ES2693158T3

ES2693158T3 - Detección de cepas variantes mecA de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina

Info

Publication number: ES2693158T3
Application number: ES12813030.9T
Authority: ES
Inventors: François PAILLIER; Céline CHAMBON; Cathy SAINT-PATRICE
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2032-12-21
Also published as: AU2012356749A1; CA2858284A1; US9394573B2; AU2012356749B2; AU2018256562A1; AU2018256562B2; CN104169437B; JP2020072723A; IL233148A0; US20160281144A1; EP2794917B1; ZA201404536B; HK1201888A1; US20130164752A1; BR112014015401A8; BR112014015401A2; EP3450572A1; JP2018038402A; US10829825B2; WO2013093106A1

Abstract

Un método para amplificar y detectar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una inserción de un módulo SCCmec dentro del ADN cromosómico de Staphylococcus aureus, en el que el módulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho método: realizar sobre la muestra una reacción de amplificación utilizando un conjunto de oligonucleótidos que comprende: a. un primer oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse específicamente con una región de orfX del ADN cromosómico de Staphylococcus aureus, y b. un segundo oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse específicamente con una región de un variante de mecA, y c. un tercer oligonucleótido capaz de hibridarse específicamente dentro de una región del MRSA entre la región de hibridación del primer oligonucleótido y la región de hibridación del segundo oligonucleótido, en el que cada uno del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido está orientado de modo que, bajo las condiciones de la amplificación, si la muestra contiene el MRSA, la región del MRSA entre la región de hibridación del primer oligonucleótido y la región de hibridación del segundo oligonucleótido se amplifica, y si la muestra contiene el MRSA, entonces se detecta la hibridación del tercer oligonucleótido.

Description

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DESCRIPCION

Deteccion de cepas variantes mecA de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a la deteccion molecular de Staphylococcus aureus resistente a meticilina ("methicillin-resistant Staphylococcus aureus", MRSA). Mas en concreto, la invencion se refiere a una deteccion mejorada de MRSA que incluye otras cepas que portan una variante del gen mecA.

Antecedentes de la invencion

En 1961 se demostro por primera vez la existencia de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. En la actualidad, Staphylococcus aureus resistente a meticilina ("methicillin-resistant Staphylococcus aureus", MRSA) es uno de los patogenos resistentes a antibioticos mas extendidos que provocan infecciones hospitalarias y en colectividades. El surgimiento de cepas MRSA es debido a la adquisicion e insercion de un elemento genetico movil, el modulo cromosomico estafilococico mec ("Staphylococcal Cassette Chromosome mec", SCCmec) en el cromosoma de cepas de S. aureus susceptibles. En efecto, este elemento SCCmec porta el gen mecA, que es responsable de la resistencia a la meticilina (modulo cromosomico estafilococico mec, Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother., 45(5):1323-1336; Hiramatsu, et al., 2001, Trends Microbiol., octubre, 9(10):486-493). El gen mecA codifica una protema de union a penicilina modificada denominada PBP2a o PBP2'. Al contrario que la PBP nativa, esta PBP2a tiene baja afinidad por los antibioticos de p-lactama y permite continuar la smtesis de la pared celular incluso en presencia de antibioticos de p-lactama.

El elemento SCCmec puede incorporarse en el cromosoma de S. aureus y otros estafilococos negativos a coagulasa, principalmente S. epidermidis y S. haemolyticus. El SCCmec se caracteriza por la presencia de repeticiones directas e invertidas terminales, un conjunto de genes recombinasa espedficos de sitio (ccrA y ccrB), y el complejo genico mecA (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother., 43:1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother., 44:1549-1555). Se conoce el sitio de insercion de este modulo SCCmec del gen mecA en el genoma de Staphylococcus aureus y la secuencia se conserva (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother., 45:1323-1336). Despues de la insercion en el cromosoma de S. aureus, el SCCmec presenta una zona de union del extremo izquierdo y una zona de union del extremo derecho (vease la figura 1), con una region de la zona de union del extremo izquierdo y una region de la zona de union del extremo derecho circundantes, respectivamente, que incluye el modulo SCCmec y ADN cromosomico, en las que la secuencia SCCmec esta contigua a la secuencia cromosomica de S. aureus. La secuencia de nucleotidos de las regiones circundantes a los lfmites izquierdo y derecho del ADN de SCCmec (concretamente, attL y attR, respectivamente), asf como la de las regiones que rodean al sitio de integracion del ADN de SCCmec (concretamente, attBscc, el sitio de union al cromosoma bacteriano del ADN de SCCmec), han sido previamente analizadas. El analisis de la secuencia de los sitios de integracion revelo que attBscc esta localizado en el extremo 3' de un nuevo marco de lectura abierto ("open reading frame", ORF), orfX. El orfX codifica un polipeptido de 159 aminoacidos que recientemente se ha indicado que es una ARNr 23S metiltransferasa (
http://www.uniprot.org/uniprot/Q6I7F2). Tambien se ha estudiado la organizacion de la region mecA de SCCmec (Oliveira, D.C., et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother., 44(7):1906- 1910}.

Generalmente, en un ensayo de MRSA en un paciente se recoge un frotis nasal del paciente y se cultiva varias veces para determinar si esta presente una cepa MRSA. Se estan desarrollando metodos nuevos que permiten la identificacion de MRSA directamente del frotis nasal y en un periodo de tiempo mucho mas corto. Tambien estan desarrollandose nuevas muestras y muchos artfculos demuestran interes en tomar muestras de varios sitios anatomicos del mismo paciente para aumentar la posibilidad de detectar portadores de MRSA. Los sitios pueden ser la nariz mas la garganta, la axila, la ingle y/o el perineo (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus colonisation at different Body Sites: a Prospective, Quantitative Analysis, Mermel et al., 2011, Journal of Clinical Microbiology).

La amplificacion es una tecnica muy conocida y se han desarrollado diversos metodos, que incluyen una amplificacion basada en la transcripcion, tal como la amplificacion mediada por transcripcion ("transcription-mediated amplification", TMA; patentes de EE. UU. n.os 5.766.849; 5.399.491; 5.480.784; 5.766.849; y 5.654.142) y la amplificacion basada en la secuencia del acido nucleico ("nucleic acid sequence-based amplification", NASBA; documentos 5.130.238; 5.409.818; 5.654.142; y 6.312.928), y las tecnologfas de amplificacion de acidos nucleicos por ciclacion (termociclado), tal como la reaccion en cadena de polimerasa (PCR; patentes de EE. UU. n.os 4.683.195; 4.965.188; 4.683.202) y la reaccion en cadena de ligasa (LCR; patente de EE. UU. n.° 5.792.607). Los metodos de amplificacion conocidos tambien incluyen la amplificacion por desplazamiento de hebra ("strand displacement amplification", SDA), la replicacion de secuencias autonoma (3SR), la Q-p replicasa, y la amplificacion por drculo rodante en cascada ("cascade rolling circle amplification", CRCA}.

En la tecnica tambien son muy conocidos los metodos de deteccion que utilizan acidos nucleicos. Los acidos nucleicos a menudo se marcan para diversos objetivos de deteccion. Por ejemplo, los metodos descritos en las patentes de EE. UU. n.os 4.486.539 (Kourlisky); 4.411.955 (Ward); 4.882.269 (Schneider); y 4.213.893 (Carrico), ilustran la preparacion de sondas de deteccion marcadas para detectar secuencias de acidos nucleicos espedficas.

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Tambien se han descrito disenos de sondas para diferentes metodos de deteccion, tales como diana-captura, HPA, TaqMan, balizas moleculares e hibridacion de "sandwich" (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.486.539, y patentes de EE. UU. n.os 4.751.177; 5.210.015; 5.487.972; 5.804.375; 5.994.076). Los expertos en la tecnica conocen tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos y sus condiciones, y se han descrito, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Lab. Press, Dec. 1989; patentes de EE. UU. n.os 4.563.419 (Ranki) y 4.851.330 (Kohne), y en Dunn, et al., Cell, 12, pp. 23-26 (1978), entre muchas otras publicaciones.

Se han descrito metodos moleculares anteriores desarrollados para detectar e identificar MRSA basandose en la deteccion del gen mecA y secuencias cromosomicas espedficas de S. aureus (Saito et al., 1995, J. Clin. Microbiol., 33:2498-2500; Ubukata et al., 1992, J. Clin. Microbiol., 30:1728-1733; Murakami et al., 1991, J. Clin. Microbiol., 29:2240-2244; Hiramatsu et al., 1992, Microbiol. Immunol., 36:445-453). Sin embargo, en los ensayos basados en la deteccion solo de la zona de union del modulo se han observado falsos positivos con aislados de S. aureus susceptibles a meticilina que contienen un pequeno fragmento del extremo derecho del SCCmec (vease Rupp, J. et al., J. Clin. Microbiol., 44(6):2317 (2006)). Ademas, Ramakrishnan y Riccelli describen un metodo para detectar MRSA utilizando sondas oligonucleotidicas que contienen secuencias que son complementarias con regiones cerca de la zona de union izquierda del sitio de insercion del modulo SCCmec, que incluyen parte de la secuencia del modulo SCCmec y parte de la secuencia de S. aureus en la region de insercion (la region de la zona de union del extremo izquierdo) (publicacion de patente n.° US20060057613).

Se han publicado los conceptos para determinar la resistencia a la meticilina que porta espedficamente S. aureus:

- el concepto de amplificacion de la zona de union del extremo derecho de SCCmec (Hiramatsu et al., documento W097/31125; documento EP 0 887 424; patente de EE. UU. n.° 6.156.507; y ademas Huletsky y Rossbach, documento WO02/099034 (2002); Huletsky et al., Clin. Microbiol., 42(5):1875-1884 (2004)),

- el concepto de inmunoenriquecimiento descrito por Francois y colaboradores (Francois, P. et al., J. Clin. Microbiol., 41(1):254-260 (2003); documento WO02082086}, en el que al inmunoenriquecimiento le sigue una amplificacion de tres marcadores (gen mecA, marcador espedfico de S. aureus, y marcador espedfico de S. epidermidis),

- la combinacion de la amplificacion de la zona de union del extremo derecho de SCCmec y la amplificacion de mecA (Jay, et al., documento US20090203013; documento WO2009085221).

El concepto de la zona de union del extremo derecho de SCCmec se basa en la amplificacion de una region que cubre la region de la zona de union del extremo derecho del sitio de integracion de SCCmec. El principio es el siguiente: el modulo SCCmec siempre se integra en el cromosoma de S. aureus cadena arriba de un marco de lectura abierto espedfico de S. aureus denominado orfX; el ensayo de amplificacion (por ejemplo, PCR) combina multiples cebadores directos localizados en la parte derecha del modulo ("region de la zona de union del extremo derecho" del modulo SCCmec), un cebador inverso y una sonda, ambos localizados en el orfX cromosomico de S. aureus, concretamente cadena abajo de la zona de union del extremo derecho de SCCmec con orfX ("region de la zona de union del extremo derecho" de orfX). Hiramatsu et al. describen un ensayo con dos cebadores directos en la region de la zona de union del extremo derecho del modulo para amplificar los principales tipos de SCCmec descritos en ese momento (un cebador para los tipos I y II de SCCmec y un segundo cebador para el tipo III). Huletsky et al. indican que no pueden detectarse varias cepas de MRSA si se emplean solo los dos cebadores directos descritos por Hiramatsu, y determinaron nuevos tipos de modulos, denominados tipos MREJ, que presentan variaciones en la secuencia en la parte derecha del modulo SCCmec. Un ensayo disponible en el mercado (Infectio Diagnostics Inc.) combina cinco cebadores directos localizados en la parte derecha del modulo (un cebador se diseno para la deteccion de los tipos i y ii de MREJ, y los otros cuatro para los tipos iii, iv, v y vii de MREJ), un cebador inverso localizado en el orfX, y tres sondas genericas que cubren la misma porcion de la region de orfX y que son necesarias para identificar los variantes de orfX identificados. Este ensayo se realiza con PCR a tiempo real. Sin embargo, la especificidad de este ensayo, tal como se indica (Huletsky et al., 2004) demuestra que 4,6% de MSSA (26 de los 569 ensayados) no fueron identificados. Tambien se ha indicado un resultado falso positivo con otro ensayo del mercado que emplea un ensayo de PCR de locus unico (zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec-orfX) (Rupp, J., et al., J. Clin. Microbiol., (44)6:2317 (2006)).

El documento US20090203013 trata de las fuentes primarias de falsos positivos de MRSA y proporciona un ensayo mejorado para detectar MRSA que no han podido ser detectados por los ensayos disponibles en la epoca. Esta solicitud indica que la identificacion de falsos positivos por los metodos moleculares previos puede explicarse en algunos casos por la presencia en cepas MSSA de un fragmento del extremo derecho de SCCmec residual tras la delecion de una region cromosomica que contiene mecA o la presencia de un SCCmec que no contiene mecA. Ademas, si indica que una parte de los falsos positivos puede ser debida a una amplificacion no espedfica; en efecto, debido a que el cebador inverso y las sondas estan localizadas en el orfX, que es comun a MRSA y MSSA, la asociacion no espedfica del cebador o cebador directos al cromosoma de MSSA conducira a la amplificacion y la deteccion de MSSA. La solicitud estudia ambas fuentes de falsos positivos y proporciona un ensayo mejorado. Se ha comercializado un ensayo que utiliza este principio (NucliSENS EasyQ® MRSA, bioMerieux, sA, Marcy l'Etoile, Francia).

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Previamente, en ensayos para la deteccion de S. aureus resistente a meticilina, se determinaba si el gen mecA estaba presente en el modulo SCCmec, lo cual conduda a que la cepa sea resistente a la meticilina, o se determinaba si el gen mecA estaba ausente (escision del modulo o no modulo), con lo que se conclrna que la cepa era susceptible a la meticilina. Tomando en cuenta las numerosas secuencias disponibles en los bancos de datos de acceso publico para el gen mecA, procedente de MRSA u otros patogenos resistentes a meticilina, se demostro que el gen mecA esta bien conservado y solo se encontraron algunas mutaciones concretas.

En fechas recientes, se detecto un S. aureus resistente a meticilina que careda de mecA mediante secuenciacion de micromatrices y PCR convencional (Shore, A.C. et al., Antimicrob. Agents Chemother., Doi:10.1128/AAC.00187-11 (2 de junio de 2011); y Garda-Alvarez, L. et al., Lancet, doi:10.1016/S1473-3099(11)70126-8 (3 de junio de 2011), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine population in the UK and Denmark: a descriptive study). La secuenciacion del genoma completo revelo un elemento SCCmec de 30 kb que tiene un blaZ-mecA-mecRI-mecl altamente divergente, e indico que el elemento mec presente en el elemento SCCmec presenta 70% de identidad de secuencia con homologos de mecA de S. aureus; ademas, el elemento SCCmec es casi identico al SCCmec de tipo XI previamente identificado (secuencia de tipo 425 de la cepa LGA251 de MRSA bovino listado en el sitio web de the International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements). El elemento SCCmec esta integrado en la misma posicion de nucleotidos dentro de orfX que todos los demas elementos SCCmec. La cepa incluye ademas un complejo mec de clase E, un complejo de modulo cromosomico de recombinasa ("cassette chromosome recombinase", ccr) de tipo 8 que consiste en ccrAl-ccrB3, un operon de resistencia al arsenico y repeticiones directas flanqueantes. Los presentes metodos de deteccion no identifican esta cepa como MRSA.

Shore et al. utilizan la cepa FR823292 como cepa de referencia y emplean los cebadores mecA_M10/0061. Garda- Alvarez et al. estudiaron un mecA divergente en el genoma de LGA251, y este variante de mecA esta localizado en un nuevo modulo denominado "SCCmec de tipo XI". Emplearon la cepa LGA251 como cepa de referencia y utilizaron los cebadores mecA_LGA2S1. De hecho, las dos publicaciones se refieren al mismo tema. Ambos variantes de mecA comparten un porcentaje de similitud muy alto (99%), y al mismo tiempo muestran una similitud global debil con todas las secuencias mecA conocidas hasta la fecha.

A medida que se identifican nuevas cepas y subtipos, son necesarios medios para detectar dichas cepas y subtipos. Esto resulta particularmente importante cuando los ensayos que existen en la actualidad no los detectan de manera fortuita y, por tanto, pueden ofrecer resultados falsos negativos. La presente invencion satisface esta necesidad con respecto a la deteccion de cepas que contienen un variante de mecA proporcionando un ensayo que puede detectar dichas cepas. Ademas, esta nueva invencion confirma, en el mismo ensayo, la presencia de una cepa de S. aureus y de un gen de resistencia a la meticilina. Este ensayo puede utilizarse por sf solo o en combinacion con los ensayos existentes para otros tipos de SCCmec.

Sumario de la invencion

La presente invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La invencion proporciona un metodo para amplificar y detectar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (mRsA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo:

realizar sobre la muestra una unica reaccion de amplificacion utilizando un conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de orfX del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, y

b. un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA, y

c. un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido,

en el que cada uno del primer oligonucleotido y el segundo oligonucleotido esta orientado de modo que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA, la region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido se amplifica, y si la muestra contiene el MRSA, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido.

En la presente tambien se describe un metodo para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo:

realizar sobre la muestra una reaccion de amplificacion utilizando:

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a. un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

1) un primer oligonucleotido de variante de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una primera region de un elemento variante de mecA, y

2) un segundo oligonucleotido de variante de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una segunda region de un elemento variante de mecA; y

b. un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

1) un primer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una primera region de mecA, y

2) un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una segunda region de mecA,

en el que cada uno del primer oligonucleotido y el segundo oligonucleotido esta orientado de modo que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA, la region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido se amplifica.

La presente invencion proporciona ademas un kit para amplificar y detectar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho kit un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de orfXdel ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, y

en el que:

- el primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10; y

- el segundo primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21, y

- el tercer primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada como SEQ ID NO:8, 11, 18 y 19.

Tambien se describe un kit para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho kit:

a) un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b) un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

2) un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una segunda region de mecA.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra, en general, la region del cromosoma de MRSA con el modulo SCCmec insertado, indicandose las zonas de union del extremo izquierdo y derecho.

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La figura 2 muestra, en general, la region del cromosoma de MRSA con el modulo SCCmec insertado que porta un variante de mecA (mecALGA251).

Descripcion detallada de la invencion

Tal como se analiza en la presente, la presente invencion proporciona la identificacion de cepas de S. aureus resistentes a meticilina que incluyen un gen mecA variante (que generalmente no se detectan con los kits de deteccion de MRSA disponibles en el mercado en la actualidad) y que esta dispuesto estructuralmente de tal modo que una unica reaccion de amplificacion puede amplificar una porcion pertinente de mecA y una zona de union de un extremo en el punto de insercion de un modulo SCCmec en el cromosoma de S. aureus. La presente invencion trata sobre una fuente recien descubierta de resultados falsos negativos y proporciona un ensayo mejorado.

A menos que se indique lo contrario, todos los terminos y expresiones tecnicos y cientificos empleados en la presente tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente los expertos en la tecnica a la cual pertenece la invencion descrita. Aunque pueden emplearse muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la practica o el ensayo de la presente invencion, se describen los metodos, dispositivos y materiales preferidos.

Tal como se emplean en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/una" y "el/la" incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Las cepas identificadas por la presente invencion son resistentes a meticilina, pero no portan el gen mecA clasico que, hasta la fecha, se sada que estaba bien conservado. En este caso, la resistencia a meticilina es conferida por un nuevo gen variante de mecA. Un variante de mecA documento se denomina en las publicaciones de diversa forma, como mecALGA25i, mecAMio/0061, homologo de mecA, y mecAvariante nuevo (recientemente se ha propuesto denominar a este variante como "mecC" (Ito, T. et al., Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues, Agents Chemother., doi:10.1128/AAC.01199-12]); sin embargo, con la presente invencion pueden detectarse otros variantes de mecA. Tal como se emplea en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresion "variante de mecA" se emplea para referirse a cualquier gen variante de mecA que confiere resistencia a la meticilina y que puede detectarse por medio de un metodo reivindicado, en particular con una reaccion de amplificacion que, con un unico conjunto de cebadores, amplifica una region que incluye una porcion pertinente de un variante de mecA (es decir, suficiente para identificarlo como un variante de mecA) y una zona de union de un extremo en el punto de insercion de un modulo SCCmec en el cromosoma de S. aureus. Se advertira que, a medida que las tecnologfas de la amplificacion se vayan desarrollando, sera posible lograr amplicones mas largos, de modo que podran disenarse conjuntos de cebadores para la deteccion de un gen variante de mecA para que se hibriden en sitios alejados de esta region diana que comprende una porcion pertinente de un gen variante de mecA y una zona de union de un extremo del modulo SCCmec.

El tamano de los modulos SCCmec en cepas de MRSA previamente estudiadas es divergente, pero en general se ha descubierto que el gen mecA tiene de aproximadamente 8000 a 15.000 pb desde el cromosoma de S. aureus en la direccion del orfX (a veces indicado en la presente como "cadena abajo") y mas largo en la otra direccion (vease la figura 1 y la figura 2a). En el nuevo SCCmec de tipo XI, se ha descubierto que el gen variante de mecA esta colocado en un lugar mas cercano a orfX, siendo la distancia de tan solo aproximadamente 1500 pb (vease la figura 2b). Aunque la aplicacion de disenos de amplificacion de MRSA tradicionales podna predecir un diseno de ensayo en dos partes (deteccion del gen variante de mecA, ademas de la deteccion de la zona de union), los solicitantes, por el contrario, consideraron y reconocieron la utilidad potencial de la distancia mas corta desde el gen variante de mecA al orfX. As^ la presente invencion amplifica, de modo ventajoso, la region entre el gen variante de mecA y una region de la zona de union de un extremo del cromosoma de S. aureus (es decir, a traves de la zona de union de un extremo) directamente empleando un cebador en el gen variante de mecA y otro en la region del cromosoma de S. aureus en la region de la zona de union de un extremo (vease la figura 2, por ejemplo, a traves de la zona de union del extremo derecho). Aunque sigue siendo un amplicon largo y poco convencional, los solicitantes han descubierto que este diseno funciona sorprendentemente bien. Ademas, esta nueva invencion resuelve el problema de la baja especificidad, porque solo se necesita una amplificacion y esta amplificacion confirma, en la misma reaccion, la presencia de una cepa de S. aureus y de un gen variante de resistencia a la meticilina.

La presente invencion proporciona un metodo para amplificar y detectar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo:

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en el que cada uno del primer oligonucleotido y el segundo oligonucleotido esta orientado de modo que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA, la region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido se amplifica. La region del ADN cromosomico de S. aureus puede estar en una region de la zona de union del extremo derecho.

Los oligonucleotidos de la presente invencion que se hibridan espedficamente con una diana pueden seleccionarse entre los que se hibridan selectivamente, en las condiciones de hibridacion seleccionadas, con su diana, es decir, que se unen con su diana o dianas previstas, pero no con aquello que no es la diana. Las condiciones de hibridacion/amplificacion pueden seleccionarse con una rigurosidad apropiada para lograr la selectividad, tal como se conoce en la tecnica (por ejemplo, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edicion (2001)). Pueden realizarse ligeras modificaciones para seleccionar los oligonucleotidos, con la condicion de que las condiciones de reaccion permitan que el oligonucleotido modificado se hibride espedficamente con la diana o dianas.

Un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en una region de la zona de union de un extremo, y un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA pueden actuar cada uno como cebador, y cada uno esta orientado de modo que, tras la hibridacion con su acido nucleico diana espedfico, y tras el inicio de una reaccion de amplificacion que incluye el cebador, se forma un amplicon que incluye la region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido. Esta reaccion esta disenada para la amplificacion a traves de una zona de union de un extremo del SCCmec en su insercion dentro del cromosoma de S. aureus (es decir, esta lo suficientemente cerca de la zona de union para que una reaccion de amplificacion pueda extenderse a traves de la zona de union). Asf, una pareja de cebadores para un variante de mecA util para amplificar una zona de union generalmente se hibridara con dos regiones, una en el variante de mecA y la otra en una region cromosomica de S. aureus, y asf rodea a la zona de union, y cada cebador estara orientado para que se hibride de tal modo que sea capaz de dirigir la amplificacion en la direccion 5'-3' hacia la zona de union. Generalmente, el cebador para el variante de mecA se disena para que se hibride dentro de 1600 nt, 1550 nt, 1500 nt, 1450 nt, 1400 nt, 1350 nt, 1300 nt, 1200 nt, 1100 nt, 1000 nt, 900 nt, 800 nt, 700 nt, 600 nt, 500 nt, 400 nt, 350 nt, 300 nt, 250 nt, 200 nt 150 nt, 100 nt, 50 nt, 30 nt, 25 nt, 20 nt, etc. de la zona de union; sin embargo, a medida que las nuevas tecnologfas permitan obtener amplicones mas largos, podran disenarse cebadores que se hibriden a mayor distancia de la zona de union. El cebador que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA generalmente se disenara para que se hibride a mayor distancia de la zona de union que el cebador que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en una region de la zona de union de un extremo, debido a la organizacion del SCCmec que contiene un gen variante de mecA y la distancia del gen variante de mecA de la zona de union.

El conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion del variante de mecA-orfX puede comprender ademas un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido, y cuando la muestra contiene el MRSa, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido. Este oligonucleotido puede actuar como sonda para detectar un producto de la amplificacion y, por tanto, se selecciona para que sea capaz de hibridarse espedficamente con una region entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido. En ciertas realizaciones, dicha sonda puede hibridarse espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, tal como una region de orfX. En otra realizacion, una sonda puede hibridarse espedficamente con una region de la region de zona de union del extremo derecho del ADN del modulo SCCmec (por ejemplo, dentro de secuencias blaZ), y en otra realizacion, una sonda puede hibridarse espedficamente con una region del variante de mecA. La amplificacion puede detectarse mediante cualquier medio seleccionado. Por ejemplo, este tercer oligonucleotido puede marcarse mediante varios medios y con cualquiera de diversos metodos. Asf, si la muestra contiene el MRSA se produce la amplificacion del acido nucleico entre los dosc cebadores, y el tercer oligonucleotido, que puede ser una sonda marcada, puede hibridarse con el amplicon. La hibridacion del tercer oligonucleotido puede detectarse mediante de cualquier medio conocido. Como alternativa, puede emplearse un tinte intercalante para detectar la amplificacion a partir de los dos cebadores. Si se emplea una sonda, la sonda puede disenarse para que se hibride espedficamente con una region de la region de zona de union del extremo derecho del ADN del modulo SCCmec. Por ejemplo, la sonda puede disenarse para que se hibride espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, tal como una region de orfX del aDn cromosomico de Staphylococcus aureus. Como alternativa, una sonda puede disenarse para que se hibride espedficamente con una region del variante de mecA.

Puede determinarse la presencia o la ausencia de cualquier diana dentro de la presente invencion realizando cualquier ensayo que proporcione la deteccion del producto, por ejemplo, si se emplea una sonda marcada, la deteccion del marcador hibridado se realizara mediante un dispositivo de deteccion apropiado. En esta realizacion, la falta de una senal detectable indica la ausencia de la diana; la percepcion de una senal detectable indica la

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presencia de la diana.

Los ejemplos de un primer oligonucleotido, o cebador, capaz de hibridarse espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en una region de la zona de union de un extremo pueden incluir, pero no se limitan a un oligonucleotido que se hibrida espedficamente en la region de orfX. Los ejemplos de dicho oligonucleotido incluyen las SEQ ID NO:9 y 10. Los ejemplos de un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA pueden incluir, pero no se limitan a una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO:6, 7, 16, 17 y 21. Estos ejemplos espedficos son particularmente utiles como cebadores directos (es decir, para dirigir la amplificacion hacia la zona de union del extremo derecho de SCCmec}. Los ejemplos de un tercer oligonucleotido, que puede emplearse como sonda, capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido (que se hibrida dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus) y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido (que se hibrida dentro de una region del variante de mecA) pueden incluir, pero no se limita a una secuencia de acido nucleico indicada como SEQ ID NO:8, 18 y 19.

La estructura genomica del MRSA ya ha sido caracterizada previamente. Tal como se emplea en las reivindicaciones, un "modulo SCCmec" (a veces denominado "ADNmec", por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.156.507} tiene la definicion que se conoce en la tecnica, es decir, un ADN adventicio integrado que existe en un cromosoma de MRSA o MR-CNS y que incluye el complejo genico mec, un conjunto de genes de recombinasa espedficos de sitio (ccrA y ccrB), y repeticiones directas e invertidas terminales (en ambos extremos 3' y 5'); tal como se emplea en la memoria descriptiva, esa expresion incluye cualquier variacion de SCCmec que se encuentre en las cepas que portan un variante de mecA. Un "gen mecA" incluye todas las secuencias necesarias para conferir resistencia a la meticilina (es decir, que codifican PBP2a o PBP2' (protema de union a penicilina, "Penicillin Binding Protein")).

Tal como se conoce en la tecnica, la insercion del modulo SCCmec en el cromosoma de S. aureus crea dos zonas de union y dos correspondientes zonas de union del ADN de SCCmec con el ADN cromosomico de S. aureus, en la que la secuencia de SCCmec esta contigua a la secuencia cromosomica de S. aureus. Por tanto, estas zonas de union estan localizadas en los extremos izquierdo y derecho del modulo SCCmec (vease la figura 1). Estas dos regiones han sido denominadas "zona de union SCCmec-cromosoma derecha" y "zona de union SCCmec- cromosoma izquierda" por Ito et al. (Antimicrob. Agents Chemother., mayo, 2001, 45(5):1323-1336, "Structural Comparison of three Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Integrated in the chromosome in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus"), y en la presente se denominan "zona de union del extremo derecho" y "zona de union del extremo izquierdo", respectivamente. En la zona de union del extremo derecho, la secuencia genomica de S. aureus que linda con el modulo SCCmec es el gen orfX, que en algunas referencias se denomina "IntM". Tal como se emplea en las reivindicaciones, una "region de la zona de union de un extremo" es una region del modulo SCCmec o del acido nucleico cromosomico de S. aureus dentro de una distancia de la zona de union del extremo derecho o izquierdo, o sitio de insercion, de modo que un cebador que se hibrida en SCCmec (por ejemplo, region J3) o orfX puede, en una reaccion de extension con cebadores o una reaccion del tipo de la transcripcion (por ejemplo, NASBA o TMA), extenderse a traves de esa zona de union, por ejemplo, dentro de 600 nt, 550 nt, 500 nt, 450 nt, 400 nt, 350 nt, 300 nt, 250 nt, 200 nt, 150 nt, 100 nt, o 50 nt (en cualquier direccion) de la zona de union. Las distancias utiles pueden variar dependiendo de la tecnologfa de amplificacion utilizada. Por tanto, una "zona de union de un extremo", dependiendo del contexto utilizado, puede indicar una region dentro del ADN de SCCmec o una region dentro del ADN cromosomico de S. aureus; ambos usos se refieren a dicho ADN dentro de una distancia de la zona union de modo que un cebador seleccionado de modo apropiado que se hibrida en SCCmec (por ejemplo, region J3) o orfX puede, bajo condiciones de amplificacion o extension convencionales y apropiadas, ser extendido o trascrito en la direccion de la zona de union y a traves de la zona de union. Es decir, "una region de la zona de union de un extremo del modulo SCCmec" sena una region dentro del ADN de SCCmec cercana a su lfmite, o sitio de integracion, con el ADN cromosomico de S. aureus; y "una region de la zona de union de un extremo de orfX' sena una region dentro del ADN de orfX cercana a su lfmite con el ADN de SCCmec (un sitio de integracion de SCCmec). De modo similar, "una region de la zona de union de un extremo del ADN cromosomico de S. aureus" sena una region dentro del ADN cromosomico de S. aureus cercana a un lfmite con el ADN de SCCmec. Como alternativa, esta region tambien puede denominarse ADN cromosomico de S. aureus en la region de la zona de union de un extremo de SCCmec. Asf, la "region de la zona de union del extremo derecho" se refiere a la region que rodea a la zona de union en el lado derecho (o cadena abajo) del modulo SCCmec, y la "region de la zona de union del extremo izquierdo" se refiere a la region que rodea a la zona de union en el lado izquierdo (o cadena arriba) del modulo SCCmec (vease la figura 1).

De modo ventajoso, se puede realizar una reaccion de amplificacion para detectar la presencia de cepas de MRSA previamente caracterizadas (que contienen el gen mecA descrito originariamente) empleando metodos conocidos, tales como un metodo que comprende detectar la zona de union de la insercion SCCmec y secuencias mecA (concretamente, Jay, et al.), junto con una amplificacion para detectar las cepas recien descubiertas que portan un variante de mecA. Esta reaccion de amplificacion y deteccion puede realizarse, por ejemplo, en recipientes distintos o en un unico recipiente, tal como una reaccion multiplex. Asf, ademas de la reaccion para detectar un variante de mecA, un ensayo puede incluir una reaccion para detectar, por ejemplo, una region de zona de union de un patron de insercion del modulo SCCmec (es decir, como se describe para SCCmec de tipos I-X), un patron del gen mecA (es decir, como se describe para SCCmec de tipos I-X) y/o una region cromosomica espedfica de S. aureus.

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"Amplificar una porcion de ADN de mecA" significa realizar una reaccion de amplificacion en una muestra que produce un producto de la amplificacion que incluye secuencias que se corresponden con cualquier porcion de un gen mecA, por ejemplo, la region entre los cebadores que comprende la secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID NO:12 y 13. Por ejemplo, un cebador puede comprender una secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID NO:12 y l3. Pueden utilizarse cebadores que comprenden estas secuencias y cebadores que consisten fundamentalmente en estas secuencias, asf como cebadores que consisten en esas secuencias. La amplificacion puede detectarse, por ejemplo, utilizando una sonda que comprende una secuencia de acido nucleico entre los acidos nucleicos diana de los cebadores, o empleando un tinte intercalante. Los cebadores y las sondas pueden disenarse con facilidad para la hibridacion con la secuencia de mecA conocida.

Zona de union. En la presente tambien se describe un metodo que, ademas de amplificar el variante de mecA, si esta presente, puede comprender ademas amplificar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un mecA, mediante la utilizacion, en una reaccion de amplificacion, de un segundo conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec con el ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, comprendiendo dicho segundo conjunto de oligonucleotidos:

a. un primer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en la region de la zona de union del extremo derecho; y

b. un segundo oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec del MRSA que comprende un mecA,

en el que cada uno del primer oligonucleotido de zona de union y el segundo oligonucleotido de zona de union esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA que comprende un mecA, la zona de union derecha se amplifica. El segundo conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de zona de union y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de zona de union, en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende la zona de union del extremo derecho, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de zona de union.

El tercer oligonucleotido de zona de union puede ser una sonda. El tercer oligonucleotido de zona de union puede tener una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec, o puede tener una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX. Como alternativa, puede realizarse un metodo de deteccion, tal como el uso de un tinte intercalante. El primer oligonucleotido de zona de union, que puede actuar como cebador de amplificacion, puede tener una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX.

Las sondas y los cebadores utilizados en cualquier reaccion de esta invencion son capaces de hibridarse espedficamente con un acido nucleico diana. La hibridacion espedfica es conocida en la tecnica y, generalmente, se logra por medio de obtener una elevada similitud o identidad del acido nucleico de la sonda/cebador con el acido nucleico diana y/o por medio del uso de condiciones de hibridacion rigurosas (por ejemplo, condiciones rigurosas de temperatura y/o sales). La hibridacion espedfica proporciona una hibridacion selectiva con la diana dentro de la reaccion.

Generalmente, para las reacciones de amplificacion distintas a la amplificacion de los acidos nucleicos de variante de mecA-orfX(tales como para amplificar una zona de union, un mecA no variante y/o una region cromosomica de S. aureus), el cebador se selecciona de modo que el producto de la amplificacion sintetizado mediante su utilizacion y un segundo cebador (localizado en una secuencia genomica de S. aureus) tengan una longitud de aproximadamente 100 a 350 nt. Aunque la amplificacion con PCR puede disenarse para generar amplicones mas largos o mas cortos (por ejemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, l0o0 nt o mas largos), las longitudes preferidas de los amplicones para las reacciones basadas en la transcripcion (por ejemplo, NASBA o TMA) o las reacciones de tipo PCR para la deteccion de los genes cromosomicos de S. aureus, la zona de union o mecA en la presente invencion tendran una longitud de aproximadamente 100 a 300 nt (por ejemplo, 150, 200, 250, 300 nt). Ademas, para una reaccion de amplificacion multiplex, tanto basada en la transcripcion como basada en PCR, para estas dianas es preferible un amplicon en el intervalo de 100 a 300 nt o mas cortos para potenciar la sensibilidad del ensayo. Se advierte que la amplificacion que emplea un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en una region de la zona de union de un extremo, y un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA, empleara un amplicon mas largo que el que se emplea generalmente en otras amplificaciones que forman parte del presente ensayo. Tambien se advierte que, a medida que los metodos de amplificacion se sigan desarrollando y perfeccionando, sera posible preparar amplicones mas largos que finalmente seran habituales y estos se incluyen en la presente invencion.

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Un cebador orientado de tal forma que, "bajo las condiciones de la amplificacion, la zona de union se amplifica" incluye un cebador orientado de tal forma que, tras su hibridacion con su acido nucleico diana espedfico y tras iniciar una reaccion de amplificacion que incluye el cebador, se forma un amplicon que incluye la zona de union. Esta reaccion se disena para que se produzca la amplificacion a traves de la zona de union (es decir, esta lo suficientemente cerca de la zona de union para que una reaccion de amplificacion tipica pueda extenderse a traves de la zona de union). Asf, una pareja de cebadores utiles para amplificar una zona de union generalmente se hibrida con dos regiones que rodean a la zona de union, y cada cebador estara orientado para que se hibride en la direccion 5'-3' hacia la zona de union. Generalmente, el cebador se disena para que se hibride dentro de 600 nt, 500 nt, 400 nt, 350 nt, 300 nt, 250 nt, 200 nt, 150 nt, 100 nt, 50 nt, 30 nt, 25 nt, 20 nt, etc. de la zona de union. Por tanto, una sonda para detectar un producto de la amplificacion se selecciona para que sea capaz de hibridarse selectivamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec entre las secuencias diana de los cebadores. Por ejemplo, la sonda puede hibridarse dentro de secuencias genomicas de S. aureus (por ejemplo, orfX, entre la secuencia diana de la sonda de S. aureus y la zona de union) o dentro de SCCmec (entre la secuencia diana del cebador de SCCmec y la zona de union) o a traves de la zona de union. En ciertas realizaciones, dicha sonda puede hibridarse espedficamente en una posicion totalmente dentro o principalmente dentro del modulo SCCmec. En una realizacion en la que la sonda se hibrida espedficamente dentro del modulo SCCmec, la region a la cual se hibrida la sonda puede incluir ademas la zona de union y, por tanto, al menos uno o dos o tres o unos pocos nucleotidos del orfX contiguos a la zona de union. Generalmente, el cebador se selecciona de modo que el producto de la amplificacion sintetizado mediante su utilizacion y un segundo cebador (localizado en una secuencia genomica de S. aureus) tenga una longitud de aproximadamente 100 a 350 nt. Aunque la amplificacion con PCR puede disenarse para generar amplicones mas largos (por ejemplo, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 nt o mas largos), las longitudes preferidas de los amplicones para las reacciones basadas en la transcripcion (por ejemplo, NASBA o TMA) o las reacciones de tipo PCR para la deteccion de los genes cromosomicos de S. aureus, la zona de union o mecA en la presente invencion tendran una longitud de aproximadamente 100 a 300 nt (por ejemplo, 150, 200, 250, 300 nt). Ademas, para una reaccion de amplificacion multiplex, tanto basada en la transcripcion como basada en PCR, para estas dianas es preferible un amplicon en el intervalo de 100 a 300 nt o mas cortos para potenciar la sensibilidad del ensayo. Los cebadores espedficos utiles para amplificar regiones de la zona de union de un extremo pueden disenarse con facilidad mediante las indicaciones de la presente y los conocimientos de la tecnica.

Tal como se emplean en las reivindicaciones, las "condiciones de la amplificacion" son las condiciones adecuadas para una reaccion de amplificacion seleccionada, tal como conocen los expertos en la tecnica, tal como se emplean en las diversas reacciones de amplificacion. Dichas condiciones pueden optimizarse para una reaccion, cebadores, etc., espedficos, tal como se conocen tambien los expertos en la tecnica. Tal como se sabe, dichas condiciones de amplificacion incluyen el contacto con los reactivos requeridos para la amplificacion, por ejemplo, nucleotidos y enzimas, asf como las condiciones de temperatura, sales y pH seleccionadas apropiadas, entre otros aspectos. Ademas, tal como se emplean en las reivindicaciones, un cebador o una sonda pueden ser un conjunto de cebadores o sondas, es decir, multiples cebadores o sondas. Estos conjuntos de cebadores/sondas pueden utilizarse en una reaccion en la que se desea amplificar y/o detectar mas de un tipo o subtipo de MRSA, y en la que la secuencia de acido nucleico de la region de MRSA diana seleccionada para la hibridacion del cebador y/o sonda vana entre los tipos y/o subtipos. Pueden disenarse sondas/cebadores individuales para cada tipo o subtipo, tal como se ejemplifica en la presente.

mecA. El presente metodo puede comprender ademas amplificar un Staphylococcus aureus que comprende mecA utilizando, en una reaccion de amplificacion, un tercer conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un elemento mecA que comprende:

a. un primer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de mecA; y

b. un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro de mecA, en el que cada uno del primer oligonucleotido de mecA y el segundo oligonucleotido de mecA esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, una porcion del mecA se amplifica. El tercer conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del mecA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de mecA y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de mecA,

en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende mecA, se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de mecA. Como alternativa, puede realizarse un metodo de deteccion, tal como el uso de un tinte intercalante. Los ejemplos de cebadores para mecA pueden incluir SEQ ID NO:12 y 13.

"Amplificar una porcion de ADN de mecA" significa realizar una reaccion de amplificacion en una muestra que produce un producto de la amplificacion que incluye secuencias que se corresponden con cualquier porcion identificadora de un gen mecA, por ejemplo, la region entre los cebadores que comprenden la secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID nO:12 y 13. La amplificacion puede detectarse utilizando una sonda que se hibrida entre los acidos nucleicos diana de los cebadores o empleando un tinte intercalante. Los cebadores y las sondas

pueden disenarse con facilidad para la hibridacion con la secuencia de mecA conocida.

Cromosoma de S. aureus. El presente metodo puede comprender ademas utilizar un cuarto conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

5 a. un primer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus; y

b. un segundo oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus, en el que cada uno del primer oligonucleotido de S. aureus y el segundo oligonucleotido de S. aureus esta orientado 10 de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, una porcion del ADN espedfico de S. aureus se amplifica. El cuarto conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus, en el que si la muestra contiene la region del ADN de S. aureus entre la region de 15 hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido. Este tercer oligonucleotido de S. aureus puede actuar como una sonda. El ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus puede ser cualquier region genomica espedfica de S. aureus conocida, tal como dentro de los genes spa, orfX o nuc. Los ejemplos de cebadores para spa pueden incluir SEQ ID NO:24 y 25, y de sonda, SEQ ID NO:26. Los ejemplos de cebadores 20 para orfX pueden incluir SEQ ID NO:9 y 10, y de sonda, SEQ ID NO:11. Los ejemplos de cebadores para nuc pueden incluir SEQ ID NO:27, 28 y 30, y de sonda, SEQ ID NO:29. Como alternativa, puede realizarse un metodo de deteccion, tal como el uso de un tinte intercalante.

La presente descripcion comprende un metodo para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de 25 Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo realizar en la muestra una reaccion de amplificacion utilizando:

a. un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

30 2) un segundo oligonucleotido de variante de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse

espedficamente con una segunda region de un elemento variante de mecA; y

b. un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

35 2) un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse

espedficamente con una segunda region de mecA, en el que cada uno del primer oligonucleotido y el segundo oligonucleotido esta orientado de modo que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA, la region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido se amplifica. El primer conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer 40 oligonucleotido de variante de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de variante de mecA y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de variante de mecA, y en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende un elemento variante de mecA, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de variante de mecA. El segundo conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de mecA capaz de hibridarse 45 espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de mecA y

la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de mecA, y en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende mecA, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de mecA. Dicho tercer oligonucleotido puede ser una sonda. Como alternativa, puede realizarse un metodo de deteccion, tal como el uso de un tinte intercalante. Como ejemplo, el primer oligonucleotido de variante de mecA puede comprender una 50 secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15 y 20. El segundo oligonucleotido de variante de mecA puede comprender una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, 17 y 21. El tercer oligonucleotido de variante de mecA puede comprender una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 18 y 19. En dicho metodo, el variante de mecA puede ser mecALGA251 o puede ser otro variante de mecA.

55 Zona de union. El metodo para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, puede comprender ademas la

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amplificacion de otros elementos de MRSA y/o S. aureus. Por ejemplo, el metodo puede comprender amplificar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del aDn cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un mecA, mediante la utilizacion, en una reaccion de amplificacion, de un segundo conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec con el ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, comprendiendo dicho segundo conjunto de oligonucleotidos:

en el que cada uno del primer oligonucleotido de zona de union y el segundo oligonucleotido de zona de union esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA que comprende un mecA, la zona de union derecha se amplifica. El tercer conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de zona de union y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de zona de union, en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende la zona de union del extremo derecho, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de zona de union. El tercer oligonucleotido de zona de union puede tener una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec. El primer oligonucleotido de zona de union puede tener una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX. El tercer oligonucleotido de zona de union puede tener una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX. Como alternativa, puede realizarse un metodo de deteccion, tal como el uso de un tinte intercalante.

S. aureus. El metodo para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, puede comprender ademas la utilizacion de un cuarto conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

a. un primer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus; y

b. un segundo oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus, en el que cada uno del primer oligonucleotido de S. aureus y el segundo oligonucleotido de S. aureus esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, una porcion del ADN espedfico de S. aureus se amplifica. El cuarto conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus,

en el que si la muestra contiene la region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido. Este tercer oligonucleotido de S. aureus puede actuar como una sonda. Como alternativa, puede realizarse un metodo de deteccion, tal como el uso de un tinte intercalante. El ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus puede seleccionarse, por ejemplo, de spa, orfX y nuc; sin embargo, pueden utilizarse otras dianas de ADN cromosomico espedfico de S. aureus, tal como conocen los expertos en la tecnica.

Se reconocera que, ademas de la reaccion de amplificacion que detecta la presencia de un variante de mecA, la invencion incluye una reaccion que puede amplificar tambien una o mas secuencias pertinentes adicionales, tales como la zona de union de SCCmec para los tipos de SCCmec distintos a los portan un variante de mecA, mecA (no variante), y una secuencia cromosomica espedfica de S. aureus. Se pueden combinar cualquiera o todas estas reacciones de amplificacion adicionales en una reaccion multiplex o en reacciones individuales.

Una reaccion de amplificacion multiplex significa que se ponen en contacto entre sf los reactivos espedficos para la amplificacion de mas de una diana, de modo que puede producirse mas de una amplificacion dentro del mismo recipiente de reaccion. Ademas pueden incluirse reactivos de deteccion para mas de una diana. Asf, se puede realizar una reaccion de deteccion y amplificacion multiplex poniendo en contacto todos los reactivos espedficos para la deteccion y la amplificacion de mas de una diana. Por tanto, en una reaccion multiplex se pueden amplificar multiples regiones diana en la misma reaccion. Las reacciones de amplificacion multiple tambien pueden realizarse

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de modo secuencial. Tambien puede emplearse la amplificacion simultanea, si no se desea o no se factible realizar un multiplex, en la que se deja que se desarrollen reacciones individuales al mismo tiempo, pero sin que sea necesario que los reactivos para mas de una reaccion de amplificacion esten dentro del mismo tubo o recipiente de reaccion, sino que se realizan en distintos recipientes de reaccion. Se entiende que, incluso en una reaccion de amplificacion multiplex, cada reaccion se producira a la velocidad en que se desarrollan las reacciones individuales bajo las condiciones proporcionadas. La deteccion tambien puede ser "simultanea", lo cual significa que si se incluyen las sondas apropiadas para cada reaccion en el recipiente de reaccion puede lograrse la deteccion, bajo las condiciones apropiadas, de mas de una diana en un unico recipiente de reaccion (multiplex) o en mas de un recipiente de reaccion (las sondas apropiadas se distribuyen al recipiente de reaccion pertinente). Esta deteccion puede realizarse, si se desea, en el mismo recipiente de reaccion que la reaccion de amplificacion multiplex o simultanea, y ademas puede realizarse a medida que se desarrollan las reacciones de amplificacion (es decir, a tiempo real). En el unico recipiente pueden incluirse todos los componentes de una mezcla de reaccion, adaptados al metodo de amplificacion y deteccion espedfico utilizado. Asf, una "mezcla de reaccion" puede incluir todos los reactivos necesarios para realizar una reaccion que pueden incluir, pero no se limitan a agentes tamponantes para mantener el pH a un nivel seleccionado durante una reaccion, sales, cofactores, captadores y similares.

Tal como se emplea en la presente, un oligonucleotido que "tiene" una secuencia de acido nucleico incluida en una porcion de un aDn diana significa una secuencia que tiene la identidad suficiente con la secuencia de ADN diana, o su complemento, para hibridarse de modo espedfico y selectivo a dicho ADN diana bajo condiciones de hibridacion rigurosas. Incluye secuencias de acidos nucleicos que presentan una identidad total con la secuencia.

En general, las reacciones de amplificacion que producen amplicones (el producto de una reaccion de amplificacion de polinucleotidos) estan "dirigidas por moldes" porque, en el apareamiento de bases de los reactivos, los nucleotidos o los oligonucleotidos tienen complementos en un polinucleotido molde que son necesarios para la creacion de los productos de la reaccion. En un aspecto, las reacciones dirigidas por molde son extensiones con cebadores con una acido nucleico polimerasa, o acoplamientos de oligonucleotidos con una acido nucleico ligasa. La amplificacion puede incluir cualquier metodo de amplificacion conocido o recientemente disenado, que incluye los empleados en metodos publicados (por ejemplo, la amplificacion basada en la transcripcion, tal como la amplificacion mediada por transcripcion ("transcription-mediated amplification", TMA) y la amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos ("nucleic acid sequence-based amplification", NASBA) (tal como se ejemplifica en la presente), y las tecnologfas de amplificacion de acido nucleicos por ciclado (termociclado), tal como la reaccion en cadena de polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), y la reaccion en cadena de ligasa (LCR), y cualquier metodo de amplificacion, por ejemplo, replicacion de secuencia sostenida (3SR), amplificacion por desplazamiento de hebra ("strand displacement amplification", SDA), ADN ramificado (bDNA), tecnologfa de sondas ciclantes ("cycling probe technology", CPT), amplificacion en fase solida ("solid phase amplification", SPA), tecnologfa de amplificacion por drculo rodante ("rolling circle amplification technology", RCA), rCa en fase solida, SDA anclada y amplificacion de senal dependiente de nucleasa ("nuclease dependent signal amplification", NDSA), todas las cuales son conocidas por los expertos en la tecnica. Una reaccion de amplificacion puede ser una amplificacion "a tiempo real" si esta disponible una qrnmica de deteccion que permita medir un producto de la reaccion a medida que se desarrolla la reaccion de amplificacion, por ejemplo, PCR a tiempo real o NASBA a tiempo real. Por tanto, esta invencion incluye el uso de cualquier metodo de amplificacion de acidos nucleicos o cualquier otro procedimiento que pueda emplearse para aumentar la sensibilidad y/o la rapidez de ensayos de diagnostico basados en acidos nucleicos. La presente invencion tambien incluye el uso de cualquier tecnologfa de deteccion que incluye las tecnologfas de deteccion despues de la amplificacion, cualquier tecnologfa de amplificacion combinada con deteccion, cualquier tecnologfa de hibridacion de matrices o chips de acidos nucleicos, y cualquier tecnologfa de amplificacion de chips o combinacion de tecnologfas de amplificacion e hibridacion de chips. La deteccion y la identificacion mediante cualquier metodo de secuenciacion de nucleotidos tambien se incluyen en la presente invencion.

En la invencion puede utilizarse una diversidad de metodos de deteccion. Los metodos de deteccion que utilizan sondas de acidos nucleicos son muy conocidos en la tecnica. Las sondas de los presentes kits y/o para su uso en los presentes metodos pueden marcarse con cualquier marcador seleccionado adecuado para el metodo de deteccion elegido, muchos de los cuales son conocidos en la tecnica, tales como fosfatasa (por ejemplo, fosfatasa alcalina), biotina, avidina, una peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rabano), digoxigenina, un tinte fluorescente

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(tales como los tintes Cy3 y Cy5, fluorescema, FAM, ROX), un marcador quimioluminiscente, un marcador cromoforico, un marcador radiactivo (por ejemplo, un radioisotopo) y un ligando. Pueden emplearse disenos de sondas para diferentes metodos de deteccion, tales como diana-captura, HPA, TaqMan, balizas moleculares, escorpiones e hibridacion de "sandwich". Las condiciones de hibridacion pueden seleccionarse segun el tipo de sonda y el tipo de reaccion de deteccion seleccionada. Ademas, pueden emplearse tintes intercalantes. Un tinte intercalante es un tinte que se une espedficamente al ADN bicatenario y fluoresce intensamente tras dicha union; en ausencia de un ADN bicatenario no se unen a nada, y solo emite una fluorescencia muy baja. La deteccion se controla midiendo el aumento en la fluorescencia a lo largo del ciclo de amplificacion. Si se desea puede emplearse un tinte intercalante con analisis de fusion, tal como se conocen en la tecnica. Los ejemplos de tintes intercalantes pueden incluir, pero no se limitan a bromuro de etidio, SYBR® Green, LC Green, LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy y SYTO 9. Los expertos en la tecnica conoceran otros y puede que esten disponibles otros tintes nuevos.

El presente metodo proporciona ademas kits utiles para su uso en dichos metodos de amplificacion y deteccion. De modo espedfico, la presente invencion proporciona un kit para amplificar y detectar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho kit un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

c. un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido, en el que:

- el segundo oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21, y

- el tercer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada como SEQ ID NO:8, 11, 18 y 19.

Un kit de la presente descripcion para amplificar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, puede comprender ademas uno o mas elementos adicionales, que incluyen conjuntos de oligonucleotidos para la deteccion de otros elementos de MRSA y MSSA. Aunque a veces en la presente se hace referencia a un "segundo", "tercer" o "cuarto" conjunto de oligonucleotidos, la eleccion de un conjunto de nucleotidos adicional es independiente de las otras opciones. Por ejemplo, el kit puede incluir conjuntos de oligonucleotidos para la amplificacion de uno o mas de la zona de union de SCCmec para los tipos de SCCmec distintos a los portan un variante de mecA, mecA (no variante), y una secuencia cromosomica espedfica de S. aureus. En un ejemplo, un kit puede comprender un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec. En otro ejemplo, el kit puede comprender un tercer conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un elemento mecA que comprende:

a. un primer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de mecA; y

b. un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN de mecA. Otro ejemplo es un kit que puede comprender un cuarto conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse

espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus.

Otro kit de la presente descripcion proporciona un kit para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, en el 5 que el modulo SCCmec comprende un elemento mecA o variante de mecA.

a) un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

2) un segundo oligonucleotido de variante de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse

10 espedficamente con una segunda region de un elemento variante de mecA; y

b) un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

2) un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse 15 espedficamente con una segunda region de mecA. El kit puede comprender, ademas, en el primer conjunto de

oligonucleotidos, un tercer oligonucleotido de variante de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido. Puede comprender, en el segundo conjunto de oligonucleotidos, un tercer oligonucleotido de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer 20 oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido. En un ejemplo espedfico, el primer oligonucleotido de variante de mecA puede comprender una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10. En otro ejemplo, el segundo oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21. En otra realizacion, en el primer conjunto de oligonucleotidos, el tercer oligonucleotido de variante de mecA 25 comprende una secuencia de acido nucleico indicada como SEQ ID NO: 8, 18 y 19. En cualquiera de estos kits, el variante de mecA puede ser preferiblemente mecALGZ251; sin embargo, puede ser otro variante de mecA.

Un kit de esta descripcion puede comprender ademas un tercer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en la region de la zona de

30 union del extremo derecho; y

b. un segundo oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec que comprende mecA, en el que cada uno del primer oligonucleotido de zona de union y el segundo oligonucleotido de zona de union esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion en presencia del MRSA

35 en el que el modulo SCCmec comprende mecA, se amplifica la zona de union de la insercion del extremo derecho del modulo SCCmec. El tercer conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de zona de union y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de zona de union.

40 Un kit de esta descripcion puede comprender ademas un cuarto conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus,

45 en el que cada uno del primer oligonucleotido de S. aureus y el segundo oligonucleotido de S. aureus esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion en presencia de un MRSA, una porcion del ADN espedfico de S. aureus se amplifica. El cuarto conjunto de oligonucleotidos puede comprender ademas un tercer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region 50 de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus.

Las sondas de esta invencion, que incluyen las que estan incluidas en dichos kits, pueden marcarse de modo ventajoso para la deteccion, tal como conocen los expertos en la tecnica. Los marcadores pueden seleccionarse de forma apropiada segun el diseno espedfico y el tipo de reaccion de amplificacion que se va a realizar. Los reactivos de sondas y cebadores pueden proporcionarse en cualquiera de varios estados, que incluyen en estado secado,

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liofilizado, en forma de granulos, secado por pulverizacion o en Kquidos.

Los kits de esta invencion pueden incluir elementos adicionales, tales como reactivos para un metodo de amplificacion seleccionado (por ejemplo, una o mas enzimas de amplificacion, uno o mas tampones y/o una o mas enzimas de restriccion, entre otros), uno o mas controles, uno o mas recipientes de reaccion y similares. Si se va a emplear un tinte intercalante, este debe incluirse en el kit. Ademas, un kit de la presente invencion puede comprender un recipiente que comprende un kit tal como se describe en la presente. Los elementos pueden proporcionarse en un unico recipiente o en mas de un recipiente. Estos kits pueden ser utiles para realizar amplificaciones multiplex.

Se advierte que las referencias a las secuencias de sondas y cebadores que incluyen timidina pueden adaptarse con facilidad para emplear uridina en sustitucion de la timidina cuando resulte util para un ensayo concreto. Ademas, los nucleotidos pueden modificarse mediante la adicion de grupos qmmicos, o la sustitucion de restos individuales por analogos (por ejemplo, las versiones de 2'-O-metoxi}. Estos nucleotidos modificados adicionales son conocidos en la tecnica; algunos ejemplos incluyen hidroximetil nucleotidos, nucleotidos metilados, nucleotidos fluorados, alfa- tiofosfatonucleotidos, nucleotidos modificados con amina, metoxinucleotidos, carboximetilnucleotidos, tionucleotidos, inosina, dihidrouridina, pseudouridina, wibutosina, queuosina, C7dGTP. Pueden encontrarse otros nucleotidos modificados en las patentes de EE. UU. n.os 5.405.950 y 5.633.364 (ambas de Mock and Lovern). Ademas, una sonda puede comprender ADN, ARN, ADN o ARN modificado, ANP, otros acidos nucleicos sinteticos o sustitutos de acidos nucleicos que emplean bases de nucleotidos como medio para hibridarse selectivamente con una diana.

El presente metodo puede utilizarse en cualquier muestra seleccionada, tal como una muestra directa de un paciente, por ejemplo, un frotis nasal o inguinal, un frotis del perineo, un frotis de la axila, un frotis de la garganta, un frotis rectal, muestras procedentes de heridas, todos ellos particularmente adecuados para la seleccion, asf como particularmente adecuados para el diagnostico, lavado broncoalveolar o sangre (por ejemplo, septicemia o cultivo de sangre). Estas muestras generalmente contienen una poblacion mixta de organismos. Ademas, si se desea, este metodo puede aplicarse a una muestra que solo presente un unica especie o cepa bacteriana, por ejemplo, muestras que utilizan el aislamiento, el cultivo, la captura y/o el enriquecimiento de MRSA.

Otros aspectos de la invencion se describen a continuacion.

La invencion tambien se refiere a un metodo para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo:

realizar sobre la muestra una reaccion de amplificacion utilizando un conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus en una region de la zona de union de un extremo, y

b. un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA,

Opcionalmente, la region de la zona de union de un extremo del ADN cromosomico de S. aureus es una region de la zona de union del extremo derecho.

Opcionalmente, el conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido, y en el que cuando la muestra contiene el MRSA, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido.

Opcionalmente, el metodo comprende ademas poner en contacto la muestra amplificada con un tinte intercalante, en el que si la muestra contiene el MRSA, entonces se detecta la intercalacion del tinte en un producto de la amplificacion.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido se hibrida espedficamente con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido se hibrida espedficamente con una region de orfX del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido se hibrida espedficamente con una region de la region de zona de union del extremo derecho del ADN del modulo SCCmec.

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Opcionalmente, el tercer oligonucleotido se hibrida espedficamente con una region del variante de mecA.

Opcionalmente, el primer oligonucleotido se hibrida espedficamente con una region de orfX del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus.

Opcionalmente, el variante de mecA es mecALGA25i.

Opcionalmente, el primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10.

Opcionalmente, el segundo oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID NO:8, 11, 18 y 19.

Opcionalmente, el metodo comprende ademas amplificar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un mecA, mediante la utilizacion, en una reaccion de amplificacion, de un segundo conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec con el ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, comprendiendo dicho segundo conjunto de oligonucleotidos:

en el que cada uno del primer oligonucleotido de zona de union y el segundo oligonucleotido de zona de union esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA que comprende un mecA, la zona de union derecha se amplifica.

Opcionalmente, el segundo conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de zona de union y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de zona de union,

en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende la zona de union del extremo derecho, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de zona de union.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido de zona de union tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido de zona de union tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX.

Opcionalmente, el primer oligonucleotido tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX.

Opcionalmente, el metodo comprende ademas amplificar un Staphylococcus aureus que comprende mecA utilizando, en una reaccion de amplificacion, un tercer conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un elemento mecA que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN de mecA,

en el que cada uno del primer oligonucleotido de mecA y el segundo oligonucleotido de mecA esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, una porcion del mecA se amplifica.

Opcionalmente, el tercer conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del mecA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de mecA y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de

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mecA,

en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende mecA, se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de mecA.

Opcionalmente, el metodo segun la invencion comprende ademas utilizar un cuarto conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

en el que cada uno del primer oligonucleotido de S. aureus y el segundo oligonucleotido de S. aureus esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, una porcion del ADN espedfico de S. aureus se amplifica.

Opcionalmente, el cuarto conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus,

en el que si la muestra contiene la region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido.

Opcionalmente, el ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus se selecciona del grupo que consiste en spa, orfX y nuc.

Tambien se describe un metodo para amplificar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende mecA o un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo:

realizar sobre la muestra una reaccion de amplificacion utilizando:

a. un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b. un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

1) un primer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido espedficamente con una primera region de mecA, y

2) un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido espedficamente con una segunda region de mecA,

Opcionalmente, el primer conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de variante de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de variante de mecA y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de variante de mecA, y

en el que si la muestra contiene el MRSA que comprende el elemento variante de mecA, se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de variante de mecA.

Opcionalmente, el segundo conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de mecA y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de mecA, y

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Opcionalmente, el primer oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15 y 20.

Opcionalmente, el segundo oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, 17 y 21.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 18 y 19.

Opcionalmente, el variante de mecA es mecALGA251.

Opcionalmente, el tercer conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de zona de union y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de zona de union,

Opcionalmente, el primer oligonucleotido de zona de union tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de orfX.

Opcionalmente, el metodo comprende ademas utilizar un cuarto conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

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Tambien se describe un kit para amplificar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho kit un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b. un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA.

Opcionalmente, el kit comprende ademas un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID NO:8, 18 y 19.

Opcionalmente, el variante de mecA es mecALGA251.

Opcionalmente, el kit comprende ademas un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec.

Opcionalmente, el kit comprende ademas un tercer conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un elemento mecA que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN de mecA.

Opcionalmente, el kit comprende ademas un cuarto conjunto de oligonucleotidos para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus.

a) un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

espedficamente con una segunda region de un elemento variante de mecA; y b) un segundo conjunto de oligonucleotidos que comprende:

y cada conjunto esta orientado de tal forma que cuando una muestra se coloca bajo condiciones de amplificacion con el conjunto de oligonucleotidos, si la muestra contiene MRSA puede producirse la amplificacion.

Opcionalmente, el kit comprende ademas, en el primer conjunto de oligonucleotidos, un tercer oligonucleotido de variante de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido.

Opcionalmente, el kit comprende ademas, en el segundo conjunto de oligonucleotidos, un tercer oligonucleotido de mecA capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido.

Opcionalmente, el primer oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10.

Opcionalmente, el segundo oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21.

Opcionalmente, el tercer oligonucleotido de variante de mecA comprende una secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID NO:8, 18 y 19.

Opcionalmente, el variante de mecA es mecALGA251.

Opcionalmente, el kit comprende ademas un tercer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

b. un segundo oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region de la region de la zona de union del extremo derecho del modulo SCCmec que comprende mecA,

en el que cada uno del primer oligonucleotido de zona de union y el segundo oligonucleotido de zona de union esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion en presencia del MRSA en el que el modulo SCCmec comprende mecA, se amplifica la zona de union de la insercion del extremo derecho del modulo SCCmec.

Opcionalmente, el tercer conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de zona de union que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de zona de union y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de zona de union.

Opcionalmente, el kit comprende ademas un cuarto conjunto de oligonucleotidos que comprende:

en el que cada uno del primer oligonucleotido de S. aureus y el segundo oligonucleotido de S. aureus esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion en presencia de un MRSA, una porcion del ADN espedfico de S. aureus se amplifica.

Opcionalmente, el cuarto conjunto de oligonucleotidos comprende ademas un tercer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus.

La presente invencion se ejemplifica en los siguientes ejemplos. Tal como se indica a lo largo de la memoria descriptiva, la deteccion de un variante de mecA puede combinarse en cualquier combinacion deseada, en forma

5

10

15

20

25

multiples o en forma simplex multiple, con otro ensayo deseado, tal como una o mas sondas y/o cebadores para mecA, ADN genomico de S. aureus y/o zona de union de SCCmec.

Ejemplos

Condiciones de amplificacion

Las amplificaciones empleando PCR pueden realizarse bajo condiciones convencionales. Estas condiciones pueden incluir:

Preparacion de la mezcla MIX (reaccion realizada en 25 |jl):

Reactivo: Concentracion inicial Concentracion final para 1 muestra (volumen en pl)

Agua: NA NA 16,15

Tampon, pH 8,6 (KCl 50 mM): 50X 1X 0,50

Disolucion de MgCl2: 1 M 5,4 mM 0,14

dNTP: 10 M 0,124 mM 0,31

KCl: 1,2 M 14,8 mM 0,31

Cebador directo: 20 |iM 0,2 jM 0,25

Cebador inverso: 20 |iM 0,2 jM 0,25

Sonda: 20 |iM 0,1 jM 0,13

BSA: 10 jg/jl 0,5 jg/jl 1,25

Enzima Fast Start: 5 U/jl 0,112 U/jl (3,6 U/rxn) 0,72

Diana (pl): NA NA 5

Ciclo de amplificacion en Biorad CFX96:

: Activacion de la enzima Desnaturalizacion Asociacion/extension (optica)

Temperatura (°C): 95 95 65

Tiempo (s): 300 5 30

Ciclo o ciclos: 1 50

Diseno de los oligonucleotidos

Pueden utilizarse oligonucleotidos dedicados a la amplificacion o la deteccion y que pertenezcan a las regiones genomicas descritas en la presente, cualquiera que sea el metodo utilizado para su diseno. Entre estos metodos que pueden utilizarse se encuentran, por ejemplo (sin limitacion) el diseno manual (la experiencia humana en el diseno de oligonucleotidos) o el diseno por ordenador (secuencias de instrucciones, programas, software) (por ejemplo,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1476746, Eberhardt N. L., A shell program for the design of PGR primers using genetics computer group (GCG) software (7.1) on VAX/VMS systems, Biotechniques, diciembre de 1992, 13(6):914- 917); Mitsuhashi M., Technical report: Part 1. Basic requirements for designing optimal oligonucleotide probe sequences, J. Clin. Lab. Anal., 1996, 10(5):277-284).

Ejemplo 1: Diseno de sondas y cebadores de variantes de mecA

Se disenaron experimentos para desarrollar una PCR para amplificar la region de orX-variante de mecA de Staphylococcus aureus. En un principio, para disenar los cebadores en el lado de orfX de la zona de union de SCCmec, se disenaron dos cebadores y una sonda en la region de orfX. Tambien se diseno un conjunto de oligos espedficos de variante mecA (para mecALGA251, tambien denominado en la bibliograffa mecAM10/0061, homologo de mecA, y mecAvariante nuevo). Puesto que en un principio se desconoda la orientacion del variante de mecA, se

disenaron cebadores divergentes de variante de mecA para obtener un amplicon de variante de mecA-orfX. Se disenaron otros candidates en ambos extremos del gen del variante de mecA para desarrollar PCR espedficas de Staphylococcus aureus. El ensayo de PCR seleccionado para la amplificacion del variante de mecA a traves de la zona de union de SCCmec debena generar un amplicon con una longitud de aproximadamente 1300 nt. El ensayo 5 de PCR seleccionado para la deteccion del propio elemento variante de mecA puede variar en tamano con respecto a este amplicon; por ejemplo, puede producir un amplicon mas corto.

Se descubrio una secuencia de referencia de variante de mecA en NCBI con el siguiente numero de registro, FR823292, y se utilizo para el diseno inicial de cebadores. La primera etapa fue disenar oligos espedficos de variante de mecA. Puesto que en un principio se desconoda la orientacion del variante de mecA, se disenaron 10 cebadores divergentes de variante de mecA (ambos en los extremos 5' y 3' del gen del variante de mecA) para obtener un amplicon de variante de mecA-orfX.

Diseno en el extremo 5' del gen del variante de mecA

Se utilizaron condiciones de PCR convencional, tal como se describio anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

15 Diseno de cebadores

Se disenaron muchos cebadores (los datos no se muestran). Se seleccionaron dos basandose en las caractensticas termodinamicas:

Tabla 1 - Caractensticas de los cebadores directos 5'

: mecAv-orfX-1 (SEQ ID NO:1) mecAv-orfX-2 (SEQ ID NO:2)

FR823292, posicion en extremo 5': 3613 3614

Secuencia (5'^3'): ATGAAGCAATATCAAAGGA TGAAGCAATATCAAAGGAA

Longitud del oligo: 19 nt 19 nt

Tm: cn CD o o O o O CD

GC %: 31% 31%

Evaluacion del riesgo de formacion de estructuras de horquilla (volumen de trabajo de plegamiento intramolecular): NO-Estructura intramolecular estable NO-Estructura intramolecular estable

Evaluacion del riesgo de dimerizacion del cebador (volumen de trabajo de hibridacion): NO se predice riesgo de dimerizacion del cebador NO se predice riesgo de dimerizacion del cebador

20 Diseno de sondas

Se disenaron muchas sondas para el extremo 5' del variante de mecA (los datos no se muestran) y se seleccionaron tres basandose en las caractensticas termodinamicas:

Tabla 2 - Caractensticas de las sondas 5'

: mecAv-orfX-3 (SEQ ID NO:3) mecAv-orfX-4 (SEQ ID NO:4) mecAv-orfX-5 (SEQ ID NO:5)

FR823292, posicion en extremo 5': 3657 3655 3653

Secuencia (5'^3'): ATAACTTGGTTATTCA ACTTGGTTATTCAAAG TGGTTATTCAAAGATG

AAGATGACGATATT: ATGACGATATTGA ACGATATTGAGA

Longitud del oligo: 30 nt 29 nt 28 nt

Tm (Apollo PCR por defecto): O) CD o o O o 00 CD 67 °C

GC %: 26% 31% 32%

Evaluacion del riesgo de formacion de estructuras de horquilla (volumen de trabajo de plegamiento intramolecular): NO-Estructura intramolecular estable NO-Estructura intramolecular estable NO-Estructura intramolecular estable

Evaluacion del riesgo de dimerizacion del cebador (volumen de trabajo de hibridacion): NO se predice riesgo de dimerizacion del cebador NO se predice riesgo de dimerizacion del cebador NO se predice riesgo de dimerizacion del cebador

Diseno en el extremo 3' del gen del variante de mecA Diseno de cebadores

Se disenaron muchas sondas para el extremo 3' del variante de mecA (los datos no se muestran) y se seleccionaron 5 dos de ellas basandose en las caractensticas termodinamicas:

Tabla 3 - Caractensticas de los cebadores directos 3' de variante de mecA

: mecAv-orfX-6 (SEQ ID NO:6) mecAv-orfX-7 (SEQ ID NO:7)

FR823292, posicion en extremo 5': 1877 1863

Secuencia (5'^3'): ATCCTAATATGTTAATGGCGA ATGGCGATTAATGTTAAAGA

Longitud del oligo: 21 nt 20 nt

Tm (Apollo PCR por defecto): O o CM CD 61 °C

GC %: 33% 30%

Diseno de sondas

Se disenaron muchas sondas para el extremo 3' del gen del variante de mecA (vease la tabla 4, los datos 10 adicionales no se muestran) y se selecciono una basandose en las caractensticas termodinamicas:

Tabla 4 - Caractensticas de la sonda 3': de variante de mecA

: mecAv-orfX-8 (SEQ ID NO:8)

FR823292, posicion en extremo 5': 1826

Secuencia (5'^3'): TGGCCAGCTATAATGCTACTATATCTGGA

Longitud del oligo: 29 nt

Tm (Apollo PCR por defecto): 71 °C

GC %: 41%

Evaluacion del riesgo de formacion de estructuras de horquilla (volumen de trabajo de plegamiento intramolecular): NO-Estructura intramolecular estable

Evaluacion del riesgo de dimerizacion del cebador (volumen de trabajo de hibridacion): NO se predice riesgo de dimerizacion del cebador

Compatibilidad de los oligos

Parametros de entrada: Temperatura: 63 °C; [Na+]: 0,05 M; [Mg2+]: 0,005 M; Concentracion de hebra: 0,00001 M Tabla 5 - Compatibilidad de los oligonucleotidos de los variantes de mecA; la unidad de ene^a libre es Kcal/mol

DG: Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-1 (SEQ ID NO:1) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-2 (SEQ ID NO:2) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-3 (SEQ ID NO:3) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-4 (SEQ ID NO:4) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-5 (SEQ ID NO:5) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-6 (SEQ ID NO:6) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-7 (SEQ ID NO:7) Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-8 (SEQ ID NO:8)

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-1: -1,09 -1,56 -1,56 -1,56 -1,56 -1,4 -1,4 -0,8

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-2: -1,56 -1,09 -1,56 -1,56 -1,56 -1,6 -1,4 -0,64

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-3: -1,56 -1,56 -1,09 -1,56 -1,56 -1,4 -1,4 -1,04

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-4: -1,56 -1,56 -1,56 -1,09 -1,56 -1,4 -1,4 -1,04

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-5: -1,56 -1,56 -1,56 -1,56 -1,09 -1,4 -1,4 -1,04

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-6: -1,4 -1,6 -1,4 -1,4 -1,4 -0,77 -1,24 -1,77

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-7: -1,4 -1,4 -1,4 -1,4 -1,4 -1,24 -0,77 -1,77

Cebador variante de mecA, mecAV- orfX-8: -0,8 -0,64 -1,04 -1,04 -1,04 -1,77 -1,77 -2,88

5 Se descubrio que todos los oligonucleotidos anteriores son compatibles entre sf y tambien son compatibles con los oligonucleotidos disenados y seleccionados en el orfX (vease a continuacion). Estos experimentos proporcionaron la orientacion del gen del variante de mecA y se concluyo que los oligos disenados en el extremo 3' del variante de mecA se pueden utilizar para una reaccion de amplificacion de variante de mecA-orfX.

Ejemplo 2a: Seleccion de cebadores

5 Se realizaron ensayos con una cepa de variante de mecA (+) (numero de cepa de coleccion interna 1156001) a 10 ng/pl, y una cepa mecA(+) (cepa ATCC 4330G) a 10 ng/pl. Los cebadores ensayados fueron:

Cebadores de orfX de MRSA:

- mecAv-orfX-9 (SEQ ID NO:9): 10 pM

- mecAv-orfX-10 (SEQ ID NO:10): 10 pM

10 Cebadores del extremo 3' del variante de mecA:

- mecAv-orfX-6 (SEQ ID MO:6): 10 pM

- mecAv-orfX-7 (SEQ ID NO:7): 10 pM

Las condiciones para todas las reacciones de PCR para la seleccion de cebadores fueron las siguientes:

Formato de PCR: 45 pl de MIX + 5 pl de diana 15 Condiciones de PCR: se ensayaron 4 condiciones (vease a continuacion)

Sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche, ref. 11732650001, n.° de lote 11398326)

Sistema de PCR GeneAmp PCR 9700

Tabla 6 - Condiciones de las 4 PCR ensayadas

Tabla 6a: Condicion n.° 20555, 1/termo

Temperatura: Tiempo Ciclo

95°C: 2 min 1 ciclo

95°C: 30 s

55°C: 20 s 30 ciclos

72°C: 30 s

72°C: 7 min 1 ciclo

4°C: infinito 1 ciclo

20

Tabla 6b: Condicion n.° 20556, 2/termo

Temperatura: Tiempo Ciclo

95°C: 2 min 1 ciclo

95°C: 15 s

55°C: 30 s 30 ciclos

72°C: 45 s

72°C: 7 min 1 ciclo

4°C: infinito 1 ciclo

Tabla 6c: Condicion n.° 20557, 3/termo

Temperatura: Tiempo Ciclo

95°C: 5 min 1 ciclo

95°C: 30 s

55°C: 45 s 35 ciclos

72°C: 1 min

72°C: 7 min 1 ciclo

4°C: infinito 1 ciclo

Tabla 6d: Condicion n.° 20559, 4/termo

Temperatura: Tiempo Ciclo

95°C: 5 min 1 ciclo

95°C: 1 min

55°C: 1:30 35 ciclos

72°C: 2 min

72°C: 7 min 1 ciclo

4°C: infinito 1 ciclo

Se ensayaron los siguientes cebadores que se hibridan selectivamente en un variante de mecA (mecALGA25i) en las 5 condiciones espedficas listadas:

MIX 1: control positivo para el variante de mecA

MIX 2: oligo de ensayo, mecAv-orfX6 (SEQ ID NO:6) en el variante de mecA (amplicon de 1498 nt de longitud)

MIX 3: oligo de ensayo, mecAv-orfX-7 (SEQ ID NO:7) en el variante de mecA (amplicon de 1484 nt de longitud)

Tabla 7a: Control positivo

MIX 1: Control positivo

Reactivo: MIX/tubo Concentracion final 4 tubos

Tampon 10X: 5 pl 1X 20 pl

MgCl2 25 mM: 3 pl 1,5 mM 12 pl

dNTP 25 mM: 0,4 pl 0,2 mM 1,6 pl

Cebador + control 10 pM: 2 pl 0,4 pM 8 pl

Cebador + control 10 pM: 2 pl 0,4 pM 8 pl

Enzima 3,5 U/pl: 0,74 pl 2,6 U 3 pl

H2O csp 45 pl: 31,86 pl NA 127,4 pl

MIX total: 45 pl 180 pl

Diana: ADN 10 ng/pl: 5 pl 50 ng

TOTAL: 50 pl

10

MIX 2: mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-6

Reactivo: MIX/tubo Concentracion final 10 tubos

Tampon 10X: 5 pl 1X 50 pl

MgCl2 25 mM: 8 pl 4 mM 80 pl

dNTP 25 mM: 1,2 pl 0,6 mM 12 pl

mecAv-orfX-9 10 pM: 3 pl 0,6 pM 30 pl

mecAv-orfX-10 10 pM: 3 pl 0,6 pM 30 pl

mecAv-orfX-6 10 pM: 3 pl 0,6 pM 30 pl

Enzima 3,5 U/pl: 1 pl 3,5 U 10 pl

H2O csp 45 pl: 20,8 pl NA 208 pl*

MIX total: 45 pl 450 pl

Diana: ADN 10 ng/pl: 5 pl 50 ng

TOTAL: 50 pl

Tabla 7c: Ensayo de variantes de mecA-orfX

MIX 3: mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7

Reactivo: MIX/tubo Concentracion final 10 tubos

Tampon 10X: 5 pl 1X 50 pl

MgCl2 25 mM: 8 pl 4 mM 80 pl

dNTP 25 mM: 1,2 pl 0,6 mM 12 pl

mecAv-orfX-9 10 pM: 3 pl 0,6 pM 30 pl

mecAv-orfX-10 10 pM: 3 pl 0,6 pM 30 pl

mecAv-orfX-7 10 pM: 3 pl 0,6 pM 30 pl

Enzima 3,5 U/pl: 1 pl 3,5 U 10 pl

H2O csp 45 pl: 20,8 pl NA 208 pl*

MIX total: 45 pl 450 pl

Diana: ADN 10 ng/pl: 5 pl 50 ng

TOTAL: 50 pl

5 Resultados/conclusiones del ensayo

Resultados: Variante de mecA Variante de mecA-orfX (mecAv-orfX-6)

ID de la muestra: condicion 1 condicion 1 condicion 2 condicion 3 condicion 4

cepa n.° 1156001 de la coleccion de cepas interna: + + + + +

Cepa ATCC 43300: - - - - NA

H2O: - - - - NA

Resultados: Variante de mecA Variante de mecA-orfX (mecAv-orfX-7)

cepa n.° 1156001 de la coleccion de cepas interna: + + + + +

Cepa ATCC 43300: - - - - NA

H2O: - - - - NA

Se descubrio que todas las condiciones funcionaban: se obtuvieron resultados positivos para los variantes de mecA y resultados negativos para mecA. Ambos cebadores de los variantes de mecA fueron eficaces para amplificar el 5 amplicon de variante de mecA-orfX y, por tanto, para su uso en un ensayo para detectar cepas de MRSA que portan variantes de mecA. A continuacion se proporcionan los detalles de una PCR de variantes de mecA-orfX que emplea el cebador de orfX mecAv-orfX-9, el cebador de variante de mecA mecAv-orfX-7, y el cebador de orfX mecAv-orfX- 10 que se preparo y se llevo a cabo. Se logro la amplificacion con exito de un variante de mecA (mecAi_GA25i).

Tabla 9 - PCR de variantes de mecA-orfX

MIX: PCR de variantes de mecAv-orfX

Reactivo: [C] inicial Concentracion final volumen/tubo

Tampon: 10X 1X 5 jl

MgCl2: 25 mM 4 mM 8 jl

dNTP: 25 mM 0,6 mM 1,2 jl

mecAv-orfX-9: 10 jM 0,6 jM 3 jl

mecAv-orfX-10: 10 jM 0,6 jM 3 jl

mecAv-orfX-7: 10 jM 0,6 jM 3 jl

Enzima: 3,5 U/jl 3,5 U 1 jl

H2O csp 45 |jl: NA NA 20,8 jl

MIX total: 45 jl

ADN: 10 ng/jl 50 ng 5 jl

TOTAL: 50 jl

10

Ciclos de PCR:

Temperatura: Tiempo Ciclo

94°C: 2 min 1 ciclo

94°C: 15 s

55°C: 30 s 30 ciclos

72°C: 45 s

72°C: 7 min 1 ciclo

4°C: infinito 1 ciclo

Ejemplo 2b: Amplificacion con una sonda en orfXy una sonda en el gen del variante de mecA

Despues se anadio la sonda y se ensayo la PCR en un instrumento Bio-Rad (sistema de PCR a tiempo real). Se 5 realizaron ensayos con una sonda TaqMan en el orfX (mecAv-orfX-11 (SEQ ID NO:11)) o en el gen del variante de mecA (mecAi_GA25i: extremo 3') (mecAv-orfX-8 (SEQ ID NO:8)) (vease a continuacion). El fluoroforo utilizado para ambas sondas Taqman es FAM. Se ensayo ADN de cinco muestras (10 ng/pl).

Sonda: SEQ ID NO: Secuencia (5'^3')

mecAv-orfX-11: 11 TGATGCGGGTTGTGTTAATTGAGCAAGTG

mecAv-orfX-8: 8 TGGCCAGCTATAATGCTACTATATCTGGA

Las amplificaciones se realizaron bajo las siguientes condiciones:

10 Formato de PCR: 45 pl de MIX + 5 pl de diana

Condiciones de PCR: Se ensayaron 2 sondas a 2 concentraciones (0,3 pM y 0,6 pM) Sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche, ref. 11732650001, n.° de lote 11398326) Se utilizaron las siguientes combinaciones de cebadores y sondas (todas, 10 pM):

MIX 1: mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-11 a 0,6 pM 15 MIX 2: mecAv-orfX-9/mecAv-orfX- 10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-11 a 0,3 pM

MIX 3: mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-8 a 0,6 pM MIX 4: mecAv-orfX-9/mecAv-orfX-10/mecAv-orfX-7/mecAv-orfX-8 a 0,3 pM Los resultados fueron los siguientes:

Resultados: MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX 4


: mecAv-orfX-11/0,6 pM mecAv-orfX-11/0,3 pM mecAv-orfX-8/0,6 pM mecAv-orfX-8/0,3 pM

ID de la muestra: Cepas Cq RFU final Cq RFU final Cq RFU final Cq RFU final

1: mecAv (+) 29,51 65,5 21,61 819 28,48 90,9 17,92 1331

2: mecAv (+) 25,89 70,3 N/A 32,5 25,8 57,7 N/A 1,41

3: mecAv (+) 29,53 47,7 N/A 38,1 20,37 91,3 26,56 124

5

10

15

20

25

4: mecA (+) N/A 9,58 28,65 47,5 N/A -8,87 N/A 3,63

5: MSSA N/A 6,52 30,32 53 N/A -1,35 N/A 0,746

H2O: NA 6,37 172 N/A 1,36 N/A 3,26 N/A 0,0398



: RFU: umbral con 40

Los resultados indican que la concentracion ideal de sonda, bajo estas condiciones, puede ser de aproximadamente 0,3 pM. Los resultados con la sonda en orfX o en el gen de variante de mecA fueron ambos buenos. En general, bajo estas condiciones, los ensayos parecen ser mas espedficos con la sonda en el gen de variante de mecA; sin embargo, se pueden ajustar los parametros, tal como realizar la etapa de asociacion a 55 °C, para optimizar el ensayo. Tambien puede optimizarse aun mas, por ejemplo, se puede aumentar el numero de ciclos, anadir una lectura de FAM despues de la ultima etapa a 72 °C y/o aumentar la temperatura de asociacion. Este experimento demuestra que, en cepas de MRSA, es factible realizar una PCR a tiempo real espedfica entre el orfX y el gen de variante de mecA a pesar de que se generan amplicones muy largos (aproximadamente 1484 pb).

Ejemplo 3: Amplificacion de la region de union de SCCmec:orfXde mecA y un tipo no XI

Puede realizarse un ensayo en combinacion con un ensayo para SCCmec de tipo XI para detectar tambien la presencia o la ausencia de cepas de MRSA que portan SCCmec de tipo no XI (las que portan mecA). Tambien puede realizarse un ensayo en combinacion con un ensayo para otras secuencias, tales como una o mas regiones genomicas de S. aureus y/o mecA para caracterizar tambien el organismo u organismos presentes en una muestra. Estos ensayos pueden realizarse en formato multiplex o por separado.

Ejemplo 3a: Deteccion de la region de la zona de union del extremo derecho

Para la deteccion de la zona de union del extremo derecho en tipos de SCCmec distintos del tipo XI se puede utilizar, en formato multiplex con un ensayo para detectar el tipo Xl o por separado, cebadores localizados en la parte derecha del modulo SCCmec y en el orfX. Esta reaccion puede emplear sondas localizadas en la parte derecha del modulo o en el orfX. Pueden ensayarse cepas de MRSA y MSSA empleando un lisado como diana, que se corresponde a 105CPU por reaccion de amplificacion o como se indica en un kit espedfico. Por ejemplo, los kits disponibles en el mercado para detectar esta zona de union incluyen:

NucliSens EasyQ® MRSA: BioMerieux (Marcy l'Etoile, Francia)

Ensayo de MRSA BD GeneOhm™: Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)

Ensayo de MRSA ACP BD GeneOh ™: Becton Dickinson

Ensayo de MRSA BD MAX: Becton Dickinson

Ensayo de MRSA PLEX-ID: Abbott (Ibis Biosciences) (Abott Park, IL)

Ensayo de MRSA Detect-Ready™: Molecular Detection Inc. (MDI) (Wayne, PA)

Ensayo avanzado de MRSA LightCycler®: Roche (Pleasanton, CA)

Xpert MRSA: Cepheid (Sunnyvale, CA)

Xpert MRSA/SA BC: Cepheid

Xpert MRSA/SA SSTI: Cepheid

Ademas, pueden disenarse cebadores utilizando Path-MRSA o Path-MRSA std (ambos de Genesig).

Ejemplo 3b: Amplificacion y deteccion multiplex del gen mecA y la region de insercion del modulo (zona de union)

Tal como se muestra en este ejemplo, la amplificacion y la deteccion simultaneas de la region de insercion del modulo y el gen mecA puede utilizarse para reducir la deteccion de ciertas cepas (MRSA falsos positivos) para cepas de tipo no XI. Tal como se describe y ejemplifica en Jay, et al. (documento U.S. 20090203013; documento

5

10

15

20

25

30

35

WO2009085221) y como esta disponible en el mercado (NucliSens EasyQ® MRSA (bioMerieux, Marcy I'Etoile, Francia)), esta estrategia puede utilizarse para una amplificacion multiplex para la deteccion del gen mecA y la region de la zona de union del modulo en el mismo tubo. En un ejemplo, el ensayo emplea 5 cebadores directos espedficos del modulo SCCmec en la region de la zona de union del extremo derecho, 1 cebador inverso en orfX, y 5 sondas espedficas del modulo SCCmec marcadas para la region de la zona de union del modulo, en combinacion con 1 cebador directo, 1 cebador inverso y 1 sonda marcada para mecA. Los resultados de dicho ensayo demuestran que, en el caso de un MSSA que presenta la region de insercion del modulo sin el gen mecA, esta porcion del ensayo puede proporcionar, de modo adecuado, un resultado “MRSA negativo” (zona de union de SCCmec (+) mas mecA (-)).

Ejemplo 4: Amplificacion de una region genomica de MRSA (spa)

El gen spa de S. aureus es un gen que codifica la protema A, que es una protema de la superficie que se encuentra espedficamente en la pared celular de bacterias de Staphylococcus aureus. Una parte del gen spa, la region polimorfica X, es muy variable y se emplea para la tipificacion de spa que permite diferenciar entre varios S. aureus. Sin embargo, en el gen spa tambien estan presentes areas mas conservadas y estas se emplean como marcadores espedficos para detectar todas las cepas de S. aureus (Kuhn, J. C. M., 2007, “Double-locus sequence typing using clfR and spa, a fast and simple method for epidemiological typing of methipillin-resistant Staphlococcus aureus").

Despues de construir un alineamiento de multiples secuencias (a partir de una coleccion de secuencias de bancos de datos patentados y/o publicos), se disenaron los oligonucleotidos en el area conservada del gen. La amplificacion y/o deteccion resultante de la region spa demostro que S. aureus estaba presente en la muestra.

Los oligonucleotidos fueron los siguientes:

Oligo: SEQ ID NO: Secuencia

Cebador-1 de S. aureus: 24 CACCTGCTGCAAATGCTG (18 nt)

Cebador-2 de S. aureus: 25 CGTTGATCAGCRTTTAAGTTAGGCATATT (29 nt)

Sonda-3 de S. aureus: 26 CGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGC (28 nt)

Ejemplo 5: Amplificacion de una region genomica de MRSA (nuc)

El gen nuc codifica la nucleasa termoestable de S. aureus, tambien denominada termonucleasa. Este gen es espedfico de S. aureus y esta altamente conservado (Bragstad et al., J. C. M., 1992, “Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene”).

Despues de construir un alineamiento de multiples secuencias (a partir de una coleccion de secuencias de bancos de datos patentados y/o publicos), se disenaron los oligonucleotidos en el area conservada del gen. La amplificacion y/o deteccion resultante de la region nuc, bajo condiciones de PCR convencionales tal como se describe en la presente, demostro que S. aureus estaba presente en la muestra.

Los oligonucleotidos fueron los siguientes:

Oligo: SEQ ID NO: Secuencia

Cebador-4 de S. aureus: 27 GGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGC (26 nt)

Cebador-5 de S. aureus: 28 GTCCTGAAGCAAGTGCATTTACG (23 nt)

Sonda-6 de S. aureus: 29 GGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG (31 nt)

Cebador-7 de S. aureus: 30 GCAACTTTAGCCAAGCCTTGAC (22 nt)

Ejemplo 6: Amplificacion de mecA y de un variante de mecA

Pueden utilizarse condiciones de PCR convencional, tal como se describio anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

El mecA codifica la PBP2a (protema de union a penicilina 2a, "Penicillin Binding Protein 2a"), es una PBP modificada. Un variante de mecA descubierto recientemente tambien codifica una protema que pertenece a la familia

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25

de PBP2a. Despues de construir un alineamiento de multiples secuencias (a partir de una coleccion de secuencias de bancos de datos patentados y/o publicos), se disenaron los oligonucleotidos en las areas conservadas del gen. Pueden disenarse oligonucleotidos para amplificar y detectar mecA y un variante de mecA en la misma reaccion s^plex o en varias reacciones simplex distintas o en una reaccion multiplex. La amplificacion y/o deteccion resultante de mecA y/o el variante de mecA (en formato simplex o multiplex) demostro que el gen de resistencia a la meticilina estaba presente en la muestra.

El mecA puede ensayarse mediante amplificacion empleando los siguientes oligonucleotidos bajo condiciones de PCR convencionales:

Oligo: SEQ ID NO: Secuencia

Cebador directo-1 de mecA: 12 ACCTTCTACACCTCCATATCAC (22 nt)

Cebador inverso-2 de mecA: 13 CGTTACGGATTGCTTCACTG (20 nt)

El variante de mecA puede ensayarse mediante amplificacion empleando los siguientes oligonucleotidos para detectar las secuencias del variante de mecA:

Oligo: SEQ ID NO: Secuencia

Cebador directo-1 de mecAv: 14 AACACTGATGGTTTTAAGGTATCCA (25 nt)

Cebador directo-2 de mecAv: 15 AAGGTATCCATTGCAAATACTTATGACAA (29 nt)

Cebador inverso-3 de mecAv: 16 TACCAGATCCATCGTATTTTTCATATGT (29 nt)

Cebador inverso-4 de mecAv: 17 TACCAGATCCATCGTCATTTTTCATAT (27 nt)

Sonda-5 de mecAv: 18 ATTGGAGAAAAAGGCTGAAAACGGAA (26 nt)

Sonda-6 de mecAv: 19 ATTGGAGAAAAAGGCTGAAAACGGAAAAGA (30 nt)

Cebador directo-7 de mecAv: 20 CCAGATATAGTAGCATTATA (20 nt)

Sonda de cebador inverso-8 de mecAv: 21 AAAGATGACGATATTGAG (18 nt)

Como alternativa, el variante de mecA puede determinarse empleando un ensayo de variante de mecA-orfX. Uno de estos ensayos se ejemplifica en el anterior ejemplo 2.

A continuacion se describe un ensayo para detectar mecA y un variante de mecA. Se seleccionan secuencias de sonda/cebador en una region comun a mecA y el variante de mecA.

El mecA+variante de mecA puede amplificarse empleando los siguientes oligonucleotidos:

Oligo: SEQ ID NO: Secuencia

Cebador-1 de mecA-mecAv: 22 TCACCAGGTTCAACYCAAAA (20 nt)

Cebador-2 de mecA-mecAv: 23 CCTGAATCWGCTAATAATATTTC (23 nt)

Se entiende que la invencion descrita no se limita a la metodologfa, protocolos y reactivos concretos descritos, ya que estos pueden variar. Tambien se entiende que la terminologfa empleada en la presente tiene el objetivo de describir solo realizaciones concretas y no pretende limitar el alcance del presente invencion, que solo esta limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Los expertos en la tecnica reconoceran o seran capaces de determinar, sin emplear mas que la experimentacion habitual, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas de la invencion descritas en la presente. Se pretende que estos equivalentes esten incluidos en las siguientes reivindicaciones.

(ju zz) OVOllOOOWOOOVlllOVVOO: onu oe L~$nGjne §

(ju 1£) OlVOlOOlVlllVIVlOOOVllOOOlOOVOO: onu 62 g-snGjne s

(ju zz) oovmvooiowoowoiooio: onu 82 g-snGjne s

(ju Qz) OOWOIOOIOOIVIVWOVOVIOIOO: onu LZ fr-snGjne s

(}U zz) OOIWWOWOIOOWOIVOOVOWOOO: eds 92 g-snGjne s

(ju 6Z) iivivoooviiowiiiyoovoivonoo: eds S2 Z-snGjne s

(ju 80 OIOOIVWOOIOOIOOVO: eds VZ l-snejne s

(ju 02) VIVIIVOOVIOVIVIVOVOO: \/ogui ap epBUBA 02 l-A)/OQLU

(ju oe) VOWWOOOVVWOIOOOVWWOVOOIIV: \/ogui ap 0}ububa 61- Q-A)/OQLU

(ju qz) WOOOWWOIOOOVWWOVOOIIV: \/ogui ap epBUBA 81- g-A)/OQLU

(}U LZ) IVlVOlllllVOlOOlVOOlVOVOOVl: \/ogui ap epBUBA LI ty-A\/OGUJ

(ju qz) loivivoimivoiooivooivovoovi: \/ogui ap epBUBA 91- £-A]/OQLU

(ju qz) WOVOIVIIOVIVWOOIIVOOIVIOOW: \/ogui ap epBUBA SI- Z-A\/oeuj

(ju zz) VOOlVlOOWllllOOlVOlOVOW: \/ogui ap 0}ububa H \,-A\/oeui

(ju qz) OlOVOllOOllVOOOVllOO: \/09ut ei. Z-V^slu

(}U zz) 0V01V1V00100V0V101100V: tfoeui 21- 1-V09LU

(iu qz) oiowoyvoiivviioionoooooivoi: XJUo-\/oguj ap apBUBA ll l l-X^0-A\/09UJ

(ju zz) VOlVOVOOOllVOVOlWWOOVOl: XJUo-\/oguj ap apBUBA 01- 0l-X}JO-A\/oeiu

(ju zz) VOlVOVOOlllVOVOlWWOOVOl: XJUO-\/OGUJ ap 0JUBUBA 6 Q-XiJ0-A\/09LU

(ju qz) V00101V1V10V1001W1V100V00001: XJUo-\/oguj ap apBUBA 8 Q-X^0-A\/09UJ

(}U qz) VOVWllOlWllVOOOOlV: XJUo-\/oguj ap apBUBA L i~XPO-A\/OGUd

(ju iz) VOOOOIWIIOIVIWIOOIV: XJUO-\/OGUJ ap 0JUBUBA 9 Q-XiJO-AyoeLU

(ju 82) VOVOllVIVOOVOlVOVWOllVllOOl: XJUo-\/oguj ap apBUBA S g-X±JO-A\/OGLU

(ju 62) VOllVIVOOVOlVOVWOllVllOOllOV: Xjuo-\fOGUJ ap apBUBA V \rXJJO-A\/OeUI

(iu oe) iivivoovoivowvoiiviiooiiowiv: XJUo-\/oguj ap apBUBA e £-X}JO-A\/oeLU

(}U 60 WOOVWOlVIWOOWOl: XJUO-\/OGUJ ap 0JUBUBA 2 Z-X^0-A\/09LU

(1U 60 VOOVWOIVIWOOWOIV: XJUo-\/oguj ap apBUBA i- \,-XJJ0-A\/09LU

epuanoas: eue\Q :on ai D3S op!joa|onuo6no

8U03-0U-93

oeoe L-82U3

5

10

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25

30

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40

45

Listado se secuencias

<110> bioMerieux

<120> Deteccion de cepas variantes mecA de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina <130> P122984 <160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-1 <400> 1

atgaagcaat atcaaagga 19

<210> 2 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-2 <400> 2

tgaagcaata tcaaaggaa 19

<210> 3 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-3 <400> 3

ataacttggt tattcaaaga tgacgatatt 30

<210> 4 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-4 <400> 4

acttggttat tcaaagatga cgatattga 29

<210> 5 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-5 <400> 5

tggttattca aagatgacga tattgaga 28

<210> 6 <211> 21

5

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15

20

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50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-6 <400>6

atcctaatat gttaatggcg a 21

<210>7 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-7 <400> 7

atggcgatta atgttaaaga 20

<210>8 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-8 <400> 8

tggccagcta taatgctact atatctgga 29

<210> 9 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-9 <400> 9

tcagcaaaat gacatttcca catca 25

<210> 10 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-10 <400> 10

tcagcaaaat gacattccca catca 25

<210> 11 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-orfX-11 <400> 11

tgatgcgggt tgtgttaatt garcaagtg 29

<210> 12 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<220>

<223> Oligonucleotido mecA-1 <400> 12

accttctaca cctccatatc ac 22

<210> 13 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecA-2 <400> 13

cgttacggat tgcttcactg 20

<210> 14 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-1 <400> 14

aacactgatg gttttaaggt atcca 25

<210> 15 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-2 <400> 15

aaggtatcca ttgcaaatac ttatgacaa 29

<210> 16 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-3 <400> 16

taccagatcc atcgtcattt ttcatatgt 29

<210> 17 <211> 27 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-4 <400> 17

taccagatcc atcgtcattt ttcatat 27

<210> 18 <211> 26 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-5

5

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20

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45

50

<400> 18

attggagaaa aaggctgaaa acggaa 26

<210> 19 <211> 30 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-6 <400> 19

attggagaaa aaggctgaaa acggaaaaga 30

<210> 20 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-7 <400> 20

ccagatatag tagcattata 20

<210> 21 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecAv-8 <400> 21

aaagatgacg atattgag 18

<210> 22 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecA-mecAv-1 <400> 22

tcaccaggtt caacycaaaa 20

<210> 23 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido mecA-mecAv-2 <400> 23

cctgaatcwg ctaataatat ttc 23

<210> 24 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-1 <400> 24

cacctgctgc aaatgctg 18

5

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30

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40

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50

<210> 25 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-2 <400> 25

cgttgatcag crtttaagtt aggcatatt 29

<210> 26 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-3 <400> 26

cgcaacacga tgaagctcaa caaaatgc 28

<210> 27 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-4 <400> 27

ggtgtagaga aatatggtcc tgaagc 26

<210> 28 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-5 <400> 28

gtcctgaagc aagtgcattt acg 23

<210> 29 <211> 31 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-6 <400> 29

ggacgtggct tagcgtatat ttatgctgat g 31

<210> 30 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotido S.aureus-7 <400> 30

gcaactttag ccaagccttg ac 22

Claims

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REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para amplificar y detectar en una muestra un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho metodo:

realizar sobre la muestra una reaccion de amplificacion utilizando un conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de orfXdel ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, y

b. un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA, y

c. un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido,

en el que cada uno del primer oligonucleotido y el segundo oligonucleotido esta orientado de modo que, bajo las condiciones de la amplificacion, si la muestra contiene el MRSA, la region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido se amplifica, y si la muestra contiene el MRSA, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido.
2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que el tercer oligonucleotido se hibrida espedficamente: con una region del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus; una region de orfX del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus; o una region del variante de mecA.
3. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que:

- el primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10 y/o

- el segundo oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21 y/o

- el tercer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada en SEQ ID NO:8, 11, 18 y 19.
4. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas amplificar un Staphylococcus aureus que comprende mecA utilizando, en una reaccion de amplificacion, un conjunto de oligonucleotidos de mecA para la amplificacion de un elemento mecA que comprende:

a. un primer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de mecA; y

b. un segundo oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN de mecA,

en el que cada uno del primer oligonucleotido de mecA y el segundo oligonucleotido de mecA esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, se amplifica una porcion del ADN de mecA,

y en el que, opcionalmente, el conjunto de oligonucleotidos de mecA comprende ademas un tercer oligonucleotido de mecA que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del mecA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de mecA y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de mecA,

en el que si se emplea el tercer oligonucleotido de mecA, entonces si la muestra contiene el MRSA que comprende mecA, se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido de mecA.
5. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas utilizar un conjunto de oligonucleotidos de S. aureus para la amplificacion de un ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus que comprende:

a. un primer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus; y

b. un segundo oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una segunda region dentro del ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus,

en el que cada uno del primer oligonucleotido de S. aureus y el segundo oligonucleotido de S. aureus esta orientado de tal forma que, bajo las condiciones de la amplificacion, una porcion del ADN espedfico de S. aureus se amplifica y, opcionalmente,

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c. un tercer oligonucleotido de S. aureus que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus,

en el que si la muestra contiene la region del ADN de S. aureus entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido de S. aureus y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido de S. aureus, entonces se detecta la hibridacion del tercer oligonucleotido.
6. - El metodo de la reivindicacion 5, en el que el ADN cromosomico espedfico de Staphylococcus aureus se selecciona del grupo que consiste en spa, orfXy nuc.
7. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas poner en contacto la muestra amplificada con un tinte intercalante, en el que si la muestra contiene el MRSA, entonces se detecta la intercalacion del tinte en un producto de la amplificacion.
8. - Un kit para amplificar y detectar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo ScCmec dentro del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho kit un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de orfX del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, y

b. un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA, y

c. un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido, en el que:

- el primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10; y

- el segundo oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21, y

- el tercer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada como SEQ ID NO:8, 11, 18 y 19.
9. - El uso de un kit para realizar el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, siendo dicho kit un kit para amplificar y detectar un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que comprende una insercion de un modulo SCCmec dentro del aDn cromosomico de Staphylococcus aureus, en el que el modulo SCCmec comprende un elemento variante de mecA, comprendiendo dicho kit un primer conjunto de oligonucleotidos que comprende:

a. un primer oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de orfX del ADN cromosomico de Staphylococcus aureus, y

b. un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia de acido nucleico capaz de hibridarse espedficamente con una region de un variante de mecA,

y

c. un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse espedficamente dentro de una region del MRSA entre la region de hibridacion del primer oligonucleotido y la region de hibridacion del segundo oligonucleotido.
10. - El uso segun la reivindicacion 8, en el que:

- el primer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9 y 10 y/o

- el segundo oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 7, 14, 15, 16, 17, 20 y 21 y/o

- el tercer oligonucleotido comprende una secuencia de acido nucleico indicada como SEQ ID NO:8, 11, 18 y 19.
11. - El uso segun la reivindicacion 9 o 10, en el que el kit es el kit segun la reivindicacion 8.
12. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el kit de la reivindicacion 8 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el variante de mecA es mecALGA251.