JP2015513907A - ＭＲＥＪタイプＸＸＩのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出および同定するための配列 - Google Patents

ＭＲＥＪタイプＸＸＩのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出および同定するための配列 Download PDF

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Abstract

本発明は、多形ＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＰ）タイプｘｘｉ配列を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株を検出及び同定するための組成物及び方法に関する。【選択図】図１

Description

配列表、表、またはコンピュータープログラムリストへの参照
本願は、電子形式での配列表とともに出願されている。配列表は、サイズが８５．６ＫＢである、２０１３年３月１４日に最後に保存したＧＥＮＯＭ．１１４Ａ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供されている。この情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書に開示の実施形態は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを検出するための分子診断ツールに関する。
コアグラーゼ陽性種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ヒト日和見病原体として十分に実証されている（Ｍｕｒｒａｙら編、１９９９年、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７版、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる院内感染は、罹患率および死亡率の主な原因である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる最も一般的な感染症のいくつかは、皮膚が関与し、これらとしては、様々な部位におけるフルンケルまたはおでき、蜂巣炎、膿痂疹、および術後創傷感染がある。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって生じるより深刻な感染症のいくつかは、菌血症、肺炎、骨髄炎、急性心内膜炎、心筋炎、心膜炎、脳炎、髄膜炎、熱傷様皮膚症候群、および様々な膿瘍である。ブドウ球菌エンテロトキシンによって媒介される食中毒は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに関連した別の重要な症候群である。毒素ショック症候群、市中病（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）も、毒素産生性Ｓ．ａｕｒｅｕｓでの感染症またはコロニー形成に起因すると考えられている。
メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、病院内の主要な臨床的および疫学的問題として１９８０年代に出現した（Ｏｌｉｖｅｉｒａら、（２００２）Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、２：１８０〜９）。ＭＲＳＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を治癒させるのに最も一般に使用される抗生物質である、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、およびモノバクタムを含めたすべてのβ−ラクタムに耐性である。
ＭＲＳＡ感染症は、防御のラストラインとして通常使用される有毒でより高価な抗生物質でのみ治療することができる。ＭＲＳＡは、人を介して患者から患者に容易に伝播し得、世界中の病院が、ＭＲＳＡを制御する問題と直面している。
先ごろまで、株の耐性を知る唯一の方法は、マニュアル抗菌剤感受性試験を実施することであった。抗菌剤感受性試験は、結果が入手可能になるまでの大規模な時間（少なくとも４８時間）、再現性の欠如、プロセスの規格化の欠如、ユーザーエラーを含めた、多くの欠点を抱えている。したがって、ＭＲＳＡの蔓延を低減し、感染患者の診断および治療を改善するためにＭＲＳＡを検出および／または同定するための迅速で単純なスクリーニングまたは診断検査を開発する必要がある。
ＭＲＳＡを素早く高感度で検出するための組成物および方法の必要がある。
本明細書に開示の実施形態は、ｍｅｃＡホモログ遺伝子ｍｅｃＡＬＧＡ２５１を保有するものを含めたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのある特定の株が、ＭＲＳＡ核酸のＳＣＣｍｅｃ領域の右端（ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）に位置した同じ配列、すなわち、多型右端接合部を共有するという発見に部分的に基づく。従来の市販の分子ベースアッセイによってこれまで検出不可能であった、これらのＭＲＳＡ株を検出するのに使用することができる方法および組成物が、本明細書に提供されている。一般に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのさらなる（例えば、同時または逐次の）検出、ならびに／またはＭＲＳＡ株に加えてｍｅｃＡおよび／もしくはｍｅｃＡＬＧＡ２５１のさらなる検出を可能にする組成物および方法も、本明細書に提供されている。
したがって、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を保有するＭＲＳＡを検出するための方法および組成物が、本明細書に提供されている。いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を有するメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するための組成物を提供する。ＭＲＳＡは、ｍｅｃＡホモログ（ｍｅｃＡＬＧＡ２５１またはｍｅｃＣ）を含むブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）エレメントを含むことができ、ＳＣＣｍｅｃカセットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体ＤＮＡ内に挿入されており、それによって多型右端接合部（ＭＲＥＪ）タイプｘｘｉ配列を生じ、この配列は、右端からの多型配列および多型右端に隣接する染色体ＤＮＡを含む。組成物は、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、標準的なＰＣＲ条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする第１増幅プライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、第１増幅プライマーは、前記標準的なＰＣＲ条件下で配列番号１の核酸配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズする。
本明細書に開示の組成物は、標準的なＰＣＲ条件下で、染色体ＤＮＡ内へのＳＣＣｍｅｃエレメントの挿入点から１キロ塩基以内に位置したＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体配列に特異的にハイブリダイズする、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間の第２増幅プライマーをさらに含み得る。好ましくは、第１および第２増幅プライマーは一緒に、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むＭＲＳＡの存在下で、標準的なＰＣＲ条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の右端接合部のアンプリコンを生成する。したがって、いくつかの実施形態では、第２増幅プライマーは、標準的なＰＣＲ条件下でｏｒｆＸに特異的にハイブリダイズする。本明細書に開示の組成物は、標準的なＰＣＲ条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸のアンプリコンに特異的にハイブリダイズするプローブ、例えば、蛍光エミッター部分および蛍光クエンチャー部分を含むオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得る。
本明細書に開示の組成物は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘ ＭＲＳＡに由来する１種または複数の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列、すなわち、配列番号５〜２９からなる群から選択される１種または複数の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に特異的にハイブリダイズする、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間の１種または複数の追加の増幅プライマーを含み得る。
本方法および組成物は、さらなるオリゴヌクレオチド、すなわち、ｍｅｃＡおよび／もしくはｍｅｃＡＬＧＡ２５１／ｍｅｃＣ配列を特異的に増幅するように構成され、かつ／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的配列を特異的に増幅するように構成されているオリゴヌクレオチドもさらに含み得る。
したがって、いくつかの実施形態は、第１増幅プライマーが配列番号２と少なくとも８０％同一である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３と少なくとも８０％同一である第２増幅プライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号４または８２と少なくとも８０％同一であるプローブを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、乾燥形態、例えば、凍結乾燥したものなどで提供される。
ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するため、およびＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を検出するための方法であって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ｍｅｃＡホモログ（ｍｅｃＡＬＧＡ２５１またはｍｅｃＣ）を含むブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）エレメントを含む、方法も本明細書に提供されている。ＳＣＣｍｅｃカセットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体ＤＮＡ内に挿入することができ、それによって多型右端接合部（ＭＲＥＪ）タイプｘｘｉ配列を生じ、この配列は、右端からの多型配列（ＭＲＥＰ配列）および多型右端に隣接する染色体ＤＮＡを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、検査試料を準備するステップと、試料を、標準的なＰＣＲ条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間の第１増幅プライマーと接触させるステップとを含むことができ、接触ステップは、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むＳ．ａｕｒｅｕｓが試料中に存在する場合、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸のｍｅｃ右端接合部のアンプリコンが生成される条件下で実施される。本方法は、接触ステップの後にＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸のアンプリコンが生成されるか否かを判定するステップも含み得る。いくつかの実施形態では、第１増幅プライマーは、前記標準的なＰＣＲ条件下で配列番号１の核酸配列に特異的にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、本方法は、試料を、標準的なＰＣＲ条件下でＳ．ａｕｒｅｕｓのｏｒｆＸ遺伝子にハイブリダイズする、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間の第２増幅プライマーと接触させるステップを含むことができ、前記第１および第２増幅プライマーは一緒に、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の存在下で、標準的なＰＣＲ条件下で、ＭＲＳＡのＳＣＣｍｅｃ右端接合部のＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）領域配列のアンプリコンを生成する。
試料をプローブと接触させるステップをさらに含み、前記プローブは、標準的なＰＣＲ条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸のＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）領域配列のアンプリコンに特異的にハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光エミッター部分および蛍光クエンチャー部分を含む。
いくつかの実施形態では、接触ステップは、試料を、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘ ＭＲＳＡに由来する１種または複数の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に特異的にハイブリダイズする、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間である１種または複数の追加の増幅プライマーと接触させることも含む。いくつかの実施形態では、接触ステップは、試料を、ｍｅｃＡ配列、ｍｅｃＣ配列、および／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的配列のアンプリコンに特異的にハイブリダイズし、これを生成するように構成されている、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間の１種または複数の追加の増幅プライマーと接触させることも含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列の非限定例としては、それだけに限らないが、ｎｕｃ配列、ｒＲＮＡ配列、ｆｅｍＢ配列、Ｓａ４４２配列などがある。しかし、当業者は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに独特である任意の配列を、本明細書に記載の実施形態において使用することができることを容易に理解するであろう。
したがって、本明細書に記載の方法の接触ステップは、核酸増幅反応、例えば、ＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、例えば、多置換増幅（ＭＤＡ）、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、免疫増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、またはローリングサークル増幅などを実施することを含み得る。いくつかの好適な実施形態では、本方法は、マルチプレックスＰＣＲを実施するステップを含む。いくつかの好適な実施形態では、本方法は、リアルタイムＰＣＲを実施するステップを含む。
タイプｘｘｉ ＭＲＥＪ領域の配列を示す図である。本明細書に記載の実施形態に開示の様々なプライマーおよびプローブの位置も示されている。
前述の一般的な記述および以下の詳細な説明はともに、例示的で説明的であるだけであり、本教示の範囲を限定するように意図されていないことが理解されるべきである。本願では、単数形の使用は、別段に特に明言されていない限り、複数形を含む。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、またはこれらの語根の修飾、例えば、それだけに限らないが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含有した（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定的であるように意図されていない。「または」の使用は、別段に明言されていない限り、「および／または」を意味する。用語「および／または」は、前後の用語が、一緒に、または別個に採用され得ることを意味する。限定としてではなく、例示の目的で、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」、または「ＸおよびＹ」を意味し得る。
値の範囲が本明細書に提供されているときはいつでも、その範囲は、別段に特に明言されていない限り、開始値および終了値、ならびにその間の任意の値または値の範囲を含むことを意味する。例えば、「０．２〜０．５」は、０．２、０．３、０．４、０．５；その間の範囲、例えば、０．２〜０．３、０．３〜０．４、０．２〜０．４など；その間の増分、例えば、０．２５、０．３５、０．２２５、０．３３５、０．４９など；０．２６〜０．３９などのその間の増分範囲などを意味する。
本明細書に使用される節の表題は、編成の目的のみであり、記載される主題を限定するものとして決して解釈されるべきでない。それだけに限らないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびインターネットウェブページを含めた、本願で引用されるすべての文献および同様の資料は、このような文献および同様の資料の形式にかかわらず、任意の目的に関してこれらの全体が参照により明白に組み込まれている。組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が、ある用語を、本願におけるその用語の定義と矛盾する様式で定義または使用する場合には、本願が支配する。本教示を、様々な実施形態と併せて記載するが、本教示がこのような実施形態に限定されることは意図されていない。反対に、本教示は、当業者が理解することになる様々な代替案、改変、および均等物を包含する。
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の改善された検出のための組成物および方法、特に、ｍｅｃＡホモログ遺伝子を保有するＳ．ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＣＣ１３０またはｃｃ１３０ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株などを検出する方法が、本明細書に提供されている。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性は、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ−２ａ）、β−ラクタム耐性トランスペプチダーゼをコードするｍｅｃＡ遺伝子の遺伝子産物に起因する。ｍｅｃＡは、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓには存在しないが、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｕｓ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｄｅｌｐｈｉｎｉ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓ．ｍｕｓｃａｅ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．ｃｏａｇｕｌａｎｓなどを含めたブドウ球菌の他の種の中で広く分布している。ｍｅｃＡ遺伝子は、高度に保存されている（Ｕｂｕｋａｔａら、１９９０、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３４：１７０〜１７２）。メチシリン耐性ブドウ球菌では、ｍｅｃＡは、ブドウ球菌の染色体内に挿入されている、ブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）と呼ばれる遺伝子エレメント内に存在する。
ＳＣＣｍｅｃカセットは、長さが２０ｋｂ〜６０ｋｂ超の範囲であり、ｍｅｃＡ遺伝子に加えて、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子および転位因子を含む。ＳＣＣｍｅｃカセットは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの染色体ＤＮＡ内の「ａｔｔＢｓｃｃ」と呼ばれる固定された位置に挿入されており、これは、「ｏｒｆＸ」と呼ばれるオープンリーディングフレームの３’末端に位置している。Ｈｕｌｅｔｓｋｙら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４２（５）：１８７５〜１８８４。ＭＲＳＡ株は、ＳＣＣｍｅｃカセットの機構に基づいて分類されている（「ＳＣＣｍｅｃタイピング」と呼ばれる）。異なるＳＣＣｍｅｃが、これらのリコンビナーゼ遺伝子、ならびにｍｅｃＡのレギュレーターであるｍｅｃＩ遺伝子およびｍｅｃＲ遺伝子の遺伝子構成に従って分類されている。
ＭＲＳＡを検出および同定するための多くの分子アッセイでは、ｍｅｃＡ遺伝子が検出される。しかし、ｍｅｃＡはＣｏＮＳにも見つかるため、メチシリン耐性ＣｏＮＳも陽性と試験することになるので、ｍｅｃＡ単独の検出は、ＭＲＳＡの存在を判定するのに十分でない。この問題に対処するために、ｍｅｃＡに加えてＳ．ａｕｒｅｕｓ特異遺伝子が検出されるアッセイが開発された。Ｓｃｈｕｅｎｃｋら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（２００６）、印刷中、Ｓｈｉｔｔｕら、（２００６）、Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、７月１７日、Ｇｒｉｓｏｌｄら、（２００６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４５：７９〜８９、Ｃｏｓｔａら、（２００５）、Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ、５１：１３〜１７、Ｍｃ Ｄｏｎａｌｄら、（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：６１４７〜６１４９、Ｚｈａｎｇら、（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：５０２６〜５０３３、Ｈａｇｅｎら（２００５）、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９５：７７〜８６、Ｍａｅｓら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：１５１４〜１５１７、Ｓａｉｔｏら、（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３：２４９８〜２５００；Ｕｂｕｋａｔａら、（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：１７２８〜１７３３；Ｍｕｒａｋａｍｉら、（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９：２２４０〜２２４４；Ｈｉｒａｍａｔｓｕら、（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６：４４５〜４５３を参照。さらに、ＬｅｖｉおよびＴｏｗｎｅｒ（２００３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１：３８９０〜３８９２、ならびにＰｏｕｌｓｅｎら（２００３）、Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５１：４１９〜４２１には、ＥＶＩＧＥＮＥ（商標）ＭＲＳＡ検出キットを使用するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌およびＳ．ａｕｒｅｕｓにおけるメチシリン耐性の検出が記載されている。
しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方において広く分布しているので、上述した方法のそれぞれは、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（「ＭＳＳＡ」）およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方を含有する試料と、ＭＲＳＡのみを含有し、またはメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの両方を有する試料とを判別することができない。
この問題に対処するために、Ｈｉｒａｍａｔｓｕらは、ＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右側のヌクレオチド配列に対応するＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体に特異的なプライマーと組み合わせて、ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜ＩＩＩのＤＮＡの右端にハイブリダイズするプライマーを利用する、ＭＲＳＡに特異的なＰＣＲベースアッセイを開発した。（米国特許第６，１５６，５０７号、以下「‘５０７特許」）。より最近、Ｚｈａｎｇら、（２００５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：５０２６〜５０３３は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜Ｖ ＭＲＳＡをサブタイプするためのマルチプレックスアッセイを記載した。他のブドウ球菌種（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）中のＳＣＣｍｅｃ組込み部位を囲繞するヌクレオチド配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに見つかるものと異なり、したがって、ＳＣＣｍｅｃの右端およびＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用するマルチプレックスＰＣＲアッセイは、ＭＲＳＡの検出に特異的であるという利点を有する。
‘５０７特許に記載されたＰＣＲアッセイは、ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの「ＭＲＥＰタイピング」（ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の開発も導いた（Ｉｔｏら、（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：１３２３〜１３３６；Ｈｉｒａｍａｔｓｕら、（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２：１１７〜１２９）。このＭＲＥＰタイピング方法は、３つのＭＲＥＰタイプのヌクレオチド配列は、ＳＣＣｍｅｃの３つのタイプの中の組込み部位に隣接するＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの右端で異なるという事実を利用する。
用語「ＭＲＥＪ」は、ｍｅｃ右端接合部＜＜ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ＞＞を指す。ＭＲＥＪ領域核酸配列は、長さがおよそ１キロ塩基（ｋｂ）であり、ＳＣＣｍｅｃ右端からの配列、およびＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右に細菌染色体ＤＮＡを含む。ＭＲＥＰタイプｉ〜ｉｉｉとして分類された株は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｉｉに対応する。ＭＲＥＪタイプｉｖ〜ｘｘは、Ｈｕｌｅｔｓｋｙら、（２００４）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１８７５〜１８８４；国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４号、米国特許出願第２００８／０２２７０８７号によって以前に特徴付けられた。
最近、Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｖａｒｅｚらは、リボソームＲＮＡ分析によってＳ．ａｕｒｅｕｓであると確認され、慣例的な抗生物質感受性試験を使用してメチシリンに対する耐性を呈した菌株について報告した。Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｖａｒｅｚら、（２０１１）Ｌａｎｃｅｔ、１１：５９５〜６０３。しかし意外にも、これらの株は、ｍｅｃＡの検出、または既知のＭＲＥＪ領域の検出を利用する上述したアッセイを使用して、ＭＲＳＡとして陰性と試験された。アッセイ特異性は、ＭＲＥＪ領域を同定することに限定される。Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｖａｒｅｚらは、これらの株が、既知のｍｅｃＡ遺伝子と限られた相同性、すなわち、アミノ酸レベルで６３％の同一性、およびＤＮＡレベルで７０％の同一性を共有する新規ｍｅｃＡホモログを保有することを実証し、これらのＭＲＳＡを検出するのにｍｅｃＡ遺伝子の検出を利用してアッセイすることができないことを説明した。ｍｅｃＡホモログは、ｍｅｃＡＬＧＡ２５１と呼ばれたが、ｍｅｃＣとしても本明細書で知られる。ＭＲＥＪ増幅を利用するアッセイは、ｍｅｃＡＬＧＡ２５１ＭＲＳＡ株のいずれも検出することができなかったので、ｍｅｃＡＬＧＡ２５１ＭＲＳＡ株は、偽陰性として不正確に同定される。ＭＲＳＡの診断および同定におけるこのエラーは、患者の健康転帰に深刻なインパクトを与え得る。
標準的な抗生物質感受性試験を使用してメチシリン耐性として陽性と試験されたが、それでも慣例的な市販の分子アッセイを使用してＭＲＳＡとして検出されなかったＳ．ａｕｒｅｕｓのいくつかの株をさらに分析した。これらの株を、以下で表１に列挙する。
Figure 2015513907
本明細書に記載されるように、本開示は、ｍｅｃＡホモログ遺伝子、ｍｅｃＡＬＧＡ２５１／ｍｅｃＣを保有する分析したＭＲＳＡ株の大部分は、同じＭＲＥＪ配列を共有するという意外な知見に部分的に基づく。この意外な知見に基づいて、ＭＲＳＡの改善された検出のための組成物および方法が、本明細書に提供されている。本明細書に開示の組成物および方法は、有利には、ｍｅｃＡＬＧＡ２５１ＭＲＳＡ株の信頼できる、迅速な検出および同定を可能にする。
オリゴヌクレオチド
本明細書に開示のいくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーおよび／または配列特異的プローブが提供される。本明細書において、用語「プライマー」および「プローブ」は、それだけに限らないが、オリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、長さが８〜４５ヌクレオチドの間であり得る。例えば、プライマーおよび／またはプローブは、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。プライマーおよび／またはプローブは、例えば、固体支持体に結合したもの、液体、および凍結乾燥したものを含めた、任意の適当な形態で提供され得る。本明細書に開示のプライマーおよびプローブ配列は、５’もしくは３’末端、または両方で追加のヌクレオチドを含有するように修飾することができる。しかし、増幅プライマー（必ずしもプローブではない）の３’末端への追加の塩基は、一般に、鋳型配列と相補的であることを、当業者は理解するであろう。本明細書に開示のプライマーおよびプローブ配列は、５’または３’末端でヌクレオチドを除去するように修飾することもできる。増幅のために機能するために、プライマーまたはプローブは、本明細書に開示される最小限の長さおよびアニーリング温度のものとなることを、当業者は理解するであろう。
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、融解温度（Ｔｍ）未満の温度であるアニーリング温度でこれらの標的に結合することができる。本明細書において、「Ｔｍ」および「融解温度」は、二本鎖ポリヌクレオチド分子の集団の５０％が解離して一本鎖になる温度を指す互換性の用語である。ポリヌクレオチドのＴｍを計算するための式は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔｍは、以下の式、すなわち、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６−５０／Ｌによって計算することができ、式中、Ｌは、ヌクレオチド中のプローブの長さである。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴｍも、１Ｍの塩中のハイブリダイゼーションアッセイから採用され、ＰＣＲプライマーのＴｍを計算するのに一般に使用される式、すなわち、［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］を使用して推定することができる。例えば、Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら、ＰＣＲ、２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）、２４頁を参照。Ｔｍを計算するために構造特性および配列特性を考慮に入れる他のより洗練された計算が当技術分野で存在する。オリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブと結合配列との間の相補性、および塩条件に依存し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で約９０℃未満、例えば、列挙される値の任意の２つの間の範囲を含めた、約８９℃、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９℃、またはそれ未満のＴｍを有する。
以下でさらに詳細に論じるように、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のプライマー、例えば、増幅プライマーは、例えば、順方向プライマーおよび逆方向プライマー（第１増幅プライマーおよび第２増幅プライマー）を含む増幅プライマー対として提供され得る。好ましくは、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、１０℃超異ならない、例えば、１０℃未満、９℃未満、８℃未満、７℃未満、６℃未満、５℃未満、４℃未満、３℃未満、２℃未満、または１℃未満異なるＴｍを有する。
プライマーおよびプローブ配列は、オリゴヌクレオチド配列内にヌクレオチド置換を有する（標的配列と比べて）ことによって修飾されている場合があり、ただし、オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な相補性を含有する。このようにして、少なくとも１、２、３、４つ、または最大約５つのヌクレオチドが置換されていてもよい。本明細書において、用語「相補的な」は、２本のポリヌクレオチド鎖の領域間、または同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域間の配列相補性を指す。ポリヌクレオチドの第１領域は、同じまたは異なるポリヌクレオチドの第２領域と、２つの領域が逆平行様式で配列されるとき、第１領域の少なくとも１つのヌクレオチドが、第２領域の塩基と塩基対合することができる場合、相補的である。したがって、２つの相補的なポリヌクレオチドがヌクレオチド位置毎に塩基対合する必要はない。「完全に相補的な」は、第２ポリヌクレオチドに１００％または「完全に」相補的であり、したがってヌクレオチド位置毎に塩基対を形成する第１ポリヌクレオチドを指す。「部分的に相補的な」は、１００％相補的でなく（例えば、９０％、または８０％、または７０％相補的であり）、１つまたは複数のヌクレオチド位置でミスマッチしたヌクレオチドを含有する第１ポリヌクレオチドも指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な（部分的に相補的を含む）ポリヌクレオチド鎖の対形成を参照して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、ポリヌクレオチド鎖同士間の会合の強度）は、ポリヌクレオチド同士間の相補性の程度や、塩の濃度、形成されるハイブリッドの融解温度、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの存在または非存在）、ハイブリダイジング鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量などの条件によって影響される、関与する条件のストリンジェンシーを含めた、当技術部分野で周知の多くの要因によってインパクトを受ける。いくつかの実施形態、例えば、１つを超えるオリゴヌクレオチドを提供する実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つのオリゴヌクレオチドのＴｍが他のオリゴヌクレオチドのＴｍの２℃以内であるように設計される。核酸のハイブリダイゼーションへの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉ部、２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見つかる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。本明細書でさらに論じるように、用語「特異的なハイブリダイゼーション」または「特異的にハイブリダイズする」は、核酸増幅に一般に使用される条件下で、無関係な配列へではなく、標的配列、例えば、試料中の定量化される配列、陽性対照標的核酸配列などへのポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブなどのハイブリダイゼーションを指す。
いくつかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブは、オリゴヌクレオチド配列の全長にわたって標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。このような配列は、互いに対して「完全に相補的」と呼ぶことができる。オリゴヌクレオチドが本明細書の核酸配列に対して「実質的に相補的」と呼ばれる場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、またはこれらは、ハイブリダイゼーションの際にミスマッチを形成するが、以下に論じるストリンジェントな条件または標準的な核酸増幅条件下でハイブリダイズする能力を保持する場合がある。本明細書において、用語「実質的に相補的」は、２つの核酸、例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域と標的配列との間の相補性を指す。相補性は、完全である必要はなく、２つの核酸間に任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチの数が多すぎてハイブリダイゼーションが最低のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でさえまったく起こり得ない場合、配列は、実質的に相補的な配列でない。２つの配列が本明細書で「実質的に相補的」と呼ばれる場合、それは、配列が選択された反応条件下でハイブリダイズするのに互いに十分に相補的であることを意味する。特異性を実現するのに十分な核酸相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関係は、当技術分野で周知であり、配列同一性、融解温度、およびハイブリダイゼーション条件を参照して以下でさらに記載されている。したがって、実質的に相補的な配列を、本明細書に開示の検出法のいずれにおいても使用することができる。このようなプローブは、例えば、完全に相補的であり得、またはハイブリダイゼーション条件が、例えば、標的配列と非標的配列との間の識別を可能にするのに十分である限り、１つから多くのミスマッチを含有し得る。したがって、実質的に相補的な配列は、参照配列と比較して、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、もしくはそれ未満、または間の任意の数値のパーセント同一性の範囲である配列を指すことができる。例えば、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列と比較して、１、２、３、４、５、またはそれ以上のミスマッチおよび／または縮重塩基を含有することができ、ただし、オリゴヌクレオチドは、例えば、標準的な核酸増幅条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。
したがって、例として、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、以下のうちのいずれかまたは両方を指すことができる：ａ）約４５℃で６×ＳＳＣ、その後の６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の１回または複数の洗浄、およびｂ）１２〜１６時間にわたって、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、その後の洗浄。いくつかの実施形態では、用語「ストリンジェントな条件」は、標準的な核酸増幅（例えば、ＰＣＲ）条件を指すことができる。
いくつかの実施形態では、試料または検体は、以下でさらに詳細に論じる標準的な核酸増幅条件下で、一連の増幅プライマーと接触させられる。臨床微生物学に適用されるＰＣＲ条件などの標準的な核酸増幅条件を含めたＰＣＲ技術の総説については、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ；Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ（２０００）が出版したＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｐ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６７：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ（１９９７）におけるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、および「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９１〜１９９５（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照。「核酸増幅条件」および「ＰＣＲ条件」の非限定例としては、本明細書に引用した参考文献に開示された条件、例えば、７２℃のアニーリング温度で、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；または５９℃のアニーリング温度で、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｍｇのＢＳＡ、４％のトレハロース、または５５℃のアニーリング温度で、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２などがある。
本明細書に記載のプライマーは、それだけに限らないが、適切な配列のクローニングおよび消化、ならびに直接化学合成を含めた、当技術分野で公知の技法を使用して調製することができる。本明細書に記載のもののプライマーを作製するのに使用され得る化学合成法としては、それだけに限らないが、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：９０によって記載されたホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：１０９によって開示されたホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９によって開示されたジエチルホスホラミデート法、および米国特許第４，４５８，０６６号に記載された固体支持体法がある。本明細書に記載の合成オリゴヌクレオチドプライマーを調製するための自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーの使用も、本明細書で企図されている。
したがって、いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を有するＭＲＳＡ株中の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に特異的にハイブリダイズする（例えば、標準的な核酸増幅条件、例えば、標準的なＰＣＲ条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよびプローブ）を含む組成物に関する。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１またはその相補体中に存在する多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に、例えば、配列番号１またはその相補体のヌクレオチド位置１〜１６４内で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。配列番号１内の多型右端配列を含めた、ＭＲＥＪタイプｘｘｉの多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に特異的にハイブリダイズする例示的なオリゴヌクレオチドは、配列番号２またはその相補体で提供される。したがって、配列番号２またはその相補体と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド、および配列番号２またはその相補体と少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の）オリゴヌクレオチドを含めた、配列番号２またはその相補体と比べて１、２、３、４、またはそれ以上のミスマッチまたはユニバーサルヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドが本明細書に提供されている。
いくつかの実施形態では、本組成物および方法は、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ以外のＭＲＥＪ領域内の１種または複数の多型右端配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーまたは配列特異的プローブを含み得る。したがって、いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｉ領域、ＭＲＥＪタイプｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｉｖ領域、ＭＲＥＪタイプｖ領域、ＭＲＥＪタイプｖｉ領域、ＭＲＥＪタイプｖｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｉｘ領域、ＭＲＥＪタイプｘ領域、ＭＲＥＪタイプｘｉ領域、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ領域、ＭＲＥＪタイプｘｖ領域、ＭＲＥＪタイプｘｖｉ領域、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ領域、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ領域、およびＭＲＥＪタイプｘｘ領域から選択される１種または複数のＭＲＥＪ領域内の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする（標準的な核酸増幅条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）オリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーまたは配列特異的プローブを提供する。
いくつかの実施形態では、本組成物および方法は、ｍｅｃＡ配列またはこれらの断片に特異的にハイブリダイズし、それらのアンプリコンを生成することができるオリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態は、配列番号１５６内の配列に特異的にハイブリダイズし、それらのアンプリコンを生成することができるオリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態は、ｍｅｃＣ配列、例えば、配列番号１５７内の配列、またはこれらの断片に特異的にハイブリダイズし、それらのアンプリコンを生成することができるオリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的配列に特異的にハイブリダイズし、それらのアンプリコンを生成することができるオリゴヌクレオチド、例えば、増幅プライマーを含む。例えば、いくつかの実施形態は、ｎｕｃ配列（例えば、配列番号１５８に由来する配列）、ｆｅｍＢ配列（例えば、配列番号１５９に由来する配列）、Ｓａ４４２配列（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅａｕら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６（３）：６１８〜６２３からの）（配列番号１６０）に特異的にハイブリダイズし、それらのアンプリコンを生成することができるオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび配列特異的プローブ）は、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび／または配列特異的プローブ）は、ｍｅｃＡ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび／または配列特異的プローブ）は、ｍｅｃＣ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび／または配列特異的プローブ）は、ｎｕｃ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび／または配列特異的プローブ）は、Ｓａ４４２配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的オリゴヌクレオチド（例えば、増幅プライマーおよび／または配列特異的プローブ）は、ｆｅｍＢ配列に特異的にハイブリダイズする。
本明細書に開示の実施形態に関係した例示的なＭＲＥＪ領域配列としては、例えば、
Figure 2015513907
がある。
ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域内の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする、上記に論じた配列番号２のオリゴヌクレオチドに加えて、本明細書に開示の実施形態において有用な、ＭＲＥＪ領域配列内の１種もしくは複数の多型配列、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体ＤＮＡ配列に特異的であるオリゴヌクレオチドとしては、それだけに限らないが、以下のものがある。
Figure 2015513907
前述のことに加えて、本明細書に開示の組成物および方法は、上記で本明細書に述べたものに加えて、様々なＭＲＳＡ株中のＳＣＣｍｅｃ配列の右端領域を特異的に検出するためのプライマーおよび／またはプローブを含み得ることを、当業者は理解するであろう。例として、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物および方法は、国際特許出願公開第ＷＯ０８／０８０６２０号に記載された配列、例えば、プライマーおよび／またはプローブを、これらのバリアント、およびこれらの相補体を含めて、含む。したがって、本明細書に開示の組成物および方法は、以下に列挙するプライマーおよび／またはプローブを含み得る。
Figure 2015513907
したがって、例示的な実施形態では、ＭＲＥＪ ｘｘｉ、およびＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘからなる群から選択される１種または複数のＭＲＥＪタイプを含むＭＲＳＡを検出するための方法および組成物が提供される。例えば、いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体ＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、およびｘｘｉ ＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡの検出および／または同定を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、およびｘｘｉ ＭＲＥＪ配列を含むＭＲＳＡの検出および／または同定を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉｉ、およびｘｘｉ ＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡの検出を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉｉ、およびｘｘｉ ＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡの同定を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉｉ、およびｘｘｉ ＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡの検出を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉｉ、およびｘｘｉ ＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡの同定を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｉｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、およびｘｘｉ核酸を含むＭＲＳＡの検出を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｉｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、およびｘｘｉ核酸を含むＭＲＳＡの同定を提供する。いくつかの実施形態は、本明細書に開示のＭＲＥＪ特異的オリゴヌクレオチドの組合せを使用する、タイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉｉ、ｘｖｉ、およびｘｘｉ核酸を含むＭＲＳＡの検出および／または同定を提供する。
プローブ
いくつかの実施形態では、配列特異的プローブが提供される。プローブには、それだけに限らないが、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域核酸配列などの標的配列に特異的にハイブリダイズする。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、配列番号１、またはその相補体、またはその部分配列（例えば、配列番号１内の領域のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、配列特異的プローブは、本明細書に開示の順方向プライマーおよび逆方向プライマーの結合部位が隣接したヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、それと完全または実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、配列特異的プローブは、配列番号２または３の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチドを含み、その結果、配列特異的プローブは、本明細書に開示の増幅プライマーの結合部位と重複する。
いくつかの実施形態では、ｏｒｆＸにハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、ｍｅｃＡにハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、ｍｅｃＣにハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、ｎｕｃにハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、ｆｅｍＢにハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、Ｓａ４４２にハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。
増幅プライマーと配列特異的プローブとの同族対を一緒に提供することができることを、当業者は容易に理解するであろう。すなわち、特定の配列に特異的にハイブリダイズし、そのアンプリコンを生成する増幅プライマーが提供される実施形態では、本明細書に開示の実施形態は、アンプリコンにハイブリダイズし、それに特異的である配列特異的プローブも含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｉｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｍｅｃＡ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｍｅｃＣ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｎｕｃ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｆｅｍＢ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｓａ４４２配列に特異的にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、染色体ＤＮＡ内へのＳＣＣｍｅｃエレメントの挿入点から１キロ塩基以内に位置したＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体配列に特異的にハイブリダイズする。例えば、いくつかの実施形態では、核酸増幅の標準条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳ．ａｕｒｅｕｓ ｏｒｆＸ配列に特異的にハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、核酸増幅の標準条件下でｏｒｆＳＡ００２２にハイブリダイズする配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、ＭＲＥＰ配列、例えば、ＭＲＥＰタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、ｘ、ｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、ｘｘ、またはｘｘｉ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１種を超える配列特異的プローブが提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＲＥＰタイプｘｘｉ配列に特異的にハイブリダイズする配列特異的プローブが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはそれ以上の配列特異的プローブと組み合わせて提供される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能部分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、放射性標識を含み得る。放射性標識の非限定例としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、および３５Ｓがある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、それだけに限らないが、リガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および抗体を含めた、１種または複数の非放射性検出可能マーカーまたは部分を含み得る。本発明の方法の感度の増大を可能にすることができる、プローブとともに使用するための他の検出可能マーカーとしては、ビオチンおよび放射性ヌクレオチドがある。特定の標識を選択すると、それがプローブに結合される様式が指示されることは、当業者に明白となるであろう。例えば、鋳型核酸にハイブリダイズすると、蛍光の検出可能な変化が生じるように１種または複数の色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ。非特異的色素がいくつかの用途にとって望ましい場合があるが、配列特異的プローブは、増幅のより正確な測定をもたらし得る。配列特異的プローブの一構成は、フルオロフォアに繋ぎ止められたプローブの一端、およびクエンチャーに繋ぎ止められたプローブの他端を含み得る。プローブがハイブリダイズしていないとき、これは、ステムループ構成を維持することができ、ここでフルオロフォアは、クエンチャーによってクエンチされ、したがってフルオロフォアが蛍光を発するのが妨げられる。プローブが鋳型核酸配列にハイブリダイズしているとき、これは、直線化され、フルオロフォアをクエンチャーから遠ざけ、したがってフルオロフォアが蛍光を発することが可能になる。配列特異的プローブの別の構成は、ＦＲＥＴ対の第１フルオロファアに繋ぎ止められた第１プローブ、およびＦＲＥＴ対の第２フルオロファアに繋ぎ止められた第２プローブを含み得る。第１のプローブおよび第２のプローブは、第１プローブおよび第２プローブが同じアンプリコンにハイブリダイズされているとき、ＦＲＥＴによるエネルギー移動を可能にするのに十分近接した範囲内にあるアンプリコンの配列にハイブリダイズするように配置することができる。
いくつかの実施形態では、配列特異的プローブは、フルオロフォアにコンジュゲートされた本明細書に開示のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、２種以上のフルオロフォアにコンジュゲートされている。フルオロフォアの例としては、キサンテン色素、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２−［（エチルアミノ）−３−（エチルイミノ）−２−７−ジメチル−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸エチルエステルモノヒドロクロリド（Ｒ６Ｇ）（約５００〜５６０ｎｍの範囲の波長で応答放射線（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を発する）、１，１，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニンヨージド（ＨＩＤＣ）（約６００〜６６０ｎｍの範囲の波長で応答放射線を発する）、６−カルボキシフルオレセイン（略語ＦＡＭおよびＦによって一般に公知）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）、およびローダミン１１０など；シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ７色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、Ｃｙ３（約５４０〜５８０ｎｍの範囲の波長で応答放射線を発する）、Ｃｙ５（約６４０〜６８０ｎｍの範囲の波長で応答放射線を発する）などのシアニン色素など；ＢＯＤＩＰＹ色素、ならびにキノリン色素がある。対象とする特定のフルオロフォアとしては、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、ＨＩＤＣ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リッサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５などがある。
いくつかの実施形態では、プローブは、クエンチャーにコンジュゲートされている。クエンチャーは、電磁放射線を吸収し、それを熱として散逸することができ、したがって暗いままである。例示的なクエンチャーとしては、ダブシル、ＮＦＱ、例えば、ＢＨＱ−１またはＢＨＱ−２（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、ＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ ＦＱ（ＩＤＴ）、およびＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ ＲＱ（ＩＤＴ）などがある。いくつかの実施形態では、クエンチャーは、フルオロフォアが発する電磁放射線を吸収するようにフルオロフォアと対を形成するように選択される。本明細書に開示の組成物および方法で有用なフルオロフォア／クエンチャー対は、当技術分野で周知であり、ワールドワイドウェブサイトｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎｓ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｍａｒｒａｓ，ｍｍｂ０６％２８３３５％２９３．ｐｄｆで入手可能なＳ．Ｍａｒｒａｓ、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ａｎｄ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｐａｉｒｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ」に見つけることができ、例えば、記載されている場合がある。
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、プローブの第１末端に付着されており、クエンチャーは、プローブの第２末端に付着されている。付着は、共有結合を含み得、任意選択により、プローブとフルオロフォアまたはクエンチャーとの間に位置した少なくとも１つのリンカー分子を含み得る。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、プローブの５’末端に付着されており、クエンチャーは、プローブの３’末端に付着されている。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、プローブの３’末端に付着されており、クエンチャーは、プローブの５’末端に付着されている。定量的核酸増幅で使用することができるプローブの例としては、分子ビーコン、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）プローブ（Ｓｉｇｍａ）、およびＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などがある。本明細書に開示の実施形態で有用である他の核酸検出技術としては、それだけに限らないが、ナノ粒子プローブ技術（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：１０７８〜１０８１を参照。）、およびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブ技術（米国特許第５，８６６，３６６号；同第６，０９０，５９２号；同第６，１１７，６３５号；および同第６，１１７，９８６号を参照）がある。
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列、またはＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列のアンプリコン、例えば、配列番号１またはその部分配列に特異的にハイブリダイズするプローブを提供する。したがって、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、増幅プライマー配列番号２および３を使用する、配列番号１を含む鋳型の増幅からのアンプリコンにハイブリダイズするプローブを提供する。単なる例として、いくつかの実施形態では、配列番号４の配列、またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなることができるプローブが提供される。いくつかの実施形態では、プローブは、本明細書に記載のフルオロフォアおよび／またはクエンチャーを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号８２の配列、またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなることができるプローブが提供される。いくつかの実施形態では、プローブは、本明細書に記載のフルオロフォアおよび／またはクエンチャーを含む。好適な実施形態では、プローブは、フルオロフォア６−カルボキシフルオレセイン（「ＦＡＭ」）がプローブの５’末端に付着され、クエンチャーＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ Ｂｌａｃｋ−ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）２（ＩＤＴ）（「ＢＨＱ」）がプローブの３’末端に付着された、配列番号４もしくは配列番号８２、またはそのバリアントを含み得る。
キット
キットも、本明細書に提供されている。本明細書に開示のキット、プライマー、およびプローブは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｓｉｔｕ用途の両方において、ＭＲＥＪタイプｘｘｉのＭＲＳＡを検出および／または同定するのに（いくつかの実施形態では、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘの１種または複数のＭＲＳＡをさらに検出および／または同定するのに）使用することができる。例えば、キットは、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘのＭＲＳＡを検出するための任意の以前に記載されたプライマー／プローブと組み合わせて使用することができることが企図されている。本明細書に開示の診断キット、プライマー、およびプローブは、単独で、またはそれだけに限らないが、核酸検出に基づく任意のアッセイ、任意のイムノアッセイ、任意の酵素アッセイ、任意の生化学アッセイ、任意のリソティピック（ｌｙｓｏｔｙｐｉｃ）アッセイ、任意の血清学的アッセイ、任意の鑑別培地、任意の強化培地、任意の選択培地、任意の特異的アッセイ培地、任意の確認培地、任意の計数培地、任意の細胞染色剤、特定の細胞株に対する任意の培養液、および動物に対する任意の感染力アッセイを含めた、微生物を検出および／または同定するのに適した任意の他のアッセイと組み合わせて使用することができることも企図されている。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、標準的な核酸増幅条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列（例えば、配列番号１またはその相補体）の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むことになる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、配列番号２またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなるオリゴヌクレオチド（例えば、第１増幅プライマー）を含むことになる。いくつかの実施形態では、キットは、１種または複数の追加のオリゴヌクレオチド、例えば、第１増幅プライマーと一緒にＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端接合部のアンプリコンを生成する、配列番号３またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなるオリゴヌクレオチドなどの第２増幅プライマーも含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のプローブも含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、配列番号４またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなるオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、標準的な増幅条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドに加えて、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、ｘ、ｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、またはｘｘ内のＳＣＣｍｅｃ多型右端配列（ＭＲＥＰ）の１種または複数に特異的に結合する１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したものは、標準的な増幅条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドに加えて、ｍｅｃＡ配列に特異的に結合する１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、標準的な増幅条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドに加えて、ｍｅｃＣ配列に特異的に結合する１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、標準的な増幅条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドに加えて、ｎｕｃ配列に特異的に結合する１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、標準的な増幅条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドに加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ヌクレオチド配列、例えば、ｆｅｍＢ配列に特異的に結合する１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のキットは、標準的な増幅条件下でＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の多型右端配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドに加えて、Ｓａ４４２配列に特異的に結合する１種または複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実施するための試薬および組成物を含有するキットが提供される。このようなキットは、１種または複数の容器、例えば、チューブまたはバイアルなどを中に厳重に閉じ込めて受け入れるように区切られたキャリアを含むことができる。容器の１つは、本明細書に開示の少なくとも１種の標識されていない、または検出可能な程度に標識されたプライマーまたはプローブを含有し得る。１種または複数のプライマーは、必要に応じて凍結乾燥形態で、または適切な緩衝液中に存在し得る。１種または複数の容器は、例えば、核酸増幅反応で利用される１種または複数の酵素または試薬を含有し得る。これらの酵素は、これら自体で、混合物中に、凍結乾燥形態で、または適切な緩衝液中に存在することができる。本明細書に開示の核酸増幅反応で有用な例示的な酵素としては、それだけに限らないが、ＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰＴＡＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＬＥＮＴＡＱ１（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．）、ＨＯＴＧＯＬＤＳＴＡＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ＫＡＰＡＴＡＱ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）Ｆａｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｓ）、ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）などがある。
さらに、本明細書に開示のキットは、本明細書に開示の方法を実施するのに必要な追加のエレメントのすべて、例えば、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド三リン酸、濾紙、ゲル材料、転写材、オートラジオグラフィー用品などを含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示の方法の間に調製される反応混合物に要求され、またはその中に含むことが好都合な、かつ／もしくは望ましい追加の試薬を含み、この場合、このような試薬は、１種または複数のポリメラーゼ、水性緩衝媒体（調製され、あるいは成分の１種もしくは複数が予め混合されている場合があり、または成分のすべてが分離している場合がある場合、その構成成分中に存在する）などを含む。キットの様々な試薬成分は、別個の容器内に存在する場合があり、または鋳型核酸と組み合わせるための試薬混合物中にすべて予め組み合わされている場合がある。
上記成分に加えて、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示の方法を実行するための指示書も含むことができる。これらの指示書は、様々な形態でキット中に存在することができ、これらの１種または複数がキット中に存在する場合がある。これらの指示書が存在し得る一形態は、適当な媒体または基板に印刷された情報としてのもの、例えば、情報が印刷された１枚または複数枚の紙、キットの包装中のもの、添付文書中のものなどである。さらに別の手段は、情報が記録された、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、ＣＤなどである。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキット中に存在し得る。
方法
試料からＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を有するＭＲＳＡを検出、同定、および／または定量化するための方法が、本明細書に提供されている。いくつかの実施形態では、本方法は、分析される試料を、標準的な核酸増幅条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域を有するＭＲＳＡの存在について試験される試料は、本明細書に開示の方法を実施する前に処理される。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、本明細書に開示の方法を実施する前に、単離し、濃縮し、または様々な他の処理ステップにかけることができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示するように、試料をオリゴヌクレオチドと接触させる前に、試料を処理して試料から核酸を単離することができる。本明細書において、語句「核酸を単離する」は、１種または複数の細胞成分からの核酸の精製を指す。自己から「核酸を単離」するために処理された試料は、核酸以外の成分および不純物を含み得ることを、当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試料を培養することなく、試料に対して実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、試料を本明細書に開示のオリゴヌクレオチドと接触させる前に試料から核酸を単離することなく、試料に対して実施される。
ｉ．非増幅ベース法
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書の他で記載するように、検出可能部分を含み、ＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域の多型右端配列へのオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを、例えば、直接的または間接的手段によって検出することができる。したがって、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （ＭＲＳＡ）を検出および／または同定するためのいくつかの実施形態は、検査試料を準備するステップと、試料を、標準的な核酸増幅条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップとを含み、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、検出可能部分を含み、接触ステップは、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を含むＳ．ａｕｒｅｕｓが試料中に存在する場合、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列のｍｅｃ右端接合部へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施される。ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列（試験される試料中に存在する場合）のｍｅｃ右端接合部に特異的に結合しているプローブの存在および／または量を判定することができ、結合したプローブは、試料中にＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を有するＭＲＳＡの存在を示す。いくつかの実施形態では、結合しているプローブの量は、試料中にＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を有するＭＲＳＡの量を判定するのに使用される。
同様に、いくつかの実施形態では、非増幅ベース法を、追加のヌクレオチド配列を検出するのに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列に加えて、他のＭＲＥＪ配列、例えば、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、ｘ、ｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、もしくはｘｘ、またはこれらの任意の組合せの１種または複数の存在および／または量を検出するための非増幅ベース法の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、ＭＲＥＪ（またはＭＲＥＰ）タイプｘｘｉ配列に加えて、ｍｅｃＡ配列の存在を検出するための非増幅ベース法の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、（ＭＲＥＰ）ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列に加えて、ｍｅｃＣ配列の存在を検出するための非増幅ベース法の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、（ＭＲＥＰ）ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列に加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列、例えば、ｎｕｃ配列、ｆｅｍＢ配列、Ｓａ４４２配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列などの存在を検出するための非増幅ベース法の使用を含み得る。したがって、例示的な実施形態では、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ、ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉｉ、ｍｅｃＡ、ｍｅｃＣ、およびｎｕｃ配列を同時検出するための方法および組成物が提供される。
判定ステップは、接触ステップ後に、それだけに限らないが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含めた、当業者に公知の任意の方法を使用して実現することができる。ハイブリッドデュプレックスの（すなわち、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域由来の多型右端配列に特異的に結合したプローブの）検出は、いくつかの方法によって実施され得る。一般に、ハイブリダイゼーションデュプレックスがハイブリダイズしていない核酸から分離され、次いで、デュプレックスに結合した標識が検出される。このような標識は、当技術分野で標準的に使用される放射性、蛍光、生物学的、または酵素タグもしくは標識を指す。標識は、オリゴヌクレオチドプローブ、または生体試料に由来する核酸にコンジュゲートすることができる。過剰の試料／標的核酸またはオリゴヌクレオチドプローブ（および適用可能な場合、非結合コンジュゲート）を洗い流すのに、洗浄ステップを使用することができることを、当業者は理解するであろう。さらに、標準的なヘテロジニアスアッセイ形式は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ上に存在する標識を使用してハイブリッドを検出するのに適している。
したがって、いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示の方法は、当技術分野で認められている方法を使用する、例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、ディップスティック形式、マルチウェル形式など）を含み得る。
ｉｉ．増幅ベース法
いくつかの実施形態では、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出および／または同定するための方法は、検査試料を準備するステップと、試料を、標準的な核酸増幅条件、および／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域の多型右端配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップとを含み、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間である。
いくつかの実施形態では、試料は、標準的な増幅条件、またはＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を含むＳ．ａｕｒｅｕｓが試料中に存在する場合、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列のｍｅｃ右端多型配列（ＭＲＥＰ配列）へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を可能にする条件下で接触させられる。したがって、本方法は、例えば、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列のｍｅｃ右端接合部を含むアンプリコンまたは増幅産物を生成するための、試料からのＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を特異的に増幅させるステップを含む。いくつかの実施形態では、試料は、ＳＣＣｍｅｃ−染色体接合部にわたるアンプリコンを生成するために、標準的な増幅条件、またはプライマー対、例えば、ｍｅｃ右端多型配列（ＭＲＥＰ配列）にハイブリダイズする第１プライマー、およびＳＣＣｍｅｃ右端に隣接するＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体配列、すなわち、ｏｒｆＸにハイブリダイズする第２プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させられる。いくつかの実施形態は、ＳＣＣｍｅｃ−染色体接合部にわたるアンプリコンを生成するための、標準的な増幅条件、またはプライマー対、例えば、ｍｅｃ右端多型配列（ＭＲＥＰ配列）にハイブリダイズする第１プライマー、およびＳＣＣｍｅｃ右端に隣接するＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体配列、すなわち、ｏｒｆＸにハイブリダイズする第２プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試料を接触させることによって、ＳＣＣｍｅｃ右端接合部配列データを生成する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、試料は、例えば、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ特異的オリゴヌクレオチド（複数可）との接触と同時に（マルチプレックスＰＣＲと同様に）、または逐次的に、１種または複数の追加のＭＲＥＪタイプ配列、例えば、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、ｘ、ｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、またはｘｘ配列の１種または複数の特異的増幅を可能にする追加のプライマーと、同じ標準的な増幅条件下で接触させられる。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ特異的オリゴヌクレオチド（複数可）との接触と同時に（マルチプレックスＰＣＲ）、または逐次的に、ｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ配列の特異的増幅を可能にする追加のプライマーと、同じ標準的な増幅条件下で接触させられる。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ特異的オリゴヌクレオチド（複数可）との接触と同時に（マルチプレックスＰＣＲ）、または逐次的に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに独特である１種または複数の配列（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列）、例えば、ｎｕｃ、ｆｅｍＢ、Ｓａ４４２などの特異的増幅を可能にする追加のプライマーと、同じ標準的な増幅条件下で接触させられる。したがって、いくつかの実施形態では、試料は、ＭＲＥＰタイプｘｘｉ、ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉｉ、ｉｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、およびｘｘｉ配列、ならびにｍｅｃＡ、ｍｅｃＣ、およびｎｕｃ配列に特異的なプライマーと接触させられる。
いくつかの実施形態では、本方法は、配列の特定のタイプ（例えば、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列）の同定を含む。例えば、シンプレックスでＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列のみを特異的に増幅する実施形態では、アンプリコンの存在または非存在は、試料中のＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の存在または非存在を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列の特異的増幅とマルチプレックスで、追加の配列、例えば、ＭＲＥＪ配列、ｍｅｃ配列、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的配列などを特異的に増幅する。マルチプレックス増幅を伴う実施形態では、いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、１種のアンプリコンのみにハイブリダイズする配列特異的プローブを使用することによる、特異的配列の同定または検出を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、増幅後の試料中に存在する異なる可能なアンプリコンの一部またはすべてを判別しない。例えば、いくつかの実施形態では、ｏｒｆＸにハイブリダイズする配列特異的プローブを、１種または複数のＭＲＥＪタイプのアンプリコンの存在を検出するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、特定の配列を特異的に検出することのない増幅産物の検出を含む。
標的核酸を特異的に増幅するためのいくつかの方法が当技術分野で公知であり、本明細書に開示の実施形態で有用である。増幅法の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｉｋｉら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０〜１３５４を参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；すべて参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕら、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０〜５６９；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０、Ｇｅｎｅ、８９：１１７〜１２２；Ｂａｒａｎｙ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８９〜１９３を参照）、転写媒介増幅（ＴＭＡ；参照により本明細書に組み込まれている、Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１１７３〜１１７７を参照）、自立配列複製（３ＳＲ；参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１８７４〜１８７８を参照）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑβレプリカーゼシステム（参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１１９７〜１２０２）、ならびに好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）を含めた鎖置換増幅（ＳＤＡ；すべて参照により本明細書に組み込まれている、Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３９２〜３９６；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２０：１６９１〜１６９６；およびＥＰ０４９７２７２を参照））がある。
様々な実施形態では、本明細書に開示の方法は、臨床試料中のＳＣＣｍｅｃ ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸または配列の存在を検出するのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、生理的範囲内にある細菌の濃度（すなわち、細菌に感染した対象から収集された試料中の細菌の濃度）を有する試料中のタイプｘｘｉ ＭＲＥＪ領域を有するＳ．ａｕｒｅｕｓを検出および同定するのに有用である。したがって、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を有するＭＲＳＡの存在を検出するための細菌集団を単離、濃縮、または拡大（例えば、培養）する必要なく、試料を直接スクリーニングすることができる。様々な実施形態では、本明細書に開示の方法は、約１ＣＦＵ／ｍｌ、１０ＣＦＵ／ｍｌ、１００ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、または約１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、またはその間の任意の数値の細菌濃度を有する試料から、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を有するＭＲＳＡの存在を検出することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、本方法は、アンプリコンを生成するためのＰＣＲまたはｑＰＣＲのパフォーマンスを含む。多数の異なるＰＣＲおよびｑＰＣＲプロトコールが当技術分野で公知であり、以下で本明細書に例示されており、試料中のＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を有するＭＲＳＡを検出および／または同定するために本記載の組成物を使用して使用するのに直接適用し、または適合させることができる。
一般に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、またはオリゴヌクレオチドプライマーの対との反応によって増幅される。プライマー（複数可）が標的核酸の相補性領域に特異的にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマー（複数可）を伸長して標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件下で、一サイズの核酸断片が反応生成物を支配する（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）。単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増大させるために、増幅サイクルが繰り返される。反応は、ＰＣＲに一般に使用される任意のサーモサイクラーで実施することができる。しかし、リアルタイム蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が好適である。
いくつかの実施形態は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる）を含む方法を提供する。ｑＰＣＲは、定量的な測定をもたらすことができ、時間および汚染の低減という利益ももたらすことができる。本明細書において、「定量的ＰＣＲ」（または「リアルタイムｑＰＣＲ」）は、反応生成物のサンプリングの繰り返しを必要とすることなく、ＰＣＲ増幅が行われている際のＰＣＲ増幅の進行の直接監視を指す。ｑＰＣＲでは、反応生成物は、これらが、信号がバックグラウンドレベルを超えて上昇し、しかし反応がプラトーに到達する前に生成および追跡される際に、シグナル伝達機構（例えば、蛍光）を介して監視することができる。蛍光の検出可能または「閾値」レベルを実現するのに要求されるサイクルの数（サイクル閾値または「ＣＴ」と本明細書で呼ぶ）は、ＰＣＲプロセス開始時の増幅可能標的の濃度とともに直接に変化し、シグナル強度の尺度が、リアルタイムで、試料中の標的核酸の量の尺度をもたらすことを可能にする。
ＰＣＲおよびｑＰＣＲを設定するための方法は、当業者に周知である。反応混合物は、鋳型核酸（例えば、以下に記載する陰性対照の場合を除いて、検査試料中に存在する場合）、ならびに適当な緩衝液、塩などと組み合わせたオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブ、ならびに適切な濃度の核酸ポリメラーゼを最小限含む。本明細書において、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。一般に、酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終了するまで鋳型に沿って５’方向に進行する。適切な濃度には、本記載方法においてこの反応を触媒するものが含まれる。本明細書に開示の方法で有用な公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ） ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰＴＡＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＬＥＮＴＡＱ１（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．）、ＨＯＴＧＯＬＤＳＴＡＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ＫＡＰＡＴＡＱ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）Ｆａｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｓ）、ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）などがある。
上記成分に加えて、本方法の反応混合物は、プライマー、プローブ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。
通常、反応混合物は、４種の天然に存在するヌクレオシド塩基に対応する４つの異なるタイプのｄＮＴＰ、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰをさらに含むことになる。本発明の方法では、各ｄＮＴＰは一般に、約１０〜５０００μΜ、通常、約２０〜１０００μΜ、約１００〜８００μΜ、または約３００〜６００μΜの範囲の量で存在することになる。
反応混合物は、一価イオンの供給源、二価陽イオンの供給源、および緩衝剤を含む水性緩衝媒体をさらに含むことができる。一価イオンの任意の好都合な供給源、例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを使用することができる。二価陽イオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛などであり得、この場合、陽イオンは典型的には、マグネシウムとなる。塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどを含めたマグネシウム陽イオンの任意の好都合な供給源を使用することができる。緩衝液中に存在するマグネシウムの量は、０．５〜１０ｍＭの範囲であってもよく、約１〜約６ｍＭ、または約３〜約５ｍＭの範囲であり得る。緩衝液中に存在し得る代表的な緩衝剤または塩としては、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどがあり、この場合、緩衝剤の量は一般に、約５〜１５０ｍＭ、通常、約１０〜１００ｍＭ、より通常には、約２０〜５０ｍＭの範囲となり、この場合、ある特定の好適な実施形態では、緩衝剤は、約６．０〜９．５の範囲のｐＨ、例えば、約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、または９．５のｐＨをもたらすのに十分な量で存在することになる。緩衝媒体中に存在し得る他の作用物質としては、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどがある。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＢＳＡなどを含むことができる。さらに、いくつかの実施形態では、反応物は、特に、試薬がマスターミックスとして準備される場合、トレハロースなどの凍結保護物質を含むことができ、それは、時間をかけて貯蔵することができる。
反応混合物の調製において、様々な構成成分を任意の好都合な順序で組み合わせることができる。例えば、緩衝液をプライマー、ポリメラーゼ、次いで鋳型核酸と組み合わせてもよく、または様々な構成成分のすべてを同時に組み合わせて反応混合物を生成することができる。
代わりに、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＯＭＮＩＭＩＸ（登録商標）もしくはＳＭＡＲＴＭＩＸ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、ＩＱ＆＃８４８２；Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、またはＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含めた、市販のプレミックス試薬を、製造者の指示に従って本明細書に記載の方法で利用し、または反応条件を改善するように改変することができる（例えば、必要に応じて、緩衝液濃度、陽イオン濃度、またはｄＮＴＰ濃度の改変）。
反応混合物を、プライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件」）、すなわち、鋳型として鋳型鎖を使用してプライマー分子の末端にヌクレオチドを付加することによってポリメラーゼ媒介プライマー伸長を可能にする条件に付すことができる。多くの実施形態では、プライマー伸長反応条件は、増幅条件であり、これらの条件は、複数の反応サイクルを含み、各反応サイクルは、（１）変性ステップ、（２）アニーリングステップ、および（３）重合ステップを含む。以下に論じるように、いくつかの実施形態では、増幅プロトコールは、アニーリングに専念された特定の時間を含まず、代わりに、変性および伸長に専念された特定の時間のみを含む。反応サイクルの数は、実施される用途に応じて変化することになるが、通常、少なくとも１５、より通常には、少なくとも２０となり、６０以上もの多くである場合があり、異なるサイクルの数は一般に、約２０〜４０の範囲となる。約２５超、通常、約３０超のサイクルが実施される方法については、酵素プライマー伸長に適した条件が維持されるように、追加のポリメラーゼを反応混合物中に導入することが好都合であり、または望ましい場合がある。
変性ステップは、反応混合物を高温に加熱するステップ、および反応混合物中に存在する任意の二本鎖核酸またはハイブリダイズした核酸が解離するのに十分な時間、その高温で混合物を維持するステップを含む。変性に関して、反応混合物の温度は通常、約８５〜１００℃、通常、約９０〜９８℃、より通常には、約９３〜９６℃の範囲の温度に上昇され、これらの温度で約３〜１２０秒、通常、約３秒からの範囲の時間維持されることになる。
変性後、反応混合物は、混合物中に存在する鋳型核酸（存在する場合）へのプライマーアニーリングにとって、かつプライマーが、これが鋳型としてハイブリダイズされる核酸を使用して５’から３’方向に伸長される様式でプライマー末端にヌクレオチドを重合するのに十分な条件、すなわち、プライマー伸長産物の酵素産生に十分な条件に付されることができる。いくつかの実施形態では、アニーリングおよび伸長プロセスは、同じステップ内で行われる。これらの条件を実現するために反応混合物が下げられる温度は、通常、最適な効率および特異性をもたらすように選ばれることになり、一般に、約５０〜８５℃、通常約５５〜７０℃、より通常には、約６０〜６８℃の範囲となる。いくつかの実施形態では、アニーリング条件は、約１５秒〜３０分、通常、約２０秒〜５分、もしくは約３０秒〜１分、または約３０秒の範囲の時間にわたって維持され得る。
このステップは、各ステップについて温度および時間の長さのバリエーションおよび最適化を伴ったアニーリングステップおよび伸長ステップのそれぞれの１つを任意選択により含み得る。２ステップのアニーリングおよび伸長では、アニーリングステップは、上記のように進行させられる。鋳型核酸にプライマーをアニールした後、反応混合物は、上記のようにプライマー末端にヌクレオチドを重合するのに十分な条件にさらに付される。重合条件を実現するために、反応混合物の温度は、一般に、約６５〜７５℃、通常、約６７〜７３℃の範囲の温度に上昇され、またはこの温度で維持され、約１５秒〜２０分、通常、約３０秒〜５分の範囲の時間維持される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、別個のアニーリングおよび伸長ステップを含まない。むしろ、本方法は、アニーリングに特に専用の任意のステップを伴わない、変性ステップおよび伸長ステップを含む。
変性、アニーリング、および伸長の上記サイクルは、サーマルサイクラーとして一般に公知の自動デバイスを使用して実施することができる。使用することができるサーマルサイクラーは、本明細書に他で、ならびに米国特許第５，６１２，４７３号、同第５，６０２，７５６号、同第５，５３８，８７１号、および同第５，４７５，６１０号に記載されており、これらの特許の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書に記載の方法は、標的核酸配列であって、このような標的が固体支持体に固定化されている場合のある、配列を検出するために非ＰＣＲベース用途において使用することもできる。固体支持体に核酸配列を固定化する方法は、当技術分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）に、ならびに製造者、例えば、膜について：Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ａｍｐ；Ｓｃｈｕｅｌｌ、磁気ビーズについて：Ｄｙｎａｌ、培養プレートについて：Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、ビーズアレイプラットフォームについて：ＬｕｍｉｎｅｘおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、および本明細書に提供される実施形態によって有用な他の支持体について、ＣＰＧ，Ｉｎｃによって提供されているプロトコールに記載されている。
様々な試薬の正確な量、およびＰＣＲ、または同様の増幅もしくは検出／定量化結果をもたらす他の適当な増幅手順の条件（例えば、緩衝液条件、サイクリング時間など）に対するバリエーションは、当業者に公知であり、等価であるとみなされる。一実施形態では、対象とするｑＰＣＲ検出は、試料中の標的核酸（すなわち、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸）の５０コピー未満（好ましくは、２５コピー未満、より好ましくは１５コピー未満、さらにより好ましくは１０コピー未満、例えば、５、４、３、２、または１コピー）を検出する感度を有する。
対照
本明細書に開示のアッセイは、対照を任意選択により含み得る。本明細書に開示のＰＣＲまたはｑＰＣＲ反応は、様々な対照を含有し得る。このような対照は、プライマー、緩衝液、酵素（複数可）、および他の必要な試薬（例えば、ＭｇＣｌ２、ヌクレオチドなど）が、添加される検査試料の非存在下でサイクルされる「鋳型なし」陰性対照を含むことができる。これは、試薬が、プライマーと反応性であり、疑わしい増幅産物を生成するポリヌクレオチドで汚染されていないことを保証する。「鋳型なし」対照に加えて、陰性対照は、反応物中に含まれる非特異的標的核酸との増幅反応物も含むことができ、または検査試料を添加することなく、試料調製の任意もしくはすべてのステップ（核酸抽出から増幅調製まで）（例えば、各ステップは、検査試料をまったく使用しないか、もしくはカルバペネム耐性微生物を含まないことが分かっている試料を使用する）を使用して調製される試料とすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、例えば、方法および試薬が予期されたように機能していることを保証するために、陽性対照を含むことができる。陽性対照は、本明細書に開示のＭＲＥＪタイプｘｘｉ標的核酸と無関係である公知の標的を含み得る。増幅の前に、陽性対照核酸（例えば、直線化した、または非直線化したプラスミドの形態での）を増幅反応物に添加することができる。単一反応物は、陽性対照鋳型、陰性対照、もしくは試料鋳型を含有することができ、または単一反応物は、試料鋳型および陽性対照の両方を含有することができる。好ましくは、陽性対照は、本明細書に開示のＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列に由来するＭＲＥＪタイプｘｘｉ順方向および逆方向増幅プライマーに実質的に相補的な配列を含み、その結果、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を増幅するのに使用される増幅プライマー対は、同じアッセイ条件下で対照核酸も増幅することになる。いくつかの実施形態では、陽性対照鋳型核酸から生成されるアンプリコンは、標的アンプリコンより大きい。好ましくは、順方向および逆方向プライマーに相補的または実質的に相補的である陽性対照核酸中の配列は別として、陽性対照核酸は、本明細書に開示の標的アンプリコン／ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列と実質的な類似性を共有しない。言い換えれば、順方向および逆方向プライマーから外側で、陽性対照アンプリコンは、例えば、配列同一性がＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ＡＬＩＧＮツールを使用して比較されるとき、陽性対照ポリヌクレオチドと、好ましくは、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、さらにより好ましくは１０％未満、同一である。
陽性および／または陰性対照は、パラメータであって、その範囲内で検査試料がＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を有するＭＲＳＡを有する、または有さないと分類される、パラメータの設定に使用することができる。例えば、ｑＰＣＲ反応では、アンプリコンが陽性対照試料中で検出されるサイクル閾値を、試料を「陽性」と分類するための閾値を設定するのに使用することができ、アンプリコンが陰性対照試料中で検出されるサイクル閾値を、試料を「陰性」と分類するための閾値を設定するのに使用することができる。単一反応からのＣＴを各対照に使用することができ、または複製試料の中央値または平均を使用することができる。さらに別の実施形態では、ヒストリカル対照値（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖａｌｕｅ）を使用することができる。陰性および陽性対照のそれぞれの検出の最低レベルは、一般に、複数の反応にわたる平均ＣＴの９５％信頼区間の下端で設定される。この値は、診断アッセイの要求事項に応じて調整することができる。
好ましくは、ＰＣＲ対照は、同じ増幅反応内で、同じ試薬を使用して、検査試料と同時に実施されるべきである。
いくつかの実施形態は、増幅反応の間に、例えば、リアルタイムで、標的増幅産物の素性および／または量の判定をもたらす。例えば、いくつかの実施形態は、例えば、標的アンプリコン核酸、および／または陽性対照アンプリコンに特異的に結合しているプローブの測定（例えば、蛍光によって示される）を行うことに関する。いくつかの実施形態では、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用するのではなく、本方法は、二本鎖核酸に非特異的に結合する非配列特異的プローブ、例えば、インターカレート剤などを利用することができる。インターカレート剤は、非結合であるとき相対的に低い蛍光、および二本鎖核酸に結合すると相対的に高い蛍光を有する。したがって、インターカレート剤は、核酸増幅反応の間の二本鎖核酸の蓄積を監視するのに使用することができる。このような非特異的な色素の例としては、二本鎖核酸の存在下で蛍光を発し、検出可能な信号を生成する、インターカレート剤、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム、ＬＣグリーン、ＳＹＴＯ９、ＥＶＡＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光色素、ＣＨＲＯＭＯＦＹ（登録商標）、ＢＥＢＯなどがある。測定は、増幅反応の各サイクルの間の指定時点で、例えば、各伸長ステップの後（各変性ステップの前）に行うことができる。配列特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されるか、非配列特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されるかにかかわらず、標的アンプリコン核酸、および／または陽性対照アンプリコンに特異的に結合しているプローブの量の測定は、各サイクル全体にわたって連続的に行うことができる。
代わりに、いくつかの実施形態では、アンプリコン（例えば、標的および／または陽性対照）の素性／量は、増幅反応が完了した後、（例えば）サザンブロット法、ドットブロット法などを含めた標準的な分子技法を使用して確認することができる。
以下の実施例は、本技術を適用することができる特定の状況および設定を実証するために提供されており、本開示に含まれる本発明の範囲および特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１
臨床試料からのＭＲＥＪタイプＸＸＩ ＭＲＳＡの検出および同定
ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を有するＭＲＳＡを検出および同定するためのｑＰＣＲ反応を実施する。臨床試料は、Ａｍｉｅｓ液体スワブ（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ）を使用して患者から収集する。
製造者の指示に準じてＢＤ ＧｅｎｅＯｈｍ（商標）溶解キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して臨床試料からＤＮＡを任意選択により単離する。単離したＤＮＡの試料を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ種特異的ｏｒｆＸ配列、およびＭＲＥＪタイプｘｘｉの多型右端配列、すなわち、それぞれ０．２〜０．７μＭの配列番号２および３に、標準的な増幅条件下で特異底にハイブリダイズするプライマー、０．３μＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、２．８ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅＭａｔ）、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、４％のトレハロース（ＳＩＧＭＡ）と接触させる。反応物は、検出可能なＭＲＥＪタイプｘｘｉの右端接合部の増幅産物に特異的にハイブリダイズし、反応混合物に添加されるＦＡＭ、テキサスレッドおよびＴｅｔチャネルで、ＢＤ ＭＡＸ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）装置、またはリアルタイムＰＣＲ用に構成された他の装置で検出可能な検出可能部分を含む分子ビーコンプローブも含む。
ＰＣＲは、以下のような同じサイクリングパラメータを使用して、ＢＤ ＭＡＸ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）で実施する。
Figure 2015513907
ＦＡＭ、テキサスレッド、およびＴＥＴチャネルにおけるサイクル閾値（ＣＴ）は、ＢＤ ＭＡＸ（商標）またはＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアを使用して求める。
実施例２
臨床試料からのＭＲＥＪタイプＩ〜ＸＸＩ ＭＲＳＡのマルチプレックス検出
ＭＲＥＪタイプｉ〜ｖｉｉ、ｉｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、およびｘｘｉのいずれかを有するＭＲＳＡの存在を検出するために、マルチプレックス増幅反応を実施する。臨床試料は、Ａｍｉｅｓ液体スワブ（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ）を使用して患者から収集する。
製造者の指示に準じてＢＤ ＧｅｎｅＯｈｍ（商標）溶解キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して臨床試料からＤＮＡを任意選択により単離する。単離したＤＮＡの試料を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ種特異的ｏｒｆＸ配列、ならびにＭＲＥＪタイプｉ〜ｖｉｉ、ｉｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、およびｘｘｉの多型右端配列、すなわち、それぞれ０．２〜０．７μＭの配列番号２、３、３９、７７、および８１に、標準的な増幅条件下で特異的にハイブリダイズするプライマー、０．３μＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、２．８ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅＭａｔ）、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、４％のトレハロース（ＳＩＧＭＡ）と接触させる。反応物は、検出可能なＭＲＥＪタイプｘｘｉの右端接合部の増幅産物に特異的にハイブリダイズし、反応混合物、すなわち、配列番号４に添加されるＦＡＭ、テキサスレッド、およびＴｅｔチャネルで、ＢＤ ＭＡＸ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）装置、またはリアルタイムＰＣＲ用に構成された他の装置で検出可能な検出可能部分を含む分子ビーコンプローブも含む。
ＰＣＲは、以下のような同じサイクリングパラメータを使用して、ＢＤ ＭＡＸ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）で実施する。
Figure 2015513907
ＦＡＭ、テキサスレッド、およびＴＥＴチャネルにおけるサイクル閾値（ＣＴ）を、ＢＤ ＭＡＸ（商標）またはＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアを使用して求める。ＣＴを使用して、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｖｉｉ、ｘｖｉ、ｉｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、およびｘｘｉのいずれかのＭＲＳＡが存在するか否かを判定する。
実施例３
ＭＲＥＪタイプＸＸＩ配列は、ＭＥＣＡホモログ、ＭＥＣＣと関連している
ＭＲＥＪタイプｘｘｉ領域およびｍｅｃＣ遺伝子のＰＣＲ増幅を、ウシまたはヒト宿主から単離したＭＲＳＡの５１単離体について実施した。
単離体のリストを、以下の表に提供する。
Figure 2015513907
製造者の指示に準じてＢＤ ＧｅｎｅＯｈｍ（商標）溶解キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ｍｅｃＣを保有することが知られている上記臨床試料からＤＮＡを単離した。ＰＣＲ反応物を、以下の通り調製した：それぞれ０．２〜０．７μＭの配列番号１８２、１８３、および１８７、０．３μＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、２．８ユニットのＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３（ＥＭＤ）、１０ｍＭのＫＣｌ（ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅＭａｔ）、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、４％のトレハロース（ＳＩＧＭＡ）。
反応は、ＦＡＭチャネルを使用してＢＤ ＭＡＸ（登録商標）システムで実施した。
データは、ｍｅｃＣ遺伝子を保有した５１のＭＲＳＡ株のうちの５０がＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を含有していたことを示し、したがって、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ配列を使用するｍｅｃＣ ＭＲＳＡ株の検出の高い遍在の証拠をもたらす。
本発明を一般に記載してきたが、例示のみの目的で本明細書に提供され、限定的であることを意図してないある特定の具体的な実施例を参照して、さらなる理解を得ることができる。

Claims (22)

  1. ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するための組成物であって、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ｍｅｃＡホモログ（ｍｅｃＡＬＧＡ２５１）を含むブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）エレメントを含み、該ＳＣＣｍｅｃカセットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体ＤＮＡ内に挿入されており、それによって多型右端接合部（ＭＲＥＪ）タイプｘｘｉ配列を生じ、該配列は、該右端からの多型配列および該多型右端に隣接する染色体ＤＮＡを含み、該組成物は、
    長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、標準的なＰＣＲ条件下で該ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の該多型右端配列に特異的にハイブリダイズする第１増幅プライマーを含む、組成物。
  2. 前記第１増幅プライマーが、前記標準的なＰＣＲ条件下で配列番号１の核酸配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の組成物。
  3. 長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、標準的なＰＣＲ条件下で、前記染色体ＤＮＡ内への前記ＳＣＣｍｅｃエレメントの挿入点から１キロ塩基以内に位置したＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体配列に特異的にハイブリダイズする第２増幅プライマーをさらに含み、前記第１および第２増幅プライマーが一緒に、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むＭＲＳＡの存在下で、前記標準的なＰＣＲ条件下で、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の前記右端接合部のアンプリコンを生成する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記第２増幅プライマーが、標準的なＰＣＲ条件下でｏｒｆＸに特異的にハイブリダイズする、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記標準的なＰＣＲ条件下で前記ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の前記アンプリコンに特異的にハイブリダイズするプローブをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
  6. 配列番号１５６内で特異的にハイブリダイズし、配列番号１５６内のｍｅｃＡ配列を増幅することができるプライマー対をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 配列番号１５７内で特異的にハイブリダイズし、配列番号１５７内のｍｅｃＣ配列を増幅することができるプライマー対をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  8. 配列番号１５８内で特異的にハイブリダイズし、配列番号１５８内のｎｕｃ配列を増幅することができるプライマー対をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘ ＭＲＳＡに由来する１種または複数の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に特異的にハイブリダイズする１種または複数の追加の増幅プライマーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記１種または複数の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列が、配列番号５〜２９からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記第１増幅プライマーが、配列番号２と少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記第２増幅プライマーが、配列番号３と少なくとも８０％同一である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 配列番号４または８２と少なくとも８０％同一であるプローブをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記プローブが、蛍光エミッター部分および蛍光クエンチャー部分を含む、請求項９に記載の組成物。
  15. 前記第１増幅プライマーが凍結乾燥形態にある、請求項１に記載の組成物。
  16. ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸を含むメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するための方法であって、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ｍｅｃＡホモログ（ｍｅｃＡＬＧＡ２５１）を含むブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）エレメントを含み、該ＳＣＣｍｅｃカセットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ染色体ＤＮＡ内に挿入されており、それによって多型右端接合部（ＭＲＥＪ）タイプｘｘｉ配列を生じ、該配列は、該右端からの多型配列および該多型右端に隣接する染色体ＤＮＡを含み、該方法は、
    検査試料を準備するステップと、
    該試料を、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、標準的なＰＣＲ条件下で該ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の該多型右端配列に特異的にハイブリダイズする第１増幅プライマーと接触させるステップと、
    該試料を、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、該標準的なＰＣＲ条件下でＳ．ａｕｒｅｕｓのｏｒｆＸ遺伝子にハイブリダイズする第２増幅プライマーと接触させるステップであって、該第１および第２増幅プライマーは一緒に、ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸の存在下で、該標準的なＰＣＲ条件下で、ＭＲＳＡの該ＳＣＣｍｅｃ右端接合部のＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）領域配列のアンプリコンを生成する、ステップと、
    該ＭＲＥＪタイプｘｘｉ核酸のアンプリコンが、該接触ステップの後に生成されるか否かを判定するステップと
    を含む、方法。
  17. 前記第１増幅プライマーが、前記標準的なＰＣＲ条件下で配列番号１のＭＲＥＰ領域に特異的にハイブリダイズする、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記接触ステップが、前記試料を、長さが１０〜４５ヌクレオチドの間であり、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘｘ ＭＲＳＡに由来する１種または複数の多型ＳＣＣｍｅｃ右端配列に特異的にハイブリダイズする１種または複数の追加の増幅プライマーと接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記接触ステップが、前記試料を、前記標準的なＰＣＲ条件下でｎｕｃ配列に特異的にハイブリダイズし、ｎｕｃ配列のアンプリコンを生成することができる１種または複数の追加の増幅プライマー対と接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記接触ステップが、マルチプレックスＰＣＲを実施することを含む、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記接触ステップが、リアルタイムＰＣＲを実施することを含む、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記接触ステップが、前記試料を、前記標準的なＰＣＲ条件下でｍｅｃＡおよび／またはｍｅｃＣ配列に特異的にハイブリダイズし、これらの配列のアンプリコンを生成することができる１種または複数の追加の増幅プライマー対と接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
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