JP2014515268A - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、生物試料を含む試料(例えば、血液、鼻咽頭または咽頭スワブ、糞便、創傷スワブ、または他の組織)中の、黄色ブドウ球菌(「SA」)およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)を検出するための方法、プローブおよびプライマーを提供する。
I.一般
本開示は、黄色ブドウ球菌(SA)およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の検出のための方法、プローブおよびプライマーを提供する。開示する方法および組成物は、臨床的に適当なレベルの検出を可能にする高感度、高い特異性および高速でもって、SAおよびMRSAに対して特異性が高い。これらの方法および組成物を好都合に用いて、試料中のSAおよびmecAを増幅および/または検出することができる。幾つかの実施形態において、mecAは黄色ブドウ球菌以外の細菌で検出する。
本明細書中で使用する「試料」とは、黄色ブドウ球菌を含むことが疑われるいずれかの起源の試料をいう。これらの試料は、本明細書に記載する方法によって試験することができる。試料は研究室起源のものであっても、研究室以外の起源のものであってもよい。試料は、緩衝液、抽出溶媒、溶媒などのような液体材料に懸濁または溶解することができる。試料には、動物およびヒトの組織または全血液、血液画分、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、乳、尿、呼吸器、腸および尿生殖路の様々な外分泌物、および涙などの体液などの生物試料;および細胞抽出物、細胞培養上清のような生物流体、固定組織標本および固定細胞標本も含まれる。試料には、鼻咽頭または咽頭スワブ、糞便、創傷または直腸スワブが含まれる。生物試料には、生検や剖検試料または組織学目的で採取された凍結切片のような組織の切片も含むことができる。生物試料は、例えばヒトなどを含むいずれの動物からも得られる。
本発明の方法は、SAマーカーとしてのldh1およびメチシリン耐性マーカーとしてのmecAを組み合わせた検出に基づくSAおよびMRSA核酸の増幅および/または検出に関する。プライマーおよびプローブは、単一の反応または別の反応において同時にSAおよびMRSAを検出する本発明の方法に使用するのに好適である。典型的に、この方法は、ゲノムDNAで行い、ついでそれをいずれかのDNA-ベースの増幅方法で増幅する。1のかかる増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応である(例えば、米国特許第4,683,195号および第4,965,188号;Mullisら,Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,51 Pt 1:263-273(1986))ご参照)。増幅は、幾つかの販売業者から現在入手可能な試薬を用いて行う(例えば、Life Technologies;Carlsbad,CA;およびQuiagen;Valencia,CA)。
(a)ldh1核酸を含むことが疑われる試料と、式:
5'-(X)nY-3' (I)
(式中、XはSA核酸に非相補的であるフラップ・プライマーの5'部分を表し、nは0または1であり、Yはldh1核酸に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、ここにXは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第1のフラップ・プライマーおよび第2のフラップ・プライマーとを接触させ、
(b)mecA核酸を含むことが疑われる同じ試料と、式::
5'-(X)nY'-3' (II)
(式中、XはmecA核酸に非相補的であるフラップ・プライマーの5'部分を表し、nは0または1であり、Y'はmecA核酸に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、ここにXは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第3のフラップ・プライマーおよび第4のフラップ・プライマーとを接触させ、
(c)ldh1およびmecA核酸を増幅するのに十分な条件下で工程(a)および(b)の混合物をインキュベートし、それによって増幅したldh1およびmecA核酸を生成し;ついで
(d)存在する場合には増幅したldh1およびmecA核酸を検出することが含まれる。
配列番号:1
GGTGAACATGGTGACACTGAATTACCAGTATGGTCACACGCTAATATTGCGGGTCAACCTTTGAAGACATTACTTGAACAACGTCCTGAGGGCAAAGCGC(配列番号:1)
配列番号:2
GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCGCTATAGATTGAAAGGATCTGTACTGGGTTAATCAGTATTTCACCTTGTCCGTAACC(配列番号:2)
AATAAATCATAA(配列番号:3)。
5'-GCGCTTTGCCCTCAGGACG-3'(配列番号:5)。好ましくは、第1のフラップ・プライマーには、以下の配列が含まれ:
5'-Ra-G*ACATTACT*T*GA*ACAA*CG-Rb-5'(配列番号:10)
(式中、Raは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、F1は約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オン(SUPER G(登録商標)、Elitech Group)であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、RaおよびRbの置換はプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光を消光させる)。
5'-Ra-G*AAAGGATCTGTACTGG*G-Rb-5'(配列番号:11)
(式中、Raは独立して(M)a-F1および(M)a-Qから選択され、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Mはマイナーブルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400から900nmに発光波長を有する発蛍光団であり、G*はSUPER G(登録商標)(Elitech Group)であって、Qは非-蛍光消光剤であるが、但し、RaおよびRbの置換により、プローブがハイブリダイズしない場合には蛍光を消光させる)。
(a)黄色ブドウ球菌の核酸を含むことが疑われる試料と:
(i)以下の配列を含む第1のフラップ・プライマー:
(ii)以下の配列を含む第2のフラップ・プライマー:
とを接触させ、
(b)ldhl核酸を増幅するのに十分な条件下で工程(a)の反応混合物をインキュベートし、それによって、SAを含有する試料から増幅した核酸を発生させ;ついで
(c)増幅したSA核酸を検出する
ことが含まれる。
(i)配列番号:8の配列を含む第3のフラップ・プライマー、
GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCG;および
(ii)配列番号:9の第4の配列を含む第4のフラップ・プライマー、
GGTTACGGACAGGTGAAATAITGATTACC(式中、Iは3-アルキニル-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オン(スーパーイノシン)である)
とを接触させる、工程(a)後のさらなる工程を追加することができ、ここに第3および第4のフラップ・プライマーには、各々、mecA核酸に相補的である配列部分が含まれる。
(a)以下の配列を含む第1のフラップ・プライマー:
(b)以下の配列を含む第2のフラップ・プライマー:および
が含まれる。
(a)以下の配列を含む第1のフラップ・プライマー:
5'-GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCG-3'(配列番号:8)、および
(b)以下の配列を含む第2のフラップ・プライマー:
5'-GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC -3'(配列番号:9)
が含まれる。
5'-Ra-G*ACATTACT*T*GA*ACAA*CG-Rb-5'(配列番号:10)
(式中、Raは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qであり、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、G*はSuper G(登録商標)(Elitech Group)であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、プローブがハイブリダイズしない場合、RaおよびRbの置換により蛍光が消光される)。
5'-Ra-G*AAAGGATCTGTACTGG*G-Rb-3'(配列番号:11)
(式中、Raは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qであり、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、G*はSuper G(登録商標)(Elitech Group)であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、プローブがハイブリダイズしない場合、RaおよびRbの置換により蛍光が消光される)。
CTGCACGGACCAGTTACTTTACGGACCACGTACCGCATTGGTACAAGATCTCCGGTAGAAAAAATGAG-3'(配列番号:12)。
プローブ:5'-Ra-G*AATG*CGGTACGTGGTCC-Rb-3'(配列番号:13);
プライマー:CTGCACGGACCAGTTACTTTACG (配列番号:14);
CTCATTTTTTCTACCGGAGATCTTGT (配列番号:15)
(式中、Raは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、G*はSuper G(登録商標)(Elitech Group)であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、プローブがハイブリダイズしない場合、RaおよびRbの置換により蛍光が消光される)。
(a)試料と、式:
5'-(X)nY-3' (I)
(式中、Xはldh1遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5‘部分を表し、nは0または1であり、Yはldh1遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、およびXは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第1のフラップ・プライマーおよび第2のフラップ・プライマーとを接触させ;
(b)工程(a)後の試料と、式:
5'-(X)nY'-3' (I)
(式中、XはmecA遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5‘部分を表し、nは0または1であり、Y'はmecA遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、およびXは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第3のフラップ・プライマーおよび第4のフラップ・プライマーとを接触させ;
(c)増幅したldh1およびmecA遺伝子を産生するのに十分な条件下で工程(a)および(b)後の試料をインキュベートし;ついで
(d)増幅したldh1およびmecA遺伝子と蛍光発生プローブとを接触させ、ここに第1の蛍光発生プローブは増幅したldh1遺伝子および野生型ldh1遺伝子に相補的であり、第2の蛍光発生プローブは増幅したmecA遺伝子および野生型mecA遺伝子に相補的であり、ついで
(e)蛍光発生プローブの存在下で増幅したldh1およびmecA遺伝子に対して融解曲線分析を行うことが含まれ、ここに増幅したldh1核酸と野生型ldh1核酸との融解温度(Tm)の約3-12℃の差異が、増幅したldh1核酸中の突然変異の存在を示し、増幅したmecA核酸と野生型mecA核酸との融解温度(Tm)の約3-12℃の差異が、増幅したmecA核酸中の突然変異の存在を示す。
CTCGTCAGAATTAATTGGACCCACATAACCTAAAAGGTGTACTG
TTGCTTCGTTCAATGGATAAACACGGC(配列番号:19)
CTCGTCAGAAT*T*AATTGGACCCAC(配列番号:20)(式中、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオン(SUPER T(登録商標)、Elitech Group)であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、プローブがハイブリダイズしない場合、RaおよびRbの置換により蛍光が消光される)。さらなる実施形態において、第2のmecALGA251プライマーには、以下の配列が含まれる:GCCGTGTTTATCCATTGAACGAAGCA(配列番号:21)。
5'-Ra-G*TAAAAGGTGTA*CTGTTGC-Rb-3'(配列番号:27)
(式中、Raは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オン(SUPER G(登録商標)、Elitech Group)であり、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、プローブがハイブリダイズしない場合、RaおよびRbの置換により蛍光が消光される)。
5'-Ra-G*ATAAAAT*T*T*GTA*TA*GG-Rb-3'(配列番号:28)および
5'-Ra-FAM-AAAT*T*T*CAAATCACTAC-Rb-3'(配列番号:29)
(式中、Raは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Rbは独立して(M)a-Flおよび(M)a-Qから選択され、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オン(SUPER G(登録商標)、Elitech Group)であり、T*はSuper Tであり、A*は4-(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オール(SUPER A(登録商標)、Elitech Group)であり、Qは非蛍光消光剤であるが、但し、プローブがハイブリダイズしない場合、RaおよびRbの置換により蛍光が消光される)。もう1の方法には、配列番号:27ないし29のいずれか10のヌクレオチド塩基が含まれる。
1の態様において、最も一般的に5'-X-Y-3'または5'-(X)nY'-3'プライマーとして記載するオリゴヌクレオチド・プライマー(「オーバーハング・プライマー」、「フラップ・プライマー」または「アダプター・プライマー」)が提供される。Xはldh1またはmecA核酸に非相補的であるプライマーの配列部分を表し、YまたはY'は、各々、ldh1またはmecA核酸に相補的であるプライマーの配列部分を表す。
5'-(X)n-Y-3' (I)または
5'-(X)n-Y'-3' (II)
(式中、Xはldh1またはmecA核酸に非相補的であるプライマーの5'配列を表し、Yはldh1に対するプライマーの相補的3'配列を表し、Y'はmecAに対するプライマーの相補的3'配列を表し、5'-X-Y-3'または5'-(X)nY'-3'は核酸オリゴマー・プライマーを表す)。ある種のさらなる実施形態において、Xは[A-B]mであり、Yは[A-B]pであり、ここにAは糖リン酸骨格、修飾型糖リン酸骨格、ロックされた核酸骨格、核酸調製に使用したそれらのキメラまたは変異型であり;Bは核酸塩基または塩基の修飾塩基を表し;およびmは約3-18または4-16、通常は約8-15、10-14または11-13、さらに通常は約12の整数である。添字pは約4-50、通常は約8-20、10-18または12-16の整数である。ある種の実施形態において、添字mおよびnの値は等しく、例えば、mおよびpの両方が同時に8-15、10-14または11-13、より通常は約12とすることができる。
V.さらなる増幅反応成分
緩衝液
塩濃度
マグネシウムイオン濃度
デオキシヌクレオチド三リン酸濃度
核酸ポリメラーゼ
VI.他の試薬
VII.マイナーグルーブバインダー
VIII.連結基
IX.使用方法
X.キット
XI.コンピュータ解析
実施例
CFU/mL=コロニー数×10×希釈係数
状況1:CT1>35.0かつCT2>35.0かつIC CT<34.0の場合には、結果は「MRSA陰性/SA陰性」である。
状況2:CT1>35.0かつCT2>35.0かつIC CT≧34.0の場合には、結果は「無効」である。
状況3:CT1≦35.0かつCT2≦35.0かつ|CT1−CT2|<2の場合には、結果は「MRSA陽性」である。
状況4:CT1≦35.0かつ|CT1−CT2|≧2の場合には、結果は「MRSA陰性/SA陽性」である。
状況5:CT1>35.0かつCT2≦35.0の場合には、結果は「MRSA陰性/SA陰性」である。
状況1
E2=IF(AND(C2<=35.05,ABS(C2-D2)<2,D2<=35.05),"MRSA",IF(AND(C2<=35.05,ABS(C2-D2)>=2),"SA","NEG"))
結果呼び出し:「MRSA陰性/SA陰性」
状況3
E7=IF(AND(C7<=35.05,ABS(C7-D7)<2,D7<=35.05),"MRSA",IF(AND(C7<=35.05,ABS(C7-D7)>=2),"SA","NEG"))
結果呼び出し:「MRSA陽性」
状況4
E20= =IF(AND(C20<=35.05,ABS(C20-D20)<2,D20<=35.05),"MRSA",IF(AND(C20<=35.05,ABS(C20-D20)>=2),"SA","NEG"))
結果呼び出し:「MRSA陰性/SA陽性」
状況5
E4 =IF(AND(C4<=35.05,ABS(C4-D4)<2,D4<=35.05),"MRSA",IF(AND(C4<=35.05,ABS(C4-D4)>=2),"SA","NEG"))
結果呼び出し:「MRSA陰性/SA陰性」
参考文献
米国特許文献
米国特許第3,194,805;3,128,179;3,996,345;4,351,760;4,683,195;4,683,202;4,965,188;5,187,288;5,188,934;5,227,487;5,248,782;5,304,645;5,433,896;5,442,045;5,492,806;5,525,464;5,556,752;5,556,959;5,583,236;5,808,044;5,852,191;5,986,086;5,994,056;6,020,481;6,127,121;6,156,507;6,162,931;6,171,785;6,180,295;6,221,604;6,569,627;6,727,356;6,790,945;6,946,267;6,949,367;7,348,146;7,671,218;7,767,834;7,838,221;RE 38,416号
米国特許出願公開第2005/0118623
国際特許文献
国際公開WO 03/023357、WO 02/062816、WO 92/10588およびWO 96/17957
EP特許第1408366、1314734
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Claims (59)
- 核酸を含む試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (「MRSA」)を検出する方法であって:
試料中の核酸を増幅し;ついで
増幅したmecAおよびldh1遺伝子を含む試料中の核酸を検出することを含み、ここに、増幅したmecAおよびldh1遺伝子の存在がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在を示す該方法。 - 増幅したldh1遺伝子が配列番号:1を含み、増幅したmecA遺伝子が配列番号:2を含む請求項1記載の方法。
- 増幅したmecAおよびldh1遺伝子がほぼ1:1の比で存在する請求項1記載の方法。
- 増幅を、検出工程の間に連続してモニターする請求項1記載の方法。
- さらに、増幅したmecAおよびldh1遺伝子のリアルタイム濃度を計算する工程を含み、ここに濃度における差異が、試料中の黄色ブドウ球菌およびコアグラーゼ陰性キャリアの混合感染を示す請求項4記載の方法。
- 試料がMRAS感染症を有することが疑われる動物からのものである請求項1記載の方法。
- 動物がヒトである請求項6記載の方法。
- 試料を、創傷スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブまたは糞便試料から収集する請求項6記載の方法。
- 増幅したmecAおよびldh1遺伝子を、mecAまたはldh1特異的プローブへのハイブリダイゼーションによって検出する請求項1記載の方法。
- プローブが蛍光発生プローブである請求項9記載の方法。
- 増幅したmecAおよびldh1遺伝子をmecAまたはldh1特異的標識プライマーによって検出する請求項1記載の方法。
- プライマーが蛍光発生プライマーである請求項11記載の方法。
- さらに、少なくとも1の増幅したSCCmec組込み部位またはブリッジ領域を含む試料中の核酸を検出する工程を含む請求項1記載の方法。
- さらに、ldh1に加えて少なくとも1の増幅した黄色ブドウ球菌(「SA」)特異的遺伝子を含む試料中の核酸を検出する工程を含む請求項1記載の方法。
- 試料中の黄色ブドウ球菌(「SA」)およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)核酸を検出する方法であって、
(a)試料と、式:
5'-(X)nY-3' (I)
(式中、Xはldh1遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5'部分を表し、nは0または1であり、Yはldh1遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第1のフラップ・プライマーおよび第2のフラップ・プライマーとを接触させ;
(b)工程(a)後の試料と、式:
5'-(X)nY'-3' (I)
(式中、XはmecA遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5'部分を表し、nは0または1であり、Y'はmecA遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)を有する第3のフラップ・プライマーおよび第4のフラップ・プライマーとを接触させ;
(c)ldh1およびmecA遺伝子を増幅するのに十分な条件下で工程(a)および(b)後の試料をインキュベートし;ついで
(d)試料中の増幅したldh1およびmecA遺伝子を検出する
ことを含む該方法。 - 増幅したldh1遺伝子が配列番号:1を含み、増幅したmecA遺伝子が配列番号:2を含む、請求項14記載の方法。
- Xが約9〜約15ヌクレオチド長である請求項14記載の方法。
- Xが配列番号:3、AATAAATCATAAを含む請求項14記載の方法。
- Yが配列番号:4の配列、GGT*GA*ACA*TGGTGACACTGAAT(式中、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4-(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールである)を含む、請求項14記載の方法。
- Yが配列番号:5の配列、GCGCTTTGCCCTCAGGACGを含む請求項14記載の方法。
- 第3のフラップ・プライマーが配列番号:8の第3の配列、GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCG(式中、nは0である)を含み、第4のフラップ・プライマーが配列番号:9の第4の配列、GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC(式中、xは0であり、Iは3-アルキニル-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンである)を含む請求項14記載の方法。
- 試料が、MRSA感染症を有することが疑われる動物からのものである請求項14記載の方法。
- 動物がヒトである請求項22記載の方法。
- 試料を、創傷スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブ、血液または糞便試料から収集する請求項22記載の方法。
- 増幅した遺伝子を検出工程中に連続してモニターする請求項14記載の方法。
- 増幅したmecAおよびldh1遺伝子を、mecA特異的プローブまたはldh1特異的プローブへのハイブリダイゼーションによって検出する請求項14記載の方法。
- プローブが蛍光発生プローブである請求項26記載の方法。
- ldh1特異的蛍光-発生プローブが、配列番号:10の配列、5'-Ra-G*ACATTACT*T*GA*ACAA*CG-Rb 5'(式中、Raは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Rbは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、Qは非-蛍光消光剤であり、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4,(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールであり、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オン(式中、RaおよびRbのうちの1は発蛍光団を含み、もう1は消光剤を含み、プローブがハイブリダイズしない場合に消光剤は蛍光を消光させる)を含む請求項26記載の方法。
- mecA特異的蛍光-発生プローブが、配列番号:11の配列、5'-Ra-G*AAAGGATCTGTACTGG*G-Rb 5'(式中、Raは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Rbは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、Qは非-蛍光消光剤であり、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ [3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンであり、ここにRaおよびRbのうちの1は発蛍光団を含み、もう1は消光剤を含み、プローブがハイブリダイズしない場合に消光剤は蛍光を消光させる)を含む請求項26記載の方法。
- 増幅したmecAおよびldh1遺伝子を、mecA特異的標識プライマーまたはldh1特異的標識プライマーによって検出する請求項14記載の方法。
- プライマーが蛍光発生プライマーである請求項30記載の方法。
- さらに、少なくとも1の増幅したSCCmec組込み部位またはブリッジ領域を含む試料中の核酸を検出する工程を含む請求項30記載の方法。
- ldh1またはmecA核酸を含むことが疑われる試料中の複数のヒトMRSAからの核酸を同時に検出する方法であって:
(a)試料と、配列番号:6の第1の配列、AATAAATCATAAGGT*GA*ACA*TGGTGACACTGAAT(式中、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4,(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールである)を含む第1のフラップ・プライマーおよび配列番号:7の第2の配列、AATAAATCATAAGCGCTTTGCCCTCAGGACGを含む第2のフラップ・プライマー(ここに、第1および第2のフラップ・プライマーは、各々、ldh1核酸に相補的である配列部分を含む)とを接触させ;
(b)工程(a)後の試料と、配列番号:8の第3の配列、GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCGを含む第3のフラップ・プライマーおよび配列番号:9の第4の配列、GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC(式中、Iは3-アルキニル-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンである)を含む第4のフラップ・プライマーとを接触させ(ここに、第3および第4のフラップ・プライマーは、各々、mecA核酸に相補的である配列部分を含む)とを接触させ;
(c)ldh1およびmecA核酸を増幅するのに十分な条件下で工程(a)および(b)後の試料をインキュベートし、それによって、増幅したldh1およびmecA核酸を産生し;ついで
(d)増幅したldh1およびmecA核酸を検出する
ことを含む該方法。 - 増幅したldh1およびmecA核酸が1:1の比で存在する請求項33記載の方法。
- 検出工程が、さらに、増幅したmecAおよびldh1遺伝子のリアルタイム濃度を計算することを含み、ここに、2以上の濃度の差異が試料中の黄色ブドウ球菌およびmecAキャリアの混合感染を示す請求項33記載の方法。
- 試料が、MRSA感染症を有することが疑われる動物からのものである請求項33記載の方法。
- 動物がヒトである請求項36記載の方法。
- 試料を、創傷スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブ、血液または糞便試料から収集する請求項36記載の方法。
- 増幅したldh1およびmecA核酸を検出工程で連続してモニターする請求項33記載の方法。
- 配列番号:8の第1の配列、GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCGを有する第1のプライマー;および配列番号:9の第2の配列、GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC(式中、Iは3-アルキニル-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンである)を有する第2のプライマーを含み、ここに第1および第2プライマーは、各々、mecA核酸に相補的である配列部分を含む、試料中のmecA核酸を検出するキット。
- さらに、試料中のldh1核酸を検出するための請求項40記載のキットであり、さらに:
配列番号:6の第3の配列、AATAAATCATAAGGT*GA*ACA*TGGTGACACTGAAT(式中、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4,(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールである)を含む第3のフラップ・プライマー;および配列番号:7の第4の配列、AATAAATCATAAGCGCTTTGCCCTCAGGACGを含む第4のフラップ・プライマー(ここに、第3および第4のフラップ・プライマーは、各々、ldh1核酸に相補的である配列部分を含む)
を含む該キット。 - さらに、mecAおよびldh1核酸にハイブリダイズし、それらを検出する蛍光発生プローブを含む請求項41記載のキット。
- プローブが、配列番号:10の配列、5'-Ra-G*ACATTACT*T*GA*ACAA*CG-Rb 5'および配列番号:11の配列、5'-Ra-G*AAAGGATCTGTACTGG*G-Rb 5'(式中、Raは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Rbは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、Qは非-蛍光消光剤であり、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4-(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールであり、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンである)を含み、ここに、RaおよびRbの1が発蛍光団を含み、他の1が消光剤を含み、プローブがハイブリダイズしない場合に消光剤は蛍光を消光させる、請求項42記載のキット。
- さらに、対照核酸を含む請求項40記載のキット。
- 対照核酸が配列番号:12の配列、CTGCACGGACCAGTTACTTTACGGACCACGTACCGCATTGGTACAAGATCTCCGGTAGAAAAAATGAG
を含む請求項44記載のキット。 - ldh1およびmecA核酸を含むことが疑われる試料中のldh1およびmecA遺伝子中の突然変異を検出する方法であって:
(a)試料と、式:
5'-(X)nY-3' (I)
(式中、Xはldh1遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5'部分を表し、nは0または1であり、Yはldh1遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第1のフラップ・プライマーおよび第2のフラップ・プライマーとを接触させ;
(b)工程(a)後の試料と、式:
5'-(X)nY'-3' (I)
(式中、XはmecA遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5'部分を表し、nは0または1であり、Y'はmecA遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)を有する第3のフラップ・プライマーおよび第4のフラップ・プライマーとを接触させ;
(c)増幅したldh1およびmecA遺伝子を生成するのに十分な条件下で工程(a)および(b)後の試料をインキュベートし;ついで
(d)増幅したldh1およびmecA遺伝子と、蛍光発生プローブとを接触させ、ここに第1の蛍光発生プローブは増幅したldh1遺伝子および野生型ldh1遺伝子に相補的であり、第2の蛍光発生プローブは増幅したmecA遺伝子および野生型mecA遺伝子に相補的であり、ついで
(e)蛍光発生プローブの存在下で増幅したldh1およびmecA遺伝子に対して融解曲線分析を行うことを含み、ここに増幅したldh1核酸と野生型ldh1核酸との融解温度(Tm)の約3-12℃の差異が、増幅したldh1核酸中の突然変異の存在を示し、増幅したmecA核酸と野生型mecA核酸との融解温度(Tm)の約3-12℃の差異が、増幅したmecA核酸中の突然変異の存在を示す該方法。 - 第1のフラップ・プライマーが配列番号:6の第1の配列、AATAAATCATAAGGT*GA*ACA*TGGTGACACTGAAT(式中、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4-(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールである)を含み、第2のフラップ・プライマーが配列番号:7の第2の配列、AATAAATCATAAGCGCTTTGCCCTCAGGACGを含む請求項46記載の方法。
- 第3のフラップ・プライマーが配列番号:8の第3の配列、GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCG(式中、nは0である)を含み、第4のフラップ・プライマーが配列番号:9の第4の配列、GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC(式中、xは0であり、Iは3-アルキニル-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンである)を含む請求項46記載の方法。
- 第1の蛍光発生プローブが配列番号:10の配列、5'-Ra-G*ACATTACT*T*GA*ACAA*CG-Rb 5'を含み、第2の蛍光発生プローブが配列番号:11の配列、5'-Ra-G*AAAGGATCTGTACTGG*G-Rb 5'(式中、Raは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Rbは(M)a-Flまたは(M)a-Qであり、Mはマイナーグルーブバインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有する発蛍光団であり、Qは非-蛍光消光剤であり、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンであり、A*は4-(4,6-ジアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-ブト-3-イン-1-オールであり、G*は6-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4(5H)-オンである)を含み、ここに、RaおよびRbの1が発蛍光団を含み、他の1が消光剤を含み、プローブがハイブリダイズしない場合に消光剤は蛍光を消光させる、請求項46記載の方法。
- 配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の配列を含む単離された核酸。
- 核酸を含む試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)を検出する方法であって:
試料中の核酸を増幅し;ついで
少なくとも1の増幅したSSCmec組込み部位またはブリッジ領域および少なくとも1のldh1遺伝子を含む試料中の核酸を検出することを含み、ここに少なくとも1の増幅したSCCmec組込み部位またはブリッジ領域および少なくとも1のldh1遺伝子の存在がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在を示す該方法。 - 核酸を含む試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)を検出する方法であって:
試料中の核酸を増幅し;ついで
増幅したmecA、ldh1およびmecALGA251遺伝子を含む試料中の核酸を検出することを含み、ここに増幅したmecAおよびldh1遺伝子または増幅したmecALGA251およびldh1遺伝子の同じ量の存在がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在を示す該方法。 - ldh1、mecALGA251およびmecA遺伝子の組み合わせた検出を用いて試料中の黄色ブドウ球菌(「SA」)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌LGA251(「LGA251」およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)核酸を検出する方法であって、
(a)試料と、式:
5'-(X)nY-3' (I)
(式中、Xはldh1遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5‘部分を表し、nは0または1であり、Yはldh1遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第1のフラップ・プライマーおよび第2のフラップ・プライマーとを接触させ;
(b)工程(a)後の試料と、式:
5'-(X)nY'-3' (I)
(式中、XはmecA遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5‘部分を表し、nは0または1であり、Y'はmecA遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第3のフラップ・プライマーおよび第4のフラップ・プライマーとを接触させ;
(c)工程(b)後の試料と、式:
5'-(X)nY'-3' (I)
(式中、XはmecA遺伝子に非相補的であるフラップ・プライマーの5‘部分を表し、nは0または1であり、Y'はmecA遺伝子に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3-30ヌクレオチド長である)
を有する第5のフラップ・プライマーおよび第6のフラップ・プライマーとを接触させ;
(d)増幅したldh1、mecAおよびmecALGA251遺伝子を増幅するのに十分な条件下で工程(a)、(b)および(c)後の試料をインキュベートし;ついで
(e)試料中のldh1、mecAおよびmecALGA251遺伝子を検出する
ことを含む該方法。 - 配列番号:20の第1の配列、CTCGTCAGAAT*T*AATTGGACCCAC(式中、T*は5-(4-ヒドロキシ-ブト-1-イニル)-1H-ピリミジン-2,4-ジオンである)を有する第1のプライマー、および
配列番号:21の第2の配列、GCCGTGTTTATCCATTGAACGAAGCAを有する第2のプライマーを含む、試料中のmecALGA251核酸を検出するためのキット。 - 核酸を含む試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)を検出する方法であって:
試料中の核酸を増幅し;ついで
少なくとも1の増幅したSCCmec組込み部位またはブリッジ領域および少なくとも1のmecALGA251遺伝子を含む試料中の核酸を検出することを含み、ここに少なくとも1の増幅したSCCmec組込み部位またはブリッジ領域および少なくとも1のmecALGA251遺伝子の存在が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在を示す該方法。 - 試料と配列番号:20を有する第1のプライマーとを接触させ、ついで
試料と配列番号:21を有する第2のプライマーとを接触させることを含む、mecA251遺伝子を検出する方法。 - a)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(「MRSA」)検出アッセイを用いて対象からの試料を分析して、試料についてのmecA、ldh1および対照サイクル閾値(CqsまたはCts)を決定し、それによって試料MRSA検出データを作成し;
b)該試料MRSA検出データをシステムに入力し、ここに該システムは:
i)データを受領し、プロセシングし、および通信するコンピュータ・プロセッサ、
ii)mecA、ldh1および対照サイクル閾値(Cts)の参照データベースおよびそれらの割り当てられたMRSA検出状況を含むデータを保存するためのストーレッジ・コンポーネント、および
iii)該コンピュータ・プロセッサーに包含され、該参照データベースに沿って該試料MRSA検出データをプロセシングして、結果として試料のMRSA検出状況を決定するように設計されたコンピュータ・プログラム
を含み、
c)該試料MRSA検出データを該参照データベースに沿って該コンピュータ・プログラムでプロセシングして、結果として試料の該MRSA検出状況を決定し;ついで
d)該コンピュータ・プログラムから該結果を通信する
ことを含む方法。 - MRSA検出状況が、MRSA陽性、MRSA-陰性/SA-陰性、無効な分析、MRSA-陰性/SA-陽性およびMRSA-陰性/SA-陰性を含む請求項57記載の方法。
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