CN112501268B - 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米孔测序法检测呼吸道微生物的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～20所示，所述微生物为：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林)、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫。本发明针对呼吸道微生物的不同类型样本进行测序优化，使得检测方法、试剂盒等适用于多种类型的呼吸道样本，采用靶向扩增的方法，能满足痰液以及肺泡灌等样本类型的检测需要。此外，本发明可进行平行测序，增加检测样本通量，降低测序时间，进一步减轻检测病原种类通量与成本和时间的矛盾。

Description

一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及呼吸道微生物的检测领域技术领域，更具体地，涉及一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
致病微生物侵入呼吸道并进行繁殖导致的疾病称呼吸道感染。呼吸道感染的病原微生物种类繁多，感染症状相似，临床上难以鉴别，并且常常发生多种病原微生物的合并感染。由于精准诊疗亟需对症下药，因此需要对多重病原微生物的鉴别。
病原微生物类型鉴别的最直接的方法是进行病原微生物核酸检测。目前常用的呼吸道病原微生物在临床的检测方法有病原微生物培养以及核酸检测方法，如qPCR或者QF-PCR方法、质谱等方法，其中病原微生物培养耗时长，培养阳性率低；qPCR或QF-PCR方法的选择靶点单一，容易造成检测偏差，引起假阳性或假阴性，质谱方法也需要经过培养再进行鉴定，耗时长。因此，上述方法在呼吸道病原微生物的临床检测上都具有明显的局限性。
目前基于PCR方法检测病原体微生物的专利居多如：CN101985665A《一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针》、CN103074451A《一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法》、CN104342503A《一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法》、CN105734168A《一种12种呼吸道病毒核酸多重PCR检测试剂盒》、CN109609692A《用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法》、CN110894533A《用于检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂、试剂盒及系统》。以上专利共同点是多重荧光PCR或基因芯片的方法进行检测，但无法对病原的序列进行分析，如果病原体浓度比较低接近试剂盒的检测限时，此时的结果存在一定的不确定性。纳米孔测序平台具备读长长、实时简单快速、测序通量高、便携性高、装机成本相对低等优点。相比mNGS方法，纳米孔测序对病原体的检测和和分型可在基层实验环境或现场完成，有助于病原体的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用。
本发明的第一个目的在于提供一组基于纳米孔测序法检测呼吸道微生物的引物。
本发明的第二个目的在于提供所述引物组中的一条或几条引物在制备检测呼吸道微生物的试剂盒的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种基于纳米孔测序的检测呼吸道微生物的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
本发明给予一种新的基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组设计思路，设计了针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫设计相应的检测引物。
这里的引物设计思路是指，由于细菌的16S rDNA基因相对比较，通过生物信息基因比对分析，选出合适的保守区域进行引物设计；真菌选择ITS基因进行生物信息学分析然后进行引物设计；同时根据耶氏肺孢子虫的特异性基因设计相应的扩增引物，通过设计引物组，实现基于靶向扩增测序对呼吸道微生物的检测。
其中，所述的呼吸道微生物的种类包括细菌、真菌以及原虫等；所述呼吸道病原微生物，选取其遗传信息的一个或多个靶向区域进行靶向扩增、检测；所述的靶向扩增区域，可以为微生物的保守区域、毒力区域。
进一步地，细菌的保守区域为16s rDNA序列；真菌的保守区域为ITS序列；金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）的毒力或耐药区域，根据金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）的特点进行选择，在一些实施例中，耐甲氧西林葡萄球菌的耐药基因选择为MecA基因和MecC基因，耶氏肺孢子虫的保守区域为18srDNA序列。
基于以上的思路，本发明要求保护一种基于纳米孔测序的检测呼吸道微生物的引物组，其核苷酸序列如SEQID NO:1～20所示，所述微生物为：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、和耶氏肺孢子虫中的任意一种或几种。
在引物设计的过程中，10种细菌（肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌），靶向区域选择16srDNA序列；白假丝酵母菌、烟曲霉靶向区域选择ITS序列；耐甲氧西林葡萄球菌的靶向区域设计在其保守基因和耐药基因，具体地为Nuc基因、mecA基因和mecC基因；耶氏肺孢子虫靶向区域选择18srDNA序列。
引物的具体信息如表1所示：
表1：
引物对 靶向 区域 Forward pimer(5‘→3’) Reverse pimer(5‘→3’) 扩增子 长度 （bp）
1 16s rDNA GTTTGATCHTGGCTCAG （SEQ ID NO.1） GTATTACCGCGGCTGCTG （SEQ ID NO.2） 538
2 16s rDNA AAGSVMCGGCTAACTHYGTG （SEQ ID NO.3） TCGAATTAAACCACATYCTC CAC（SEQ ID NO.4） 468
3 16s rDNA AAACTCAAAKGAATTGACGGG （SEQ ID NO.5） TTGTACACACCGCCCGTC （SEQ ID NO.6） 508
4 16s rDNA TGAAGYYGGAATCGCTAGTAAT （SEQ ID NO.7） GATCCAACCGCABVRTCC （SEQ ID NO.8） 207
5 ITS1 GTGAACCAGCGGAGGGAT （SEQ ID NO.9） GCAATGTGCGTTCAAAGA （SEQ ID NO.10） 320
6 ITS2 GAAGAACGCAGCRAAATGCGAT （SEQ ID NO.11） GCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGC （SEQ ID NO.12） 350
7 18s rDNA AGAAACGGCTACCACATCCA （SEQ ID NO.13） CCCTTGCGACCATACTCCC （SEQ ID NO.14） 735
8 Nuc GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG （SEQ ID NO.15） GCACTTGCTTCAGGACCATA （SEQ ID NO.16） 355
9 mecA TCATAGCGTCATTATTCCAGG （SEQ ID NO.17） GAGTTAATGGGACCAACATAACCTA （SEQ ID NO.18） 399
10 mecC ATGAAATCGGTATTGTCCCTAA （SEQ ID NO.19） CGATGGGGTACTTACCAAAGC （SEQ ID NO.20） 590
进一步本发明要求保护所述引物组中的一条或几条引物在制备检测呼吸道微生物的试剂盒的应用。
优选地，所述试剂盒为纳米孔测序建库试剂盒。
优选地，所述微生物为：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、和耶氏肺孢子虫中的任意一种或几种。
同时，本发明还要求保护一种基于纳米孔测序的检测呼吸道微生物的试剂盒，包括所述引物组的中的一条或几条引物。
优选地，包括所述引物组。
更优选地，所述的引物组混合为多重PCR引物混合液。
进一步更优选地，所述的多重PCR引物混合液中各引物浓度为400nM～1μM。
最优选地的，多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.1所示的引物浓度为400nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.2所示的引物浓度为400nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.3所示的引物浓度为600nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.4所示的引物浓度为600nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.5所示的引物浓度为500nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.6所示的引物浓度为500nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.7所示的引物浓度为450nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.8所示的引物浓度为450nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.9所示的引物浓度为800nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.10所示的引物浓度为800nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.11所示的引物浓度为1000nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.12所示的引物浓度为1000nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.13所示的引物浓度为400nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.14所示的引物浓度为400nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.15所示的引物浓度为400nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.16所示的引物浓度为400nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.17所示的引物浓度为500nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.18所示的引物浓度为500nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.19所示的引物浓度为500nM；
多重PCR引物混合液中核苷酸序列如SEQID NO.20所示的引物浓度为500nM。
优选地，所述试剂盒，还包括文库构建试剂、接头试剂、测序试剂、测序芯片和/或DNA纯化试剂。
更优选地，所述文库构建试剂为：多重PCR扩增酶、连接反应混合液、洗脱液、阳性质控品、阴性质控品和内标。
进一步优选地，所述阳性质控品为含所述的引物组的目的扩增片段的克隆质粒。
进一步优选地，所述阴性质控品为人基因组DNA。
进一步优选地，所述内标为MS2噬菌体DNA。
进一步优选地，所述多重PCR扩增酶含有Taq酶和dNTPs。
进一步更优选地，所述多重PCR扩增酶中Taq浓度0.4～0.8U/μL。
最优选地，所述多重PCR扩增酶中Taq浓度为0.5U/μL。
进一步更优选地，所述多重PCR扩增酶中dNTPs浓度为0.5～1.0mM。
最优选地，所述多重PCR扩增酶中dNTPs的浓度为0.8mM。
进一步优选地，所述连接反应混合液为DNA连接酶和缓冲液buffer混合物，其中DNA连接酶浓度为0.5～1U/μL。
更进一步优选地，所述连接反应混合液为DNA连接酶和缓冲液buffer混合物，其中DNA连接酶浓度为1U/μL。
更优选地，所述接头试剂购包含12条标签接头，标签接头为人工合成的寡核苷酸。
更优选地，所述DNA纯化试剂为：DNA纯化磁珠。
更优选地，所述测序试剂为Nanopore公司的纳米孔测序试剂。
更优选地，所述测序芯片为FLO-MIN106D测序芯片。
最优选的，所示试剂盒包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1～20所示引物组，引物组制成多重PCR引物混合液（其中，SEQID NO.1所示引物的浓度为400nM、SEQID NO.2所示引物的浓度为400nM、SEQID NO.3所示引物的浓度为600nM、SEQID NO.4所示引物的浓度为600nM、SEQID NO.5所示引物的浓度为500nM、SEQID NO.6所示引物的浓度为500nM、EQIDNO.7所示引物的浓度为450nM、SEQID NO.8所示引物的浓度为450nM、SEQID NO.9所示引物的浓度为800nM、SEQID NO.10所示引物的浓度为800nM、SEQID NO.11所示引物的浓度为1000nM、SEQID NO.12所示引物的浓度为1000nM、SEQID NO.13所示引物的浓度为400nM、SEQID NO.14所示引物的浓度为400nM、SEQID NO.15所示引物的浓度为400nM、SEQID NO.16所示引物的浓度为400nM、SEQID NO.17所示引物的浓度为500nM、SEQID NO.18所示引物的浓度为500nM、SEQID NO.19所示引物的浓度为500nM、SEQID NO.20所示引物的浓度为500）；
文库构建试剂：多重PCR扩增酶、连接反应混合液、洗脱液、阳性质控品、阴性质控品和内标，其中阳性质控品为含所述的引物组的目的扩增片段的克隆质粒，阴性质控品为人基因组DNA，内标为MS2噬菌体DNA，多重PCR扩增酶含有Taq酶（0.5U/μL）和dNTPs（0.8mM），连接反应混合液为DNA连接酶（1U/μL）和buffer的混合液，洗脱液为1×TE；
接头试剂：所述接头试剂购自Nanopore公司，包含12条标签接头，标签接头为人工合成的寡核苷酸的混合物，浓度为10mmol/L；
测序试剂：Nanopore公司的纳米孔测序试剂；
测序芯片：FLO-MIN106D测序芯片；
DNA纯化试剂：DNA纯化磁珠。
所述的检测试剂盒的应用是用于呼吸道微生物的检测，其检测过程包括如下步骤：
1、样本总核酸提取：提取痰液或肺泡灌洗液等样本的总核酸；
2、文库构建
（1）靶向扩增：采用PCR完成对样本中总基因组DNA的靶向扩增，按照如下配制反应体系：待测DNA模板或质控品(注：阳性质控品、阴性质控品和内标各2μL)XμL、多重PCR扩增酶6.25μL、多重PCR引物混合液（含有苷酸序列如SEQID NO：1～20所示引物组）3.7μL、无核酸酶水(2.55—X)μL，[其中x=（起始量5ng）/（DNA模板的浓度）]；按如下程序进行反应：98℃，30秒；（98℃15秒，65℃5分钟）25个循环；4℃，Hold。
（2）PCR产物纯化：利用DNA纯化磁珠进行PCR产物纯化，纯化好的PCR产物用Qubit荧光计进行DNA定量，浓度需≥10ng/μL。
（3）测序接头连接：连上测序接头和牵引蛋白，用于DNA序列牵引至复合膜中纳米孔进行测序，得到文库；
3、测序分析以及生物信息分析：由MinION测序仪进行纳米孔测序，获得测序数据经生信分析和比对。
本发明待测微生物肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫各50例，利用本申请的试剂盒检测判定为检出的总reads阈值，确定肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫的总reads阈值均大于1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
与现有技术相比本发明专利的创新点有：（1）本专利可以对扩增产物的序列进行分析，能够精准的定位病原体，相对传统的PCR和基因芯片检测方法具有更高的准确性。（2）本专利跟宏基因组测序比具有快速的特点，宏基因组测序一般需2～3天才能出结果，本专利只需4小时即可出结果。（3）本专利采用的是纳米孔测序技术检测病原微生物，可以对测序进行实时分析。（4）本专利引物设计是针对细菌或真菌的保守基因（16s、18s及ITS），无需针对每种病原体进行单独设计引物，大大降低了设计难度和产品的研发难度。
本发明针对呼吸道微生物的不同类型样本进行测序优化，使得检测方法、试剂盒等适用于多种类型的呼吸道样本，采用靶向扩增的方法，能够解决低微生物载量的样本类型中部分微生物核酸量不足无法满足检测需求的弊端，也能满足痰液以及肺泡灌等样本类型的检测需要。此外，本发明采用靶向扩增测序，还能采用平行测序方法，增加检测样本通量，进一步减轻检测病原种类通量与经济负担的矛盾。
附图说明
图1为检测流程。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1呼吸道微生物检测引物的设计
根据文献报道和流行病学趋势，本实施例设计了针对14种呼吸道微生物（肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫）的检测引物。
本实施例设计的检测对象包括了细菌、真菌、病毒等常见的微生物。通过设计不同靶向区域对上述微生物进行鉴定，其中（1）细菌：设计4对引物，分别扩增16srRNA的V1-V3、V4-V5、V6-V7以及V8区，其引物对序列分别为如SEQID NO.1和SEQID NO.2、SEQID NO.3和SEQID NO.4、SEQID NO.5和SEQID NO.6、SEQID NO.7和SEQID NO.8；（2）真菌:设计了2对引物，分别扩增ITS1和ITS2区域，其引物对序列如SEQID NO.9和SEQID NO.10、SEQID NO.11和SEQID NO.12所示；（3）耶氏肺孢子虫设计了1对引物，扩增18srRNA的保守区域，其引物对序列如SEQID NO.13和SEQID NO.14所示；（4）耐甲氧西林葡萄球菌：设计1对引物扩增Nuc基因进一步区分金黄色葡萄球菌亚型，其他引物对如SEQID NO.15和SEQID NO.16所示；2对引物分别扩增mecA和mecC耐药基因，其引物对如SEQID NO.17和SEQID NO.18、SEQID NO.19和SEQID NO.20所示。引物的具体信息如表2所示：
表2：
引物对 靶向 区域 Forward pimer(5‘→3’) Reverse pimer(5‘→3’) 扩增子 长度 （bp）
1 16s rDNA GTTTGATCHTGGCTCAG （SEQ ID NO.1） GTATTACCGCGGCTGCTG （SEQ ID NO.2） 538
2 16s rDNA AAGSVMCGGCTAACTHYGTG （SEQ ID NO.3） TCGAATTAAACCACATYCTCCAC （SEQ ID NO.4） 468
3 16s rDNA AAACTCAAAKGAATTGACGGG （SEQ ID NO.5） TTGTACACACCGCCCGTC （SEQ ID NO.6） 508
4 16s rDNA TGAAGYYGGAATCGCTAGTAAT （SEQ ID NO.7） GATCCAACCGCABVRTCC （SEQ ID NO.8） 207
5 ITS1 GTGAACCAGCGGAGGGAT （SEQ ID NO.9） GCAATGTGCGTTCAAAGA （SEQ ID NO.10） 320
6 ITS2 GAAGAACGCAGCRAAATGCGAT （SEQ ID NO.11） GCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGC （SEQ ID NO.12） 350
7 18s rDNA AGAAACGGCTACCACATCCA （SEQ ID NO.13） CCCTTGCGACCATACTCCC （SEQ ID NO.14） 735
8 Nuc GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG （SEQ ID NO.15） GCACTTGCTTCAGGACCATA （SEQ ID NO.16） 355
9 mecA TCATAGCGTCATTATTCCAGG （SEQ ID NO.17） GAGTTAATGGGACCAACATAACCTA （SEQ ID NO.18） 399
10 mecC ATGAAATCGGTATTGTCCCTAA （SEQ ID NO.19） CGATGGGGTACTTACCAAAGC （SEQ ID NO.20） 590
实施例3呼吸道微生物检测试剂盒及其使用方法
一、组成
核苷酸序列如SEQID NO：1～20所示引物组，引物组制成多重PCR引物混合液，各引物浓度为400nM～1μM，各引物浓度如表3；
表3：
编号 序列 浓度nM
1 SEQ ID NO.1 400
2 SEQ ID NO.2 400
3 SEQ ID NO.3 600
4 SEQ ID NO.4 600
5 SEQ ID NO.5 500
6 SEQ ID NO.6 500
7 SEQ ID NO.7 450
8 SEQ ID NO.8 450
9 SEQ ID NO.9 800
10 SEQ ID NO.10 800
11 SEQ ID NO.11 1000
12 SEQ ID NO.12 1000
13 SEQ ID NO.13 400
14 SEQ ID NO.14 400
15 SEQ ID NO.15 400
16 SEQ ID NO.16 400
17 SEQ ID NO.17 500
18 SEQ ID NO.18 500
19 SEQ ID NO.19 500
20 SEQ ID NO.20 500
文库构建试剂：多重PCR扩增酶、连接反应混合液、洗脱液、阳性质控品、阴性质控品和内标，其中阳性质控品为含所述的引物组的目的扩增片段的克隆质粒，阴性质控品为人基因组DNA，内标为MS2噬菌体DNA，多重PCR扩增酶含有Taq酶（0.5U/μL）和dNTPs（0.8mM），连接反应混合液为DNA连接酶（1U/μL）和buffer的混合液，洗脱液为1×TE；
接头试剂：所述接头试剂购自Nanopore公司，包含12条标签接头，标签接头为人工合成的寡核苷酸的混合物，浓度为10mmol/L。
测序试剂：Nanopore公司的纳米孔测序试剂。
测序芯片：FLO-MIN106D测序芯片。
DNA纯化试剂：DNA纯化磁珠。
二、使用方法
1、样本的总核苷酸提取
收集待测人员的痰液以及肺泡灌洗液样本，按照广州市达瑞生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂说明书，提取其总核酸，并利用qubit荧光计进行检测定量。
2、文库构建
（1）靶向扩增
1)按照如下配制反应体系：待测DNA模板或质控品(注：阳性质控品、阴性质控品和内标各2μL)XμL、多重PCR扩增酶6.25μL、多重PCR引物混合液（含有苷酸序列如SEQID NO：1～20所示引物组）3.7μL、无核酸酶水(2.55—X)μL，[其中x=（起始量5ng）/（DNA模板的浓度）]。
2)按如下程序进行反应：98℃，30秒；（98℃15秒，65℃5分钟）25个循环；4℃，Hold。
（2）PCR产物纯化
对于每个样本，在PCR扩增产物中按照1:1体积加入DNA纯化磁珠，然后按照磁珠纯化步骤进行纯化操作，其中利用80%乙醇洗涤两次，最终用30μL洗脱液进行洗脱回收核酸。
纯化好的PCR产物用Qubit荧光计进行DNA定量，浓度需≥10ng/μL。
（3）测序接头连接
在10μL产物中加入1μL连接反应混合液，低速涡旋混匀，瞬时离心，室温放置10分钟，然后置于冰上，即得到测序文库。
3、MinIon测序分析
（1）测序芯片处理
1）打开芯片清洗口盖子，除去气泡。
2）室温静置5分钟，打开芯片进样口盖子。
3）利用移液器，通过芯片进样口以逐滴方式将构建好的文库加到芯片中。
4）关闭芯片进样口和芯片清洗口。
4、测序及数据分析
（2）将FLO-MIN106D测序芯片载入至基因测序仪使用Nanopore公司的纳米孔测序试剂进行测序，严格按照MinIon基因测序仪操作说明书操作，进行纳米孔测序。
4、生物信息分析
按照MinIon测序仪等操作说明进行后，获得测序数据经MinKNOW软件处理，与数据比对，确定每个待检测微生物检出总reads，然后通过ROC曲线，利用最大Youden’sindex确定各待检微生物的判定为检出的总reads数。
三、结果判读
阳性结果判定：待测样本中检测到14种呼吸道病原体存在检出的总reads数≥1时，判定为阳性；
阴性结果判定：待测样本中检测到14种呼吸道病原体全部检出的总reads数=0时，判定为阴性。
实施例3 靶向扩增建库法与宏基因组法的对比
一、实验方法
分别收集50例痰液、10例肺泡灌液样本，采用宏基因组建库法和靶向扩增法进行建库，对待测微生物的检测范围进行对比，所述待测微生物为14种呼吸道微生物：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫。
宏基因组建库方法，使用的是广州市达瑞生物技术股份有限公司研发的二代测序宏基因组病原体检测试剂盒，其文库质控要求是：构建好的文库用Qubit荧光计进行DNA定量，浓度需大于0.2ng/μL。
靶向扩增建库法，使用的是实施例2的试剂盒，其中文库质控要求是：纯化好的PCR产物用Qubit荧光计进行DNA定量，浓度需≥10ng/μL。
按照试剂盒的说明书或实施例2的方法分别对50例痰液、10例肺泡灌液样本进行文库构建和测序，以对比2者的文库合格率及检出来。
二、实验结果
结果如表3所示，靶向扩增的满足建库比例、满足文库要求比例、检出率以及阳性率均和宏基因组建库方法相近。说明本实施例2的试剂盒方法可行。
表3：
实施例4呼吸道微生物样本的检测
收集肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉、耶氏肺孢子虫各1例；利用实施例2的试剂盒检测。
结果如表5所示，均判定其为相应微生物。
表5：
编号 病原 reads数
1 肺炎链球菌 （5）
2 耐甲氧西林葡萄球菌 （7）
3 肺炎克雷伯菌 （2）
4 铜绿假单胞菌 （1）
5 鲍曼不动杆菌 （2）
6 嗜麦芽窄食单胞菌 （3）
7 白色假丝酵母 （1）
8 流感嗜血杆菌 （1）
9 嗜肺军团菌 （701）
10 屎肠球菌 （18）
11 鹦鹉热衣原体 （81）
12 格特隐球菌 （180）
13 烟曲霉 （42）
14 耶氏肺孢子虫 （34）
实施例5临床阳性样本对比鉴定
收集了痰液临床样本以及肺泡灌洗液临床样本共20例，利用实施例4的检测试剂盒进行对比验证分析。
检测结果如表5所示，检出率和对照结果一致性为100%，阴阳性符合率均为100%，且单个样本一般会检出的检测范围的多种微生物，符合呼吸道感染一般存在多种病原微生物复合感染的情况。
表5：
样本 编号 样本来源 临床诊断结果 本专利检测结果
1201 痰液 肺炎链球菌 肺炎链球菌
1202 肺泡灌洗液 鲍曼不动杆菌 鲍曼不动杆菌
1203 痰液 金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林） 金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）
1204 痰液 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌
1205 肺泡灌洗液 嗜肺军团菌、副流感嗜血杆菌 嗜肺军团菌
1206 肺泡灌洗液 大肠埃希菌 阴性
1207 肺泡灌洗液 无乳链球菌 阴性
1208 肺泡灌洗液 金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林） 金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）
1209 肺泡灌洗液 黄曲霉 阴性
1210 痰液 白假丝酵母菌 白假丝酵母菌
1211 痰液 铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌
1212 痰液 白假丝酵母菌 白假丝酵母菌
1213 痰液 卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌 铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌
1214 肺泡灌洗液 鲍曼不动杆菌 鲍曼不动杆菌
1215 肺泡灌洗液 肺炎链球菌 肺炎链球菌
1216 肺泡灌洗液 流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌
1217 肺泡灌洗液 白假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林） 白假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）
1218 肺泡灌洗液 肺炎克雷伯菌、 肺炎克雷伯菌、
1219 痰液 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌
1220 痰液 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司
<120> 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtttgatcht ggctcag 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtattaccgc ggctgctg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagsvmcggc taacthygtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgaattaaa ccacatyctc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaactcaaak gaattgacgg g 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtacacac cgcccgtc 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgaagyygga atcgctagta at 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatccaaccg cabvrtcc 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgaaccagc ggagggat 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaatgtgcg ttcaaaga 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagaacgca gcraaatgcg at 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttattgat atgcttaagt tcagc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agaaacggct accacatcca 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccttgcgac catactccc 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggatggctat cagtaatgtt tcg 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcacttgctt caggaccata 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcatagcgtc attattccag g 21
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagttaatgg gaccaacata accta 25
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgaaatcgg tattgtccct aa 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgatggggta cttaccaaag c 21

Claims (7)

1.一种基于纳米孔测序法检测呼吸道微生物的引物组在制备检测呼吸道微生物的试剂盒的应用，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQID NO：1～20所示；所述微生物为：肺炎链球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、白色假丝酵母、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、屎肠球菌、鹦鹉热衣原体、格特隐球菌、烟曲霉和耶氏肺孢子虫。
2.一种基于纳米孔测序的检测呼吸道微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1中所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述权利要求1中所述的引物组混合为多重PCR引物混合液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还含有文库构建试剂、接头试剂、测序试剂、测序芯片和/或DNA纯化试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述文库构建试剂为：多重PCR扩增酶、连接反应混合液、洗脱液、阳性质控品、阴性质控品和内标。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含权利要求1中所述的引物组的目的扩增片段的克隆质粒；所述阴性质控品为人基因组DNA；所述内标为MS2噬菌体DNA。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR扩增酶为热启动DNA聚合酶和dNTPs，浓度分别为0.4～0.8U/μL和0.5～1.0mM；所述连接反应混合液为DNA连接酶和缓冲液buffer混合物，DNA连接酶浓度为0.5～1U/μL。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113430303A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种基于纳米孔测序仪的23种呼吸道rna病毒快速鉴定方法
CN113667729A (zh) * 2021-07-29 2021-11-19 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法
CN113667715A (zh) * 2021-08-11 2021-11-19 广州达安基因股份有限公司 一种用于检测呼吸道样本中病原体dna文库的构建方法及试剂盒
CN114196779A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 武汉明德生物科技股份有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒
CN114015795B (zh) * 2022-01-10 2022-04-01 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用
CN114351261B (zh) * 2022-02-28 2023-12-15 江苏先声医学诊断有限公司 基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原微生物的检测方法
CN115992267B (zh) * 2022-07-15 2023-11-03 中国医学科学院北京协和医院 一种高通量高精度检出多种病原菌的引物组、试剂盒及方法
CN116287434B (zh) * 2022-10-21 2024-03-26 深圳康美生物科技股份有限公司 一种呼吸道症候群病原体核酸检测试剂盒
CN117363767B (zh) * 2023-12-07 2024-04-05 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937578A (zh) * 2017-12-06 2018-04-20 西安九安生物技术有限公司 15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1997886B1 (en) * 2006-02-21 2013-06-05 National University Corporation University of Toyama Rapid method for identifying causative microorganism of infectious disease
US20130266942A1 (en) * 2012-04-06 2013-10-10 Geneohm Sciences Cananda, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) of mrej type xxi
RU2015122794A (ru) * 2012-11-15 2017-01-10 Молекуляр Детекшн Израиль Лтд. Реакционные смеси для пцр и способы применения
CN104561280A (zh) * 2014-12-24 2015-04-29 华美生物工程有限公司 一种检测细菌性肠胃炎的多重pcr快速检测试剂盒
CN105950732B (zh) * 2016-05-25 2019-12-13 中国农业大学 动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片
KR101969905B1 (ko) * 2016-06-20 2019-04-17 한국표준과학연구원 염기서열분석을 위한 라이브러리용 프라이머 세트 및 라이브러리 제조방법
CN111836903A (zh) * 2017-12-22 2020-10-27 博德研究所 基于crispr效应系统的多重诊断
CN109251992A (zh) * 2018-09-13 2019-01-22 昆明医科大学第附属医院 一种检测耶氏肺孢子菌的lamp引物组合物和方法
CN110964840B (zh) * 2018-09-30 2023-07-25 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测5种血流感染病原体的引物组、试剂盒及建库方法
CN111662958B (zh) * 2020-02-18 2022-12-06 武汉臻熙医学检验实验室有限公司 基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937578A (zh) * 2017-12-06 2018-04-20 西安九安生物技术有限公司 15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒

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