JP2015511116A - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の変異型ｍｅｃＡ株の検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、変異型ｍｅｃＡ遺伝子を有するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出のための改良された試験を提供する。この試験は、患者サンプルのＭＲＳＡにこの変異型が存在することによる特定の偽陰性結果を除外するのに特に有用である。

Description

本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の分子検出に関する。より詳しくは、本発明はｍｅｃＡ遺伝子の変異体を有する株をさらに含むＭＲＳＡの改良された検出に関する。

黄色ブドウ球菌株は、1961年に初めて、メチシリンに耐性があることが示された。現在、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、院内および市中感染を引き起こす、最も一般的な抗生物質耐性病原菌の一つである。ＭＲＳＡ株は、可動遺伝因子であるStaphylococcal Cassette Chromosome mec（ＳＣＣｍｅｃ）が感受性黄色ブドウ球菌株の染色体内に捕捉および挿入されることにより出現する。実際、このＳＣＣｍｅｃ因子がメチシリン耐性の原因となるｍｅｃＡ遺伝子を保有する（Staphylococcal Cassette Chromosome mec; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45(5):1323-1336; Hiramatsu, et al., 2001, Trends Microbiol. Oct;9(10):486-93）。ｍｅｃＡ遺伝子は、ＰＢＰ２ａまたはＰＢＰ２’と呼ばれる修飾ペニシリン結合タンパク質をコードする。未変性のＰＢＰに反し、このＰＢＰ２ａは、β-ラクタム系抗生物質に対する親和性が低いため、β-ラクタム系抗生物質の存在下においても細胞壁の合成を継続することが可能である。

ＳＣＣｍｅｃ遺伝子は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびその他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、主に表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびＳ．ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の染色体の中に取り込むことができる。ＳＣＣｍｅｃは、逆方向および順方向末端反復配列の存在、一組の部位特異的なリコンビナーゼ遺伝子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびにｍｅｃＡ遺伝子複合体により特徴付けられる（Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:1549-1555）。このｍｅｃＡ遺伝子カセットＳＣＣｍｅｃの黄色ブドウ球菌ゲノムへの挿入部位は公知であり、配列が保存されている（Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336）。黄色ブドウ球菌染色体への挿入後、ＳＣＣｍｅｃは左端部連結領域（left extremity junction region）および右端部連結領域（right extremity junction region）にそれぞれ囲まれ、ＳＣＣｍｅｃカセットおよび染色体ＤＮＡを含む、左端部連結領域および右端部連結領域を有し（図１参照）、ここでＳＣＣｍｅｃ配列は、黄色ブドウ球菌染色体配列に隣接している。ＳＣＣｍｅｃＤＮＡの左右の境界を取り囲んでいる領域のヌクレオチド配列（すなわち、それぞれ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）、ならびにＳＣＣｍｅｃＤＮＡ組込み部位の周囲の領域のヌクレオチド配列（すなわち、ａｔｔＢｓｃｃ、ＳＣＣｍｅｃＤＮＡに対する細菌染色体付着部位）は、これまでに分析されている。組込み部位の配列分析により、ａｔｔＢｓｃｃが、新規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端、ｏｒｆＸに位置することが明らかとなった。ｏｒｆＸは、２３ＳｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼとして最近解析されている１５９アミノ酸のポリペプチド（http://www.uniprot.org/uniprot/Q6I7F2）をコードする。ＳＣＣｍｅｃのｍｅｃＡ領域の組織が、さらに研究されている(Oliveira, D.C., et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44(7):1906-1910)。

一般に、患者におけるＭＲＳＡでは、患者から鼻腔スワブを採取し、繰り返し培養して、ＭＲＳＡ株が存在するかどうか判定する。鼻腔スワブから直接、かつ大幅に短い時間でＭＲＳＡを同定可能にする、より新規な方法が開発されている。サンプルもまた進化しており、多くの論文が、同じ患者のいくつかの解剖学的部位をサンプル採取してＭＲＳＡキャリアの検出可能性を高めることに興味を示している。その部位は鼻に加え、咽喉、脇の下、鼠蹊部および、または会陰でありうる。（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus colonisation at different Body Sites: a Prospective, Quantitative Analysis, Mermel et al. 2011, Journal of Clinical Microbiology）。

増幅は周知の技術であり、転写に基づく増幅、例えば転写介在増幅（ＴＭＡ；米国特許第５，７６６，８４９号；同第５，３９９，４９１号；同第５，４８０，７８４号；同第５，７６６，８４９号；および同第５，６５４，１４２号）ならびに核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；同第５，１３０，２３８号；同第５，４０９，８１８号；同第５，６５４，１４２号；および同第６，３１２，９２８号）、ならびにサイクリング核酸増幅技術（サーモサイクリング）、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，９６５，１８８号；同第４，６８３，２０２号）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；米国特許第５，７９２，６０７号）を含む様々な方法が開発されている。また、公知の増幅法として、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、およびカスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）も含まれる。

核酸を利用する検出法も当分野でよく知られている。核酸は、様々な検出目的のために標識される場合が多い。例えば、米国特許第４，４８６，５３９号（Kourlisky）；同第４，４１１，９５５号（Ward）；同第４，８８２，２６９号（Schneider）および４，２１３，８９３号（Carrico）に記載される方法は、特定の核酸配列を検出するための標識された検出プローブの調製を説明する。異なる検出法、例えば標的捕捉、ＨＰＡ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコンおよびサンドイッチハイブリダイゼーションのためのプローブ設計も記載されている（例えば、米国特許第４，４８６，５３９号、および米国特許第４，７５１，１７７号；同第５，２１０，０１５号；同第５，４８７，９７２号；同第５，８０４，３７５号；同第５，９９４，０７６号）。核酸ハイブリダイゼーション技法および条件は、当業者に公知であり、例えば、多くのその他の刊行物の中でも、Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Lab. Press, Dec. 1989；米国特許第４，５６３，４１９号（Ranki）および同第４，８５１，３３０号（Kohne）ならびにDunn, et al., Cell 12, pp. 23-26 (1978)に、特に記載されている。

ｍｅｃＡ遺伝子および黄色ブドウ球菌特異的染色体配列の検出に基づいてＭＲＳＡを検出および同定するために以前開発された、分子的方法が記載されている（Saito et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500; Ubukata et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733; Murakami et al., 1991, J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244; Hiramatsu et al., 1992, Microbiol. Immunol. 36:445-453）。しかし、カセット連結部位のみの検出に基づく試験において、ＳＣＣｍｅｃの右端部の小さい断片を含有するメチシリン感受性黄色ブドウ球菌分離株に関して偽陽性が観察されている（Rupp, J. et al., J. Clin. Microbiol. 44(6): 2317 (2006)を参照のこと）。さらに、RamakrishnanおよびRiccelliは、ＳＣＣｍｅｃカセット配列の一部および挿入領域（左端部連結領域）中の黄色ブドウ球菌配列の一部を含む、ＳＣＣｍｅｃカセット挿入部位の左連結部位の近くの領域と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを利用する、ＭＲＳＡを検出するための方法を記載している（米国特許出願公開第２００６００５７６１３号）。

黄色ブドウ球菌により特異的に保有されるメチシリンに対する耐性を決定するための以下の概念が発表されている。
-ＳＣＣmec右端部連結部位増幅概念（Hiramatsu et al．国際公開第９７／３１１２５号；欧州特許第０８８７４２４号；米国特許第６，１５６，５０７号；およびさらに、Huletsky and Rossbach 国際公開第０２／０９９０３４号（２００２）；Huletsky et al., J. Clin.Microbiol. 42(5): 1875-1884 (2004)）；
-Francoisおよび共同研究者により記載される、免疫選択菌培養の後に続いて３種類のマーカー（ｍｅｃＡ遺伝子、黄色ブドウ球菌特異的マーカー、および表皮ブドウ球菌特異的マーカー）が増幅される、免疫選択菌培養（immuno-enrichment）概念（Francois, P et al., J. Clin. Microbiol. 41(1):254-260 (2003)；国際公開第０２／０８２０８６号）、
-ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位増幅とｍｅｃＡ増幅の組み合わせ(Jay, et al. 米国特許出願公開第２００９０２０３０１３号；国際公開第２００９／０８５２２１号、これらの全体は参照により組み込まれる)。

ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位概念は、ＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右端部連結領域を網羅する領域の増幅に基づく。原則は以下のとおりである：ＳＣＣｍｅｃカセットは、ｏｒｆＸと呼ばれる黄色ブドウ球菌特異的オープンリーディングフレームの上流の黄色ブドウ球菌染色体に組み込まれ；増幅（例えばＰＣＲ）アッセイは、該カセットの右部分（ＳＣＣｍｅｃカセットの「右端部連結領域」）に位置する複数の順方向プライマー、１つの逆方向プライマーおよびプローブを組み合わせるものであり、両方とも黄色ブドウ球菌染色体ｏｒｆＸ、すなわちｏｒｆＸを含むＳＣＣｍｅｃの右端部連結部位の下流（ｏｒｆＸの「右端部連結領域」）に位置する。Hiramatsu et al.は、カセットの右端部連結領域で２つの順方向プライマーを用いて、その当時にいわれていた主なＳＣＣｍｅｃの型を増幅する試験を記載している（１つのプライマーはＳＣＣｍｅｃＩ型およびＩＩ型のためのものであり、２番目のプライマーはＩＩＩ型のためのものである）。Huletsky et alは、Hiramatsuに記載される２つの順方向プライマーのみを使用した場合に数種類のＭＲＳＡ菌株が検出されなかったこと、およびかれらがＳＣＣｍｅｃカセットの右部分に配列多様性を有する、ＭＲＥＪ型と名付けられた新しい型のカセットを決定したことを示す。市販されている（Infectio Diagnostics Inc.）試験は、カセットの右部分に位置する５つの順方向プライマー（１つのプライマーはＭＲＥＪｉ型およびｉｉ型の検出用に、その他の４つのプライマーはＭＲＥＪｉｉｉ型、ｉｖ型、ｖ型およびｖｉｉ型用に設計された）、ｏｒｆＸに位置する１つの逆方向プライマー、ならびに、ｏｒｆＸ領域の同じ部分を網羅し、同定されたｏｒｆＸ変異体を同定するために必要な３種の一般的なプローブを組み合わせたものである。この試験は、リアルタイムＰＣＲで行われる。しかし、報告されるように（Huletsky et al．２００４）、この試験の特異性により、４．６％のＭＳＳＡ（試験した５６９例の中の２６例）が誤まって同定されたことが示される。偽陽性の結果は、単一遺伝子座（右端部ＳＣＣｍｅｃカセット−ｏｒｆＸ連結部位）ＰＣＲアッセイを用いる別の市販の試験でも報告されている（Rupp, J, et al., J. Clin. Microbiol. (44)6: 2317 (2006)）。

米国特許出願公開第２００９／０２０３０１３号は、ＭＲＳＡ偽陽性の主要因に対応し、当時利用可能な試験によって対応されていなかった、ＭＲＳＡを検出するための改良された試験を提供した。この出願は、これまでの分子的方法による偽陽性の同定が、場合によっては、ＭＳＳＡ中のｍｅｃＡを含有する染色体領域の欠失の直後の残留ＳＣＣｍｅｃ右端部断片の存在、または、ｍｅｃＡを含有しないＳＣＣｍｅｃの存在により、説明することができることを提示した。さらに、その出願は、一部の偽陽性が非特異的増幅に起因する可能性を提供した（実際に、逆方向プライマーおよびプローブは、ＭＲＳＡとＭＳＳＡの両方に共通しているｏｒｆＸに位置するため、ＭＳＳＡ染色体での順方向プライマー（複数でも可）の非特異的アニーリングは、ＭＳＳＡの増幅および検出につながる）。その出願は、偽陽性の両方の要因に対応し、改良された試験を提供した。この原理を利用したアッセイは、市販されている(NucliSENS EasyQ(R) MRSA, bioMerieux, SA, Marcy l'Etoile, フランス)。

従来、黄色ブドウ球菌におけるメチシリン耐性の検出のためのアッセイでは、ｍｅｃＡ遺伝子がＳＣＣｍｅｃカセットに存在し、メチシリンに対する耐性を株にもたらすことを確認するか、またはｍｅｃＡ遺伝子が存在しない（カセットから除去されるか、カセットが存在しない）ことを確認し、株がメチシリンの影響を受けると判断した。ｍｅｃＡ遺伝子のパブリックデータバンクから入手可能な多数の配列を考慮すると、ＭＲＳＡから、または他のメチシリン耐性病原体から、いくつかの突然変異体のみが発見され、ｍｅｃＡ遺伝子の保存性が高いことが分かった。

最近、従来のＰＣＲおよびマイクロアレイ配列決定によりｍｅｃＡの欠如が判明した、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌が検出された（Shore, A.C. et al., Antimicrob. Agents Chemother. Doi:10.1128/AAC.00187-11 (2 June 2011) and Garcia-Alvarez, L. et al., Lancet doi:10.1016/S1473-3099(11)70126-8 (3 June 2011) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine population in the UK and Denmark: a descriptive study.）。全ゲノム配列決定により、３０ｋｂのＳＣＣｍｅｃ因子が高度に分岐したｂｌａＺ−ｍｅｃＡ−ｍｅｃＲＩ−ｍｅｃＩを有することが明らかになり、ＳＣＣｍｅｃ因子内に存在するｍｅｃ因子が、黄色ブドウ球菌ｍｅｃＡ同族体に対し、７０％の配列同一性を有し、さらに、ＳＣＣｍｅｃ因子が、先に同定されたＳＣＣｍｅｃＸＩ型とほぼ同一であることが示された(International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elementsのウェブサイトに記載された配列タイプ４２５ウシＭＲＳＡ株ＬＧＡ２５１)。ＳＣＣｍｅｃ因子は、他のすべてのＳＣＣｍｅｃ因子と同じ、ｏｒｆＸ内のヌクレオチド配列部位で組み込まれる。さらに、株は、クラスＥｍｅｃ複合体、ｃｃｒＡ１−ｃｃｒＢ３からなる８型カセット染色体リコンビナーゼ（ｃｃｒ）複合体、ヒ素耐性オペロン、および隣接順方向反復を含んでいた。本検出方法は、この株をＭＲＳＡとして同定しない。

Shore et al.は、ＦＲ８２３２９２株を標準株として用い、ｍｅｃＡ＿Ｍ１０／００６１プライマーを用いた。Garcia-Alvarez et al.は、ＬＧＡ２５１ゲノムの分岐ｍｅｃＡを調査し、この変異型ｍｅｃＡは、「ＸＩ型ＳＣＣｍｅｃ」と呼ばれる新たなカセットに位置する。ＬＧＡ２５１株が標準株として用いられ、ｍｅｃＡ＿ＬＧＡ２５１プライマーが用いられた。実際には、２つの刊行物は同じ対象に言及している。両方の変異型ｍｅｃＡは、非常に高い類似率（９９％）を共有し、同時に、これまでに知られるすべてのｍｅｃＡ配列に対し弱い全体的類似性を示す。

新たな亜型および株を同定すると、このような亜株および株を検出する手段が必要となる。これは、現存するアッセイがすでにそれを偶然検出おらず、したがって、偽陰性の結果がもたらされうる場合に、特に重要である。本発明は、このような株を検出可能なアッセイを提供することにより、ｍｅｃＡ変異株を含む株の検出に関する要望に応える。さらに、本新規発明は、同じアッセイにおいて、黄色ブドウ球菌株とメチシリン耐性遺伝子の両方の存在を確認する。このアッセイは、単独で、または、他のＳＣＣｍｅｃ型のための既存のアッセイと組合せて用いる事ができる。

本発明は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
前記サンプルに対し、オリゴヌクレオチドセットを利用して増幅反応をもたらす工程を備え、前記オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向される方法を提供する。

本発明は、さらに、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡまたは変異型ｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
前記サンプルに対し、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットとを利用して増幅を行う工程を備え、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向される方法を提供する。

本発明は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅するためのキットであって、前記キットが第１のオリゴヌクレオチドセットを備え、該第１のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと、必要に応じて
ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドとを備えるキットを提供する。

さらに、本発明は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅するためのキットであって、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）変異型ｍｅｃＡＤＮＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットとを備えるキットを提供する。

全体として、ＳＳＣｍｅｃカセットを挿入したＭＲＳＡ染色体の領域を示し、左右の端部連結部を示す。 全体として、変異型ｍｅｃＡ（ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}）を有するＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したＭＲＳＡ染色体の領域を示す。

前述のとおり、本発明は、（一般的に、現在市販されているＭＲＳＡ検出キットで検出されない）変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含み１回の増幅反応でｍｅｃＡの適切な箇所およびＳＣＣｍｅｃカセットの黄色ブドウ球菌染色体への挿入箇所の端部連結部の両方を、増幅可能であるように配置された構造を有する、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の株の同定を可能にする。本発明は、新たに発見された偽陰性結果の要因に対応し、改良された試験を提供する。

別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示される本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似するかまたは同等であるあらゆる方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料は、記載されるとおりである。

本明細書および添付される特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに指示されている場合を除いて、複数形への言及を含むものとする。

本発明により同定する株はメチシリン耐性をもつが、これまでのところ保存性が高いことが知られている古典的なｍｅｃＡ遺伝子を含まない。メチシリン耐性は、この場合、新たな変異型ｍｅｃＡ遺伝子によって付与される。１つの考証された変異型ｍｅｃＡは、刊行物において、ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}、ｍｅｃＡ_{Ｍ１０／００６１}、ｍｅｃＡ同族体、ｍｅｃＡ_{ｎｅｗ ｖａｒｉａｎｔ}など様々に呼ばれている（この変異体は、最近になって、「ｍｅｃＣ」と改称することが提案されている［Ito, T. et al., Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues, Agents Chemother. doi:10.1128/AAC.01199-12］）が、他の変異型ｍｅｃＡを本発明で検出しうる。明細書および特許請求の範囲において用いられるように、用語「変異型ｍｅｃＡ」を用いて、メチシリン耐性を付与するとともに、請求項に記載された、特に、増幅反応において、単一のプライマーセットで、変異型ｍｅｃＡの適切な部分（すなわち、変異型ｍｅｃＡとして同定するのに十分な部分）および端部連結部の両方を含む領域を、ＳＣＣｍｅｃカセットの黄色ブドウ球菌染色体への挿入箇所において増幅させる方法によって検出される、任意の変異型ｍｅｃＡ遺伝子を指す。なお、増幅技術がさらに開発されると、単位複製配列をより長くすることが可能となり、変異型ｍｅｃＡ遺伝子を検出するためのプライマーセットが、変異型ｍｅｃＡ遺伝子の適切な部分およびＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結部を含む標的領域からさらにハイブリダイズするよう設計されうるようになりうる。

これまでに研究されたＭＲＳＡ株のＳＣＣｍｅｃカセットのサイズは様々であるが、一般的に、ｍｅｃＡ遺伝子は、黄色ブドウ球菌染色体から、ｏｒｆＸの方向（本明細書で「下流」とも呼ぶ）へは約８０００〜１５，０００ｂｐであり、他の方向へはさらに長くなることが分かっている（図１および図２ａ参照）。新たなＳＣＣｍｅｃＸＩ型では、変異型ｍｅｃＡ遺伝子は、約１５００ｂｐの距離で、ｏｒｆＸにより近接して位置することが分かっている（図２ｂ参照）。従来のＭＲＳＡを用いる場合、増幅設計は、連結部の検出とともに変異型ｍｅｃＡ遺伝子の検出の２部のアッセイ設計を予測し得えたが、出願人は、変異型ｍｅｃＡ遺伝子からｏｒｆＸへのより短い距離を利用する可能性を検討し、認識した。したがって、本発明は、変異型ｍｅｃＡ遺伝子と黄色ブドウ球菌染色体端部連結領域との間の領域（すなわち端部連結部位にわたって）を、変異型ｍｅｃＡ遺伝子のプライマーおよび端部連結領域（図２参照、例えば、右端部連結部位）内の黄色ブドウ球菌染色体領域のプライマーを用いることにより直接増幅し、有利である。さらに従来にない長さの単位複製配列について、出願人は、この設計が驚くほど良い効果を示すことを発見した。さらに、この新規の発明は、増幅が１回のみでよく、この増幅により、同じ反応において、黄色ブドウ球菌株および変異型メチシリン耐性遺伝子の存在が確認されるため、特異性の劣化の問題を解決する。

本発明は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
前記サンプルに対し、オリゴヌクレオチドセットを利用して増幅反応をもたらす工程を備え、前記オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向される方法を提供する。
黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域は右端部連結領域内に存在しうる。

標的に特異的にハイブリタイズする本発明のオリゴヌクレオチドを、選択されたハイブリダイゼーション条件で、その標的に選択的にハイブリタイズする、すなわちその目的の標的と結合するが、非標的とは結合しないものとして選択することができる。ハイブリダイゼーション／増幅条件は、当該技術分野で知られるように、適切な厳密性のために選択し、選択性を達成することができる(例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001))。オリゴヌクレオチドの選択は若干変更することができるが、それは反応条件が、変更されたオリゴヌクレオチドが標的に特異的にハイブリダイズすることをゆるす限りにおいて可能である。

端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチド、および変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドは、各々プライマーとして機能することができる。また各々は、その特異的な標的核酸へのハイブリダイゼーションの際、かつ、該プライマーを含む増幅反応の開始の際に、第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域との間のＭＲＳＡの領域を含む単位複製配列が形成されるよう配向される。このような反応は、黄色ブドウ球菌染色体へ挿入されたＳＣＣｍｅｃの端部連結部にわたって増幅するよう（すなわち、増幅反応が連結部位にわたって広がるように連結部位に十分近接するよう）設計される。したがって、連結部位を増幅するために有用な、変異型ｍｅｃＡのためのプライマー対は、一般に、連結部位を事実上囲む、変異型ｍｅｃＡ内と黄色ブドウ球菌染色体領域内の２つの領域とハイブリダイズし、各プライマーは、増幅を連結部位に向かって５’−３’方向に向けられるようにハイブリダイズするように配向される。一般に、変異型ｍｅｃＡのためのプライマーは、連結部位の１６００ｎｔ、１５５０ｎｔ、１５００ｎｔ、１４５０ｎｔ、１４００ｎｔ、１３５０ｎｔ、１３００ｎｔ、１２００ｎｔ、１１００ｎｔ、１０００ｎｔ、９００ｎｔ、８００ｎｔ、７００ｎｔ、６００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３５０ｎｔ、３００ｎｔ、２５０ｎｔ、２００ｎｔ、１５０ｎｔ、１００ｎｔ、５０ｎｔ、３０ｎｔ、２５ｎｔ、２０ｎｔなど以下でハイブリダイズするように設計されるが、新しい技術は、より長い単位複製配列を許容するため、プライマーは、連結部位からさらなる距離でハイブリタイズするよう設計することができる。変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有するプライマーは、変異型ｍｅｃＡ遺伝子を有するＳＣＣｍｅｃの組織および連結部位からの変異型ｍｅｃＡ遺伝子の距離のため、一般的に、端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有するプライマーよりも連結部位から遠くでハイブリタイズするよう設計される。

ｏｒｆＸ−変異型ｍｅｃＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドセットは、第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域との間のＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドとをさらに備えることができ、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。このようなオリゴヌクレオチドは、増幅産物を検出するためのプローブとして機能することができ、したがって、第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域との間の領域に特異的にハイブリダイズすることができるように選択される。特定の実施形態において、このようなプローブは、ｏｒｆＸの領域などの、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる。別の実施形態では、プローブは、ＳＣＣｍｅｃカセットＤＮＡの右端部連結領域の領域（例えば、ｂｌａＺ配列内）に特異的にハイブリダイズすることができ、さらに別の実施形態では、プローブは、変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる。増幅は選択される任意の手段で検出することができる。例えば、この第３のオリゴヌクレオチドは、幾つかの手段のいずれかによって、幾つかの方法のいずれかを用いて標識することができる。そのため、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、２つのプライマーの間の核酸の増幅が発生し、標識されたプローブでありうる第３のオリゴヌクレオチドは単位複製配列にハイブリダイズしうる。第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは任意の公知の手段によって検出することができる。あるいは、挿入染料を用いて、２つのプライマーから増幅を検出することができる。プローブを用いる場合、プローブは、ＳＣＣｍｅｃカセットＤＮＡの右端部連結領域の領域に特異的にハイブリダイズするよう設計されうる。例えば、プローブは、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡのｏｒｆＸの領域などの、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。あるいは、プローブは、変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズするよう設計することができる。

本発明における任意の標的の有無は、産物の検出をもたらすあらゆる分析により決定することができ、例えば、標識されたプローブを使用する場合、ハイブリダイズした標識の適切な検出装置による検出により決定することができる。このような実施形態では、検出可能なシグナルがないことは、その標的が存在しないことを示し、検出可能なシグナルが認知されることは、その標的が存在することを示す。

端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる第１のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーの例として、これに限定されないが、ｏｒｆＸ領域で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドの例として、配列番号９および１０が挙げられる。変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドの例として、これらに限定されないが、配列番号６、７、１６、１７および２１からなる群から選択された核酸配列が挙げられる。これらの具体例は、順方向（すなわち、増幅をＳＣＣｍｅｃの右端部連結部位に向けるための）プライマーとして特に有用である。第１のオリゴヌクレオチドの（黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内でハイブリダイズする）ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの（変異型ｍｅｃＡの領域内でハイブリダイズする）ハイブリダイズ領域との間のＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる、プローブとして使用可能な第３のオリゴヌクレオチドの例として、これらに限定されないが、配列番号８，１８，１９で示される核酸配列が挙げられる。

ＭＲＳＡのゲノム構造の特徴は既に明らかにされている。特許請求の範囲において用いられるように、「ＳＣＣｍｅｃカセット」（「ｍｅｃＤＮＡ」とも呼ばれる。例えば、Hiramatsuの米国特許第６，１５６，５０７号）は、当該技術分野で周知の定義を有し、すなわち、ＭＲＳＡまたはＭＲ−ＣＮＳの染色体上に存在する組み込まれた外因性ＤＮＡであり、それには、ｍｅｃ遺伝子複合体、一組の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびに（３’および５’の両末端での）逆方向および順方向末端反復配列が含まれる。本明細書で用いられるように、この用語は、変異型ｍｅｃＡを含む株に見られるＳＣＣｍｅｃの変種を含む。「ｍｅｃＡ遺伝子」には、メチシリン耐性を付与する(すなわち、ＰＢＰ２ａまたはＰＢＰ２’（ペニシリン結合タンパク質）をコードする）ために必要なすべての配列が含まれる。

当該技術分野で周知のように、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体に挿入されると、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡのＳＣＣｍｅｃに２つの連結部位および２つの対応する連結領域が形成され、この際、ＳＣＣｍｅｃ配列は、黄色ブドウ球菌染色体配列に隣接している。そのため、該連結部位は、ＳＣＣｍｅｃカセットの左右の端部に位置する（図１参照）。これらの２つの領域は、Ｉｔｏらにより「右ＳＣＣｍｅｃ−染色体連結部位」および「染色体−左ＳＣＣｍｅｃ連結部位」と名付けられており（Antimicrob. Agents Chemother. May 2001 45(5): 1323-1336, “Structural Comparison of three Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Integrated in the chromosome in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus”）、本明細書においては、それぞれ「右端部連結部位」および「左端部連結部位」と呼ぶ。右端部連結部位では、ＳＣＣｍｅｃカセットに隣接する黄色ブドウ球菌ゲノム配列は、ｏｒｆＸ遺伝子であり、これは一部の文献では「ＩｎｔＭ」と称される。特許請求の範囲において用いられる「端部連結領域」は、右または左のいずれかの端部連結部位または挿入部位の距離内の、ＳＣＣｍｅｃカセットまたは黄色ブドウ球菌染色体核酸のいずれかの領域であり、ＳＣＣｍｅｃ（例えばＪ３領域）またはｏｒｆＸのいずれかでハイブリダイズするプライマーは、プライマー伸長反応または転写型の（例えば、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ）反応において、その連結部位の全域にわたり、例えば、連結部位の（いずれかの方向に）６００ｎｔ、５５０ｎｔ、５００ｎｔ、４５０ｎｔ、４００ｎｔ、３５０ｎｔ、３００ｎｔ、２５０ｎｔ、２００ｎｔ、１５０ｎｔ、１００ｎｔ、または５０ｎｔ以内まで伸長させることができる。有用な距離は、使用する増幅技術によって変化する可能性がある。「端部連結領域」は、そのために、使用される文脈によって、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡ内の領域または黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内の領域を意味しうる。いずれを使用しても、ＳＣＣｍｅｃ（例えばＪ３領域）またはｏｒｆＸのいずれかでハイブリダイズする、適切に選択されたプライマーが、適切で標準的な伸長または増幅条件下で、プライマーから、連結部位の方向に、連結部位にわたって伸長されるか、または転写されることができるような、連結部位の距離内のＤＮＡを指す。つまり、「ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域」は、その接合点（ａｂｕｔｍｅｎｔ）の近くのＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡ内の領域、または黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含む組込み部位であり、そして、「ｏｒｆＸの端部連結領域」は、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡを含む（ＳＣＣｍｅｃ組込み部位）接合点の近くのｏｒｆＸ−ＤＮＡ内の領域である。同様に、「黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域」は、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡを含む接合点の近くの黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内の領域である。あるいは、この領域は、「ＳＣＣｍｅｃ端部連結部位の領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ」とも呼ばれうる。したがって、「右端部連結領域」とは、ＳＣＣｍｅｃカセットの右（すなわち下流）側で連結部位を取り囲む領域をさし、「左端部連結領域」とは、ＳＣＣｍｅｃカセットの左（すなわち上流）側で連結部位を取り囲む領域を指す（図１参照）。

有利には、ＳＣＣｍｅｃ挿入連結部位およびｍｅｃＡ配列（例えば、Ｊａｙら）の検出を含む公知の方法を用いて、既に特徴が明らかにされている（もともとのｍｅｃＡ遺伝子を含む）ＭＲＳＡ株の存在を検出するための増幅反応とともに、新たに発見された変異型ｍｅｃＡを含む株を検出するための増幅を行うことができる。このような増幅および検出反応は、例えば、別個の容器または単一の容器内で、多重反応として行うことができる。したがって、変異型ｍｅｃＡを検出する反応に加えて，アッセイは、例えば、標準的な（すなわち、ＳＣＣｍｅｃＩ〜Ｘ型について説明するような）ＳＣＣｍｅｃカセット挿入部位、標準的な（すなわち、ＳＣＣｍｅｃＩ〜Ｘ型について説明するような）ｍｅｃＡ遺伝子、および／または黄色ブドウ球菌特異的染色体領域の連結領域を検出するための反応を含みうる。

「ｍｅｃＡＤＮＡの一部を増幅させる」とは、ｍｅｃＡ遺伝子の任意の部分、例えば、配列番号１２および１３で示される核酸配列を備えるプライマー間の領域などに相当する配列を含む増幅産物を生じる増幅反応をサンプルに対して行うことを意味する。例えば、プライマーは、配列番号１２および１３で示される核酸配列を備えうる。これらの配列を備えるプライマーおよび、これらの配列から本質的になるプライマーを、これらの配列からなるプライマーとともに利用することができる。例えば、プライマーの標的核酸の間の核酸配列を備えるプローブを利用するか、または挿入染料を用いて、増幅を検出することができる。プライマーおよびプローブは、公知のｍｅｃＡ配列へのハイブリダイゼーションのために設計することが容易である。

（連結部位）
本発明の方法は、変異型ｍｅｃＡが存在する場合の変異型ｍｅｃＡの増幅に加えて、増幅反応において、第２のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結部の増幅に利用することにより、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅させる工程をさらに備えることができ、前記第２のオリゴヌクレオチドセットは、
ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）ｍｅｃＡを含む前記ＭＲＳＡの前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドであって、
前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記右端部連結部が増幅されるよう配向される第２の連結オリゴヌクレオチドを備える。第２のヌクレオチドセットは、さらに前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドとを備えることができ、
前記サンプルが前記右端部連結部を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

第３の連結オリゴヌクレオチドはプローブでありうる。第３の連結オリゴヌクレオチドは、ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有するか、またはｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有しうる。あるいは、挿入染料の使用のような検出方法を行うことができる。増幅プライマーとして機能しうる第１の連結リゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有しうる。

本発明の任意の反応で使用されるプライマーおよびプローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。特異的ハイブリダイゼーションは当該技術分野で周知であり、一般に、特異的ハイブリダイゼーションは、核酸同一性またはプライマー／プローブと標的核酸との高度な類似性によって、かつ／または、厳密なハイブリダイゼーション条件（例えば、厳密な温度および／または塩条件）の使用によって達成される。特異的ハイブリダイゼーションは、反応内部での標的への選択的ハイブリダイゼーションを可能にする。

一般に、ｏｒｆＸ−変異型ｍｅｃＡ核酸を増幅する増幅反応以外の増幅反応（例えば、連結部位、非変異型ｍｅｃＡおよび／または黄色ブドウ球菌染色体領域を増幅する）では、プライマーは、そのプライマーを用いて合成された増幅産物および第２のプライマー（黄色ブドウ球菌ゲノム配列内に位置する）が、約１００〜３５０ヌクレオチド長となるように選択される。ＰＣＲ増幅は、より長い、またはより短い単位複製配列（例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｔまたはそれ以上）を生成するよう設計されうるが、本発明のｍｅｃＡ、連結部位または黄色ブドウ球菌染色体遺伝子の検出のための転写に基づく反応（例えば、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ）またはＰＣＲ型の反応のいずれかに好ましい単位複製配列長は、約１００〜３００ｎｔ（例えば、１５０、２００、２５０、３００ｎｔ）の長さである。さらに、多重増幅反応では、転写に基づくものであってもＰＣＲに基づくものであっても、これらの標的には、１００〜３００ｎｔの範囲またはそれより短い単位複製配列が、試験の感受性を高めるために好ましい。なお、端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを用いた増幅は、本アッセイの一部をなしうる他の増幅において一般に用いられる単位複製配列よりも長い単位複製配列を生じうる。また、増幅方法がさらに開発され、改良されると、より長い単位複製配列が可能となり、やがて当たり前となりえ、本発明に包含される。

「増幅条件下、連結部位が増幅」されるように配向されるプライマーには、その特異的標的核酸とのハイブリダイゼーションの際、かつ、該プライマーを含む増幅反応の開始の際に、連結部位を含む単位複製配列が形成されるように配向されるプライマーが含まれる。そのような反応は、連結部位にわたって増幅するよう（すなわち、典型的な増幅反応が連結部位にわたって広がるように連結部位に十分近接するよう）設計されている。従って連結部位を増幅するために有用なプライマー対は、一般に、連結部位を囲む２つの領域にハイブリダイズし、各プライマーは、連結部位に向かって５’−３’方向にハイブリダイズするように配向される。一般に、プライマーは、連結部位の６００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３５０ｎｔ、３００ｎｔ、２５０ｎｔ、２００ｎｔ、１５０ｎｔ、１００ｎｔ、５０ｎｔ、３０ｎｔ、２５ｎｔ、２０ｎｔなど以内でハイブリダイズするように設計される。そのため、増幅産物を検出するためのプローブは、プライマーの標的配列間のＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができるよう選択される。例えば、プローブは、黄色ブドウ球菌ゲノム配列（例えば、黄色ブドウ球菌プローブの標的配列と連結部位との間のｏｒｆＸ）内で、ＳＣＣｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃプライマーの標的配列と連結部位との間の）内で、または連結部位にわたってハイブリダイズすることができる。特定の実施形態では、このようなプローブは、完全にＳＣＣｍｅｃカセット内でまたは主にＳＣＣｍｅｃカセット内で特異的にハイブリダイズすることができる。プローブが主にＳＣＣｍｅｃカセット内で特異的にハイブリダイズする一実施形態では、該プローブがハイブリダイズする領域は、さらに連結部位を含んでもよく、そのため、連結部位に隣接するｏｒｆＸの少なくとも１個、または２個または３個または数個のヌクレオチドを含んでもよい。一般に、プライマーは、そのプライマーおよび（黄色ブドウ球菌ゲノム配列中に位置する）第２のプライマーを用いて合成された増幅産物が、約１００〜３５０ヌクレオチド長となるように選択される。ＰＣＲ増幅は、より長い増幅（例えば、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｔまたはそれ以上）を作製するために設計され得るが、本発明のｍｅｃＡ、連結部位または黄色ブドウ球菌染色体遺伝子の検出のための転写に基づく反応（例えば、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ）またはＰＣＲ型の反応のいずれかに好ましいアンプリコン長は、約１００〜３００ｎｔ（例えば、１５０、２００、２５０、３００ｎｔ）の長さである。さらに、多重増幅反応では、転写に基づくものであってもＰＣＲに基づくものであっても、これらの標的には、１００〜３００ｎｔの範囲またはそれより短い単位複製配列が、試験の感受性を高めるために好ましい。端部連結領域を増幅するために有用な特異的プライマーは、本明細書の教示ならびに当該技術分野における知識および技能があれば、容易に設計することができる。

本特許請求の範囲において用いられるように、「増幅条件」は、当業者に公知の、選択された増幅反応に適切な条件、例えば様々な増幅反応で利用される条件などである。このような条件は、これも当業者に公知のように、特異的反応、プライマーなどのために最適化することができる。周知のように、このような増幅条件には、増幅に必要な試薬、例えば、ヌクレオチドおよび酵素との接触、ならびに、その他の局面の中でも、適切な選択温度、塩およびｐＨ条件が含まれる。さらに、特許請求の範囲において用いられる、プライマーまたはプローブは、プライマーまたはプローブセット、すなわち複数のプライマーまたはプローブであってもよい。このようなプライマー／プローブセットは、ＭＲＳＡの複数の型または亜型が増幅され、かつ／または検出されることが望まれる反応において利用することができ、かつ、該プライマーおよび／またはプローブのハイブリダイゼーションのために選択された標的ＭＲＳＡ領域の核酸配列は、型および／または亜型によって異なる。個々のプライマー／プローブは、本明細書において例証されるように、各々の型または亜型のために設計することができる。

（ｍｅｃＡ）
本方法は、増幅反応において、第３のオリゴヌクレオチドセットを、ｍｅｃＡ遺伝子の増幅に利用することにより、ｍｅｃＡを有する耐性黄色ブドウ球菌を増幅させる工程をさらに備え、前記第３のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）ｍｅｃＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
ｂ）ｍｅｃＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備え、前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドおよび前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、ｍｅｃＡＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される。前記第３のオリゴヌクレオチドセットが、前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ｍｅｃＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、その際、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。あるいは、挿入染料の使用のような検出方法を用いることができる。ｍｅｃＡのためのプライマーの例として、配列番号１２および１３が挙げられる。

ｍｅｃＡＤＮＡの一部を増幅させることは、ｍｅｃＡ遺伝子の任意の識別部分、例えば、配列番号１２および１３で示される核酸配列を備えるプライマー間の領域に相当する配列を含む増幅産物を生じる、サンプルに対する増幅反応を行うことを意味する。増幅は、プライマーの標的核酸間でハイブリタイズするプローブを用いるか、または挿染料を用いて検出することができる。プライマーおよびプローブは、公知のｍｅｃＡ配列へのハイブリダイゼーションのために設計することが容易である。

（黄色ブドウ球菌染色体）
本方法は、第４のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅に利用する工程をさらに備えてもよく、前記染色体ＤＮＡが、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡ内の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡ内の第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備え、その際、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される。前記第４のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備えうる。このような第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能しうる。黄色ブドウ球菌特異的染色体DNAは、spa、orfX、またはnuc遺伝子内など、任意の公知の黄色ブドウ球菌特異的ゲノム領域でありうる。ｓｐａのためのプライマーの例として、配列番号１２および１３が挙げられ、同プローブの例として配列番号２６が挙げられる。ｏｒｆＸのためのプライマーの例として、配列番号９および１０が挙げられ、同プローブの例として配列番号１１が挙げられる。ｎｕｃのためのプライマーの例として、配列番号２７、２８、３０が挙げられ、同プローブの例として配列番号２９が挙げられる。あるいは、挿入染料の使用のような検出方法を行うことができる。

本発明は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットとを利用して増幅を行う工程を備え、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向される、方法を含む。第１のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドをさらに備えることができ、その際、前記サンプルが変異型ｍｅｃＡ遺伝子を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。第２のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとをさらに備えることができ、その際、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。このような第３のオリゴヌクレオチドは、プローブでありうる。また、挿入染料の使用のような検出方法を行うこともできる。例として、前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６，７，１４，１５，２０からなる群から選択された核酸配列を含みうる。前記第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１６，１７，２１からなる群から選択された核酸配列を含みうる。前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８，１８，１９からなる群から選択された核酸配列を含みうる。このような方法では、変異型ｍｅｃＡはｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}であってもよく、別の変異型ｍｅｃＡであってもよい。

（連結部位）
黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法は、さらなるＭＲＳＡ黄色ブドウ球菌遺伝子の増幅を含みうる。例えば、この方法は、増幅反応において、第２のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結部の増幅に利用することにより、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅させる工程備えることができ、前記第２のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）ｍｅｃＡを含む前記ＭＲＳＡの前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記右端部連結部が増幅されるよう配向される。第３のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドとを備えることができ、前記サンプルが前記右端部連結部を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。前記第３の連結オリゴヌクレオチドは、前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有しうる。第１の連結オリゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有しうる。第３の連結オリゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有しうる。また、挿入染料の使用のような検出方法を行うこともできる。

（黄色ブドウ球菌）
黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に、ｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法は、第４のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅に利用する工程をさらに備えてもよく、前記染色体ＤＮＡは、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドであって、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される、第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備える。第４のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備えることができ、
前記サンプルが、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの前記領域を含む場合、前記第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。このような第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能しうる。また、挿入染料の使用のような検出方法を行うこともできる。黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡは、例えばｓｐａ，ｏｒｆＸ，ｎｕｃから選択することができるが、当業者に公知でありうる他の黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡ標的を用いてもよい。

変異型ｍｅｃＡの存在を検出する増幅反応に加えて、本発明は、変異型ｍｅｃＡ、ｍｅｃＡ（非変異型）、および黄色ブドウ球菌特異的染色体配列を有するＳＣＣｍｅｃ型以外のＳＣＣｍｅｃ型のＳＣＣｍｅｃ連結部位などの、さらなる適切な配列を、１つまたは複数、さらに増幅することができる増幅反応を含むことを認識されたい。多重反応または個別の反応で、これらのさらなる増幅反応のいずれか、またはすべてを組み合わせることができる。

多重増幅反応は、複数の増幅が同一反応容器内で起こり得るように、複数の標的の増幅に特異的な試薬同士を接触させることを意味する。さらに、複数の標的のための検出試薬を含むことができる。したがって、複数の標的の増幅および検出に特異的な試薬をすべて接触させることにより、多重増幅および検出反応を行うことができる。従って、多重反応では、同一反応において複数の標的領域を増幅することができる。多重増幅反応はまた、順次行うことができる。多重が望ましくないかまたは実行不可能である場合、同時増幅を用いることができ、その際、個別の反応が同時に進行可能であるが、複数の増幅反応のための試薬は、必ずしもすべて同一の反応容器または反応管内に存在せず、別個の反応容器内で行われる。多重増幅反応においてさえ、与えられた条件下で個々の反応がいかなる速度で進行しようとも、各反応が生じることは理解される。検出はまた、「同時」であっても良く、それは、反応容器に各々の反応に適切なプローブが含まれている場合、適切な条件下、単一の反応容器（多重）で、または複数の反応容器（当該反応容器へ分配された適切なプローブ）で、複数の標的の検出を達成することができることを意味する。このような検出は、所望であれば多重または同時増幅反応と同一の反応容器内で行うことができ、さらに、増幅反応が継続する間（すなわち、リアルタイム）に行うことができる。単一の容器には、利用する特異的増幅および検出法に合わせた反応混合物のすべての成分が含まれてもよい。したがって、「反応混合物」には、反応を行うために必要なすべての試薬が含まれてもよく、それには、限定されるものではないが、反応の間ｐＨを選択されたレベルに維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャー、および同類のものを挙げることができる。

本特許請求の範囲において用いられるように、「増幅条件」は、当業者に公知の、選択された増幅反応に適切な条件、例えば様々な増幅反応で利用される条件などである。このような条件は、これも当業者に公知のように、特異的反応、プライマーなどのために最適化することができる。周知のように、このような増幅条件には、増幅に必要な試薬、例えば、ヌクレオチドおよび酵素との接触、ならびに、その他の局面の中でも、適切な選択温度、塩およびｐＨ条件が含まれる。さらに、特許請求の範囲において用いられる、プライマーまたはプローブは、プライマーまたはプローブセット、すなわち複数のプライマーまたはプローブであってもよい。このようなプライマー／プローブセットは、ＭＲＳＡの複数の型または亜型が増幅され、かつ／または検出されることが望まれる反応において利用することができ、かつ、該プライマーおよび／またはプローブのハイブリダイゼーションのために選択された標的ＭＲＳＡ領域の核酸配列は、型および／または亜型によって異なる。個々のプライマー／プローブは、本明細書において例証されるように、各々の型または亜型のために設計することができる。

本明細書において、標的ＤＮＡの一部に含まれる核酸配列を「有する」オリゴヌクレオチドとは、その配列が、標的ＤＮＡ配列またはその相補鎖に対して厳密なハイブリダイゼーション条件下でその標的ＤＮＡに特異的かつ選択的にハイブリダイズするために十分な同一性を有することを意味する。それには該配列に対して完全な配列同一性を有する核酸配列が含まれる。

一般に、単位複製配列（ポリヌクレオチド増幅反応の産物）を生じる増幅反応は、試薬（ヌクレオチドかまたはオリゴヌクレオチドである）の塩基対形成が、反応産物の形成に必要とされる鋳型ポリヌクレオチド中に相補体を有するという点で、「鋳型主導（template-driven）」である。一態様では、鋳型主導型の反応は、核酸ポリメラーゼを用いるプライマー伸長または核酸リガーゼを用いるオリゴヌクレオチド連結である。増幅には、あらゆる公知のまたは新規に設計された増幅法が含まれてもよく、それには、公開された方法で使用されるもの（例えば、転写に基づく増幅、例えば転写媒介性増幅（ＴＭＡ）および核酸配列に基づく増幅（本明細書において例証される）ＮＡＳＢＡ、およびサイクリング核酸増幅技術（サーモサイクリング）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など、ならびに任意の増幅法、例えば、持続配列複製法（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、固相増幅（ＳＰＡ）、ローリングサークル増幅技術（ＲＣＡ）、固相ＲＣＡ、アンカーＳＤＡおよびヌクレアーゼ依存性シグナル増幅（ＮＤＳＡ））が含まれ、それらはすべて当業者に周知である。増幅反応が進行する時に反応産物を測定することを可能にする検出化学が利用可能であるならば増幅反応は、「リアルタイム」増幅、例えば、リアルタイムＰＣＲまたはリアルタイムＮＡＳＢＡであってもよい。したがって、本発明には、核酸に基づく診断検査の感受性および／または迅速性を増大させるために使用することのできるあらゆる核酸増幅法またはあらゆるその他の手順の使用が含まれる。また、本発明には、増幅後検出技術、検出と組み合わせたあらゆる増幅技術、あらゆるハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技術、およびあらゆる増幅チップまたは増幅とハイブリダイゼーションチップ技術の組合せを含む、あらゆる検出技術の使用が含まれる。任意のヌクレオチド配列決定法による検出および同定も本発明の範囲内である。

本発明では、多様な検出方法を利用することができる。核酸プローブを利用する検出法は当分野で周知である。本キットの、かつ／または本方法で使用するためのプローブは、選定された検出法に適した任意の選択された標識により標識することができ、その多くは当分野で公知であり、例えば、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ジゴキシゲニン、蛍光染料（例えばＣｙ３およびＣｙ５染料、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＲＯＸなど）、化学発光標識、発色団標識、放射性標識（例えば、放射性同位元素）およびリガンドなどである。さまざまな検出方法のためのプローブ設計、例えば標的捕捉、ＨＰＡ、Ｔａｑｍａｎ、分子ビーコン、スコーピオン、およびサンドイッチハイブリダイゼーションを利用することができる。ハイブリダイゼーション条件は、選択するプローブの種類および検出反応の種類にしたがって選択することができる。さらに、挿入染料を利用することができる。挿入染料は、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、このような結合の際に、明るい蛍光を発するものであり、二本鎖ＤＮＡが存在せず、結合する対象が存在しない場合は、低輝度で蛍光を発する。検出は、増幅サイクルにわたる蛍光の増加を測定することにより観察される。挿入染料は、当該分野で周知であるように、必要に応じて、融解分析とともに用いうる。挿入染料の例として、これらに限定されないが、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ(R)Ｇｒｅｅｎ、ＬＣＧｒｅｅｎ、ＬＣＧｒｅｅｎＰｌｕｓ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、Ｃｈｒｏｍｏｆｙ、およびＳＹＴＯ９が挙げられる。その他の染料は、当該技術分野の当業者に周知となり、このような新たな染料が利用可能となりうる。

本発明の方法は、このような増幅および検出方法における使用に有用なキットをさらに提供する。具体的には、本発明は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の増幅のためのキットであって、前記キットが第１のオリゴヌクレオチドセットを備え、第１のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを備えるキットを提供する。このようなキットは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよい。このような第３のオリゴヌクレオチドをプローブとすることができる。前記第１のオリゴヌクレオチドが、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を備える。また、ある好適な実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を備える。さらに、別の好適な実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１８、１９で示される核酸配列を備える。キットが有用である変異型ｍｅｃＡは、ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}または別の変異型ｍｅｃＡでありうる。

黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅するための、本発明のキットは、さらなるＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ株を検出するためのオリゴヌクレオチドセットを含む、さらなる１つまたは複数の要素を備えうる。本明細書において、「第２の」「第３の」または「第４の」オリゴヌクレオチドセットとも呼ばれるが、さらなるヌクレオチドセットの選択は、他の選択肢とは無関係である。例えば、キットは、変異型ｍｅｃＡ、ｍｅｃＡ（非変異型）、および黄色ブドウ球菌染色体配列を有するもの以外のＳＣＣｍｅｃ型の１つまたは複数のＳＣＣｍｅｃ連結部位を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットを含みうる。一例において、キットは、第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）右端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備える。別の例では、キットは、ｍｅｃＡ遺伝子の増幅のための第３のオリゴヌクレオチドセットをさらに備えることができ、第３のオリゴヌクレオチドセットは、
ａ）ｍｅｃＡＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
ｂ）ｍｅｃＡＤＮＡ内の第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える。別の例は、キットが黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅ための第４のオリゴヌクレオチドセットを含むことができ、前記第４のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備えるキットを提案する。

本発明の別のキットは、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅するのためのキットであって、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）変異型ｍｅｃＡＤＮＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のヌクレオチドセットを備えるキットを提供する。このキットは、前記第１のオリゴヌクレオチドセット内に、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレチドをさらに備えてもよい。そのキットは、前記第２のオリゴヌクレオチドセット内に、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のｍｅｃＡオリゴヌクレチドを備えてもよい。具体例において、前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を含みうる。別の例では、前記第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を備える。別の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドセットにおいて、第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１８または１９で示される核酸配列を備える。任意のこのようなキットでは、変異型ｍｅｃＡはｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}であることが好ましい可能性があるが、別の変異型ｍｅｃＡであってもよい。

本発明のキットは、第３のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）右端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、ｂ）ｍｅｃＡを含む前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドであって、前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、ＳＣＣｍｅｃカセットがｍｅｃＡを含む前記ＭＲＳＡの存在下、ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部挿入連結部が増幅されるよう配向される、第２の連結オリゴヌクレオチドとを備える第３のオリゴヌクレオチドセットを備えうる。前記第３のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドとを備えうる。

本発明のキットは、第４のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドであって、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、ＭＲＳＡの存在下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される、第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備える第４のヌクレオチドセットを備えうる。第４のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備えることができる。

本発明のプローブは、このようなキットに含められるものを含めて、当業者に公知のように、有利に検出用に標識することができる。標識は、特定の設計および行われる増幅反応の種類のために適切に選択することができる。プライマーおよびプローブ試薬は、乾燥状態、凍結乾燥状態、ペレット状態、噴霧乾燥状態、または液体状態を含むいくつかの状態のいずれかで提供することができる。

本発明のキットには、選択された増幅法のためのさらなる要素、例えば試薬（例えば、数ある中でも、増幅酵素（複数でも可）、緩衝剤（複数でも可）、および／または制限酵素（複数でも可））、対照（複数でも可）、反応容器（複数でも可）、および同類のものなどが含まれ得る。挿入染料を用いる場合、キットに含めてもよい。さらに、本発明のキットは、本明細書に記載されるようなキットを含む容器を備えることができる。要素は、単独の容器または複数の容器内に備えることができる。このようなキットは、多重増幅を行うのに有用である。

なお、チミジンを含むプライマーおよびプローブ配列への言及は、特定のアッセイに有用である場合、チミジンの代わりにウリジンを利用することに容易に適合させることができる。さらに、ヌクレオチドは、化学基の付加、または類似体（例えば、２’−Ｏ−メトキシ型）による個々の残基の置換により修飾してもよい。さらなるこのような修飾ヌクレオチドは当分野で公知であり、一部の例としては、ヒドロキシメチルヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、フッ素化ヌクレオチド、αチオリン酸ヌクレオチド、アミン修飾ヌクレオチド、メトキシヌクレオチド、カルボキシメチルヌクレオチド、チオヌクレオチド、イノシン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、ワイブトシン、キューオシン、Ｃ７ｄＧＴＰが挙げられる。さらなる修飾ヌクレオチドは、米国特許第５，４０５，９５０号および同第５，６３３，３６４号（いずれもMock and Lovern）で発見されている。さらに、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＰＮＡ、その他の合成核酸または選択的に標的とハイブリダイズする手段としてヌクレオチド塩基を使用する置換核酸を含むことができる。

本方法は、あらゆる選択されたサンプル、例えば直接的な患者サンプル、例えば、鼻腔または鼠径部のスワブ、会陰スワブ、腋窩スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブ、創傷からのサンプルで利用することができ、すべてがスクリーニングに特に適している、同様に診断、気管支肺胞洗浄または血液（例えば、敗血症または血液培養）に特に適している。このようなサンプルは、一般に、生物体の混合群を含む。さらに、必要に応じて、この方法を、単一の細菌種または株のみを有するサンプル、例えば、ＭＲＳＡの単離、培養、捕獲、および／または濃縮を利用するサンプルに適用することができる。

本発明のさらなる態様を以下に記載する。

本発明はまた、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
前記サンプルに対し、オリゴヌクレオチドセットを利用して増幅反応をもたらす工程を備え、前記オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるように配向される、方法に関する。

所望により、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの前記端部連結領域は、右端部連結領域である。

所望により、オリゴヌクレオチドセットは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、本発明による方法は、増幅された前記サンプルを挿入染料と接触させる工程をさらに備え、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記染料の増幅産物への挿入が検出される。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドは、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズする。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドは、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡのｏｒｆＸの領域に特異的にハイブリダイズする。

必要に応じて、前記第３の連結オリゴヌクレオチドは、前記ＳＣＣｍｅｃカセットＤＮＡの右端部連結領域の領域に特異的にハイブリダイズする。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドは、変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズする。

必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドは、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡのｏｒｆＸの領域に特異的にハイブリダイズする。

必要に応じて、変異型ｍｅｃＡは、ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}である。

必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドは、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号６，７，１４，１５，１６，１７，２０，２１からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドは、配列番号８，１１，１８，１９からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、増幅反応において、第２のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結部の増幅に利用することにより、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅させる工程さらに備え、前記第２のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記ＭＲＳＡの前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記右端部連結部が増幅されるよう配向される。

所望により、第２のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドをさらに備え、
前記サンプルが前記右端部連結部を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、第３の連結オリゴヌクレオチドは、前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する。

必要に応じて、第３の連結オリゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する。

必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する。

必要に応じて、本発明による方法は、増幅反応において、第３のオリゴヌクレオチドセットを、ｍｅｃＡ遺伝子の増幅に利用することにより、ｍｅｃＡを有する耐性黄色ブドウ球菌を増幅させる工程をさらに備え、前記第３のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）ｍｅｃＡＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
ｂ）ｍｅｃＡＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドおよび前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、ｍｅｃＡＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ｍｅｃＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、
前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、本発明による方法は、第４のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅に利用する工程をさらに備え、第４のオリゴヌクレオチドセットは、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される。

必要に応じて、第４のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、
前記サンプルが、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの前記領域を含む場合、前記第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡは、ｓｐａ，ｏｒｆＸ，ｎｕｃからなる群から選択される。

本発明はまた、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
前記サンプルに対し、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットとを利用して増幅を行う工程を備え、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向される、方法に関する。

必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、
前記サンプルが変異型ｍｅｃＡ遺伝子を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

所望により、第２のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、
前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、本発明による方法は、増幅された前記サンプルを挿入染料と接触させる工程をさらに備え、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記染料の増幅産物への挿入が検出される。

必要に応じて、第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６、７、１４、１５および２０からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１６、１７および２１からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８、１８および１９からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、変異型ｍｅｃＡは、ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}である。

必要に応じて、増幅反応において、第２のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結部の増幅に利用することにより、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅させる工程をさらに備え、前記第２のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記ＭＲＳＡの前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記右端部連結部が増幅されるよう配向される。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる拡散領域を有する第３の連結オリゴヌクレオチドをさらに備え、
前記サンプルが前記右端部連結部を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、第３の連結オリゴヌクレオチドは、前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する。

必要に応じて、第１の連結オリゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する。

必要に応じて、第３の連結オリゴヌクレオチドは、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する。

必要に応じて、本発明による方法は、第４のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅に利用する工程をさらに備え、前記第４のオリゴヌクレオチドセットは、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡ内の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備え、
前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される。

必要に応じて、第４のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備えてもよく、
前記サンプルが、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの前記領域を含む場合、前記第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される。

必要に応じて、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡは、ｓｐａ、ｏｒｆＸおよびｎｕｃからなる群から選択される。

本発明の別の目的は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に、変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入する工程を含む、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の増幅のためのキットであって、前記キットが第１のオリゴヌクレオチドセットを備え、第１のオリゴヌクレオチドセットが、
ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドとを備えるキットである。

必要に応じて、本発明によるキットは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドをさらに備えてもよい。

必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドは、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドは、配列番号８、１１、１８および１９からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、変異型ｍｅｃＡは、ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}である。

必要に応じて、本発明のキットは、第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）右端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットをさらに備える。

必要に応じて、本発明のキットは、ｍｅｃＡ遺伝子の増幅のための第３のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）ｍｅｃＡＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
ｂ）ｍｅｃＡＤＮＡ内の第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える、第３のオリゴヌクレオチドセットをさらに備える。

必要に応じて、本発明によるキットは、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅ための第４のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌に特異的な染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備える、第４のオリゴヌクレオチドセットを備える。

本発明の別の目的は、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプル内で増幅するためのキットであって、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）変異型ｍｅｃＡＤＮＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
１）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットとを備え、
サンプルが、前記オリゴヌクレオチドセットとともに増幅条件下に配置される場合に、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含むとき、増幅が生じうるように各セットが配向される、キットである。

必要に応じて、本発明によるキットは、前記第１のオリゴヌクレオチドセット内に、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレチドをさらに備える。

必要に応じて、本発明によるキットは、前記第２のオリゴヌクレオチドセット内に、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のｍｅｃＡオリゴヌクレチドをさらに備える。

必要に応じて、第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を備える。

必要に応じて、前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８，１８，１９で示される核酸配列を備える。

必要に応じて、変異型ｍｅｃＡは、ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}である。

必要に応じて、本発明のキットは、第３のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備える第３のオリゴヌクレオチドセットをさらに備え、
前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、前記ＭＲＳＡの存在下、ｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部挿入連結部が増幅されるよう配向される。

必要に応じて、第３のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える。

必要に応じて、本発明のキットは、第４のオリゴヌクレオチドセットであって、
ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備える第４のオリゴヌクレオチドセットを備える。
前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々は、増幅条件下、ＭＲＳＡの存在下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される。

必要に応じて、第４のオリゴヌクレオチドセットは、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備える。

本発明を、以下の実施例で説明する。本明細書を通じて示すように、変異型ｍｅｃＡの検出は、マルチプレックスまたはマルチプルシンプレックス方式において、ｍｅｃＡ、黄色ブドウ球菌ゲノムおよび／またはＳＣＣｍｅｃ連結用のプライマーおよび／またはプローブなど他の望むアッセイの任意の組み合わせで、組み合わせることができる。

（増幅条件）
ＰＣＲを用いた増幅は、標準的な条件下で行うことができる。そのような条件として、以下が含まれうる。

（オリゴヌクレオチド設計）
本明細書に記載される、増幅または検出を目的とし、ゲノム領域に属するオリゴヌクレオチドは、その設計にどのような方法が用いられた場合であっても利用することができる。使用可能な方法として、例えば（限定されるものではないが）、手作業（オリゴヌクレオチド 設計における人の専門技術）での設計またはコンピュータ手段（スクリプト，プログラム，ソフトウェア）を用いた設計（例えば、 A shell program for the design of PCR primers using genetics computer group (GCG) software (7.1) on VAX/VMS systems, Biotechniques. 1992 Dec;13(6):914-7、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8887007 Mitsuhashi M., Technical report: Part 1. Basic requirements for designing optimal oligonucleotide probe sequences. J Clin Lab Anal. 1996;10(5):277-84）が挙げられる。

（実施例１：変異型ｍｅｃＡプライマーおよびプローブの設計）
黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ−変異型ｍｅｃＡ領域を増幅するＰＣＲを発展させるように実験を設計した。初めに、ｏｒｆＸ側のＳＣＣｍｅｃ連結上にプライマーを設計するために、ｏｒｆＸ領域内に２つのプライマーおよび１つのプローブを設計した。また、１組の変異型ｍｅｃＡ特異的オリゴ（ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}については、文献においてｍｅｃＡ_{Ｍ１０／００６１}、ｍｅｃＡ同族体、ｍｅｃＡ_{ｎｅｗ ｖａｒｉａｎｔ}としても記載される）も設計した。変異型ｍｅｃＡの配向が当初不明であったため、変異型ｍｅｃＡ−ｏｒｆＸ単位複製配列を得るために、変異型ｍｅｃＡの多岐にわたるプライマーを設計した。変異型ｍｅｃＡ遺伝子の両端のさらなる候補を、黄色ブドウ球菌の特異的ＰＣＲを発展させるべく設計してきた。ＳＣＣｍｅｃ連結部位をまたいで変異型ｍｅｃＡを増幅するために選択されたＰＣＲアッセイは、約１３００ｎｔの長さの単位複製配列を生成する。変異型ｍｅｃＡ遺伝子自体の検出のために選択されたＰＣＲアッセイでは、この単位複製配列サイズとは異なっていてもよく、例えば、より短い単位複製配列を生じうる。

変異型ｍｅｃＡ参照配列は、ＮＣＢＩデータベース上で、登録番号ＦＲ８２３２９２であると調べ、初期のプライマー設計に用いた。第１の工程は、変異型ｍｅｃＡ特異的オリゴを設計するためのものであった。変異型ｍｅｃＡの配向が当初不明であったため、変異型ｍｅｃＡ−ｏｒｆＸ単位複製配列を得るために変異型ｍｅｃＡの多岐にわたるプライマー（変異型ｍｅｃＡ遺伝子の３’および５’の両端の）を設計した。

（変異型ｍｅｃＡ遺伝子の５’末端の設計）
別に記載がない限り、上述したような標準的なＰＣＲ条件を用いた。

（プライマー設計）
多くのプライマーを設計した（データは示さず）。うち２つは、以下の熱力学特性に基づいて選択した。

（プローブ設計）
変異型ｍｅｃＡの５’末端のプライマーための多くのプローブを設計した（データは示さず）。うち３つは、以下の熱力学特性に基づいて選択した。

（変異型ｍｅｃＡ遺伝子の３’末端の設計）

（プライマー設計）
変異型ｍｅｃＡ遺伝子の３’末端の順方向プライマーを設計した（データは示さず）。そのうち２つは、以下の熱力学特性に基づいて選択した。

（プローブ設計）
変異型ｍｅｃＡ遺伝子の３’末端の順方向プライマーのためのプローブを設計した（図４参照。追加データは示さず）。うち１つは、以下の熱力学特性に基づいて選択した。

（オリゴ適合性）
入力パラメータ：温度：６３℃、［Ｎａ＋］：０．０５Ｍ、［Ｍｇ２＋］：０．００５Ｍ、ストランド濃度：０．００００１Ｍ

すべての上記オリゴヌクレオチドは、互いに適合し、ｏｒｆＸ（以下参照）内の、設計され、選択されたオリゴヌクレオチドと適合することが分かった。これらの実験により、変異型ｍｅｃＡ遺伝子の配向が示され、変異型ｍｅｃＡの３’末端に設計されたオリゴが変異型ｍｅｃＡ−ｏｒｆＸ増幅反応に用いられることを結論づけた。

（実施例２：変異型ｍｅｃＡ増幅反応）
別に記載がない限り、上述したような標準的なＰＣＲ条件を用いた。

（実施例２ａ：プライマーの選択）
１０ｎｇ／μｌで１つの変異型ｍｅｃＡ（＋）株（内部収集株番号１１５６００１）、および１０ｎｇ／μｌでｍｅｃＡ（＋）株（ＡＴＣＣ４３３００株）の試験を行った。試験を行ったプライマーは、以下のとおりである。
ｏｒｆＸＭＲＳＡプライマー
ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−９（配列番号：９）：１０μＭ
ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−１０（配列番号：１０）：１０μＭ
変異型ｍｅｃＡ３’末端プライマー
ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−６（配列番号：６）：１０μＭ
ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−７（配列番号：７）：１０μＭ

プライマー選択のためのすべてのＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである。
ＰＣＲ方式：４５μｌＭＩＸ＋５μｌ標的
ＰＣＲ条件：４条件を試験した（以下参照）
エキスパンドハイフィディリティＰＣＲシステム（Roche製、製品番号１１７３２６５０００１、ロット番号１１３９８３２６）
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００

（表６：ＰＣＲの４試験条件）

変異型ｍｅｃＡ（ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}）で選択的にハイブリダイズする以下のプライマーを列挙した特定の条件で試験した。
ＭＩＸ１：変異型ｍｅｃＡの陽性対照
ＭＩＸ２：変異型ｍｅｃＡ（単位複製配列長１４９８ｎｔ）で試験用オリゴ ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−６（配列番号：６）
ＭＩＸ３：変異型ｍｅｃＡ（単位複製配列長１４８４ｎｔ）で試験用オリゴ ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−７（配列番号：７）

（アッセイの結果/結論）

すべての条件が有効であることが分かり、変異型ｍｅｃＡについては陽性結果が得られ、ｍｅｃＡについては陰性結果が得られた。変異型ｍｅｃＡ単位複製配列の増幅、ひいてはＭＲＳＡ株を有する変異型ｍｅｃＡの検出のためのアッセイにおける利用で、変異型ｍｅｃＡの両プライマーが有効であった。ｏｒｆＸプライマーのｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−９、変異型ｍｅｃＡプライマーのｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−７、およびｏｒｆＸプライマーのｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−１０を用いての、用意され、実施されたｏｒｆＸ−変異型ｍｅｃＡのＰＣＲの詳細を、以下に示す。変異型ｍｅｃＡ（ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}）の良好な増幅が得られた。

（実施例２ｂ：ｏｒｆＸのプローブおよび変異型ｍｅｃＡ遺伝子のプローブによる増幅）
次に、プローブを追加してＢｉｏ−Ｒａｄ製測定器（リアル・タイムＰＣＲシステム）でＰＣＲを試験した。試験はｏｒｆＸ（ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−１１（配列番号：１１））または変異型ｍｅｃＡ遺伝子（ｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}：３’末端）（ｍｅｃＡｖ−ｏｒｆＸ−８（配列番号：８））のいずれかのＴａｑＭａｎプローブで行った（以下参照）。両方のＴａｑｍａｎプローブに用いられる蛍光体はＦＡＭである。５つのサンプル（１０ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを試験した。

増幅は、以下の条件で行った。
ＰＣＲ方式：４５μｌＭＩＸ＋５μｌ標的
ＰＣＲ条件：２種類の濃度（０．３μＭおよび０．６μＭ）で２つのプローブを試験した。
エキスパンドハイフィディリティＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、製品番号１１７３２６５０００１、ロット番号１１３９８３２６）
プライマーおよびプローブ（いずれも１０μＭ）の以下の組み合わせを用いた。
ＭＩＸ１：０．６μＭのmecAv-orfX-9／mecAv-orfX-10／mecAv-orfX-7／mecAv-orfX-11
ＭＩＸ２：０．３μＭのmecAv-orfX-9／mecAv-orfX-10／mecAv-orfX-7／mecAv-orfX-11
ＭＩＸ３：０．６μＭのmecAv-orfX-9／mecAv-orfX-10／mecAv-orfX-7／mecAv-orfX-8
ＭＩＸ４：０．３μＭのmecAv-orfX-9／mecAv-orfX-10／mecAv-orfX-7／mecAv-orfX-8
結果は以下のとおりである。

結果は、これらの条件下での理想のプローブ濃度が、およそ０．３μＭである可能性を示している。変異型ｍｅｃＡ遺伝子またはｏｒｆＸのプローブの両方が良好な結果をもたらした。一般に、これらの条件下において、試験は変異型ｍｅｃＡ遺伝子のプローブにより特化しているように見受けられるが、アニーリング工程を５５℃で行うなど、パラメータを調節してアッセイを最適化することができる。さらなる最適化を行うこともでき、例えば、サイクル数を増やし、７２℃での最終工程後に読み取られるＦＡＭを加え、さらに／あるいはアニーリング温度を高くすることができる。この実験は、ＭＲＳＡ株において、非常に長い単位複製配列が生成（およそ１４８４ｂｐ）されても、ｏｒｆＸと変異型ｍｅｃＡ遺伝子の間で特異的リアルタイムＰＣＲを実行可能であることを示す。

（実施例３：ＳＣＣｍｅｃ：非ＸＩ型およびｍｅｃＡのｏｒｆＸ連結領域の増幅）
アッセイは、ＭＲＳＡ株（ｍｅｃＡを含むもの）を有する非ＸＩ型ＳＣＣｍｅｃの有無をさらに検出するために、ＳＣＣｍｅｃＸＩ型のためのアッセイと組み合わせて行うことができる。アッセイは、また、サンプル内に存在する生物体の特徴をさらに明らかにするために、黄色ブドウ球菌ゲノム領域および／またはｍｅｃＡなどの他の配列のためのアッセイと組み合わせて行うことができる。これらのアッセイは多重方式でまたは個別に行うことができる。

（実施例３ａ：右端部連結領域の検出）
ＸＩ型以外のＳＣＣｍｅｃ型における右端部連結の検出では、ＳＣＣｍｅｃカセットおよびｏｒｆＸの右側に位置するプライマーを、ＸＩ型を検出するアッセイとの多重で用いるかまたは個別に用いることができる。この反応は、カセットまたはｏｒｆＸの右側に位置するプローブを用いることができる。ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ株は、増幅反応につき１０^５ＣＦＵに相当するかまたは特定のキットのための標的として溶解物を用いて試験することができる。例えば、この連結部位の検出に利用可能な市販のキットとして以下が挙げられる。

さらに、プライマーは、Path-MRSAまたはPath-MRSA std（いずれもGenesig製）を用いて設計することができる。

（実施例３ｂ：多重増幅ならびにｍｅｃＡ遺伝子およびカセット挿入（連結）領域の検出）
本実施例に示すように、挿入カセット領域およびｍｅｃＡ遺伝子の両方の同時増幅および検出を用いて、非ＸＩ型株の特定の株（偽ＭＲＳＡ陽性）の検出を低減することができる。Ｊａｙら（参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０２０３０１３号、国際公開第２００９／０８５２２１号）により記載され、例証されるように、また商業的に利用可能（NucliSens EasyQ(R) MRSA （bioMerieux, Marcy l’Etoile, France)）であるため、この方針を、同じチューブ内のｍｅｃＡ遺伝子およびカセット連結領域の両方を検出するための多重増幅に用いることができる。一例において、アッセイは、ＳＣＣｍｅｃ右端部連結領域の５つのＳＣＣｍｅｃカセット特異的順方向プライマー、ｏｒｆＸの１つの逆方向プライマー、および５つの標識されたＳＣＣｍｅｃカセットプローブを、ｍｅｃＡの１つの順方向プライマー、１つの逆方向プライマー、および１つの標識されたプローブと組み合わせて、カセット連結領域に用いる。このようなアッセイの結果は、ｍｅｃＡ遺伝子が存在しない挿入カセット領域を処理するＭＳＳＡの場合、アッセイのこの部分により、「ＭＲＳＡ陰性」の結果（ＳＣＣｍｅｃ連結（＋）に加えｍｅｃＡ（−））が適切にもたらされる。

（実施例４：ＭＲＳＡゲノム領域（ｓｐａ）の増幅）
別に記載がない限り、上述したような標準的なＰＣＲ条件を用いる。

黄色ブドウ球菌ｓｐａ遺伝子は、特に黄色ブドウ球菌バクテリアの細胞壁に見られる表面タンパク質である、タンパク質Ａをコードする遺伝子である。ｓｐａ遺伝子の一部である多型領域Ｘは、非常に変化しやすく、いくつかの黄色ブドウ球菌を分化させるｓｐａタイピングに用いられる。一方、ｓｐａ遺伝子にはより保存的な領域も存在しており、すべての黄色ブドウ球菌株を検出するための特異的なマーカーとして用いられる［Kuhn, JCM 2007, Double-locus sequence typing using clfB and spa, a fast and simple method for epidemiological typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus］。

（プロプライエタリおよび／またはパブリックデータバンクの配列集合から）多重配列アラインメントを構成した後、遺伝子の保存的領域内のオリゴヌクレオチドを設計した。結果もたらされる、ｓｐａ領域の増幅および／または検出は、黄色ブドウ球菌がサンプル内に存在することを証明する。
オリゴヌクレオチドは以下のとおりである。

（実施例５：ＭＲＳＡゲノム領域（ｎｕｃ）の増幅）
ｎｕｃ遺伝子は、サーモヌクレアーゼとも呼ばれる黄色ブドウ球菌熱安定性ヌクレアーゼをコードする。この遺伝子は、黄色ブドウ球菌に特異的であり、非常によく保存されている［Bragstad et al. JCM 1992, Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene］。

（プロプライエタリおよび／またはパブリックデータバンクの配列集合から）多重配列アラインメントを構成した後、遺伝子の保存的領域内のオリゴヌクレオチドを設計した。結果もたらされる、ｎｕｃ領域の増幅および／または検出は、本明細書に記載されるような標準的なＰＣＲ条件下で、黄色ブドウ球菌がサンプル内に存在することを証明する。
オリゴヌクレオチドは以下のとおりである。

（実施例６：ｍｅｃＡおよび変異型ｍｅｃＡ増幅）
別に記載がない限り、上述したような標準的なＰＣＲ条件を用いることができる。

ｍｅｃＡは、修飾ＰＢＰであるＰＢＰ２ａ（ペニシリンＢｉｎｄｉｎｇタンパク質２ａ）をコードする。最近発見された変異型ｍｅｃＡもまた、ＰＢＰ２ａ族に属するタンパク質をコードする。（プロプライエタリおよび／またはパブリックデータバンクの配列集合から）多重配列アラインメントを構成した後、遺伝子の保存的領域内のオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドは、同じシンプレックス反応またはいくつかの別個のシンプレックス反応またはマルチプレックス（多重）反応のいずれかにおいて、ｍｅｃＡおよび変異型ｍｅｃＡの両方を増幅および検出するように設計することができる。結果もたらされる、（シンプレックスまたはマルチプレックスでの）ｍｅｃＡおよび／または変異型ｍｅｃＡの増幅および／または検出は、メチシリン耐性遺伝子がサンプル内に存在することを証明する。

ｍｅｃＡは、標準的なＰＣＲ条件下で、以下のオリゴヌクレオチドを用いた増幅によって分析試験することができる。

変異型ｍｅｃＡは、以下のオリゴヌクレオチドを用いた増幅によって分析試験し、変異型ｍｅｃＡ配列を検出することができる。

あるいは、変異型ｍｅｃＡアッセイを用いて変異型ｍｅｃＡを特定することができる。このようなアッセイの１つは、上に、実施例２において例示されている。

ｍｅｃＡおよび変異型ｍｅｃＡの両方を検出するアッセイを以下に説明する。プライマー配列は、ｍｅｃＡおよび変異型ｍｅｃＡの双方に共通する領域内で選択される。
ｍｅｃＡに加えて変異型ｍｅｃＡは、以下のオリゴヌクレオチドを用いた増幅によって分析試験することができる。

本明細書に引用される刊行物およびそれらに引用される材料は、参照により具体的に組み込まれる。本明細書には、本発明が、先行発明を理由に、そのような開示に先んじえないことを認めると解釈すべきものは存在しない。

開示される本発明が、変更される可能性があるために、記載される特定の方法、手順、および試薬に限定されないことは当然理解される。また、本明細書において使用される用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、添付される特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図するものではないことも当然理解される。

当業者は、単なる通常の実験を用いて、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (26)

1. 黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
   前記サンプルに対し、オリゴヌクレオチドセットを利用して増幅反応をもたらす工程を備え、前記オリゴヌクレオチドセットが、
   ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
   ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと、必要に応じて、
   ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドとを備え、
   前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向され、
   前記第３のオリゴヌクレオチドが用いられる場合であって、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含むとき、前記第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される方法。
2. 黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの前記端部連結領域が、右端部連結領域である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第３のオリゴヌクレオチドが、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡのｏｒｆＸの領域、ＳＣＣｍｅｃカセットＤＮＡの右端部連結領域の領域、または前記変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１のオリゴヌクレオチドが、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡのｏｒｆＸの領域に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
5. -前記第１のオリゴヌクレオチドが、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を含み、さらに／あるいは
   -前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を含み、さらに／あるいは
   -前記第３のオリゴヌクレオチドを用いた場合、前記第３のオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１１、１８または１９で示される核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
6. 増幅反応において、第２のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結部の増幅に利用することにより、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅させる工程をさらに備え、前記第２のオリゴヌクレオチドセットが、
   ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
   ｂ）ｍｅｃＡを含む前記ＭＲＳＡの前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドと、必要に応じて
   ｃ）前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドとを備え、
   前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記右端部連結部が増幅されるよう配向され、
   前記第３の連結オリゴヌクレオチドが用いられる場合であって、前記サンプルが前記右端部連結部を有する前記ＭＲＳＡを含むとき、前記第３の連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記第３の連結オリゴヌクレオチドが、
   -前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域、または
   -ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１の連結オリゴヌクレオチドが、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
9. 増幅反応において、第３のオリゴヌクレオチドセットをｍｅｃＡ遺伝子の増幅に利用することにより、ｍｅｃＡを有する黄色ブドウ球菌を増幅させる工程をさらに備え、前記第３のオリゴヌクレオチドセットが、
   ａ）ｍｅｃＡＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
   ｂ）ｍｅｃＡＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備え、
   前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドおよび前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、ｍｅｃＡＤＮＡの一部が増幅されるよう配向され、
   必要に応じて、前記第３のオリゴヌクレオチドセットが、前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ｍｅｃＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドをさらに備え、
   前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが用いられる場合であって、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含むとき、前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 第４のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅に利用する工程をさらに備え、前記染色体ＤＮＡが、
    ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡ内の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡ内の第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備え、
    前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向され、
    必要に応じて、前記第４のオリゴヌクレオチドセットが、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドをさらに備え、
    前記第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドが用いられる場合であって、前記サンプルが、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの前記領域を含むとき、前記第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅させる方法であって、
    前記サンプルに対し、
    ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
    １）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
    ２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ３）前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備え、前記サンプルが変異型ｍｅｃＡ遺伝子を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、第１のオリゴヌクレオチドセットと、
    ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
    １）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
    ２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ３）前記第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備え、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、第２のオリゴヌクレオチドセットとを利用して増幅を行う工程を備え、
    前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの前記領域が増幅されるよう配向される、方法。
12. -前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、１４、１５および２０からなる群から選択された核酸配列を含み、さらに／あるいは
    -前記第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号１６、１７および２１からなる群から選択された核酸配列を含み、さらに／あるいは
    -前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが用いられる場合、該変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１８および１９からなる群から選択された核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記変異型ｍｅｃＡがｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
14. 増幅反応において、第３のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結部の増幅に利用することにより、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅させる工程さらに備え、前記第２のオリゴヌクレオチドセットが、
    ａ）右端部連結領域の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）ｍｅｃＡを含む前記ＭＲＳＡの前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドであって、
    前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記サンプルがｍｅｃＡを有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記右端部連結部が増幅されるよう配向される第２の連結オリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ｃ）前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドとを備え、
    前記サンプルが前記右端部連結部を有する前記ＭＲＳＡを含む場合、前記第３の連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、請求項１１に記載の方法。
15. 前記第３の連結オリゴヌクレオチドが、
    -前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有するか、または
    -ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記第１の連結オリゴヌクレオチドが、ｏｒｆＸ内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
17. 第４のオリゴヌクレオチドセットを、黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅に利用する工程をさらに備え、前記染色体ＤＮＡが、
    ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドであって、
    前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される、第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ｃ）前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備え、
    前記サンプルが、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの前記領域を含む場合、前記第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが検出される、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
18. 前記黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡが、ｓｐａ、ｏｒｆＸ、およびｎｕｃからなる群から選択される、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 増幅された前記サンプルを挿入染料と接触させる工程を備え、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含む場合、前記染料の増幅産物への挿入が検出される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内に変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を増幅するためのキットであって、前記キットが第１のオリゴヌクレオチドセットを備え、該第１のオリゴヌクレオチドセットが、
    ａ）端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
    ｂ）変異型ｍｅｃＡの領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のオリゴヌクレオチドとを備えるキット。
21. -前記第１のオリゴヌクレオチドが、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を備え、さらに／あるいは
    -前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を備え、さらに／あるいは
    -前記第３のオリゴヌクレオチドが存在する場合、該第３のオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１８または１９で示される核酸配列を備える、請求項２０に記載のキット。
22. -第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
    ａ）右端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセット、
    -ｍｅｃＡ遺伝子の増幅のための第３のオリゴヌクレオチドセットであって、
    ａ）ｍｅｃＡＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
    ｂ）ｍｅｃＡＤＮＡ内の第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える、第３のオリゴヌクレオチドセット、および／または
    -黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの増幅ための第４のオリゴヌクレオチドセットであって、
    ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備える、第４のオリゴヌクレオチドセットのうちの１つまたは複数をさらに備える、請求項２０または請求項２１に記載のキット。
23. 黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内にｍｅｃＡ遺伝子または変異型ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを挿入したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をサンプルにおいて増幅するためのキットであって、
    ａ）第１のオリゴヌクレオチドセットであって、
    １）変異型ｍｅｃＡＤＮＡ遺伝子の第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
    ２）変異型ｍｅｃＡ遺伝子の第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ３）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第１のオリゴヌクレオチドセットと、
    ｂ）第２のオリゴヌクレオチドセットであって、
    １）ｍｅｃＡの第１の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、
    ２）ｍｅｃＡの第２の領域に特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ３）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる第３のｍｅｃＡオリゴヌクレオチドとを備える第２のオリゴヌクレオチドセットとを備え、
    サンプルが、前記オリゴヌクレオチドセットとともに増幅条件下に配置される場合に、前記サンプルが前記ＭＲＳＡを含むとき、増幅が生じうるように各セットが配向される、キット。
24. -前記第１の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号９および１０からなる群から選択された核酸配列を備え、さらに／あるいは
    -前記第２の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、１４、１５、１６、１７、２０および２１からなる群から選択された核酸配列を備え、さらに／あるいは
    -前記第３の変異型ｍｅｃＡオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１８または１９で示される核酸配列を備える、請求項２３に記載のキット。
25. 前記変異型ｍｅｃＡがｍｅｃＡ_{ＬＧＡ２５１}である、請求項２０〜２４のいずれかに記載のキット。
26. -第３のオリゴヌクレオチドセットであって、
    ａ）右端部連結領域内の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）ｍｅｃＡを含む前記ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチドであって、前記第１の連結オリゴヌクレオチドおよび前記第２の連結オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、前記ＭＲＳＡの存在下、ｍｅｃＡを含むＳＣＣｍｅｃカセットの右端部挿入連結部が増幅されるよう配向される、第２の連結オリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ｃ）前記第１の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の連結オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の前記ＭＲＳＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の連結オリゴヌクレオチドとを備える第３のオリゴヌクレオチドセット、および／または
    -第４のオリゴヌクレオチドセットであって、
    ａ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）黄色ブドウ球菌特異的染色体ＤＮＡの第２の領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドであって、前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドおよび前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの各々が、増幅条件下、ＭＲＳＡの存在下、黄色ブドウ球菌に特異的なＤＮＡの一部が増幅されるよう配向される、第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドと、必要に応じて
    ｃ）前記第１の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域と前記第２の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズ領域との間の、前記黄色ブドウ球菌ＤＮＡの領域内で特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する第３の黄色ブドウ球菌オリゴヌクレオチドとを備える、第４のオリゴヌクレオチドセット
    のうちの１つまたは複数をさらに備える、請求項２３に記載のキット。