ES2869285T3 - Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) con MREJ de tipo xxi - Google Patents

Abstract

Los ácidos nucleicos de la secuencia mostrada en la Figura 1 o el complemento de dicha secuencia.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) con MREJ de tipo xxi

Campo

En el presente documento se describen herramientas de diagnóstico molecular para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina.

Técnica relacionada

La especie Staphylococcus aureus (S. aureus) coagulasa positiva está bien documentada como patógeno oportunista humano (Murray et al. Eds, 1999, Manual of Clinical Microbiology, 7^a ed., ASM Press, Washington, D.C.). Las infecciones nosocomiales causadas por S. aureus son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad. Algunas de las infecciones más comunes causadas por S. aureus afectan la piel e incluyen furúnculos o diviesos, celulitis, impétigo e infecciones posoperatorias de heridas en varios sitios. Algunas de las infecciones más graves producidas por S. aureus son bacteriemia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, síndrome de piel escaldada y varios abscesos. La intoxicación alimentaria mediada por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante asociado con S. aureus. El síndrome de choque tóxico, una enfermedad adquirida en la comunidad, también se ha atribuido a la infección o colonización con S. aureus toxigénico.

S. aureus resistente a la meticilina (SARM) surgió en la década de 1980 como un importante problema clínico y epidemiológico en los hospitales (Oliveira et al., (2002) Lancet Infect Dis. 2: 180-9). Los SARM son resistentes a todas las p-lactamas, incluidas las penicilinas, las cefalosporinas, los carbapenemos y los monobactamas, que son los antibióticos más utilizados para curar las infecciones por S. aureus.

Las infecciones por SARM solo pueden tratarse con antibióticos tóxicos y más costosos, que normalmente se utilizan como última línea de defensa. Dado que el SARM se puede propagar fácilmente de un paciente a otro a través del personal, los hospitales de todo el mundo se enfrentan al problema de controlar el SARM.

No hace mucho tiempo, la única forma de saber la resistencia de una cepa era realizar una prueba manual de susceptibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos adolecen de muchos inconvenientes, incluido el tiempo prolongado (al menos 48 horas) antes de que los resultados estén disponibles, la falta de reproducibilidad, la falta de normalización del procedimiento y los errores del usuario. En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar pruebas de escrutinio o diagnóstico rápidas y sencillas para la detección y/o identificación de SARM para reducir su diseminación y mejorar el diagnóstico y tratamiento de los pacientes infectados.

Existe la necesidad de composiciones y métodos para la detección rápida y sensible de SARM.

La invención se refiere a las realizaciones definidas en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a los ácidos nucleicos de la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 188) o al complemento de dicha secuencia.

La invención se refiere adicionalmente a un oligonucleótido que comprende los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, o su complemento, que hibrida específicamente con el ácido nucleico de la presente invención.

La invención se refiere adicionalmente a una composición para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, comprendiendo dicho S. aureus un elemento mec del casete cromosómico Estafilocócico (SCCmec) que incluye un homólogo de mecA (mecA_^GA251), estando insertado dicho casete SCCmec en el ADN cromosómico de S. aureus, generando así una secuencia polimórfica de unión en el extremo derecho (MREJ, por su nombre en inglés) de tipo xxi que comprende secuencias polimórficas del extremo derecho y ADN cromosómico contiguo al extremo derecho polimórfico, comprendiendo dicha composición:

un primer cebador de amplificación, dicho primer cebador de amplificación entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho primer cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con las secuencias polimórficas del extremo derecho de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi de la secuencia de la invención y es completamente complementario a las secuencias polimórficas del extremo derecho de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi de la invención, y

un segundo cebador de amplificación, dicho segundo cebador de amplificación entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho segundo cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con secuencias cromosómicas de S. aureus ubicadas a 1 kilobase del punto de inserción del elemento SCCmec en el ADN cromosómico, y en donde dichos primer y segundo cebadores de amplificación juntos generan un amplicón de la unión en el extremo derecho de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en las condiciones de PCR convencionales en presencia de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, en donde dicho amplicón comprende una secuencia específica de MREJ de tipo xxi.

La invención se refiere adicionalmente a un método para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, comprendiendo dicho S. aureus un elemento mec del casete cromosómico Estafilocócico (SCCmec) que incluye un homólogo de mecA (mecA_^GA251), estando insertado dicho casete SCCmec en el ADN cromosómico de S. aureus, generando así una secuencia polimórfica de unión en el extremo derecho (MREJ) de tipo xxi que comprende secuencias polimórficas del extremo derecho y ADN cromosómico contiguo al extremo derecho polimórfico, comprendiendo dicho método:

poner en contacto una muestra de prueba con un primer cebador de amplificación, dicho primer cebador de amplificación entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho primer cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con las secuencias polimórficas del extremo derecho de la secuencia de MREJ de tipo xxi de la secuencia del invención; poner en contacto la muestra con un segundo cebador de amplificación de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho segundo cebador de amplificación hibrida en las condiciones de PCR convencionales con el gen orfXde S. aureus, y en donde dichos primer y segundo cebadores de amplificación juntos generan un amplicón de los ácidos nucleicos de la unión en el extremo derecho (MREJ) xxi de SCCmec en las condiciones de PCR convencionales en presencia de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, en donde dicho amplicón comprende una secuencia específica de MREJ de tipo xxi; y

determinar si se genera un amplicón de ácidos nucleicos específicos de MREJ de tipo xxi después de la etapa de contacto.

Compendio

Las realizaciones descritas en el presente documento se basan, en parte, en el descubrimiento de que ciertas cepas de Staphylococcus aureus, que incluyen aquellos que albergan un gen homólogo de mecA, mecA^LGA251, comparten la misma secuencia ubicada en el extremo derecho de la región SCCmec de los ácidos nucleicos de SARM, es decir, la unión polimórfica del extremo derecho. En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones que se pueden utilizar para detectar estas cepas de SARM, que hasta ahora eran indetectables mediante ensayos convencionales comerciales de base molecular. También se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos que permiten la detección adicional (p. ej., simultánea o secuencial) de Staphylococcus aureus en general, y/o para la detección posterior de mecA y/o mecA^LGA251, además de las cepas de SARM.

Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para la detección de SARM que albergan una secuencia de MREJ de tipo xxi. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan una composición para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que tiene ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi. El SARM puede incluir un elemento mec del casete cromosómico Estafilocócico (SCCmec) que incluye un homólogo de mecA (meca^LGA251, o mecC), en donde el casete SCCmec está insertado en el ADN cromosómico de S. aureus, generando así una secuencia polimórfica de unión de extremo derecho (MREJ) de tipo xxi que comprende secuencias polimórficas del extremo derecho y ADN cromosómico contiguo al extremo derecho polimórfico. La composición puede incluir un primer cebador de amplificación que tiene entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, y que hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con las secuencias polimórficas del extremo derecho de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el primer cebador de amplificación hibrida específicamente con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma en dichas condiciones de PCR convencionales.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir adicionalmente un segundo cebador de amplificación de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud que hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con secuencias cromosómicas de S. aureus ubicadas a 1 kilobase del punto de inserción del elemento SCCmec en el ADN cromosómico. Preferiblemente, el primer y segundo cebadores de amplificación juntos generan un amplicón de la unión en el extremo derecho de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en las condiciones de PCR convencionales en presencia de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi. Por consiguiente, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, el segundo cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con orfX. Las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir adicionalmente una sonda, p. ej., una sonda oligonucleotídica comprende un radical emisor de fluorescencia y un radical extintor de fluorescencia, que hibrida específicamente con el amplicón de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en las condiciones de PCR convencionales.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir uno o más cebadores de amplificación adicionales de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud que hibridan específicamente con una o más secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec de un SARM con MREJ de tipo i a xx, es decir, con una o más secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a 29.

Los métodos y composiciones también pueden incluir otros oligonucleótidos, es decir, que están configurados para amplificar específicamente secuencias mecA y/o mecA^LGA251/mecC, y/o que están configuradas para amplificar específicamente secuencias específicas de Staphylococcus aureus.

Por consiguiente, algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan composiciones en donde el primer cebador de amplificación es al menos 80% idéntico a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las composiciones pueden incluir un segundo cebador de amplificación que es al menos 80% idéntico a SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la composición puede incluir una sonda, en donde la sonda es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 4 u 82.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las composiciones descritas en el presente documento se proporcionan en forma seca, p. ej., liofilizada o similar.

También se proporcionan en el presente documento métodos para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, y para la detección de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, en donde S. aureus incluye un elemento mec del casete cromosómico Estafilocócico (SCCmec) que incluye un homólogo de mecA (mecA_^GA251 o mecC). El casete SCCmec se puede insertar en el ADN cromosómico de S. aureus, generando así una secuencia polimórfica de unión en el extremo derecho (MREJ) de tipo xxi que comprende secuencias polimórficas del extremo derecho (secuencias MREP) y ADN cromosómico contiguo al extremo derecho polimórfico. Por consiguiente, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos pueden incluir las etapas de proporcionar una muestra de prueba; poner en contacto la muestra con un primer cebador de amplificación de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, que hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con las secuencias polimórficas del extremo derecho de la secuencia de MREJ de tipo xxi; en donde el contacto se realiza en condiciones en donde se genera un amplicón de la unión en el extremo derecho de mec de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi si está presente en la muestra S. aureus que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi. El método también puede incluir la etapa de determinar si se genera o no un amplicón de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi después de la etapa de contacto. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el primer cebador de amplificación hibrida específicamente con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 en dichas condiciones de PCR convencionales.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el método puede incluir poner en contacto la muestra con un segundo cebador de amplificación de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud que hibrida en las condiciones de PCR convencionales con el gen orfX de S. aureus, en donde dichos primer y segundo cebadores de amplificación juntos generan un amplicón de la secuencia de la región de unión en el extremo derecho de SCCmec (MREJ) de la unión en el extremo derecho de SCCmec de SARM en las condiciones de PCR convencionales en presencia de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi.

Como se describe en el presente documento, el método puede comprender adicionalmente poner en contacto la muestra con una sonda, en donde dicha sonda hibrida específicamente con el amplicón de la secuencia de la región de unión en el extremo derecho de SCCmec (MREJ) de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en las condiciones de PCR convencionales. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda incluye un radical emisor de fluorescencia y un radical extintor de fluorescencia.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la etapa de contacto también incluye poner en contacto la muestra con uno o más cebadores de amplificación adicionales, en donde dichos uno o más cebadores de amplificación adicionales tienen entre 10 y 45 nucleótidos de longitud que hibridan específicamente con una o más secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec de un SARM con MREJ de tipo i a xx. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la etapa de contacto también incluye poner en contacto la muestra con uno o más cebadores de amplificación adicionales de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud que hibridan específicamente y están configurados para generar un amplicón de secuencias de mecA, secuencias de mecC y/o secuencias específicas Staphylococcus aureus. Los ejemplos no limitantes de secuencias específicas de S. aureus incluyen, pero no se limitan a secuencias de nuc, secuencias de ARNr, secuencias de femB, secuencias de Sa442 y similares. El experto en la técnica apreciará fácilmente, sin embargo, que se puede utilizar cualquier secuencia que sea exclusiva de Staphylococcus aureus en las realizaciones descritas en el presente documento.

En consecuencia, la etapa de contacto de los métodos descritos en el presente documento puede incluir la realización de una reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como PCR, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), por ejemplo amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), reacción en cadena de la ligasa (LCR), inmuno-amplificación, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR) o amplificación de círculo rodante. En algunas realizaciones preferidas descritas en el presente documento, el método incluye realizar PCR multiplex. En algunas realizaciones preferidas descritas en el presente documento, el método incluye realizar PCR en tiempo real.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de una región MREJ de tipo xxi. También se muestran las ubicaciones de varios cebadores y sondas descritos en las realizaciones descritas en el presente documento.

Descripción detallada

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son únicamente ilustrativas y explicativas y no se pretende que limiten el alcance de las enseñanzas actuales. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, el uso de "comprender", "contener" e "incluir", o modificaciones de esas palabras raíz, por ejemplo, pero sin limitarse a, "comprende", "contenido" y "que incluye", no se debe considerar limitante. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. El término "y/o" significa que los términos antes y después pueden tomarse juntos o por separado. Con fines ilustrativos, pero no como limitación, "X y/o Y" pueden significar "X" o "Y" o "X e Y".

Siempre que se proporcione en el presente documento un intervalo de valores, se pretende que el intervalo incluya el valor inicial y el valor final y cualquier valor o intervalo de valores entre ellos, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por ejemplo, "de 0,2 a 0,5" significa 0,2, 0,3, 0,4, 0,5; intervalos intermedios tales como 0,2-0,3, 0,3-0,4, 0,2-0,4; incrementos intermedios entre tales como 0,25, 0,35, 0,225, 0,335, 0,49; intervalos de incrementos tales como 0,26 y 0,39; y similares.

En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para la detección mejorada de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) y, en particular, los métodos de detección de S. aureus que alberga un gen homólogo de mecA, tal como una cepa CC130 o ccl30 de S. aureus. La resistencia a la meticilina en Staphylococcus aureus se debe al producto génico del gen mecA, que codifica la proteína de unión a penicilina 2a (PBP-2a), una transpeptidasa resistente a p-lactama. mecA está ausente de S. aureus sensible a meticilina pero se distribuye ampliamente entre otras especies de estafilococos, incluidos los estafilococos coagulasa negativos (CoNS), tales como Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, S. saprophyticus, S. lentus, S. hominus, S. cohnii, S. delphini, S. xylosus, S. muscae, S. schleiferi, S. coagulans, y otros. £1 gen mecA está altamente conservado Ubukata et al., 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172). En estafilococos resistentes a meticilina, mecA está presente en un elemento genético denominado casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec), que se inserta en el cromosoma de estafilococos.

Los casetes SCCmec varían de 20 kb a más de 60 kb de longitud e incluyen genes de recombinasa específicos del sitio y elementos transponibles, además del gene mecA. Los casetes SCCmec se insertan en una ubicación fija, denominada "attBscc" dentro del ADN cromosómico de Staphylococcus aureus, y que se encuentra en el extremo 3' de un marco de lectura abierto denominado "orfX\ Huletsky et al. (2004) J. Clin. Microbiol. 42(5):1875-1884. Las cepas de SARM se han clasificado según la organización de los casetes SCCmec (denominados tipo "SCCmec"). Se han clasificado diferentes SCCmec de acuerdo con sus genes de recombinasa y la organización genética de los genes mecí y mecR, que son reguladores de mecA.

Muchos ensayos moleculares para la detección e identificación de SARM implican la detección del gen mecA. Puesto que mecA también se encuentra en CoNS, la detección de mecA por sí sola no es suficiente para determinar la presencia de SARM, ya que CoNS resistente a meticilina también dará positivo. Para abordar este problema, se han desarrollado ensayos en los que se detectan genes específicos S. de aureus, además de mecA. Véanse, Schuenck et al., Res. Microbiol., (2006), en prensa, Shittu et al., (2006), Diagn Microbiol Infect Dis. 17 de julio, Grisold et al., (2006), Methods Mol. Biol. 345:79-89, Costa et al., (2005), Diag. Microbiol. and infect. Dis, 51:13-17, Mc Donald et al., (2005), J. Clin. Microbiol., 43: 6147-6149., Zhang et al., (2005), J. Clin. Microbiol. 43: 5026-5033, Hagen et al. (2005), Int J Med Microbiol.

295:77-86, Maes et al. (2002) J. Clin. Microbiol. 40:1514-1517, Saito et al., (1995) J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500; Ubukata et al., (1992) J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733; Murakami et al., (1991) J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244; Hiramatsu et al., (1992) Microbiol. Immunol. 36:445-453). Además, Levi y Towner (2003), J. Clin. Microbiol., 41:3890-3892. y Poulsen et al. (2003), J Antimicrob Chemother., 51:419-421 describen la detección de resistencia a meticilina en Estafilococos coagulasa negativos y en S. aureus utilizando el kit de Detección EVIGENE™ MRSA.

Sin embargo, debido a que el gen mecA se distribuye ampliamente tanto en S. aureus como en estafilococos coagulasa negativos, cada uno de los métodos descritos anteriormente es incapaz de discriminar entre muestras que contienen tanto S. aureus sensibles a la meticilina ("SASM") como estafilococos coagulasa negativos resistentes a meticilina, y muestras que contienen solo SARM o que tienen tanto S. aureus sensible a meticilina como SARM.

Para abordar este problema, Hiramatsu et al. desarrollaron un ensayo basado en PCR específico para SARM que utiliza cebadores que hibridan con los extremos derechos del ADN de SCCmec de los tipos I-III combinados con cebadores específicos para el cromosoma de S. aureus, que corresponde a la secuencia de nucleótidos en el lado derecho del sitio de integración de SCCmec. (Patente de Estados Unidos Núm. 6.156.507, en adelante la ''patente '507"). Más recientemente, Zhang et al., (2005), J. Clin. Microbiol. 43: 5026-5033, describieron un ensayo multiplex para subtipificar SARM con los tipos I a V de SCCmec. Las secuencias de nucleótidos que rodean el sitio de integración de SCCmec en otras especies de estafilococos (p. ej., S. epidermidis y S. haemolyticus) son diferentes de los que se encuentran en S. aureus, por lo tanto, los ensayos de PCR multiplex que utilizan oligonucleótidos que hibridan con los extremos derechos de SCCmec y el cromosoma de S. aureus tienen la ventaja de ser específicos para la detección de SARM.

El ensayo de PCR descrito en la patente '507 también condujo al desarrollo de la "tipificación MREP" (del inglés “mec right extremity polymorphism” polimorfismo del extremo derecho de mec) del ADN de SCCmec (Ito et al., (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Hiramatsu et al., (1996) J. Infect. Chemother. 2:117-129). El método de tipificación MREP aprovecha el hecho de que las secuencias de nucleótidos de los tres tipos de MREP difieren en el extremo derecho de los ADN de SCCmec adyacentes al sitio de integración entre los tres tipos de SCCmec.

El término "MREJ" se refiere a la unión en el extremo derecho de mec << unión en el extremo derecho de mec >>. Las secuencias de ácido nucleico de la región MREJ tienen aproximadamente 1 kilobase (kb) de longitud e incluyen secuencias del extremo derecho de SCCmec, así como ADN cromosómico bacteriano a la derecha del sitio de integración de SCCmec. Las cepas que se clasificaron como tipos i-iii de MREP corresponden a los tipos i-iii de MREJ. Los tipos iv a xx de MREJ han sido caracterizados previamente por Huletsky et al., (2004), en J. Clin. Microbiol. 42:1875-1884; Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824, Solicitud de Patente de Estados Unidos 2008/0227087.

Recientemente, García-Alvarez et al. informaron sobre cepas bacterianas que fueron confirmadas por análisis de ARN ribosómico como S. aureus, y que mostraban resistencia a meticilina utilizando pruebas de sensibilidad a los antibióticos de rutina. García-Alvarez et al. (2011) Lancet 11:595-603. Sorprendentemente, sin embargo, estas cepas resultaron negativas como SARM utilizando los ensayos descritos anteriormente, que se basan en la detección de mecA o la detección de regiones MREJ conocidas. La especificidad del ensayo está limitada para identificar regiones MREJ. García-Alvarez et al. demostraron que las cepas albergaban un homólogo de mecA novedoso que compartía homología limitada con genes mecA conocidos, es decir, 63% de identidad a nivel de aminoácidos y 70% de identidad a nivel de ADN, lo que explica la incapacidad de los ensayos que se basan en la detección del gen mecA para detectar estos SARM. El homólogo de mecA se denominó mecALGA251, también conocido en el presente documento como mecC. Puesto que los ensayos que utilizan la amplificación MREJ tampoco pudieron detectar ninguna de las cepas de SARM mecALGA251, las cepas de SARM mecALGA251 se identificarían incorrectamente como falsos negativos. Este error en el diagnóstico e identificación de SARM podría tener un impacto grave en el resultado de la salud del paciente.

Varias cepas de S. aureus que dieron positivo como resistentes a meticilina utilizando pruebas convencionales de susceptibilidad a antibióticos, pero que no fueron detectados como SARM utilizando ensayos moleculares comerciales convencionales, se analizaron más a fondo. Las cepas se enumeran en la Tabla 1, a continuación.

Tabla 1

Como se describe en el presente documento, la presente divulgación se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de que la gran mayoría de las cepas de SARM analizadas que albergan el gen homólogo de mecA, mecA^LGA251/mecC, comparten la misma secuencia de MREJ. Basándose en este sorprendente hallazgo, se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos para la detección mejorada de SARM. Las composiciones y métodos divulgados en el presente documento permiten ventajosamente una detección e identificación rápidas y fiables de las cepas de SARM mecALGA251.

Oligonucleótidos

Según algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan oligonucleótidos, por ejemplo, cebadores de amplificación y/o sondas específicas de secuencia. Como se emplean en el presente documento, los términos "cebador" y "sonda" incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos. Preferiblemente, los cebadores y/o sondas oligonucleotídicos descritos en el presente documento pueden tener una longitud de entre 8 y 45 nucleótidos. Por ejemplo, los cebadores y/o sondas pueden tener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45 o más nucleótidos de longitud. Los cebadores y/o sondas se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, incluido unidos a un soporte sólido, en forma líquida y liofilizada, por ejemplo. Las secuencias del cebador y de la sonda descritas en el presente documento se pueden modificar para que contengan nucleótidos adicionales en el extremo 5' o 3', o en ambos. El experto en la técnica apreciará, sin embargo, que las bases adicionales al extremo 3' de los cebadores de amplificación (no necesariamente sondas) son generalmente complementarias a la secuencia molde. Las secuencias del cebador y la sonda descritas en el presente documento también se pueden modificar para eliminar nucleótidos en el extremo 5' o 3'. El experto en la técnica apreciará que con el fin de que funcione la amplificación, los cebadores o sondas tendrán una longitud y una temperatura de reasociación mínimas como se describe en el presente documento.

Los cebadores y sondas oligonucleótidos se pueden unir a sus dianas a una temperatura de reasociación, que es una temperatura menor que la temperatura de fusión (T^m). Como se emplea en el presente documento, "T^m" y "temperatura de fusión" son términos intercambiables que se refieren a la temperatura a la que 50% de una población de moléculas polinucleotídicas de doble hebra se disocia en hebras sencillas. Las fórmulas para calcular la T^m de los polinucleótidos son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la T^m se puede calcular mediante la siguiente ecuación: T^m = 69,3 0,41 x (G C)% - 6-50/L, donde L es la longitud de la sonda en nucleótidos. La t^m de un polinucleótido híbrido también se puede estimar utilizando una fórmula adoptada de ensayos de hibridación en sal 1 M, y comúnmente utilizada para calcular la T^m para cebadores de PCR: [(número de A T) x 2°C (número de G C) x 4°C]. Véase, p. ej., C. R. Newton et al. PCR, 2a ed., Springer-Verlag (Nueva York: 1997), pág. 24. En la técnica existen otros cálculos más sofisticados, que tienen en cuenta las características estructurales y de secuencia para el cálculo de la T^m. La temperatura de fusión de un oligonucleótido puede depender de la complementariedad entre el cebador o la sonda oligonucleótidos y la secuencia de unión, y de las condiciones de la sal. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, un cebador o sonda o oligonucleotídicos proporcionados en el presente documento tiene una T^m de menos de aproximadamente 90°C en KCl 50 mM, tampón Tris-HCl 10 mM, por ejemplo aproximadamente 89°C, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81,80 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39°C o menos, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.

Como se comenta con más detalle a continuación, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los cebadores descritos en el presente documento, p. ej., cebadores de amplificación, se pueden proporcionar como un par de cebadores de amplificación, p. ej., que comprende un cebador directo y un cebador inverso (primer cebador de amplificación y segundo cebador de amplificación). Preferiblemente, los cebadores directo e inverso tienen una T^m que no difiere en más de 10°C, p. ej., que difiere en menos de 10°C, menos de 9°C, menos de 8°C, menos de 7°C, menos de 6°C, menos de 5°C, menos de 4°C, menos de 3°C, menos de 2°C, o menos de 1°C.

Las secuencias del cebador y de la sonda se pueden modificar teniendo sustituciones de nucleótidos (con respecto a la secuencia diana) dentro de la secuencia oligonucleotídica, siempre que el oligonucleótido contenga suficiente complementariedad para hibridar específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana. De esta manera, se pueden sustituir al menos 1, 2, 3, 4 o hasta aproximadamente 5 nucleótidos. Como se emplea en el presente documento, el término "complementario" se refiere a la complementariedad de secuencia entre regiones de dos hebras de polinucleótidos o entre dos regiones de la misma hebra de polinucleótidos. Una primera región de un polinucleótido es complementaria a una segunda región del mismo polinucleótido o de un polinucleótido diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas de forma antiparalela, al menos un nucleótido de la primera región es susceptible de emparejarmiento de bases con una base de la segunda región. Por lo tanto, no es necesario que dos polinucleótidos complementarios emparejen las bases en cada posición de nucleótido. "Completamente complementario" se refiere a un primer polinucleótido que es 100% o "completamente" complementario a un segundo polinucleótido y, por tanto, forma un par de bases en cada posición de nucleótido. "Parcialmente complementario" también se refiere a un primer polinucleótido que no es 100% complementario (p. ej., complementaria en 90%, u 80% o 70%) y contiene nucleótidos no emparejados en una o más posiciones de nucleótidos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, un oligonucleótido incluye una base universal.

Como se emplea en el presente documento, el término "hibridación" se utiliza en referencia al emparejamiento de hebras polinucleotídicas complementarias (incluidas parcialmente complementarias). La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre las hebras de polinucleótidos) se ve afectada por muchos factores bien conocidos en la técnica, incluido el grado de complementariedad entre los polinucleótidos, la rigurosidad de las condiciones implicadas afectadas por condiciones tales como la concentración de sales, la temperatura de fusión del híbrido formado, la presencia de otros componentes (p. ej., la presencia o ausencia de polietilenglicol), la molaridad de las hebras de hibridación y el contenido de G:C de las hebras de polinucleótidos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, p. ej., las realizaciones descritas en el presente documento que proporcionan más de un oligonucleótido, los oligonucleótidos se diseñan de manera que la T^m de un oligonucleótido esté dentro del margen de 2°C de la T^m del otro oligonucleótido. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Como se analiza más detalladamente en el presente documento, los términos "hibridación específica" o "hibrida específicamente" se refieren a la hibridación de un polinucleótido, p. ej., un cebador o sonda oligonucleotídicos o similar con una secuencia diana, tal como una secuencia que se vaya a cuantificar en una muestra, una secuencia de ácido nucleico diana de control positivo, o similar, y no a secuencias no relacionadas, en las condiciones típicamente utilizadas para la amplificación de ácido nucleico.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los cebadores y/o sondas incluyen oligonucleótidos que hibridan con una secuencia de ácido nucleico diana en toda la longitud de la secuencia oligonucleotídica. Se puede hacer referencia a tales secuencias como "completamente complementarias" entre sí. Cuando se hace referencia a un oligonucleótido como "sustancialmente complementario" con respecto a una secuencia de ácido nucleico en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias o pueden formar emparejamientos erróneos tras la hibridación, pero conservar la capacidad de hibridar en condiciones rigurosas o en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales como se comenta a continuación. Como se emplea en el presente documento, el término "sustancialmente complementario" se refiere a la complementariedad entre dos ácidos nucleicos, p. ej., la región complementaria del oligonucleótido y la secuencia diana. La complementariedad no tiene por qué ser perfecta; puede haber cualquier número de emparejamientos erróneos de pares de bases entre los dos ácidos nucleicos. Sin embargo, si el número de emparejamientos erróneos es tan grande que no puede producirse hibridación ni siquiera en las condiciones de hibridación menos rigurosas, la secuencia no es una secuencia sustancialmente complementaria. Cuando en el presente documento se hace referencia a dos secuencias como "sustancialmente complementarias", se quiere significar que las secuencias son suficientemente complementarias entre sí para hibridar en las condiciones de reacción seleccionadas. La relación de complementariedad de ácido nucleico y la rigurosidad de hibridación suficiente para lograr especificidad es bien conocida en la técnica y se describe más adelante con referencia a la identidad de secuencia, temperatura de fusión y condiciones de hibridación. Por lo tanto, se pueden utilizar secuencias sustancialmente complementarias en cualquiera de los métodos de detección descritos en el presente documento. Tales sondas pueden ser, p. ej., perfectamente complementarias o pueden contener de 1 a muchos emparejamientos erróneos siempre que las condiciones de hibridación sean suficientes para permitir, por ejemplo, la discriminación entre una secuencia diana y una secuencia no diana. En consecuencia, las secuencias sustancialmente complementarias se pueden referir a secuencias que varían en porcentaje de identidad de 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 o menos, o cualquier número intermedio, en comparación con la secuencia de referencia. Por ejemplo, los oligonucleótidos descritos en el presente documento pueden contener 1, 2, 3, 4, 5 o más emparejamientos erróneos y/o bases degeneradas, en comparación con la secuencia diana con la que hibrida el oligonucleótido, con la condición de que los oligonucleótidos sean capaces de hibridar específicamente con la secuencia diana, por ejemplo, en condiciones convencionales de amplificación de ácido nucleico.

En consecuencia, a modo de ejemplo, el término "condiciones de hibridación rigurosas" se puede referir a uno cualquiera o ambos de los siguientes: a) 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 65°C, y b) NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas, seguido de lavado. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el término "condiciones rigurosas" se puede referir a condiciones de amplificación de ácido nucleico normalizadas (p. ej., PCR).

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra o espécimen se ponen en contacto con un conjunto de cebadores de amplificación en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales, que se comentan con más detalle a continuación. Para obtener una revisión de la tecnología de PCR, incluidas las condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales, tales como las condiciones de PCR, aplicadas a la microbiología clínica, véanse DNA Methods in Clinical Microbiology, Singleton P., publicado por Dordrecht; Boston: Kluwer Academic, (2000) Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B. A. Ed. en Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997) y "PCR Methods and Applications", de 1991 a 1995 (Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los ejemplos no limitantes de "condiciones de amplificación de ácido nucleico" y "condiciones de PCR" incluyen las condiciones descritas en las referencias citadas en el presente documento, tales como, por ejemplo, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl²2,5 Mm, con una temperatura de reasociación de 72°C; o MgCl² 4 Mm, Tris 100 mM, pH 8,3, KCl 10 mM, (Nh 4)2SÜ45 Mm, 0,15 mg de BSA,1, trehalosa al 4%, con una temperatura de reasociación de 59°C, o KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl² 2,5 Mm, con una temperatura de reasociación de 55°C, o similar.

Los cebadores descritos en el presente documento se pueden preparar utilizando mecanismos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, clonación y digestión de las secuencias apropiadas y síntesis química directa. Los métodos de síntesis química que se pueden utilizar para preparar los cebadores de los descritos en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, el método de fosfotriéster descrito por Narang et al. (1979) Methods in Enzymology 68:90, el método del fosfodiéster divulgado por Brown et al. (1979) Methods in Enzymology 68:109, el método de dietilfosforamidato divulgado por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859, y el método de soporte sólido descrito en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.458.066. En el presente documento también se contempla el uso de un sintetizador de oligonucleótidos automático para preparar cebadores oligonucleotídicos sintéticos descritos en el presente documento.

Por consiguiente, algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a composiciones que comprenden oligonucleótidos (p. ej., cebadores y sondas de amplificación) que hibridan específicamente (p. ej., en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales, p. ej., condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación rigurosas) con secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec en cepas de SARm que tienen secuencias de MREJ de tipo xxi. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan composiciones que comprenden oligonucleótidos que hibridan específicamente con las secuencia polimórficas del extremo derecho de SCCmec presentes en SEQ ID NO: 1, o su complemento p. ej., dentro de las posiciones de nucleótidos 1 a 164 de SEQ ID NO: 1, o su complemento. Un oligonucleótido ilustrativo que hibrida específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec de MREJ de tipo xxi, incluidas las secuencias polimórficas del extremo derecho dentro de SEQ ID NO: 1, se proporciona en SEQ ID NO: 2, o su complemento. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan oligonucleótidos que son sustancialmente complementarios a SEQ ID NO: 2 o su complemento, así como oligonucleótidos que contienen 1, 2, 3, 4 o más emparejamientos erróneos o nucleótidos universales con respecto a SEQ ID NO: 2 o su complemento , p. ej., incluidos los oligonucleótidos que son al menos 80% idénticos (por ejemplo, al menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a SEQ ID NO: 2 o su complemento.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las composiciones y métodos pueden incluir oligonucleótidos, p. ej., cebadores de amplificación o sondas específicas de secuencia, que hibridan específicamente con una o más secuencias polimórficas del extremo derecho dentro de regiones MREJ distintas de MREJ de tipo xxi. Por consiguiente, algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan oligonucleótidos, p. ej., cebadores de amplificación o sondas específicas de secuencia que hibridan específicamente (en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales y/o condiciones de hibridación rigurosas) con secuencias polimórficas del extremo derecho dentro de una o más regiones MREJ seleccionadas entre regiones MREJ de tipo i, regiones MREJ de tipo ii, regiones de MREJ de tipo iii, regiones de MREJ de tipo iv, regiones de MREJ de tipo v, regiones de MREJ de tipo vi, regiones de MREJ de tipo vii, regiones de MREJ de tipo viii, regiones de MREJ de tipo ix, regiones de MREJ de tipo x, regiones de MREJ de tipo xi, regiones de MREJ de tipo xii, regiones de MREJ de tipo xiii, regiones de MREJ de tipo xiv, regiones de MREJ de tipo xv, regiones de MREJ de tipo xvi, de MREJ regiones de tipo xvii, regiones de MREJ de tipo xviii, regiones de MREJ de tipo xix y regiones de MREJ de tipo xx.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las composiciones y métodos pueden incluir oligonucleótidos, p. ej., cebadores de amplificación que hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de, secuencias de mecA, o un fragmento de las mismas. Por consiguiente, algunas realizaciones descritas en el presente documento incluyen oligonucleótidos, p. ej., cebadores de amplificación que hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de secuencias dentro de SEQ ID NO: 156. Algunas realizaciones descritas en el presente documento incluyen oligonucleótidos, p. ej., cebadores de amplificación que hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de, secuencias de mecC, p. ej., secuencias dentro de SEQ ID NO: 157, o uno de sus fragmentos. Algunas realizaciones descritas en el presente documento incluyen oligonucleótidos, p. ej., cebadores de amplificación que hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de secuencias específicas de Staphylococcus aureus. Por ejemplo, algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan oligonucleótidos que hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de secuencias de nuc, p. ej., secuencias derivadas de SEQ ID NO: 158), secuencias de femB, p. ej., secuencias derivadas de SEQ ID NO: 159), secuencias de Sa442 (p. ej., de Martineau et al. 1998, J. Clin. Microbiol. 36(3):618-623) (SEQ ID NO: 160).

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona un oligonucleótido que hibrida específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de MREJ de tipo xxi en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) divulgados en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo i en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo ii en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de MREJ de tipo iii en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo iv de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo v en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo vi de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo vii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo viii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo ix de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo x MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xi de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xiii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xiv de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xv de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xvi de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xvii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xviii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo xix en condiciones normalizadas para amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej. cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xx de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej., cebadores de amplificación y/o sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de mecA. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej., cebadores de amplificación y/o sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de mecC. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej., cebadores de amplificación y/o sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de nuc. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej., cebadores de amplificación y/o sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de Sa442. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los oligonucleótidos específicos de secuencia (p. ej., cebadores de amplificación y/o sondas específicas de secuencia) descritos en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de femB.

Las secuencias ilustrativas de la región MREJ relacionadas con las realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen, por ejemplo:

Además del oligonucleótido de SEQ ID NO: 2, comentado anteriormente, que hibrida específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho dentro de las regiones de MREJ de tipo xxi, los oligonucleótidos que son específicos para una o más secuencias polimórficas dentro de las secuencias de la región MREJ, o para secuencias de ADN cromosómico de S. aureus, útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, las siguientes:

Además de lo anterior, el experto en la técnica apreciará que las composiciones y los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir cebadores y/o sondas para la detección específica de la región del extremo derecho de las secuencias de SCCmec en varias cepas de SARM además de las mencionadas anteriormente en el presente documento. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, las composiciones y métodos divulgados en el presente documento incluyen secuencias, p. ej., cebadores y/o sondas, descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 08/080620, incluyendo variantes de los mismos y complementos de los mismos. Por consiguiente, las composiciones y métodos divulgados en el presente documento pueden incluir los cebadores y/o sondas que se enumeran a continuación:

Tabla 2

Por consiguiente, en las realizaciones ilustrativas descritas en el presente documento, se proporcionan métodos y composiciones para la detección de SARM que comprenden MREJ xxi y uno o más tipos de MREJ seleccionados del grupo que consiste en MREJ de tipo i-xx. Por ejemplo, algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la detección y/o identificación de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo i, ii, iii y xxi, utilizando oligonucleótidos específicos de MREJ y específicos de ADN cromosómico de S. aureus divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la detección y/o identificación de SARM que comprenden secuencias de MREJ de tipo i, ii, iii, iv y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ como se describe en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la detección de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo i, ii, iii, iv, v, vii y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la identificación de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo i, ii, iii, iv, v, vii y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la detección de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo i, ii, iii, iv, v, vii y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la identificación de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo i, ii, iii, iv, v, vii y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la detección de SARM que comprende ácidos nucleicos de tipo i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la identificación de SARM que comprende ácidos nucleicos de tipo i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv y xxi, utilizando una combinación de oligonucleótidos específicos de MREJ divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la detección y/o identificación de SARM que comprende ácidos nucleicos de tipo i, ii, iii, iv, vii, xvi y xxi, utilizando una combinación de MREJ específicos divulgados en el presente documento.

Sondas

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia. Las sondas incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con una secuencia diana, tal como una secuencia de ácido nucleico de la región de MREJ de tipo xxi. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con SEC ID NO: 1, o su complemento, o una de sus subsecuencias (p. ej., un amplicón de una región dentro de SEC ID NO: 1). En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda específica de secuencia hibrida específicamente con, y es completa o sustancialmente complementaria, una secuencia de nucleótidos flanqueada por los sitios de unión de un cebador directo y un cebador inverso divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia comprenden al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3, de modo que la sonda específica de secuencia se solapa con el sitio de unión de un cebador de amplificación divulgado en el presente documento.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia que hibridan con orfX. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia que hibridan con mecA. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia que hibridan con mecC. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia que hibridan con nuc. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia que hibridan con femB. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan sondas específicas de secuencia que hibridan con Sa442.

El experto en la técnica apreciará fácilmente que se pueden proporcionar juntos pares afines de cebadores de amplificación y sondas específicas de secuencia. Es decir, en las realizaciones descritas en el presente documento en las que se proporcionan cebadores de amplificación que hibridan específicamente con, y generan un amplicón para una secuencia particular, las realizaciones descritas en el presente documento también pueden incluir una sonda específica de secuencia que hibrida con, y es específica para el amplicón.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia descritas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de MREJ de tipo xxi en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo i en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo ii en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo iii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo iv de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región MREJ de tipo v en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo vi de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo vii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo viii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo ix de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo x MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xi de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xiii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xiv de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xv de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xvi de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xvii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xviii de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xix de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácido nucleico y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de tipo xx de MREJ en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de mecA en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de mecC en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de nuc en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente secuencias de femB en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con secuencias de Sa442 en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con secuencias cromosómicas de S. aureus ubicadas a 1 kilobase del punto de inserción del elemento SCCmec en el ADN cromosómico. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona una sonda específica de secuencia que hibrida específicamente con secuencias de orfX de S. aureus en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona una sonda específica de secuencia que hibrida con orfSA0022 en condiciones normalizadas para la amplificación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia divulgadas en el presente documento hibridan específicamente con las secuencias de MREP, p. ej., MREP de tipo i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix, xx o xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona más de una sonda específica de secuencia. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas específicas de secuencia que hibridan específicamente con secuencias de MREP de tipo xxi se proporcionan combinadas con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte, o más, sondas específicas de secuencia.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas oligonucleotídicas pueden incluir un radical detectable. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas oligonucleotídicas divulgadas en el presente documento pueden comprender una marca radiactiva. Los ejemplos no limitantes de marcas radiactivas incluyen 3H, 14C, 32P, y 35S. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las sondas oligonucleotídicas pueden incluir uno o más marcadores o radicales detectables no radiactivos, que incluyen, pero no se limitan a, ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Otros marcadores detectables para su uso con sondas, que pueden permitir un aumento en la sensibilidad del método descrito en el presente documento, incluyen biotina y radio-nucleótidos. Resultará evidente para el experto en la técnica que la elección de una marca particular dicta la manera en que se une a la sonda. Por ejemplo, sondas oligonucleotídicas marcadas con uno o más colorantes, de modo que tras la hibridación con un ácido nucleico molde, se genera un cambio detectable en la fluorescencia. Si bien los colorantes no específicos pueden ser deseables para algunas aplicaciones, las sondas específicas de secuencia pueden proporcionar mediciones de amplificación más precisas. Una configuración de sonda específica de secuencia puede incluir un extremo de la sonda anclado a un fluoróforo y el otro extremo de la sonda anclado a un extintor. Cuando la sonda no está hibridada, puede mantener una configuración de tallo-bucle, en la que el fluoróforo es extinguido por el extintor, evitando así que el fluoróforo emita fluorescencia. Cuando la sonda hibrida con una secuencia nucleica molde, se linealiza, distanciando el fluoróforo del extintor y permitiendo así que el fluoróforo emita fluorescencia. Otra configuración de sonda específica de secuencia puede incluir una primera sonda anclada a un primer fluoróforo de un par FRET y una segunda sonda anclada a un segundo fluoróforo de un par FRET. La primera sonda y la segunda sonda se pueden configurar para hibridar con secuencias de un amplicón que están lo suficientemente cerca para permitir la transferencia de energía mediante FRET cuando la primera sonda y la segunda sonda hibridan con el mismo amplicón.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda específica de secuencia comprende un oligonucleótido como se divulga en el presente documento conjugado con un fluoróforo. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda se conjuga con dos o más fluoróforos. Los ejemplos de fluoróforos incluyen: colorantes de xanteno, p. ej., colorantes de fluoresceína y rodamina, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), monohidrocloruro de éster etílico de ácido 2-[etilamino)-3-(etilimino)-2-7-dimetil-3H-xanten-9-il]benzoico (R6G) (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía de aproximadamente 500 a 560 nm), yoduro de 1,1,3,3,3',3'-hexametilindodicarbocianina (HIDC) (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que oscila entre 600 y 660 nm), 6-carboxifluoresceína (comúnmente conocida por las abreviaturas FAM y F), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE o J), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA o T), 6-carboxi-X-rodamina (ROX o R), 5-carboxirodamina-6G (R6G5 o G5), 6-carboxirodamina-6G (R6G6 o G6) y rodamina 110; colorantes de cianina, p. ej. colorantes Cy3, Cy5 y Cy7; cumarinas, p. ej., umbeliferona; colorantes de bencimida, p. ej. Hoechst 33258; colorantes de fenantridina, p. ej. Rojo Texas; colorantes de etidio; colorantes de acridina; colorantes de carbazol; colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de polimetina, p. ej. colorantes de cianina tales como Cy3 (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre aproximadamente 540 y 580 nm), Cy5 (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre aproximadamente 640 y 680 nm), etc; colorantes BODIPY y colorantes de quinolina. Los fluoróforos específicos de interés incluyen: pireno, cumarina, dietilaminocumarina, fAm , fluoresceína clorotriazinilo, fluoresceína, R110, eosina, JOE, R6G, HIDC, tetrametilrodamina, TAMRA, lisamina, ROX, naftofluoresceína, Rojo Texas, naftofluoresceína, Cy3, y Cy5, y similares.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda se conjuga con un extintor. Un extintor puede absorber radiación electromagnética y disiparla en forma de calor, permaneciendo así oscuro. Los extintores ilustrativos incluyen Dabcyl, NFQ, tal como BHQ-1 o BHQ-2 (Biosearch), IOWA BLACK FQ (IDT) e IOWA BLACK RQ (IDT). En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el extintor se selecciona para emparejarse con un fluoróforo para absorber la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo. Los pares de fluoróforo/extintor útiles en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, p. ej., descritos por S. Marras, en "Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes" disponible en el sitio de la red molecularbeacons.org/download/marras.mmb06%28335%293.pdf.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se ancla un fluoróforo a un primer extremo de la sonda y se ancla un extintor a un segundo extremo de la sonda. El anclaje puede incluir la unión covalente y, opcionalmente, puede incluir al menos una molécula conectora colocada entre la sonda y el fluoróforo o extintor. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se ancla un fluoróforo a un extremo 5' de una sonda, y se ancla un extintor a un extremo 3' de una sonda. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se ancla un fluoróforo a un extremo 3' de una sonda, y se ancla un extintor a un extremo 5' de una sonda. Los ejemplos de sondas que se pueden utilizar en la amplificación cuantitativa de ácidos nucleicos incluyen balizas moleculares, sondas SCORPION™ (Sigma), sondas TAQMAN™ (Life Technologies) y similares. Otras tecnologías de detección de ácido nucleico que son útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, tecnología de sonda de nanopartículas (Véase, Elghanian et al. (1997) Science 277:1078-1081.) y la tecnología de sonda Amplifluor (Véanse, las Patentes de EE.Uu . Núm.: 5.866.366; 6.090.592; 6.117.635; y 6.117.986).

Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan sondas que hibridan específicamente con una secuencia de MREJ de tipo xxi, o un amplicón de una secuencia de MREJ de tipo xxi, p. ej., SEQ ID NO: 1, o una de sus subsecuencias. Por consiguiente, algunas realizaciones divulgadas en el presente documento proporcionan una sonda que hibrida con un amplicón a partir de la amplificación de un molde que comprende SEC ID NO: 1 utilizando los cebadores de amplificación de SEC ID NO: 2 y 3. A modo de ejemplo únicamente, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona una sonda que puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una variante de la misma. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda comprende un fluoróforo y/o extintor como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona una sonda que puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en la secuencia de SEQ ID NO: 82, o una variante de la misma. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la sonda comprende un fluoróforo y/o extintor como se describe en el presente documento. En las realizaciones preferidas descritas en el presente documento, las sondas pueden comprender SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 82, o sus variantes, con el fluoróforo 6-carboxifluoresceína ("FAM") anclado al extremo 5' de la sonda, y el extintor IOWA NEGRO Black-hole Quencher® 2 (IDT) ("BHQ") anclado al extremo 3' de la sonda.

Kits

En el presente documento también se proporcionan kits. Los kits, cebadores y sondas divulgados en el presente documento se pueden utilizar para detectar y/o identificar SARM con MREJ de tipo xxi (y, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, adicionalmente para detectar y/o identificar SARM con uno o más de los tipos ixx de MREJ), en aplicaciones in vitro y/o in situ . Por ejemplo, se contempla que los kits se puedan utilizar combinados con cualquier cebador/sonda previamente descrito para detectar SARM con los tipos i a xx de MREJ. También se contempla que los kits de diagnóstico, cebadores y sondas divulgados en el presente documento se puedan utilizar solos o combinados con cualquier otro ensayo adecuado para detectar y/o identificar microorganismos, incluyendo pero sin limitarse a: cualquier ensayo basado en la detección de ácidos nucleicos, cualquier inmunoensayo, cualquier ensayo enzimático, cualquier ensayo bioquímico, cualquier ensayo lisotípico, cualquier ensayo serológico, cualquier medio de cultivo diferencial, cualquier medio de cultivo de enriquecimiento, cualquier medio de cultivo selectivo, cualquier medio de ensayo específico, cualquier medio de cultivo de identificación, cualquier medio de cultivo de enumeración, cualquier tinción celular, cualquier cultivo en líneas celulares específicas y cualquier ensayo de infectividad en animales.

Por consiguiente, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento incluirán un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi (p. ej., SEQ ID NO: 1 o su complemento) en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales, y/o condiciones de hibridación rigurosas. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento incluirán un oligonucleótido (p. ej., un primer cebador de amplificación) que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en SEQ ID NO: 2, o una de sus variantes. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el kit también puede incluir uno o más oligonucleótidos adicionales, p. ej., un segundo cebador de amplificación tal como un oligonucleótido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en SEQ ID NO: 3, o una de sus variantes, que, junto con un primer cebador de amplificación generará un amplicón de la unión polimórfica del extremo derecho de secuencias de MREJ de tipo xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el kit también puede incluir una sonda como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, el kit puede incluir una sonda oligonucleotídica que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en SEQ ID NO: 4, o una de sus variantes.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento pueden incluir, además de un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación normalizadas, uno o más oligonucleótidos que se unen específicamente a uno o más de las secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec (MREP) dentro de MREJ de tipo i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix o xx. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, lo divulgado en el presente documento puede incluir, además de un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación normalizadas, uno o más oligonucleótidos que se unen específicamente a secuencias de mecA. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento pueden incluir, además de un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación normalizadas, uno o más oligonucleótidos que se unen específicamente a secuencias de mecC. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento pueden incluir, además de un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación normalizadas, uno o más oligonucleótidos que se unen específicamente a secuencias de nuc. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento pueden incluir, además de un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación normalizadas, uno o más oligonucleótidos que se unen específicamente a secuencias de nucleótidos específicas de S. aureus, p. ej., secuencias de femB. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits divulgados en el presente documento pueden incluir, además de un oligonucleótido que se une específicamente a las secuencias polimórficas del extremo derecho de las secuencias de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación normalizadas, uno o más oligonucleótidos que se unen específicamente a secuencias de Sa442.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan kits que contienen los reactivos y composiciones para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. Tal kit puede comprender un portador que se compartimenta para recibir en un confinamiento estrecho en el mismo uno o más recipientes, tales como tubos o viales. Uno de los recipientes puede contener al menos un cebador o una sonda no marcados o marcados de forma detectable divulgados en el presente documento. El cebador o cebadores pueden estar presentes en forma liofilizada o en un tampón apropiado según sea necesario. Uno o más recipientes pueden contener una o más enzimas o reactivos para ser utilizados, por ejemplo, en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Estas enzimas pueden estar presentes solas o en mezclas, en forma liofilizada o en tampones apropiados. Las enzimas ilustrativas útiles en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos como se divulga en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasa Taq FASTSTART™, ADN polimerasa APTATAQ™ (Roche), ADN polimerasa KLENTAQ 1™ (AB peptides Inc.), ADN polimerasa HOTGOLd St AR™ (Eurogentec), ADN polimerasa KAPATAQ™ HotStart, ADN polimerasa KAPA2G™ Fast HotStart (Kapa Biosystemss), ADN polimerasa PHUSION™ Hot Start (Finnzymes) o similares.

Además, los kits divulgados en el presente documento pueden incluir todos los elementos adicionales necesarios para llevar a cabo los métodos divulgados en el presente documento, tales como tampones, reactivos de extracción, enzimas, pipetas, placas, ácidos nucleicos, nucleósidos trifosfato, papel de filtro, materiales de gel, materiales de transferencia, suministros de autorradiografía y similares.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits incluyen reactivos adicionales que son necesarios o convenientes y/o deseables para incluir en la mezcla de reacción preparada durante los métodos divulgados en el presente documento, donde tales reactivos incluyen: una o más polimerasas; un medio de tampón acuoso (preparado o presente en sus componentes constituyentes, donde uno o más de los componentes pueden estar premezclados o todos los componentes pueden estar separados) y similares. Los diversos componentes reactivos de los kits pueden estar presentes en recipientes separados, o pueden estar todos combinados previamente en una mezcla de reactivos para combinarlos con el ácido nucleico molde.

Además de los componentes anteriores, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los kits también pueden incluir instrucciones para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuados, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que está impresa la información, en el envase del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, p. ej., disquete, CD, etc., en donde se ha grabado la información. Otro medio más que puede estar presente es una dirección de sitio en la red que se puede utilizar a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado. En los kits puede estar presente cualquier medio conveniente .

Métodos

En el presente documento se proporcionan métodos para la detección, identificación y/o cuantificación de SARM que tiene ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi de una muestra. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos incluyen la etapa de poner en contacto la muestra que se va a analizar con un oligonucleótido que hibrida específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región SCCmec de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales y/o condiciones de hibridación rigurosas.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, una muestra que se va a someter a prueba para determinar la presencia de un SARM que tiene una región SCCmec de MREJ de tipo xxi se procesa antes de realizar los métodos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se puede aislar, concentrar o someter a diversas otras etapas de procesamiento antes de realizar los métodos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se puede procesar para aislar los ácidos nucleicos de la muestra antes de poner en contacto la muestra con los oligonucleótidos, como se divulga en el presente documento. Como se emplea en el presente documento, la frase "aislar ácidos nucleicos" se refiere a la purificación de ácidos nucleicos a partir de uno o más componentes celulares. El experto en la técnica apreciará que las muestras procesadas para "aislar ácidos nucleicos" de las mismas pueden incluir componentes e impurezas distintos de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento se realizan en la muestra sin cultivar la muestra in vitro. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento se realizan en la muestra sin aislar los ácidos nucleicos de la muestra antes de poner en contacto la muestra con los oligonucleótidos como se divulga en el presente documento.

I. Métodos no basados en amplificación

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el oligonucleótido comprende un radical detectable, como se describe en otra parte del presente documento, y la hibridación específica del oligonucleótido con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región SCCmec de MREJ de tipo xxi se puede detectar, p. ej., por medios directos o indirectos. En consecuencia, algunas realizaciones descritas en el presente documento para la detección y/o identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, que incluyen las etapas de proporcionar una muestra de prueba; y poner en contacto la muestra con una sonda oligonucleotídica que hibrida específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región SCCmec de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales y/o condiciones de hibridación rigurosas, en donde la sonda oligonucleotídica tiene entre 10 y 45 nucleótidos de longitud y comprende un radical detectable, en donde el contacto se realiza en condiciones que permiten la hibridación específica del cebador con la unión en el extremo derecho mec de la secuencia de MREJ de tipo xxi si S. aureus que comprende secuencias de MREJ de tipo xxi está presente en la muestra. Se puede determinar la presencia y/o cantidad de sonda que está unida específicamente a la unión en el extremo derecho mec de la secuencia de MREJ de tipo xxi (si está presente en la muestra que se está analizando), donde la sonda unida es indicativa de la presencia de un SARM que tiene secuencias SCCmec de MREJ de tipo xxi en la muestra. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la cantidad de sonda unida se utiliza para determinar la cantidad de SARM que tiene secuencias SCCmec de MREJ de tipo xxi en la muestra.

De manera similar, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, se pueden utilizar métodos no basados en amplificación para detectar secuencias de nucleótidos adicionales. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir el uso de métodos no basados en amplificación para detectar la presencia y/o cantidad de otras secuencias de MREJ, p. ej., uno o más de los tipos i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix o xx de MREJ, o cualquier combinación de los mismos, además de las secuencias de MREJ de tipo xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir el uso de métodos no basados en amplificación para detectar la presencia de secuencias de mecA, además de secuencias de MREJ (o MREP) de tipo xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir el uso de métodos no basados en amplificación para detectar la presencia de secuencias de mecC, además de secuencias de (MREP) MREJ de tipo xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir el uso de métodos no basados en amplificación para detectar la presencia de secuencias específicas de S. aureus, tales como secuencias de nuc, secuencias de femB, secuencias de Sa442, secuencias de ARNr 16S o similares además de secuencias de (MREP) MREJ de tipo xxi. En consecuencia, en una realización ilustrativa descrita en el presente documento, se proporcionan en el presente documento métodos y composiciones para la detección simultánea de secuencias de tipo xxi, i, ii, iii, iv, vii, mecA, mecC, y nuc de MREJ.

La etapa de determinación se puede lograr utilizando cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluido, pero no limitado a, hibridación in situ, seguida de etapa de contacto. La detección de dúplex híbridos (es decir, de una sonda unida específicamente a secuencias polimórficas del extremo derecho de una región de MREJ de tipo xxi) se puede llevar a cabo mediante varios métodos. Normalmente, los dúplex de hibridación se separan de los ácidos nucleicos no hibridados y a continuación, se detectan las marcas unidas a los dúplex. Tales marcas se refieren a etiquetas o marcas radiactivas, fluorescentes, biológicas o enzimáticas o de uso convencional en la técnica. Se puede conjugar una marca con las sondas oligonucleotídicas o con los ácidos nucleicos derivados de la muestra biológica. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden emplear etapas de lavado para eliminar el exceso de muestra/ácidos nucleicos diana o sonda oligonucleotídica (así como el producto conjugado no unido, cuando sea aplicable, en exceso). Adicionalmente, los formatos de ensayo heterogéneos convencionales son adecuados para detectar los híbridos utilizando las marcas presentes en los cebadores y sondas oligonucleotídicos.

Por tanto, de acuerdo con algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, ELISA (p. ej., en un formato de tira reactiva, un formato de pocillos múltiples, o similar) utilizando métodos reconocidos por la técnica.

ii. Métodos basados en amplificación

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos para la detección y/o identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, incluyen las etapas de proporcionar una muestra de prueba; y poner en contacto la muestra con una sonda oligonucleotídica que hibrida específicamente con las secuencias polimórficas del extremo derecho de una región SCCmec de MREJ de tipo xxi en condiciones de amplificación de ácido nucleico normalizadas y/o condiciones de hibridación rigurosas, en donde la sonda oligonucleotídica tiene una longitud de entre 10 y 45 nucleótidos.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se pone en contacto en condiciones de amplificación normalizadas, o condiciones que permitan la hibridación y extensión específicas del cebador con la secuencia polimórfica del extremo derecho de mec (secuencia MREP) de la secuencia de MREJ de tipo xxi si S. aureus que comprende secuencias de MREJ de tipo xxi está presente en la muestra. Por consiguiente, los métodos incluyen la etapa de amplificación específica de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi a partir de muestras, p. ej., para generar amplicones o productos de amplificación que incluyen la unión en el extremo derecho de mec de una secuencia de MREJ de tipo xxi. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se pone en contacto en condiciones de amplificación normalizadas, o condiciones permiten la hibridación específica de un par de cebadores, p. ej., un primer cebador que hibrida con la secuencia polimórfica del extremo derecho de mec (secuencia MREP) y un segundo cebador que hibrida con la secuencia cromosómica de S. aureus adyacente al extremo derecho de SCCmec, es decir, orfX para generar un amplicón a través de la unión de SCCmec - cromosoma. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan métodos para generar datos de la secuencia de unión en el extremo derecho de SCCmec al poner en contacto una muestra en condiciones de amplificación normalizadas, o condiciones que permitan la hibridación específica de un par de cebadores, p. ej., un primer cebador que hibrida con la secuencia polimórfica del extremo derecho de mec (secuencia MREP) y un segundo cebador que hibrida con la secuencia cromosómica de S. aureus adyacente al extremo derecho de SCCmec, es decir, orfX para generar un amplicón a través de la unión de SCCmec - cromosoma.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se pone en contacto, p. ej., simultáneamente (como en PCR multiplex), o secuencialmente al contacto con el oligonucleótido o los oligonucleótidos específicos de MREJ de tipo xxi, bajo las mismas condiciones de amplificación normalizadas, con cebadores adicionales que permiten la amplificación específica de una o más secuencias de tipos de MREJ adicionales, p. ej., una o más de las secuencias de MREJ de tipo i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix o xx. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se pone en contacto, p. ej., simultáneamente (PCR multiplex), o secuencialmente al contacto con el oligonucleótidos o los oligonucleótidos específicos de MREJ de tipo xxi, en las mismas condiciones de amplificación normalizadas, con cebadores adicionales que permitan la amplificación específica de secuencias de mecA y/o mecC. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se pone en contacto, p. ej., simultáneamente (PCR multiplex), o secuencialmente al contacto con el oligonucleótido o los oligonucleótidos específicos de MREJ de tipo xxi, en las mismas condiciones de amplificación normalizadas, con cebadores adicionales que permiten la amplificación específica de una o más secuencias que son únicas para S. aureus (secuencias específicas de S. aureus), tales como nuc, femB, Sa442, y similares. En consecuencia, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se pone en contacto con cebadores específicos para las secuencias de MREP de tipo xxi, i, ii, iii, iv, v, vii, ix, xiii, xiv y xxi, así como secuencias de mecA, mecC y nuc.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos incluyen la identificación de un tipo específico de secuencia (p. ej., una secuencia de MREJ de tipo xxi). Por ejemplo, en las realizaciones descritas en el presente documento que implican la amplificación específica de solo secuencias de MREJ de tipo xxi en la muestra, la presencia o ausencia de un amplicón son indicativas de la presencia o ausencia de secuencias de MREJ de tipo xxi en la muestra. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos implican la amplificación específica de secuencias adicionales, p. ej., secuencias de MREJ, secuencias de mec, secuencias específicas de S. aureus, y similares, en PCR multiplex con la amplificación específica de secuencias de MREJ de tipo xxi. En las realizaciones descritas en el presente documento que implican amplificación multiplex, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos pueden incluir la identificación o detección de secuencias específicas, p. ej., mediante el uso de sondas específicas de secuencia que hibridan con un solo amplicón. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos no discriminan entre algunos o todos los diferentes amplicones posibles presentes en la muestra después de la amplificación. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, se puede utilizar una sonda específica de secuencia que hibrida con orfX para detectar la presencia de amplicones de uno o más tipos de MREJ. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos incluyen la detección de un producto de amplificación, sin la detección específica de una secuencia particular.

En la técnica se conocen varios métodos para la amplificación específica de ácidos nucleicos diana, y son útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de métodos de amplificación incluyen la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR; véase Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354., incorporada al presente documento como referencia), Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR; véase Wu et al., 1989, Genomics 4:560-569.; Barringer et al., 1990, Gene 89:117-122.; Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193, todas las cuales se incorporan al presente documento como referencia), Amplificación Mediada por Transcripción (TMA; véase Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, incorporada al presente documento como referencia), Replicación de Secuencia Autosostenida (3SR; véase Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, incorporada al presente documento como referencia), Amplificación de Círculo Rodante (RCA), Amplificación Basada en la Secuencia de Ácidos Nucleicos (NASBA), sistema Q p replicasa (Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202, incorporada al presente documento como referencia) y Amplificación de Desplazamiento de Hebra (SDA; véase Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; Walker et al., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1691-1696; y documento EP 0497272, todos los cuales se incorporan al presente documento como referencia)) incluyendo SDA termófila (tSDA).

En varias realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento son útiles para detectar la presencia de ácidos nucleicos o secuencias de SCCmec de MREJ de tipo xxi en muestras clínicas. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento son útiles para detectar e identificar S. aureus que tienen muestras de regiones MREJ de tipo xxi que tienen una concentración de bacterias que está dentro de los intervalos fisiológicos (es decir, la concentración de bacterias en una muestra recogida de un sujeto infectado con la bacteria). Por tanto, una muestra se puede escrutar directamente sin la necesidad de aislar, concentrar o expandir (p. ej., cultivar) la población bacteriana para detectar la presencia de SARM que tiene ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi. En varias realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento son capaces de detectar la presencia de un SARM que tiene ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi a partir de una muestra que tiene una concentración de bacterias de aproximadamente 1 UFC/ml, 10 UFC/ml, 100 UFC/ml, 1 x 103 UFC/ml, 1 x 103 UFC/ml, aproximadamente 1 x 104 UFC/ml, aproximadamente 1 x 105 UFC/ml, o aproximadamente 1x 106 UFC/ml, o cualquier número intermedio.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos descritos en el presente documento incluyen la realización de PCR o qPCR para generar un amplicón. Se conocen en la técnica numerosos protocolos de PCR y qPCR diferentes y se ilustran en el presente documento a continuación y se pueden aplicar directamente o adaptar para su uso utilizando las composiciones descritas actualmente para la detección y/o identificación de SARM que tienen ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en una muestra.

Generalmente, en la PCR, una secuencia de polinucleótidos diana se amplifica mediante reacción con al menos un cebador oligonucleotídico o un par de cebadores oligonucleotídicos. El cebador o cebadores hibridan específicamente con una región complementaria del ácido nucleico diana y una ADN polimerasa extiende el cebador o cebadores para amplificar la secuencia diana. En condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácido nucleico basados en polimerasa, un fragmento de ácido nucleico de un tamaño domina los productos de reacción (la secuencia de polinucleótidos diana que es el producto de amplificación). El ciclo de amplificación se repite para aumentar la concentración de la secuencia polinucleotídica diana única. La reacción se puede realizar en cualquier termociclador comúnmente utilizado para PCR. Sin embargo, se prefieren los cicladores con capacidades de medición de fluorescencia en tiempo real, p. ej., SMARTCYCLER® (Cepheid, Sunnyvale, CA), ABI PRISM 7700® (Applied Biosystems, Foster City, CA), r Ot OR-GENE™; (Corbett Research, Sydney, Australia), LIGHTCYCLER® (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN), ICYCLER® (Biorad Laboratories, Hercules, c A) y MX4000® (Stratagene, La Jolla, CA)

Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan métodos que incluyen PCR cuantitativa (qPCR) (también denominada PCR en tiempo real). La qPCR puede proporcionar mediciones cuantitativas y también proporcionar los beneficios de reducir el tiempo y la contaminación. Como se emplea en el presente documento, "PCR cuantitativa" (o "qPCR en tiempo real") se refiere a la monitorización directa del progreso de una amplificación por PCR a medida que se produce sin la necesidad de muestreos repetidos de los productos de reacción. En la qPCR, los productos de reacción se pueden controlar mediante un mecanismo de señalización (p. ej., fluorescencia) a medida que se generan y se rastrean después de que la señal se eleva por encima de un nivel de fondo, pero antes de que la reacción alcance una meseta. El número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel de fluorescencia detectable o "umbral" (en el presente documento denominado umbral de ciclo o "CT") varía directamente con la concentración de dianas amplificables al comienzo del procedimiento de PCR, lo que permite una medida de la intensidad de la señal para proporcionar una medida de la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra en tiempo real.

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para establecer la PCR y la qPCR. La mezcla de reacción comprende mínimamente ácido nucleico molde (p. ej., como está presente en las muestras de prueba, excepto en el caso de un control negativo como se describe a continuación) y cebadores y/o sondas oligonucleotídicos combinados con tampones, sales y similares adecuados, y una concentración apropiada de una polimerasa de ácido nucleico. Como se emplea en el presente documento, "polimerasa de ácido nucleico" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización de nucleósidos trifosfato. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador reasociado con la secuencia diana y proseguirá en la dirección 5' a lo largo del molde hasta que termine la síntesis. Una concentración apropiada incluye una que cataliza esta reacción en los métodos descritos actualmente. Las ADN polimerasas conocidas útiles en los métodos divulgados en el presente documento incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa de T7, ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerasa de Thermococcus litoralis, ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) y ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu), ADN polimerasa de Taq FASTSTART™, ADN polimerasa APTATAQ™ (Roche), ADN polimerasa KLENTa Q 1™ (AB peptides Inc.), ADN polimerasa HOTGOLDSTAR™ (Eurogentec), ADN polimerasa KAPATAQ™ HotStart, ADN polimerasa KAPA2G™ Fast HotStart (Kapa Biosystemss), Ad N polimerasa PHUSION™ Hot Start (Finnzymes) o similares.

Además de los componentes anteriores, la mezcla de reacción de los presentes métodos incluye cebadores, sondas y desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP).

Normalmente, la mezcla de reacción comprenderá adicionalmente cuatro tipos diferentes de dNTP correspondientes a las cuatro bases de nucleósidos de origen natural, es decir, dATP, dTTP, dCTP y dGTP. En los métodos de la invención, cada dNTP estará presente típicamente en una cantidad que varía de aproximadamente 10 a 5000 gM, normalmente de aproximadamente 20 a 1000 gM, de aproximadamente 100 a 800 gM o de aproximadamente 300 a 600 gM.

La mezcla de reacción puede incluir adicionalmente un medio de tampón acuoso que incluye una fuente de iones monovalentes, una fuente de cationes divalentes y un agente tamponador. Se puede emplear cualquier fuente conveniente de iones monovalentes, tal como cloruro de potasio, acetato de potasio, acetato de amonio, glutamato de potasio, cloruro de amonio, sulfato de amonio y similares. El catión divalente puede ser magnesio, manganeso, zinc y similares, donde el catión será típicamente magnesio. Se puede emplear cualquier fuente conveniente de catión de magnesio, incluyendo cloruro de magnesio, acetato de magnesio y similares. La cantidad de magnesio presente en el tampón puede oscilar entre 0,5 y 10 mM, y puede oscilar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 mM, o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5 mM. Los agentes tamponadores representativos o las sales que pueden estar presentes en el tampón incluyen Tris, Tricina, HEPES, MOPS y similares, donde la cantidad de agente tamponador típicamente variará de aproximadamente 5 a 150 mM, normalmente de aproximadamente 10 a 100 mM, y más usualmente de aproximadamente 20 a 50 mM, donde en ciertas realizaciones preferidas descritas en el presente documento, el agente tamponador estará presente en una cantidad suficiente para proporcionar un pH que varía de aproximadamente 6,0 a 9,5, por ejemplo, aproximadamente pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 o 9,5. Otros agentes que pueden estar presentes en el medio de tampón incluyen agentes quelantes, tales como EDTA, EGTA y similares. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la mezcla de reacción puede incluir BSA o similar. Además, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, las reacciones pueden incluir un crioprotector, tal como trehalosa, particularmente cuando los reactivos se proporcionan como una mezcla maestra, que se puede almacenar a lo largo del tiempo.

Al preparar una mezcla de reacción, los diversos componentes constitutivos se pueden combinar en cualquier orden conveniente. Por ejemplo, el tampón se puede combinar con cebador, polimerasa y luego ácido nucleico molde, o todos los diversos componentes constitutivos se pueden combinar al mismo tiempo para producir la mezcla de reacción.

Alternativamente, se pueden utilizar los reactivos premezclados disponibles comercialmente en los métodos divulgados en el presente documento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o se pueden modificar para mejorar las condiciones de reacción (p. ej., modificación de la concentración de tampón, concentración de cationes o concentración de dNTP, según sea necesario), incluyendo, por ejemplo, TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), o Mn IMIX® o SMARTMIX® (Cepheid), IQTM; Supermix (BioRad Laboratories), LIGHTCYCLER® FastStart (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) o BRIlL iANT® QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA).

La mezcla de reacción se puede someter a condiciones de reacción de extensión del cebador ("condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácido nucleico basados en polimerasa"), es decir, condiciones que permitan la extensión del cebador mediada por polimerasa mediante la adición de nucleótidos al extremo de la molécula del cebador utilizando la hebra molde como molde. En muchas realizaciones descritas en el presente documento, las condiciones de reacción de extensión del cebador son condiciones de amplificación, cuyas condiciones incluyen una pluralidad de ciclos de reacción, donde cada ciclo de reacción comprende: (1) una etapa de desnaturalización, (2) una etapa de reasociación y (3) una etapa de polimerización. Como se comenta a continuación, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, el protocolo de amplificación no incluye un tiempo específico dedicado a la reasociaicón y, en su lugar, comprende solo tiempos específicos dedicados a la desnaturalización y la extensión. El número de ciclos de reacción variará dependiendo de la aplicación que se deba realizar, pero usualmente será de al menos 15, más usualmente de al menos 20, y puede ser tan alto como 60 o más, donde el número de ciclos diferentes normalmente variará de aproximadamente 20 a 40. Para métodos en los que se realizan más de aproximadamente 25, normalmente más de aproximadamente 30 ciclos, puede ser conveniente o deseable introducir polimerasa adicional en la mezcla de reacción de manera que se mantengan las condiciones adecuadas para la extensión del cebador enzimático.

La etapa de desnaturalización comprende calentar la mezcla de reacción a una temperatura elevada y mantener la mezcla a temperatura elevada durante un período de tiempo suficiente para que se disocie cualquier ácido nucleico de doble hebra o hibridado presente en la mezcla de reacción. Para la desnaturalización, la temperatura de la mezcla de reacción generalmente se elevará y se mantendrá a una temperatura que varía de aproximadamente 85 a 100°C, usualmente de aproximadamente 90 a 98°C, y más usualmente de aproximadamente 93 a 96°C, durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 3 a 120 segundos, usualmente de aproximadamente 3 segundos.

Después de la desnaturalización, la mezcla de reacción se puede someter a condiciones suficientes para la reasociación del cebador con el ácido nucleico molde presente en la mezcla (si estuviera presente) y para la polimerización de nucleótidos en los extremos del cebador de manera que el cebador se extienda en la dirección 5' a 3' utilizando el ácido nucleico con el que hibrida como molde, es decir, condiciones suficientes para la producción enzimática del producto de extensión del cebador. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los procedimientos de reasociación y extensión se producen en la misma etapa. La temperatura a la que se baja la mezcla de reacción para lograr estas condiciones se elegirá usualmente para proporcionar una eficiencia y especificidad óptimas, y generalmente variará de aproximadamente 50 a 85°C, usualmente de aproximadamente 55 a 70°C, y más usualmente de aproximadamente 60 a 68°C. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las condiciones de reasociación se pueden mantener durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 15 segundos a 30 minutos, usualmente de aproximadamente 20 segundos a 5 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a 1 minuto, o aproximadamente 30 segundos.

Esta etapa puede comprender opcionalmente una de cada una de una etapa de reasociación y una etapa de extensión con variación y optimización de la temperatura y la duración de cada etapa. En una reasociación y una extensión de dos etapas, se permite que la etapa de reasociación prosiga como antes. Después de la hibridación del cebador con el ácido nucleico molde, la mezcla de reacción se someterá adicionalmente a condiciones suficientes para proporcionar la polimerización de nucleótidos a los extremos del cebador como anteriormente. Para lograr las condiciones de polimerización, la temperatura de la mezcla de reacción se elevará típicamente o se mantendrá a una temperatura que varía de aproximadamente 65 a 75°C, usualmente de aproximadamente 67 a 73°C y se mantendrá durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 15 segundos a 20 min, usualmente de aproximadamente 30 s a 5 min. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento no incluyen una etapa separada de reasociación y extensión. Más bien, los métodos incluyen etapas de desnaturalización y extensión, sin ninguna etapa dedicada específicamente a la reasociación.

Los ciclos anteriores de desnaturalización, reasociación y extensión se pueden realizar utilizando un dispositivo automatizado, normalmente conocido como termociclador. Los termocicladores que se pueden emplear se describen en otra parte del presente documento, así como en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.612.473; 5.602.756; 5.538.871; y 5.475.610.

Los métodos descritos en el presente documento también se pueden utilizar en aplicaciones no basadas en PCR para detectar una secuencia de ácido nucleico diana, donde tal diana se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Los métodos para inmovilizar una secuencia de ácido nucleico sobre un soporte sólido se conocen en la técnica y son descritos por Ausubel et al, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing y Wiley-Interscience, NY), y en protocolos proporcionados por los fabricantes, p. ej., para membranas: Pall Corporation, Schleicher & Schuell; para cuentas magnéticas: Dynal; para placas de cultivo: Costar, Nalgenunc; para plataformas de matriz de cuentas: Luminex y Becton Dickinson; y, para otros soportes útiles de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento, CPG, Inc.

Las variaciones en las cantidades exactas de los diversos reactivos y en las condiciones para la PCR u otro procedimiento de amplificación adecuado (p. ej., condiciones de tampón, tiempos de ciclación, etc.) que conducen a resultados similares de amplificación o detección/cuantificación son conocidas por los expertos en la técnica y se consideran equivalentes. En una realización descrita en el presente documento, la detección de qPCR objeto tiene una sensibilidad para detectar menos de 50 copias (preferiblemente menos de 25 copias, más preferiblemente menos de 15 copias, aún más preferiblemente menos de 10 copias, p. ej. 5, 4, 3, 2, o 1 copia) del ácido nucleico diana (es decir, ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi) en una muestra.

Controles

Los ensayos divulgados en el presente documento pueden incluir opcionalmente controles. Las reacciones de PCR o qPCR divulgadas en el presente documento pueden contener varios controles. Tales controles pueden incluir un control negativo "sin molde", en el que los cebadores, el tampón, la enzima o enzimas y otros reactivos necesarios (p. ej., MgCl2, nucleótidos y similares) se ciclan en ausencia de muestra de prueba añadida. Esto asegura que los reactivos no estén contaminados con polinucleótidos que sean reactivos con los cebadores y que produzcan productos de amplificación falsos. Además de los controles "sin molde", los controles negativos también pueden incluir reacciones de amplificación con ácido nucleico diana no específico incluido en la reacción, o pueden ser muestras preparadas utilizando cualquiera o todas las etapas de la preparación de la muestra (desde la extracción de ácido nucleico hasta la preparación de la amplificación) sin la adición de una muestra de prueba (p. ej., cada etapa no utiliza ninguna muestra de prueba o una muestra que se sabe que está libre de microorganismos resistentes a carbapenemo).

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos divulgados en el presente documento pueden incluir un control positivo, p. ej., para asegurar que los métodos y reactivos funcionan como se esperaba. El control positivo puede incluir una diana conocida que no está relacionada con los ácidos nucleicos diana de MREJ de tipo xxi divulgados en el presente documento. Antes de la amplificación, el ácido nucleico de control positivo (p. ej., en forma de un plásmido que está linealizado o no linealizado) se puede añadir a la reacción de amplificación. Una sola reacción puede contener un molde de control positivo, un control negativo o un molde de muestra, o una sola reacción puede contener tanto un molde de muestra como un control positivo. Preferiblemente, el control positivo comprenderá secuencias que son sustancialmente complementarias a los cebadores de amplificación directo e inverso de MREJ de tipo xxi derivados de las secuencias de MREJ de tipo xxi divulgadas en el presente documento, de modo que un par de cebadores de amplificación utilizado para amplificar las secuencias de MREJ de tipo xxi también amplificará los ácidos nucleicos de control en las mismas condiciones de ensayo. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el amplicón generado a partir de los ácidos nucleicos del molde de control positivo es más grande que el amplicón diana. Preferiblemente, aparte de las secuencias en un ácido nucleico de control positivo que son complementarias o sustancialmente complementarias a los cebadores directo e inverso, el ácido nucleico de control positivo no compartirá una similitud sustancial con las secuencias de amplicón diana/MREJ de tipo xxi divulgadas en el presente documento. En otras palabras, fuera de los cebadores directo e inverso, el amplicón de control positivo es preferiblemente menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, e incluso más preferiblemente, menos de 10% idéntico al polinucleótido de control positivo, p. ej., cuando la identidad de secuencia se compara utilizando herramientas NCBI BLAST ALIGN.

Se pueden utilizar controles positivos y/o negativos para establecer los parámetros dentro de los cuales se clasificará una muestra de prueba por tener o no tener un SARM que tenga secuencias de MREJ de tipo xxi. Por ejemplo, en una reacción de qPCR, el umbral del ciclo en el que se detecta un amplicón en una muestra de control positivo se puede utilizar para establecer el umbral para clasificar una muestra como "positiva" y el umbral del ciclo en el que se detecta un amplicón en una muestra de control negativo se puede utilizar para establecer el umbral para clasificar una muestra como "negativa". Se puede utilizar el CT de una sola reacción para cada control, o se puede utilizar la mediana o la media de las muestras replicadas. En otra realización más descrita en el presente documento, se pueden utilizar valores de control históricos. El nivel mínimo de detección para cada uno de los controles negativos y positivos se establece típicamente en el extremo inferior del intervalo de confianza de 95% del CT medio en múltiples reacciones. Este valor se puede ajustar según los requisitos del ensayo de diagnóstico.

Preferiblemente, los controles de PCR deben realizarse al mismo tiempo que la muestra de prueba, utilizando los mismos reactivos, en la misma reacción de amplificación.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan la determinación de la identidad y/o la cantidad de productos de amplificación diana, durante la reacción de amplificación, p. ej., en tiempo real. Por ejemplo, algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a la toma de mediciones, por ejemplo, de la sonda que está unida específicamente a los ácidos nucleicos de amplicones diana y/o amplicones de control positivo (p. ej., como lo indica la fluorescencia). En algunas realizaciones descritas en el presente documento, en lugar de utilizar sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia, los métodos pueden utilizar sondas no específicas de secuencia, que se unen de forma no específica al ácido nucleico de doble hebra, p. ej., agentes intercalantes o similares. Los agentes intercalantes tienen una fluorescencia relativamente baja cuando no están unidos y una fluorescencia relativamente alta cuando se unen a ácidos nucleicos de doble hebra. Como tales, se pueden utilizar agentes intercalantes para controlar la acumulación de ácidos nucleicos de doble hebra durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Los ejemplos de colorantes no específicos incluyen agentes intercalantes tales como SYBR Green I™ (Molecular Probes), yoduro de propidio, bromuro de etidio, verde LC, SYTO9, colorante fluorescente EVAGREEN®, CHROMOFY®, BEBO y similares, que emiten fluorescencia y producen una señal detectable en presencia de ácidos nucleicos de doble hebra. Las mediciones se pueden tomar en un punto específico durante cada ciclo de una reacción de amplificación, p. ej., después de cada etapa de extensión (antes de cada etapa de desnaturalización). Independientemente de si se utiliza una sonda oligonucleotídica específica de secuencia o una sonda oligonucleotídica no específica de secuencia, las mediciones de la cantidad de sonda que está unida específicamente a los ácidos nucleicos del amplicón diana y/o los amplicones de control positivo pueden tomarse continuamente a lo largo de cada ciclo.

Alternativamente, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, la identidad/cantidad de los amplicones (p. ej., diana y/o control positivo) se pueden confirmas después de que se complete la reacción de amplificación, utilizando técnicas moleculares convencionales que incluyen (por ejemplo) transferencia Southern, transferencia puntual y similares.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar situaciones y entornos particulares en los que se puede aplicar esta tecnología.

Ejemplo 1: Detección e identificación de SARM con MREJ de tipo xxi de muestras clínicas

Se lleva a cabo una reacción de qPCR para detectar e identificar SARM que tiene ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi. Las muestras clínicas se recolectan de pacientes utilizando hisopos líquidos Amies (Copan Diagnostics, Inc).

El ADN se aísla opcionalmente de las muestras clínicas utilizando el kit de lisis BD GeneOhm™ (Becton Dickinson) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una muestra del ADN aislado se pone en contacto con cebadores que hibridan específicamente en condiciones de amplificación normalizadas con secuencias de orfX específicas de la especie S. aureus y con secuencias polimórficas del extremo derecho de MREJ de tipo xxi, es decir, 0,2-0,7 pM de cada una de SEQ ID NO: 2 y 3. dNTP 0,3 pM (Roche), MgCl24 mM (SIGMA), 2,8 unidades de polimerasa de Taq FASTSTART® (Roche), Tris 100 mM, pH 8,3 (Em D), KCl 10 mM (LaboratoireMat), (NH4)2SO45 mM (SIGMA), 0,15 mg/ml de BSA (SIGMA), trehalosa al 4% (SIGMA). La reacción también incluye sondas de baliza molecular que hibridan específicamente con productos de amplificación de la unión en el extremo derecho de MREJ de tipo xxi detectables, y que incluyen radicales detectables detectables en el aparato BD MAX™ (Becton Dickinson), SMARTCYCLER® (Cepheid) u otro aparato configurado para PCR en tiempo real en canales FAM, Rojo Texas y Tet añadidos a la mezcla de reacción.

La PCR se lleva a cabo en un BD MAX™ (Becton Dickinson) o SMARTCYCLER® (Cepheid) utilizando los mismos parámetros de ciclación de la siguiente manera:

El umbral de ciclo (CT) en los canales FAM, Rojo Texas y TET se determina mediante el soporte lógico BD MAX™ o SMARTCYCLER®.

Ejemplo 2: Detección múltiple de SARM con MREJ de tipo i-xxi a partir de muestras clínicas

Se realiza una reacción de amplificación múltiple para detectar la presencia de SARM que tiene cualquiera de los tipos i-vii, ix, xiii, xiv y xxi de MREJ. Las muestras clínicas se recolectan de pacientes utilizando hisopos líquidos Amies (Copan Diagnostics, Inc).

El ADN se aísla opcionalmente de las muestras clínicas utilizando el kit de lisis BD GeneOhm™ (Becton Dickinson) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una muestra del ADN aislado se pone en contacto con cebadores que hibridan específicamente en condiciones de amplificación normalizadas con secuencias de orfX específicas de la especie S. aureus y con las secuencias polimórficas del extremo derecho de MREJ de tipo i-vii, ix, xiii, xiv y xxi, es decir, 0,2-0,7 pM de cada una de SEQ ID NO: 2, 3, 39, 77 y 81, dNTP 0,3 pM (Roche), MgCl24 mM (SIg Ma ), 2,8 unidades de polimerasa de Taq FASTSTART® (Roche), Tris 100 mM, pH 8,3 (Em D), KCl 10 mM (LaboratoireMat), (NH4)2SO45 mM (SIGMA), 0,15 mg/ml de BSA (SIGMA), trehalosa al 4% (SIg Ma ). La reacción también incluye sondas de baliza molecular que hibridan específicamente con productos de amplificación de la unión en el extremo derecho de MREJ de tipo xxi detectables, y que incluyen radicales detectables detectables en el aparato BD MAX™ (Becton Dickinson), SMARTCYCLER® (Cepheid) u otro aparato configurado para PCR en tiempo real en canales FAM, Rojo Texas y Tet añadidos a la mezcla de reacción, es decir, SEQ ID NO: 4.

La PCR se lleva a cabo en un BD MAX™ (Becton Dickinson) o SMARTCYCLER® (Cepheid) utilizando los mismos parámetros de ciclación de la siguiente manera:

El umbral de ciclo (CT) en los canales FAM, Rojo Texas y TET se determina utilizando el soporte lógico BD MAX™ o SMARTCYCLER®. La TC se utiliza para determinar si está presente SARM de cualquiera de los tipos i-vii, xvi, ix, xiii, xiv y xxi de MREJ.

Ejemplo 3: Las secuencias de MREJ de tipo xxi están asociadas con el homólogo de mecA, mecC

La amplificación por PCR de la región de MREJ de tipo xxi y del gen mecC se realizó en 51 productos aislados de SARM aislados de anfitriones bovinos o humanos.

En la siguiente tabla se proporciona una lista de los productos aislados:

El ADN se aisló de las muestras clínicas anteriores que se sabe que albergan mecC utilizando el kit de lisis BD GeneOhm™ (Becton Dickinson) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR se prepararon

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Los ácidos nucleicos de la secuencia mostrada en la Figura 1 o el complemento de dicha secuencia.

2. Un oligonucleótido que comprende los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, o su complemento, que hibrida específicamente con la secuencia de la Reivindicación 1.

3. Una composición para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, comprendiendo dicho S. aureus un elemento mec del casete cromosómico Estafilocócico (SCCmec) que incluye un homólogo de mecA mecALGA251), estando insertado dicho casete SCCmecen el ADN cromosómico de S. aureus, generando así una secuencia polimórfica de unión en el extremo derecho (MREJ) de tipo xxi que comprende secuencias polimórficas del extremo derecho y ADN cromosómico contiguo al extremo derecho polimórfico, comprendiendo dicha composición:

un primer cebador de amplificación, dicho primer cebador de amplificación entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho primer cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con las secuencias polimórficas del extremo derecho de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi de la secuencia de la Reivindicación 1 y es completamente complementario a las secuencias polimórficas del extremo derecho de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi de la secuencia de la Reivindicación 1, y

un segundo cebador de amplificación, dicho segundo cebador de amplificación entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho segundo cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con secuencias cromosómicas de S. aureus ubicadas a 1 kilobase del punto de inserción del elemento SCCmec en el ADN cromosómico, y en donde dichos primer y segundo cebadores de amplificación juntos generan un amplicón de la unión en el extremo derecho de ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en las condiciones de PCR convencionales en presencia de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, en donde dicho amplicón comprende una secuencia específica de MREJ de tipo xxi.

4. La composición de la Reivindicación 3, que comprende adicionalmente una sonda, en donde dicha sonda hibrida específicamente con el amplicón de los ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi en condiciones de PCR convencionales.

5. La composición de la Reivindicación 3, que comprende adicionalmente un par de cebadores que hibrida específicamente dentro y es capaz de amplificar una secuencia de mecA dentro de al menos uno de SEQ ID NO: 156, 157 o 158, respectivamente.

6. La composición de la Reivindicación 3, que comprende adicionalmente uno o más cebadores de amplificación adicionales, en donde dichos uno o más cebadores de amplificación adicionales tienen entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, y en donde dichos uno o más cebadores de amplificación adicionales hibridan específicamente con una o más secuencias polimórficas del extremo derecho de SCCmec de un SARM con MREJ de tipo i a xx.

7. La composición de la Reivindicación 6, en donde dichas una o más secuencia polimórficas del extremo derecho de SCCmec se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a 29.

8. La composición de la Reivindicación 3, en donde el primer cebador de amplificación es al menos 80% idéntico a SEQ ID NO: 2.

9. La composición de la Reivindicación 8, en donde el segundo cebador de amplificación es al menos 80% idéntico a SEQ ID NO: 3.

10. La composición de la Reivindicación 9, que comprende adicionalmente una sonda, en donde la sonda es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 4 u 82.

11. Un método para la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, comprendiendo dicho S. aureus un elemento mec del casete cromosómico Estafilocócico (SCCmec) que incluye un homólogo de mecA mecALGA251), estando insertado dicho casete SCCmec en el ADN cromosómico de S. aureus, generando así una secuencia polimórfica de unión en el extremo derecho (MREJ) de tipo xxi que comprende secuencias polimórficas del extremo derecho y ADN cromosómico contiguo al extremo derecho polimórfico, comprendiendo dicho método:

poner en contacto una muestra de prueba con un primer cebador de amplificación, dicho primer cebador de amplificación entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho primer cebador de amplificación hibrida específicamente en condiciones de PCR convencionales con las secuencias polimórficas del extremo derecho de la secuencia de MREJ de tipo xxi de la secuencia de la reivindicación 1;

poner en contacto la muestra con un segundo cebador de amplificación de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, en donde dicho segundo cebador de amplificación hibrida en condiciones de PCR convencionales con el gen orfXde S. aureus, y en donde dichos primer y segundo cebadores de amplificación juntos generan un amplicón de los ácidos nucleicos de la unión en el extremo derecho (MREJ) xxi de SCCmec en condiciones de PCR convencionales en presencia de SARM que comprende ácidos nucleicos de MREJ de tipo xxi, en donde dicho amplicón comprende una secuencia específica de MREJ de tipo xxi; y

determinar si se genera un amplicón de ácidos nucleicos específicos de MREJ de tipo xxi después de la etapa de contacto.

12. El método de la Reivindicación 11, en donde dicha etapa de contacto comprende adicionalmente poner en contacto la muestra con uno o más cebadores de amplificación adicionales, en donde dichos uno o más cebadores de amplificación adicionales tienen entre 10 y 45 nucleótidos de longitud, y en donde dichos uno o más cebadores de amplificación adicionales hibridan específicamente con una o más secuencia polimórficas del extremo derecho de SCCmec de un SARM con MREJ de tipo i a xx.

13. El método de la Reivindicación 11, en donde dicha etapa de contacto comprende adicionalmente poner en contacto la muestra con uno o más pares de cebadores de amplificación adicionales, en donde dichos uno o más pares de cebadores de amplificación adicionales hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de, secuencias de nuc en condiciones de PCR convencionales.

14. El método de la Reivindicación 11, en donde dicha etapa de contacto comprende adicionalmente poner en contacto la muestra con uno o más pares de cebadores de amplificación adicionales, en donde dichos uno o más pares de cebadores de amplificación adicionales hibridan específicamente con, y son capaces de generar un amplicón de, secuencias de mecA y/o de mecC en condiciones de PCR convencionales.

15. El método de la reivindicación 11, en donde dicha etapa para determinar si se genera un amplicón de los ácidos nucleicos específicos de MREJ de tipo xxi incluye la identificación de una secuencia específica de MREJ de tipo xxi.