-pct00045
Figure 112009057492774-pct00046
[표 4]
UV의 λmax(nm) 및 형광 계수 형광의 λmax(nm) 양자
수율		 비
n=4 프로브 단일쇄 499(135000)
532(86000)		 553 0.00911 -
프로브-DNA 이중쇄 505(111000)
530(148000)		 550 0.0706 7.7
[실시예 12]
하기 서열로 표시되는 DNA 올리고머(화합물 118)를 합성했다. X는, 실시예 9와 동일한 색소 구조를 갖는 뉴클레오티드(하기식: 화학식 118로 함)이다. 하기 서열이 나타내는 바와 같이, 이 DNA 올리고머는, 색소 도입 뉴클레오티드가 2개 연속하여 서열되어 있다. 색소의 도입 및 DNA 올리고머의 합성은, 상기 각 실시예와 동일한 수법으로 행했다.
5'-d(TTTTTTXXTTTTT)-3' (서열 번호 3)
Figure 112009057492774-pct00047
또한, 이 DNA 올리고머를 상기 각 실시예와 동일하게 형광 프로브로서 사용하여, 형광 측정에 의해 성능을 평가했다.
프로브 2.5 ㎛(스트랜드 농도)
인산 완충액 50 mM(pH 7.0)
NaCl 100mM
상보쇄 2.5 ㎛(스트랜드 농도)
도 16 및 17에, 그 결과를 나타낸다. 도 16은 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면(점선이 단일쇄, 실선이 DNA-DNA쇄, 쇄선이 DNA-RNA쇄의 스펙트럼임)이고, 도 17은 여기 스펙트럼과 형광 발광 스펙트럼을 함께 나타내는 도면이다. 도 17 중, 좌측(단파장측)의 곡선이 여기 스펙트럼을 나타내고, 우측(장파장측)의 곡선이 형광 발광 스펙트럼을 나타낸다. 발광 강도는, 여기 스펙트럼 및 형광 발광 스펙트럼 모두, 단일쇄가 가장 약하고, DNA-RNA쇄는 그보다도 강하며, DNA-DNA쇄가 가장 강하다. 도시한 바와 같이, 이와 같이 색소 도입 뉴클레오티드를 2개 연속하여 서열시킨 경우에도, 색소간 거리를 가까이 할 수 있기 때문에 엑시톤 효과를 나타내고, 표적 핵산과의 하이브리드화 전후의 상태를, 형광 강도에 따라 명확하게 구별할 수 있다.
[실시예 13]
상기 화학식 113 또는 화학식 114로 표시되는 화합물(DNA 올리고머), 즉 하기 표 5에 나타내는 각 ODN을, 링커 길이(n) 및 핵산 서열을 다양하게 변화시켜 합성했다. 또한, 「ODN」이란, 전술한 바와 같이, 올리고 DNA(DNA 올리고머)를 의미한다. 합성은 원료의 5-브로모발레르산(5-브로모펜탄산)을, 링커 길이에 맞춰 탄소수(쇄길이)를 바꾼 화합물로 하는 것과, 올리고 DNA 합성에 있어서 서열을 적절하게 변경하는 것 외에는, 상기 실시예 1∼4, 6, 8, 9 또는 12와 동일하게 행했다. 또한, ODN1는 실시예 8에서 합성한 올리고 DNA(DNA 올리고머)와 동일하고, ODN4 및 ODN5는 실시예 9에서 합성한 올리고 DNA(DNA 올리고머)와 동일하다. 합성에 있어 서, 티아졸오렌지의 N-히드록시숙신이미딜에스테르(화합물 109)는 활성아미노기의 50당량 또는 그 이상 이용했다. 합성 후, 역상 HPLC에 있어서의 전개 시간은, 필요에 따라, 20∼30분간 또는 그 이상으로 했다. 또한, 이하에 있어서, 예컨대, [113](n) 또는 [114](n)은, 그 위치에, 화학식 113 또는 화학식 114로 표시되는 뉴클레오티드가 삽입되어 있는 것을 나타낸다. n은 링커 길이이다. 또한, 하기 표 5에 있어서, ODN1'는 ODN1에 상보적인 DNA쇄를 나타낸다. 동일하게, ODN2'는 ODN2에 상보적인 DNA쇄를 나타내고, ODN3'는 ODN3에 상보적인 DNA쇄를 나타낸다.
[표 5]
Figure 112009057492774-pct00048
합성한 각 ODN은 상기 실시예 4와 동일하게 효소 소화에 의해 농도를 결정했다. 또한, 합성한 각 ODN은 MALDI TOF 매스 스펙트럼에 의해 확인했다. 이하에, 그 질량 분석값을 나타낸다.
ODN1(n=3), CGCAAT[113](3)TAACGC, calcd for C178H213N56O78P12S2([M.H]+) 4820.7, found 4818.9;
ODN1(n=4), CGCAAT[113](4)TAACGC, calcd for C180H217N56O78P12S2([M.H]+) 4848.8, found 4751.4;
ODN1(n=5), CGCAAT[113](5)TAACGC, calcd for C182H221N56O78P12S2([M.H]+) 4876.8, found 4875.6;
ODN1(n=6), CGCAAT[113](6)TAACGC, calcd for C184H225N56O78P12S2(([M.H]+) 4904.9, found 4903.6;
ODN2, TTTTTT[113](4)TTTTTT, calcd for C184H227N34O92P12S2([M.H]+) 4822.8, found 4821.4;
ODN3, TGAAGGGCTT[113](4)TGAACTCTG, calcd for C251H305N81O124P19S2([M.H]+) 7093.2, found 7092.3;
ODN(anti4.5S), GCCTCCT[113](4)CAGCAAATCC[113](4)ACCGGCGTG, calcd for C377H456N116O173P27S4([M.3H]+) 10344.9, found 10342.7;
ODN(antiB1), CCTCCCAAG[113](4)GCTGGGAT[113](4)AAAGGCGTG, calcd for C381H456N124O172P27S4([M.3H]+) 10489.0, found 10489.8.
상기 표 5의 ODN 중, 서열과 링커 길이를 여러 가지로 변화시킨 [113](n)함 유 ODN(ODN1, ODN2, ODN3)에 대해, 상보쇄와의 하이브리드화 전후로 각각 흡광 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 측정했다. 결과를, 하기 표 6, 도 18 및 도 19에 정리하여 나타낸다.
[표 6]
Figure 112009057492774-pct00049
측정 조건: 2.5 ㎛ DNA, 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0), 100 mM 염화나트륨
b488 nm에서 여기
cλmax에서 여기(λmax가 2개 있을 때는, 장파장 측의 λmax에서 여기)
d이중쇄 상태와 단일쇄 상태의 λem에 있어서의 형광 강도비
또한, 표 6 중, ODN1(n=3∼6)은 상기 실시예 8의 올리고 DNA(5'-d(CGCAATXTAACGC)-3', X는, 색소 113 도입 부분)와 동일한 구조이다. 단, 실시예 8에서는, 형광 양자 수율(ΦF) 및 이중쇄 상태와 단일쇄(단쇄) 상태의 형광 강도비(Ids/Iss)는 파장 488 nm에서 여기하여 측정했지만, 본 실시예(실시예 13)에서는, 상기와 같이, UV 흡수 스펙트럼에 있어서의 λmax에서 여기하여 측정했다. 이 때문에, 상기 표 1(실시예 8)과, 상기 표 6(실시예 13)에서는, 동일한 물질이더라도 ΦF 및 Ids/Iss가 상이하다.
도 18은 [113](4)함유 ODN의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 도 18의 (a), (b) 및 (c)에 있어서 각각, 좌측의 그래프는 흡수 스펙트럼을 나타내고, 횡축은 파장이며, 종축은 흡광도이다. 우측의 그래프는 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내고, 횡축은 파장이며, 종축은 발광 강도이다. 각 측정은 100 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0) 중의 [113](4)함유 ODN을 시료로 하여, 25℃로 행했다. 도 18 중의 각 그래프에 있어서, 흑선은, 단일쇄 ODN(ss)의 측정 결과를 나타내고, 회색선은 대응하는 상보쇄 DNA와 하이브리드화한 ODN(ds)의 측정 결과를 나타낸다.
도 18(a)는 ODN1(n=4)(2.5 ㎛)의 측정 결과를 나타낸다. 여기 스펙트럼은 ss 에 있어서는 파장 534 nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 있어서는 파장 528 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 519 nm에서 여기하고, ds에 있어서는 파장 514 nm에서 여기하여 측정했다.
도 18(b)는 ODN2의 측정 결과를 나타낸다. 스트랜드 농도는 좌측의 그래프에 있어서는 2.5 ㎛이고, 우측의 그래프에 있어서는 1 ㎛이다. 여기 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 534 nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 있어서는 파장 537 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 517 nm에서 여기하고, ds에 있어서는 파장 519 nm에서 여기하여 측정했다.
도 18(c)는 ODN3의 측정 결과를 나타낸다. 스트랜드 농도는 2.5 ㎛이다. 여기 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 535 nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 있어서는 파장 530 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 518nm에서 여기하고, ds에 있어서는 파장 516 nm에서 여기하여 측정했다.
도 19는 ODN1(n=3, 5 및 6)의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 도 19의 (a), (b) 및 (c)에 있어서 각각, 좌측의 그래프는 흡수 스펙트럼을 나타내고, 횡축은 파장이며, 종축은 흡광도이다. 우측의 그래프는, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내고, 횡축은 파장이며, 종축은 발광 강도이다. 각 측정은 100 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨완충액(pH= 7.0) 중의 ODN1(n=3, 5 또는 6)을 시료로 하여, 25℃로 행했다. 도 19 중의 각 그래프에 있어서, 흑선은 단일쇄 ODN(ss)의 측정 결과를 나타내고 회색선은 대응하는 상보쇄 DNA와 하이브리드화한 ODN(ds)의 측정 결과를 나타낸다.
도 19(a)는 ODN1(n=3)(2.5 ㎛)의 측정 결과를 나타낸다. 여기 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 537 nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 있어서는 파장 529 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 521 nm에서 여기하고, ds에 있어서는 파장 511 nm에서 여기하여 측정했다.
도 19(b)는 ODN1(n=5)(2.5 ㎛)의 측정 결과를 나타낸다. 여기 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 538 nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 있어서는 파장 529 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 520 nm에서 여기하고, ds에 있어서는 파장 512 nm에서 여기하여 측정했다.
도 19(c)는 ODN1(n=6)의 측정 결과를 나타낸다. 스트랜드 농도는 2.5 ㎛이다. 여기 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 536nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 있어서는 파장 528 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 있어서는 파장 523 nm에서 여기하고, ds에 있어서는 파장 514 nm에서 여기하여 측정했다.
표 6, 도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이 각각의[113](n)함유 ODN 시료에 대해, 400∼550 nm의 범위에 2개의 흡수대가 관측되었다. 단파장측(∼480 nm)의 흡수대는 1(n)함유 ODN 시료가 단쇄 상태일 때, 보다 강하고, 장파장 측(∼510 nm)의 흡수대는 1(n)함유 ODN 시료가 상보쇄와 하이브리드화했을 때에 현저하게 나타났다. 장파장 측(∼510 nm)의 흡수대는 티아졸오렌지 단체의 전형적인 흡수대이다. 발광 스펙트럼에 있어서는, ∼530 nm에, 단일의 넓은 흡수대가 관측되었다. [113](n)함유 ODN 시료와 상보쇄와의 하이브리드화에 의해, 발광 강도가 명확하게 변화되었다. 즉, 표적 DNA쇄에 하이브리드화한 [113](n)함유 ODN 시료는 강한 형광을 나타내고, 하이브리드화 전의 [113](n)함유 ODN 시료는 하이브리드화 후보다도 매우 약한 형광밖에 나타내지 않았다. 특히, 폴리피리미딘 서열로 이루어지는 ODN2의 형광은, 단일쇄 상태에서는 거의 완전히 소광되었다. 극대 발광 파장에 있어서의 ODN2의 이중쇄 상태와 단일쇄 상태의 형광 강도비(Ids/Iss)는 160에 달했다. 20-mer의 ODN쇄인 ODN3'쇄와, 일반적 서열 ODN3을 하이브리드화시킨 경우도, 또한, 하이브리드화의 전후로 발광 강도가 명확하게 상이했다. 또한, 표 6, 도 18(a) 및 도 19로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예의 ODN1에 있어서 링커 길이(n)를 3에서 6까지 변화시킨 경우, 어느쪽의 링커 길이에서도, 큰 Ids/Iss값을 얻을 수 있었다. 이와 같이, 표 6에 나타낸 ODN은, 프로브의 서열 및 링커 길이에 의해 소광 성능에 차는 있지만, 어느 것이나 양호한 소광 성능을 나타냈다.
또한, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, ODN1(n=4)/ODN1'의 융점(Tm)은, 천연 이중쇄 5'-CGCAATTTAACGC-3'/ODN1'와 비교하여 7℃∼9℃ 상승했다. 이 Tm값의 상승은 프로브에서의 2개의 양이온성 색소가, 표적 서열과 함께 형성된 이중쇄에 효과적으로 결합한 것을 시사한다. 또한, 도 18 및 19로부터 알 수 있는 바와 같이, 여기 스펙트럼은 화합물의 구조에 상관없이, 510 nm 부근에, 단일한 넓은 피크를 나타냈다. 이 파장은 흡수대의 하나의 파장과 좋은 일치를 나타냈다. 즉, 형광 발광에 관여하는 흡수는 510 nm 부근의 흡수대뿐이고, 480 nm 부근의 흡수대는 발광에 거의 영향받지 않는다고 생각되어진다. 또한, 색소 회합에 의한 510 nm에서 부근 480 nm 부근에의 흡수대 시프트로부터, 엑시톤 커플링 에너지는 1230 cm-1이라고 예상된다. 이것은, 시아닌 색소의 H 회합체에 대해 보고되어 있는 커플링 에너지와 동등하다. 단, 이들의 이론적 고찰은 본 발명을 한정할만한 것이 아니다.
[흡수 스펙트럼]
상기 ODN1(n=4)의 흡수 스펙트럼을, 여러 가지의 온도 및 농도로 측정하여, 온도 및 농도가 흡수대에 미치게 하는 영향을 확인했다. 도 20의 흡수 스펙트럼도에 그 결과를 나타낸다. 도 20의 (a) 및 (b)에 있어서, 횡축은 파장이고, 종축은 흡광도이다. 각 측정은 100 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨완충액(pH= 7.0) 중의 ODN1(n=4)을 시료로 하여 행했다.
도 20(a)는 용액 온도를 변화시켰을 때의 흡수 스펙트럼 변화를 나타낸다. ODN 농도는 2.5 ㎛이다. 스펙트럼은 10℃로부터 90℃까지 10℃ 간격으로 측정했다.
도 20(b)은, 용액 농도를 변화시켰을 때의 흡수 스펙트럼 변화를 나타낸다. 측정 온도는 25℃이다. ODN 농도는 0.5, 0.75, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 및 5.0 ㎛이다.
또한, 삽입도는 파장 479 nm에 있어서의 흡광도의 대수(종축)와, 파장 509 nm에 있어서의 흡광도의 대수(횡축)의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 20(a)에 도시하는 바와 같이, 시료 온도를 변화시켜 측정한 바, 2개의 흡수대의 흡광도비가 약간 변화되었다. 즉, 시료 온도의 상승에 따라, 479 nm의 흡수 대는 점차로 감소하고, 509 nm의 흡수대는 증대했다. 그러나, 그 변화는, 도 20(a)로부터 알 수 있는 바와 같이, 매우 근소했다. 이것은, 본 발명의 프로브인 ODN1(n=4)에 있어서, 온도 변화에 따르는 구조의 변화는 미소하며, 온도에 거의 영향받지 않고서 이용할 수 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 도 20(a)에 도시하는 바와 같이, 487 nm에 있어서, 2개의 스펙트럼 구성 요소의 존재를 나타내는 등흡수점이 관측되었다.
한편, 도 20(b)에 나타내는 바와 같이, ODN1(n=4)의 시료 농도를 증가시키면, 양쪽의 흡수대에서 흡광도의 증가가 관측되었다. 또한, 삽입도에 나타내는 바와 같이, log(Abs479) 대 log(Abs509)의 플롯, 즉, 각 흡수대에서의 흡광도의 대수의 비는 직선을 나타냈다. 이것은, ODN 농도에 상관없이, 2개의 스펙트럼 구성 요소의 비가 거의 일정했다는 것을 나타낸다. 즉, 본 발명의 프로브인 ODN1(n=4)은 용액 중의 농도를 바꾸더라도 구조가 거의 변화하지 않기 때문에, 농도에 영향받지 않고서 이용하는 것이 가능하다.
또한, 도 20(a) 및 (b)의 스펙트럼 변화의 요인은, 예컨대 이하와 같이 설명할 수 있지만, 이들의 설명은 이론적 고찰의 일례이고, 본 발명을 한정하지 않는다. 즉, 우선, ODN1(n=4)은 이색성 시스템에 의해, 분자내 H 회합체를 형성한다. 도 20(a)에 있어서의 스펙트럼 변화는, 온도 상승에 의해 H 회합체의 구조가 약간 느슨해지기 때문으로 추측된다. 또한, 상기 분자내 H 회합체는, 분자 내에서 완결하고 있기 때문에, 농도가 상승하더라도 분자간 상호 작용 등에 의한 구조의 변화 가 거의 없고, 도 20(b) 및 삽입도에 나타낸 바와 같이 2개의 스펙트럼 구성 요소의 비가 거의 일정하게 된다고 생각되어진다. 또한, ODN1(n=4)의 시료 용액 중에는, 분자내 H 회합체와 색소 모노머(색소 부분이 회합하지 않음)의 2개의 컨포메이션 모드가 존재한다고 생각되어진다. 단파장측(479 nm)의 흡수대는, 분자내 H 회합체 유래라고 추측되어진다. 장파장측의 흡수대(509 nm)는 가열에 의해 증대했기 때문에, 색소 단량체 유래라고 추측되어진다.
[CD 스펙트럼]
ODN1(n=4)/ODN1'의 CD 스펙트럼을 측정했다. 스트랜드 농도는 2.5 ㎛으로 하고, 100 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0) 중, 25℃에서 측정했다. 도 21의 CD 스펙트럼도에, 그 측정 결과를 나타낸다. 도 21에 있어서, 횡축은 파장(nm)이고, 종축은 각도(θ)이다. 도시한 바와 같이, ODN1(n=4)/ODN1' 이중쇄는, 450 nm∼550 nm에서, 분열형의 코튼 효과(split-Cotton effect)를 나타냈다. 즉, 측정된 CD 쌍은, 티아졸오렌지 색소가 DNA 이중쇄에 인터켈레이션할 때의 전형적인 패턴을 나타냈다. 즉, ODN1(n=4)의 색소 부분이, 형성된 이중쇄 DNA에 인터켈레이션하고, 이색성 회합체(H 회합체)의 형성이 강력하게 방해되었다고 생각되어진다. 이 CD 측정의 결과는 상기 Tm 측정 결과와 아울러, ODN1(n=4)에 있어서의 색소 부분이 이중쇄 DNA에 결합할 때에, 2개의 색소 부분이 함께 주홈에 인터켈레이션하고, 열적으로 안정한 이중쇄 구조를 형성하는 것을 시사한다. 단, 이 이론적 고찰은, 본 발명을 한정하는 것이 아니다. 형성되는 이중쇄 구조가 열적으로 안정한 것은, 본 발명의 프로브(핵산)가, 상보적 서열의 검출에 효과적으로 사용 가능한 것을 나타낸다.
[실시예 14]
상기 ODN5(CGCAAT[114](4)[114](4) AACGC)에 대해, 이중쇄 상태와 단일쇄 상태의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 측정했다. 하기 표 7 및 도 22에, 그 결과를 나타낸다.
[표 7]
Figure 112009057492774-pct00050
측정 조건: 2.5 ㎛DNA, 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0), 100 mM 염화나트륨
b488 nm에서 여기
cλmax에서 여기(λmax가 2개 있을 때는, 장파장측의 λmax에서 여기)
d이중쇄 상태와 단일쇄 상태와의 λem에 있어서의 형광 강도비
도 22는 ODN5 즉[114](4)함유 ODN의 흡수 스펙트럼, 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. ODN5의 스트랜드 농도는 2.5 ㎛이고, 100 mM 염 화나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH= 7.0) 중, 25℃에서 측정했다. 흑선은 단일쇄 ODN5(ss)의 측정 결과를 나타내고, 회색선은 ODN1'과 하이브리드화한 이중쇄의 ODN5(ds)의 측정 결과를 나타낸다. (a)는 흡수 스펙트럼이고, 횡축은 파장이며, 종축은 흡광도이다. (b)는 여기 스펙트럼 및 발광 스펙트럼이고, 횡축은 파장이며, 종축은 발광 강도이다. 여기 스펙트럼은 ss에 대해서는 파장 534 nm의 발광 강도를 측정하고, ds에 대해서는 파장 514 nm의 발광 강도를 측정했다. 발광 스펙트럼은 ss에 대해서는 파장 528 nm에서 여기하고, ds에 대해서는 파장 519 nm에서 여기했다.
상기 표 7 및 도 22에 나타내는 바와 같이, 2개의 [114](4)뉴클레오티드가 연속된 서열의 ODN5는 [114](4)뉴클레오티드를 하나만을 포함하는 단일쇄 ODN4의 발광 억제(상기 실시예 9의 표 2)와 비교하여, 보다 효과적인 형광 소광을 나타냈다. ODN5의 흡수 스펙트럼은, 단일쇄 상태에서는, 흡수대가 단파장측에 시프트했다. 이것은, ODN5에 포함되는 2개의 [114](4)뉴클레오티드가 분자내 H 회합체를 형성한 것을 시사한다. 이 회합은 [113](n)함유 ODN에서 관측된 것과 동일하게 단일쇄 ODN5의 소광에 이어졌다. 즉, ODN5 내에서의 2개의 [114](4)뉴클레오티드의 색소 부분이 H 회합하는 것으로, 상기 색소간에 엑시톤 커플링이 일어난 것이, 형광 발광 억제(소광)의 원인이라고 생각되어진다. 이에 따라, 2개의 [114](4)뉴클레오티드를 포함하는 ODN5가, [113](n)함유 ODN과 동일하게 상보쇄 검출에 유용한 것이 확인되었다.
[실시예 15]
ODN1(n=4)를 상보적인 ODN1'와 하이브리드화시켰을 때의 형광을, 육안으로 측정했다. 도 23에, 그 측정 결과를 나타낸다. 도 23의 좌측의 셀은 ODN1(n=4) 단일쇄를 포함하는 셀이고, 도 23의 우측의 셀은, ODN1(n=4)/ODN1'이중쇄를 포함하는 셀이며, 각각, 150 W 할로겐 램프 조사 후의 상태를 나타낸다. 각 셀 중의 스트랜드 농도는 각각 2.5 ㎛이며, 인산 완충액(인산나트륨 완충액) 50 mM(pH 7.0) 및 NaCl 100mM을 포함한다. 도시한 바와 같이, 150 W 할로겐 램프 조사 후는, ODN1(n=4)단일쇄를 포함하는 도의 좌측의 셀은 거의 형광 발광하지 않았지만, ODN1(n=4)/ODN1' 이중쇄를 포함하는 도의 우측의 셀은, 매우 명확하게 담록색의 형광을 나타냈다. 또한, 상보적 DNA쇄 ODN1'를 대응하는 상보적 RNA쇄로 바꾸어도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 또한, ODN2과 ODN2'에 있어서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 또한, ODN2과 ODN2'의 경우에 있어서, ODN2'에 대응하는 상보적 RNA(A13량체)로 바꾸더라도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 이들의 경우의 스트랜드 농도는 5 ㎛였다. 또한, 그 외에, 상기 표 6의 모든 ODN에 대해 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이와 같이, 본 실시예의 ODN에 따르면, 하이브리드화에 의존하여 형광 강도가 명확하게 변화되기 때문에, 하이브리드화 가능한 표적 서열의 육안에 의한 판정이 용이했다. 이것은, 이들 ODN이 가시적인 유전자 분석에 유용한 것을 나타낸다.
[실시예 16]
색소로서, 상기 화합물 107 대신에 하기 화학식 119로 표시되는 화합물을 이 용하는 외에는 실시예 8과 동일하게 하여, 하기 화학식 120으로 표시되는 DNA 올리고머를 합성했다.
Figure 112009057492774-pct00051
Figure 112009057492774-pct00052
상기 화학식 120에 있어서, n=3, 4, 5 및 6의 화합물(올리고 DNA)을 각각 동일한 방법으로 합성할 수 있었다. 또한, 서열5'-d(CGCAAT[120](5)TAACGC)-3'로 표시 되는 ODN[ODN6(n=5)으로 함]을 형광 프로브로서 이용하여, 흡수 스펙트럼 및 형광 발광 스펙트럼을 측정하여 성능을 평가했다. 측정 조건은, 실시예 7과 동일하게 했다. 도 24에, 그 측정 결과를 나타낸다. 도 24(a)는 흡수 스펙트럼이고, 횡축은 파장(nm)이며, 종축은 흡광도이다. 도 24(b)는 형광 발광 스펙트럼이고, 횡축은 파장(nm)이며, 종축은 발광 강도이다. 각각, 흑선은 단일쇄 ODN의 스펙트럼을 나타내고, 회색선은 상보적 ODN의 하이브리드화한 이중쇄 ODN의 스펙트럼을 나타낸다. 도 24(a)에 나타내는 바와 같이, 이중쇄 ODN에서는 이중 나선을 형성함으로써 600 nm 부근의 UV 흡수의 극대 파장이 장파장쪽으로 이동했다. 또한, 도 24(b)에 나타내는 바와 같이, 이중쇄 ODN에서는, 단일쇄와 비교하여 형광 강도가 대폭 증대했다. 이러한 점에서, 단일쇄 상태에서는, 엑시톤 효과가 나타나고 있는 것으로 생각된다. 즉, 본 실시예의 ODN(화합물 120)은 실시예 8의 ODN(화합물 113) 및 실시예 11의 ODN(화합물 117)과는 흡수대가 상이하지만, 동일하게 양호한 엑시톤 효과를 나타냈다. 이것은, 본 발명에 있어서, 흡수대가 상이한 형광 프로브를 이용하여 멀티 컬러에서의 검출이 가능한 것을 나타낸다.
[실시예 17: RNA와의 이중쇄 형성]
큐벳 내에서, 상기 ODN2(서열5'-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3')와, 여기에 대응하는 상보적 RNA쇄(RNA A13mer)와의 이중쇄 ODN을 형성시켜, 형광 발광 스펙트럼을 측정했다. 또한, 여기에 RNase H를 첨가하여, 스펙트럼의 변화를 관찰했다. 도 25에 그 결과를 나타낸다. 도 25에 있어서, 횡축은 시간이고, 종축은 형광 강도이다. 도면 중, 흑선은 도중에서 RNase H를 첨가한 상기 이중쇄 ODN의 스펙트럼 변화를 나타내고, 회색선은 대조, 즉 RNase H를 첨가하지 않은 상기 이중쇄 ODN의 스펙트럼 변화를 나타낸다. 측정은 37℃로 교반하면서, 상기 형광 분광기를 이용하여 행했다. 도시한 바와 같이, RNase H를 첨가하면, 상기 ODN2와 하이브리드화하고 있는 RNA가 소화되어, 상기 ODN2가 단일쇄로 되돌아가는 것에 의해, 형광 강도가 점차로 감소했다. 이러한 점에서도, 본 발명의 프로브(핵산)가, 형광에 의한 상보적 RNA 검출에 유용한 것이 확인되었다.
[실시예 18]
상기 ODN1(n=4)(서열5'-d(CGCAAT[113](4)TAACGC)-3')에 대해, 상보적 DNA쇄인 ODN1'(서열5'-d(GCGTTAAATTGCG)-3')의 농도비를 변화시켜 형광 발광 강도의 변화를 관측했다. 측정 조건으로서는, ODN1(n=4)의 스트랜드 농도를 1.0 ㎛로 고정하고, 인산 완충액 50 mM(pH 7.0), NaCl 100mM, 여기 파장 488 nm(1.5 nm 폭)으로 했다. 상보쇄 ODN1'의 농도는 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.O 또는 3.0 ㎛의 각 농도로 각각 측정했다. 도 26에 그 측정 결과를 나타낸다. 도26에 있어서, 횡축은 ODN1(n=4)에 대한 ODN1'의 당량수를 나타낸다. 종축은 형광의 λmax(529 nm)에 있어서의 형광 발광 강도(상대값)를 나타낸다. 도시한 바와 같이, 형광 발광 강도는 ODN1'의 당량수가 1 이하에서는, 상기 당량수에 대해, 매우 높은 정밀도로 정비례 관계를 나타내고 있지만, 상기 당량수가 1을 넘으면 변화하지 않았다. 이것은, ODN1(n=4)이 ODN1'와 정확하게 1: 1의 물질량비(분자수비)로 하이브리드화한 것을 나타낸다.
상기와 같이, ODN1'(표적 DNA)의 물질량이 ODN1(n=4)(프로브)과 동량 이하일 때는 표적 DNA의 농도에 비례하여 형광 강도가 증대한다. 즉, ODN1'(표적 DNA)가 존재하는 계 중에, 과잉량의 ODN1(n=4)(프로브)를 첨가하면, 형광 강도 측정에 의해 상기 표적 DNA를 정량하는 것이 가능하다. 또한, 상기 형광 강도의 증감을 추적함으로써, 상기 표적 DNA의 증감을 측정하는 것도 가능하다.
계 중에 있어서의 상기 표적 DNA를 정량하기 위해서는, 예컨대 도 26과 같이, 미리 검량선을 작성해 두면 좋다. 예컨대, ODN1'(표적 DNA) 농도 미지의 시료를 본 실시예와 동일한 조건으로 측정했을 때의 형광 강도가 80이면, 도 26으로부터, 상기 ODN1'(표적 DNA) 농도는 약 0.55 ㎛인 것을 알 수 있다.
실제로, 상기의 방법으로 핵산 중의 ODN1'(표적 DNA) 서열을 정량함으로써, 상기 서열의 증폭·분해·단백질 결합 등의 현상이 생성된 것을 바로 검출하고, 이들의 현상량을 정량할 수 있었다.
[실시예 19: 도트 블로팅 해석]
이번에 합성한 신규 프로브(핵산)의 하이브리드화에 의한 형광 특성 변화를 보기 위해, 상기 ODN(antiB1) 및 ODN(anti4.5S)을 이용하여 도트 블로팅에 의한 DNA 해석을 행했다. 표적 DNA 서열은, B1 RNA 서열을 포함하는 단쇄 DNA 단편을 이용했다. 이 서열은, 설치류 게놈에 있어서의 단분산형 핵내 반복 서열의 하나이다. 또한, 상기 단쇄 DNA 프라그멘트는, 4.5 SRNA 서열을 포함한다.
이 서열은, 설치류 세포로부터 단리한 저분자 핵내 RNA의 하나로서, B1 패밀 리와 광범위한 상동성을 갖는다. 본 실시예에서는, 블로팅용의 프로브로서 ODN(antiB1) 및 ODN(anti4.5S)을 조제하고, 이들에 2개의[113](4)뉴클레오티드를 재조합함으로써, 고감도 및 고형광 강도를 갖게 했다. 또한, ODN(antiB1) 및 ODN(anti4.5S)의 구조는 상기 실시예 13의 표 5에 기재한 바와 같다.
본 실시예의 도트 블로팅 해석은, 보다 구체적으로는, 이하와 같이 행했다. 즉, 우선, 하기 (1) 및 (2)의 2개의 DNA 프라그멘트를 상기 DNA 자동 합성기에 의해 조제했다.
(1) 하기의 4.5 SRNA 서열 및 그 상보적 DNA를 포함하는 DNA 이중쇄.
5'-d(GCCGGTAGTGGTGGCGCACGCCGGTAGGATTTGCTGAAGGAGGCAGAGGCAGGAGGATCACGAGTTCGAGGCCAGCCTGGGCTACACATTTTTTT)-3' (서열 번호 11)
(2) 하기의 B1 RNA 서열 및 그 상보적 DNA를 포함하는 DNA 이중쇄.
5'-d(GCCGGGCATGGTGGCGCACGCCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAG)-3' (서열 번호 12)
상기 DNA 이중쇄는, 0.5 M 수산화나트륨 및 1 M 염화나트륨 함유 수용액으로 변성시켰다. 이 변성 DNA의 일정 분량을, 정전하 나일론막(Roche 사) 상에 도트(스폿)했다. 이 정전하 나일론막 시트를 0.5 M 인산나트륨 및 1 M 염화나트륨 함유 수용액으로 적신 후, 0.5 M 인산나트륨, 1 M 염화나트륨 및 100μg/mL 연어 정자 DNA 함유 수용액 중, 50℃에서 30분간 항온반응시켰다. 그 후, 상기 정전하 나일론막 시트를 0.5 M 인산나트륨 및 1 M 염화나트륨을 포함하는 프로브 수용액[프로브는, 150 pmol의 ODN(anti4.5S) 또는 ODN(antiB1)] 중에서, 50℃로 1시간 항온반응시켰다. 이것을 실온에서 냉각 후, 하이브리드화 완충액을 제거하여, 새로운 인산 완충액을 첨가하고, 상기 정전하 나일론막 시트가 발하는 형광을, BioRad 사의 VersaDoc imaging system(상품명)에 의해 관측했다. 여기광으로서는, 와켄야쿠 가부시키가이샤의 UV 트랜스일루미네이터 Model-2270(상품명)로부터 발생한 광을 UV/청색광 컨버터 플레이트(UVP)를 통해 변환한 광을 이용했다.
도 27에 측정 결과를 나타낸다.
도 27(a)는 나일론막 상에 상이한 서열의 DNA 블롯한 상태를 도시하는 모식도이다.
상단의 4개의 스폿은 4.5 SRNA 서열 함유 DNA를 나타내고, 하단의 4개의 스폿은, B1 RNA 함유 DNA를 나타낸다.
도 27(b)는 ODN(anti4.5S) 함유 용액에 항온반응시킨 후의 형광 발광을 나타내는 도면이다.
도 27(c)는 ODN(antiB1) 함유 용액에 항온반응시킨 후의 형광 발광을 나타내는 도면이다.
도 27에 도시하는 바와 같이, 블롯 스폿의 형광은, 블로팅 분석 후, 반복 세정하지 않고, 실온에서, 형광 영상화 장치로 읽는 것이 가능했다. 상기 프로브에 의한 항온반응 결과, ODN(anti4.5S) 첨가에 따르면, 4.5S 서열의 스폿에 연유되는 강한 형광 발광을 얻을 수 있었지만, B1 서열의 스폿에 연유되는 형광 발광은, 무시할 수 있는 정도였다. 대조적으로, ODN(antiB1)첨가에 따르면, B1 스폿이 강한 형광을 나타내고, 4.5S 스폿으로부터는 매우 약한 형광밖에 관측되지 않았다. 이와 같이, 본 발명의 프로브에 따르면, 블로팅 후에, 다단층의 번잡한 세정 공정 및 항체 또는 효소 처리 공정을 필요로 하지 않는 점에서, 종래의 블로팅 분석과는 명확하게 상이한 분석을 실현할 수 있다. 또한, 분자 비컨 등의 on-off 프로브와 상이하게고, 본 발명 프로브에서는, 형광성 색소 표지 부분을 복수 도입하는 것도 용이하고, 이에 따라 형광 강도를 더 증진시킬 수 있다. 이것은 본 발명의 큰 이점이다. 상기 형광성 색소 표지 부분은, 예컨대, 본 실시예와 같이, [113](4)뉴클레오티드에 포함되고 있는 것이더라도 좋다.
[실시예 20]
실시예 8에 있어서의 링커 길이(n=4)의 색소를 포함하는 폴리 T 프로브(상기 ODN2)를 미소 유리관을 이용한 마이크로 주입법에 의해 세포에 도입하고, 수은 램프와 냉각 CCD 카메라 및 형광 필터 세트(YFP 용)를 구비한 도립형(倒立型) 현미경에 의해 형광 발광을 측정했다. 도 28∼30에 그 결과를 나타낸다. 도 28은 미분 간섭 측정 시의 사진이고, 도 29는 형광 관찰 시의 사진이며, 도 30은 도 28과 도 29의 중첩이다. 도시한 바와 같이, 본 발명의 형광 프로브(표지 물질)는 세포 내에 발현된 mRNA의 폴리 A 말단 서열에 결합하여 발광했다. 즉, 본 발명의 형광 프로브(표지 물질)는, 시험관내 유전자 검출뿐만 아니라, 생체내 유전자 검출에도 효과 적이다.
[실시예 21]
상기 ODN2(서열5'-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3')에, 일반적인 형광 색소인 Cy5을 정법에 의해 더 결합시키고, 또한 그것을 상기 방법으로 세포에 도입했다. 여기서 Cy5는 상기 ODN2를 합성하는 과정에서, DNA 자동 합성기에 의해 상기 ODN2의 5'말단에 추가하는 것으로 결합시켰다(서열5'-Cy5-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3'). 형광 발광은 레이저주사형 공초점 현미경에 의해 측정했다. 도 31에, 그 결과를 나타낸다. 도 31A는 633 nm에 의해 여기하여 650 nm 이상의 형광을 취득하고 있고, Cy5 유래의 형광을 나타낸다. 도 31B는 488 nm에 의해 여기하여 505­550 nm의 형광을 취득하고 있고, 2개의 티아졸오렌지 부분에 연유되는 형광을 나타낸다. 도시한 바와 같이, ODN2는 세포 내에 발현된 mRNA의 폴리A 말단 서열에 결합하여 발광했다. 이에 따라, 세포 내 mRNA의 분포가 추적 가능했다. 본 발명의 화합물 또는 핵산은, 이와 같이, 복수 종류의 색소(형광성을 나타내는 원자단)를 도입하더라도 좋다. 이와 같이하면, 예컨대, 각 색소 형광의 λmax가 상이하게 되어, 멀티 컬러에 의한 검출도 가능하다.
[실시예 22]
상기 ODN2(서열5'-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3')를 상기 방법에 의해 세포핵에 주입하고, 직후(0초 후)로부터 약 4분반 후까지, 형광 발광을 상기 레이저주사형 공초점 현미경에 의해 추적했다(여기 488 nm, 형광 취득 505 nm-550 nm). 도 32에, 그 결과를 나타낸다. 도 32는 11개의 도로 분리되어 있고, 좌측으로부터 우측으로 및 상단으로부터 하단을 향해, ODN2 주입 후의 경과를 나타낸다. 각 도에 있어서의 경과 시간(ODN2 주입 후)은 하기 표 8과 같다. 도시한 바와 같이, 프로브 ODN2은 주입 직후는 세포핵에 집중해 있지만, 하이브리드화한 mRNA(폴리A)와 함께, 점차로 세포 전체로 분산한 것이 확인되었다. 본 발명에 따르면, 이와 같이 하여 mRNA를 추적하는 것도 가능하다.
[표 8]
0 초 8 초 38 초 68 초
98 초 128 초 158 초 188 초
218 초 248 초 278 초 -
[실시예 23]
상기 ODN2에 있어서, [113](4)의 양측의 T를 각각 24개로 늘린 ODN을 합성했다. 이것을 ODN7로 한다. 합성은, ODN2의 합성 방법과 동일하게 하여 행했다. 또한, ODN7의 서열은 5'-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[113](4)TTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTT)-3')이다(서열 번호 13). 이것을, 실시예 22와 동일한 방법으로 세포핵에 주입하여, 형광 강도를 측정했다. 도 33에, 일정 시간 경과 후의 형광 사진을 나타낸다. ODN7은 주입 직후에는 세포핵에 집중해 있었지만, 실시예 22와 동일하게, 하이브리드화한 mRNA(폴리A)와 함께, 점차로 세포 전체에 분산되고, 이윽고, 도 33과 같이, 세포핵 주변에 분산된 상태로 되었다.
[실시예 24: 멀티 컬러에 의한 검출]
실시예 11, 16 등에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 형광 프로브는, 흡수 파 장, 발광 파장 등을 변화시킴으로써 멀티 컬러에 의한 상보쇄 검출이 가능하다. 이 멀티 컬러에 의한 검출은, 예컨대, 상기 화합물 113, 117 및 120과 같이, 색소(형광성을 나타내는 원자단) 부분의 구조를 변화시킴으로써 달성 가능하다. 본 실시예에서는, 추가로 다종류의 형광 프로브를 합성(제조)하고, 멀티 컬러에 의한 상보쇄 검출을 행했다.
우선, 하기 화학식 121으로 표시되는 뉴클레오티드 구조를 포함하는 DNA쇄(프로브)를, 색소(형광성을 나타내는 원자단) 부분의 구조를 다양하게 변화시켜 합성했다. 하기 화학식 121에 있어서, 「Dye」란, 색소 부분을 나타낸다.
Figure 112009057492774-pct00053
구체적으로는, 상기 화학식(121)에 있어서 「Dye」의 부분이 각각 하기 화학식으로 표시되는 화합물(DNA쇄) 113, 120, 122, 123 및 124를 합성했다. n은 각각 링커 길이(탄소 원자수)이다. 화합물 113, 120, 122, 123 및 124에 대해, n=3, 4, 5 및 6인 화합물을 각각 합성했다. 합성 방법은, 상기 색소 107 대신에 각각 대응하는 구조의 색소를 이용하는 외에는 상기 실시예 1∼4, 6, 8, 9, 12, 13 또는 16 과 동일하게 행했다. 상기 색소 107을 대신하는 색소의 합성도, 원료의 구조를 적절하게 바꾸는 외에는 상기 색소 107의 합성(상기 실시예 6의 반응식 5)과 동일하게 행했다. 또한, 화합물 113 및 120은 상기 각 실시예의 화학식 113의 화합물 및 화학식 120과 각각 동일한 구조이다.
Figure 112009057492774-pct00054
Figure 112009057492774-pct00055
Figure 112009057492774-pct00056
Figure 112009057492774-pct00057
Figure 112009057492774-pct00058
상기 화합물 113, 120, 122, 123 및 124에 대해 각각, 서열5'-d(CGCAATX(n)TAACGC)-3'로 표시되는 ODN을 합성했다. X는, 113, 120, 122, 123 또는 124이다. n은 링커 길이이다. 서열5'-d(CGCAAT[113](n)TAACGC)-3'로 표시되는 ODN은 상기 ODN1과 동일하다. 서열5'-d(CGCAAT[120](n)TAACGC)-3'로 표시되는 ODN은 상기 ODN6와 동일하다. 서열5'-d(CGCAAT[122](n)TAACGC)-3'로 표시되는 ODN을 ODN8로 한다. 서열5'-d(CGCAAT[123](n)TAACGC)-3'로 표시되는 ODN을 ODN9로 한다. 서열5'-d(CGCAAT[124](n)TAACGC)-3'로 표시되는 ODN을 ODN10으로 한다. ODN1, ODN6, ODN8, ODN9 및 ODN10에 대해, n=3, 4, 5 및 6인 ODN을 각각 합성했다.
ODN1(n=4), ODN6(n=4), ODN8(n=4), ODN9(n=4) 및 ODN10(n=4)에 대해 각각, 상보쇄인 ODN1'과 이중쇄를 형성시킨 후에, 형광 발광 스펙트럼을 측정했다. 여기 파장 이외의 측정 조건은, 상기 각 실시예와 동일하다. 그 결과를, 하기 표 9에 나 타낸다. 하기 표 9 중, Ex는 여기 파장을 나타내고, Em은 형광 발광의 극대 파장을 나타낸다. 또한, 여기 파장(Ex)는 흡수의 극대 파장(λmax)과 거의 동등하게 했다.
[표 9]
Figure 112009057492774-pct00059
표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 ODN은 이중쇄를 형성했을 때에, 456nm로부터 654 nm까지의 폭넓은 파장 범위에서 각각 다른 형광 발광의 극대 파장(Em)을 나타냈다. 즉, 본 실시예(실시예 24)로 합성한 ODN을 이용하여, 멀티 컬러에 의한 상보쇄 DNA의 검출이 가능했다. 또한, 본 실시예의 화합물(DNA쇄) 113, 120, 122, 123 및 124, ODN1, ODN6, ODN8, ODN9 및 ODN10에 대해, 상기 각 실시예와 동일하게 사용하여, 상보쇄 RNA의 검출, 도트 블로팅 해석, 세포 내 mRNA의 검출 등의 전부를 멀티 컬러로 행하는 것이 가능한 것을 확인했다.
이상과 같이, 본 발명에 따르면, 예컨대, 핵산의 이중 나선 구조를 효과적으로 검출 가능한 표지 물질을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 표지 물질을 이용한 핵산 검출 방법 및 키트를 제공할 수 있다. 상기 본 발명의 화합물 및 핵산은, 상기 화학식 (1), (1b), (1c), (16), (16b), (17), (17b), (18) 또는 (18b)에 나타내는 특징적인 구조를 갖는 것에 의해, 예컨대, 핵산의 이중 나선 구 조를 효과적으로 검출 가능한 표지 물질로서 이용할 수 있다. 본 발명의 표지 물질은, 핵산의 검출 감도 등에 우수하기 때문에, 연구용, 임상용, 진단용, 시험관내 유전자 검출, 생체내 유전자 검출 등, 폭넓은 용도에 사용 가능하다. 또한, 본 발명의 화합물 및 핵산의 용도는 여기에 한정되지 않고, 어떠한 용도로 이용하더라도 좋다.
SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Mononucleoside or mononucleotide derivative compound, Nucleic acid, Labeling substance, Detecting method of nucleic acid and Kit <130> TF07054-01 <150> JP 07/059921 <151> 2007-03-09 <150> JP 07/246253 <151> 2007-09-21 <150> JP 07/335352 <151> 2007-12-26 <160> 13 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 1 cgcaatntaa cgc 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <400> 2 gcgttaaatt gcg 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 3 ttttttnntt ttt 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 4 ttttttnttt ttt 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <400> 5 aaaaaaaaaa aaa 13 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 6 tgaagggctt ntgaactctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <400> 7 cagagttcaa aagcccttca 20 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 8 cgcaatnnaa cgc 13 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n represents for modified pyrimidine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 9 gcctcctnca gcaaatccna ccggcgtg 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n represents for modified pyrimidine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 10 cctcccaagn gctgggatna aaggcgtg 28 <210> 11 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA fragment <400> 11 gccggtagtg gtggcgcacg ccggtaggat ttgctgaagg aggcagaggc aggaggatca 60 cgagttcgag gccagcctgg gctacacatt ttttt 95 <210> 12 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA fragment <400> 12 gccgggcatg gtggcgcacg cctttaatcc cagcacttgg gaggcagagg caggcggatt 60 tctgagttcg aggccagcct ggtctacaga gtgag 95 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA oligomer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n represents for modified pyrimidine <400> 13 tttttttttt tttttttttt ttttnttttt tttttttttt ttttttttt 49

Claims (39)

  1. 하기 화학식 (16), (16b), (17) 또는 (17b)로 표시되는 구조를 적어도 하나 포함하는 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00113
    Figure 112015020669597-pct00114
    Figure 112015020669597-pct00115
    Figure 112015020669597-pct00116
    상기 화학식 (16), (16b), (17) 및 (17b) 중,
    B는 천연 핵산 염기(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실) 골격 또는 인공 핵산 염기 골격을 갖는 원자단이고,
    Z11 및 Z12는 각각 엑시톤 효과를 나타내는 형광성 원자단이고, 동일하거나 상이하여도 좋으며,
    L1, L2 및 L3은 각각 링커(가교 원자 또는 원자단)이고, 주쇄 길이(주쇄 원자수)는 임의적이며, 주쇄 중에 C, N, O, S, P 및 Si를 각각 포함하거나 포함하지 않아도 좋고, 주쇄 중에 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 이미노기, 에테르 결합, 티오에테르 결합 및 티오에스테르 결합을 각각 포함하고 있거나 포함하지 않아도 좋으며, L1, L2 및 L3은 서로 동일하거나 상이하여도 좋고,
    D는 CR, N, P, P=O, B 또는 SiR이며, R은 수소 원자, 알킬기 또는 임의 치환기이고,
    b는 단일 결합, 이중 결합 또는 삼중 결합이거나,
    또는, 상기 화학식 (16) 및 (16b) 중, L1 및 L2는 상기 링커이며, L3, D 및 b는 존재하지 않고, L1 및 L2가 B에 직접 결합하고 있어도 좋으며,
    상기 화학식 (16) 및 (17) 중, E는 데옥시리보스 골격, 리보스 골격, 또는 이들 중 어느 하나로부터 유도되는 구조를 갖는 원자단이며, 인산 가교 중 적어도 하나의 O 원자가 S 원자로 치환되어 있어도 좋고,
    상기 화학식 (16b) 및 (17b) 중, E는 펩티드 구조 또는 펩토이드 구조를 갖는 원자단이며,
    상기 화학식 (17) 및 (17b) 중, 각 B는 동일하거나 상이하여도 좋고, 각 E는 동일하거나 상이하여도 좋다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 (16), (16b), (17) 및 (17b) 중,
    E가 DNA, 수식 DNA, RNA, 수식 DNA, LNA, 또는 PNA(펩티드 핵산)의 주쇄 구조를 갖는 원자단인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (16) 중,
    Figure 112015020669597-pct00117
    로 표시되는 원자단이 하기 화학식 (2-1) 또는 (3-1)로 표시되는 원자단이고,
    Figure 112015020669597-pct00118
    Figure 112015020669597-pct00119
    상기 화학식 (16b) 중,
    로 표시되는 원자단이 하기 화학식 (4-1)로 표시되는 원자단이고,
    Figure 112015020669597-pct00121
    상기 화학식 (17) 중,
    Figure 112015020669597-pct00122
    로 표시되는 원자단이 하기 화학식 (2b-1) 또는 (3b-1)로 표시되는 원자단이고,
    Figure 112015020669597-pct00123
    Figure 112015020669597-pct00124
    상기 화학식 (17b) 중,
    Figure 112015020669597-pct00125
    로 표시되는 원자단이 하기 화학식 (4b-1)로 표시되는 원자단인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00126
    상기 화학식 (2-1), (3-1), (4-1), (2b-1), (3b-1) 및 (4b-1) 중,
    B는 상기 화학식 (16), (16b), (17) 및 (17b)와 동일하고,
    상기 화학식 (2-1) 및 (2b-1) 중,
    A는 수소 원자, 수산기, 알킬기 또는 전자 흡인기이고,
    상기 화학식 (3-1) 및 (3b-1) 중,
    M 및 J는 각각 CH2, NH, O 또는 S이며, 동일하거나 상이하여도 좋고,
    인산 가교 중의 O 원자는 하나 이상이 S 원자로 치환되어 있어도 좋다.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 화학식 (16)으로 표시되는 구조가 하기 화학식 (16-1) 또는 (16-2)로 표시되는 구조이고,
    상기 화학식 (16b)로 표시되는 구조가 하기 화학식 (16b-1) 또는 (16b-2)로 표시되는 구조이고,
    상기 화학식 (17)로 표시되는 구조가 하기 화학식 (17-1)로 표시되는 구조이고,
    상기 화학식 (17b)로 표시되는 구조가 하기 화학식 (17b-1)로 표시되는 것인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00127
    Figure 112015020669597-pct00128
    Figure 112015020669597-pct00129
    Figure 112015020669597-pct00130
    Figure 112015020669597-pct00131
    Figure 112015020669597-pct00132
    상기 화학식 (16-1), (16-2), (16b-1), (16b-2), (17-1) 및 (17b-1) 중,
    1, m 및 n은 임의적이고, 동일하거나 상이하여도 좋으며, 주쇄 중에 C, N, O, S, P 및 Si를 각각 포함하거나 포함하지 않아도 좋고, 주쇄 중에 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 이미노기, 에테르 결합, 티오에테르 결합 및 티오에스테르 결합을 각각 포함하거나 포함하지 않아도 좋으며,
    B, E, Z11 및 Z12는 상기 화학식 (16), (16b), (17) 또는 (17b)와 동일하고,
    상기 화학식 (16-1) 및 (16b-1)에서 b는 상기 화학식 (16) 및 (16b)와 동일하다.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (16), (16b), (17) 및 (17b) 중,
    Z11 및 Z12는 각각 독립적으로 티아졸오렌지, 옥사졸옐로우, 시아닌, 헤미시아닌, 그 외의 시아닌 색소, 메틸레드, 아조 색소 또는 이들의 유도체로부터 유도된 기인 것인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (16), (16b), (17) 및 (17b) 중,
    Z11 및 Z12는 각각 독립적으로 하기 화학식 (7) 내지 (9) 및 (31) 중 어느 하나로 표시되는 원자단인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00133
    Figure 112015020669597-pct00134
    Figure 112015020669597-pct00135
    Figure 112015020669597-pct00136
    상기 화학식 (7)∼(9) 및 (31) 중,
    X1 및 X2는 각각 S 또는 O이고, 동일하거나 상이하여도 좋으며,
    n은 0 또는 양의 정수이고,
    R1∼R10, R13∼R21은 각각 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 니트로기 또는 아미노기이며,
    R11 및 R12 중 하나는 상기 화학식 (16), (16b), (17) 또는 (17b) 중의 L1 또는 L2, 또는 상기 화학식 (16-1), (16-2), (16b-1), (16b-2), (17-1) 또는 (17b-1) 중의 NH에 결합하는 연결기이고, 다른 하나는 수소 원자 또는 저급 알킬기이며,
    R15가 화학식 (7), (8) 또는 (9) 중에 복수 존재하는 경우에는 동일하거나 상이하여도 좋고,
    R16이 화학식 (7), (8) 또는 (9) 중에 복수 존재하는 경우에는 동일하거나 상이하여도 좋으며,
    Z11 중의 X1, X2 및 R1∼R21과 Z12 중의 X1, X2 및 R1∼R21은 서로 동일하거나 상이하여도 좋다.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 (16), (16b), (17) 및 (17b) 중,
    B가 Py, Py der., Pu, 또는 Pu der.로 표시되는 구조인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염으로서,
    단,
    상기 Py는 하기 화학식 (11)로 표시되는 6원환 중, 1번 위치에 E와 결합하는 공유 결합손을 갖고, 5번 위치에 링커부와 결합하는 공유 결합손을 갖는 원자단이며,
    상기 Py der.은 상기 Py의 6원환의 전체 원자의 적어도 하나가 N, C, S 또는 O 원자로 치환된 원자단이고,
    상기 Pu는 하기 화학식 (12)로 표시되는 축합환 중, 9번 위치에 E와 결합하는 공유 결합손을 갖고, 8번 위치에 링커부와 결합하는 공유 결합손을 갖는 원자단이며,
    상기 Pu der.은 상기 Pu의 5원환의 전체 원자의 적어도 하나가 N, C, S 또는 O 원자로 치환된 원자단인
    핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00137
  8. 제7항에 있어서, 하기 화학식 (13-1), (13-2), (14-1) 또는 (14-2)로 표시되는 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00138
    Figure 112015020669597-pct00139
    Figure 112015020669597-pct00140
    Figure 112015020669597-pct00141
    상기 화학식 (13-1) 및 (14-1) 중, E, Z11 및 Z12는, 상기 화학식 (16)과 동일하고,
    상기 화학식 (13-2) 및 (14-2) 중, E, Z11 및 Z12는, 상기 화학식 (16b)와 동일하고,
    Py, Py der., Pu 및 Pu der.는 제7항에서 정의한 바와 같다.
  9. 제1항 또는 제2에 있어서, 하기 화학식 (10-1) 또는 (10-2)로 표시되는 구조를 갖는 것인 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염:
    Figure 112015020669597-pct00142
    Figure 112015020669597-pct00143
    상기 화학식 (10-1) 중, E, Z11 및 Z12는 상기 화학식 (16)과 동일하고,
    상기 화학식 (10-2) 중, E, Z11 및 Z12는 상기 화학식 (16b)와 동일하다.
  10. 제1항 또는 제2항에 기재된 핵산, 그 호변 이성체 또는 입체 이성체, 또는 이들의 염을 포함하는 표지 물질.
  11. 표지 올리고뉴클레오티드인 제10항에 기재된 표지 물질을 기질로서 핵산 합성을 수행하고, 상기 엑시톤 효과를 나타내는 형광성 원자단 Z11 및 Z12가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
    상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
    상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 비교함으로써 핵산 합성을 검출하는 공정을 포함하는 것인 핵산 검출 방법.
  12. 단일쇄 핵산인 제10항에 기재된 표지 물질을 제1 핵산으로 하여, 상기 제1 핵산과 상보적인 서열 또는 그것에 유사의 서열을 갖는 제2 핵산을 하이브리드화시켜 핵산 합성을 수행하고, 상기 엑시톤 효과를 나타내는 형광성 원자단 Z11 및 Z12가 인터켈레이션 또는 그룹 바인딩된 이중쇄 핵산을 합성하는 공정과,
    상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에서의 형광 강도를 각각 측정하는 공정과,
    상기 이중쇄 핵산 합성 공정의 전후에 있어서의 형광 강도를 비교함으로써 상기 제1 핵산과 상기 제2 핵산의 하이브리드화를 검출하는 공정을 포함하는 것인 핵산 검출 방법.
  13. 핵산 합성 수단과, 표지 물질과, 형광 강도 측정 수단을 포함하고, 상기 표지 물질이 제10항에 기재된 표지 물질인 키트.
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