CN114164296B

CN114164296B - 一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法

Info

Publication number: CN114164296B
Application number: CN202111518322.1A
Authority: CN
Inventors: 柴春月; 惠丰立; 刘金丽; 陈崇艺; 朱露露
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Nanyang Normal University
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN114164296A

Abstract

本发明公开了一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法，涉及基因工程技术领域。本发明利用比较基因组学方法，在寡雄腐霉菌基因组上鉴定出的引物探针组合物由正向引物oilF、反向引物B‑oilR和探针T‑oil组成。与传统的依据形态特征来鉴定寡雄腐霉菌的检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为寡雄腐霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于具有拮抗促生效果的生防菌的高灵敏度快速检测与筛选。

Description

一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法。

背景技术

土传病原菌是引起作物减产的重要因素，尽管改变耕作模式等传统措施可以一定程度地抑制土传病原菌的传播，但由于病原菌具有积年流行、发病快的特点，植物病害仍造成了全球农业经济不可估量的损失。化学农药虽然可以较有效地抑制病原菌的生长，但过量使用或滥用对环境以及人类健康造成了严重危害，因此利用环境友好的植物益生菌来拮抗土传病原菌成为近年来的研究热点。寡雄腐霉Pythium oligandrum属真菌门卵菌纲霜霉目腐霉科腐霉属，是广泛存在于自然界中的一种攻击性强的重寄生微生物。研究发现，寡雄腐霉可以抵抗多种甚至同属病原菌对植物的侵害，是一种具有应用潜力与价值的生防菌株。寡雄腐霉的生物防治机制是多种生物机制协同作用的效果，主要为以下五个方面：其一，寡雄腐霉直接攻击病原菌，通过对病原菌的重寄生作用来抑制病原菌生长。其二，诱导植物产生系统抗性。其三，通过分泌抗生物质来抑制病原菌的生长。其四，促进植物产生大量的生长素前体色胺，间接防止病原菌的侵害。其五，寡雄腐霉迅速在植株根系定殖，与病原菌争夺营养与空间。寡雄腐霉对农作物无致病性，对病原微生物具有广谱抗性，开发寡雄腐霉为高效、环保的应用菌剂是未来研究的焦点。因此快速、灵敏的从样品中检测与筛选出寡雄腐霉作为生防菌种资源，对微生物农药的开发与利用具有重大意义。

传统检测寡雄腐霉菌的方法是从样品或植物组织中分离培养并进行形态观察，其在寡雄腐霉检测中发挥了重要作用，然而这种方法费时费力，要求操作者具备专业的微生物分离、形态学鉴定知识和丰富的实际经验。随着核苷酸鉴定方法的发展，基于聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real time PCR)已成功应用于微生物检测。虽然PCR和real-time PCR在特异性和灵敏度上有较大的提高，但其依赖于精密昂贵的温度循环装置，需要专业的技术人员和复杂的反应试剂，所需的检测时间仍然比较长。要实现生防菌的快速分离鉴定，需要结合简易的样品处理技术和可视化的结果读取方法，使整个检测过程简单高效。因此，建立一种灵敏、准确的方法来快速分离鉴定寡雄腐霉是至关重要的。

比较基因组学是通过对系统发育中所涉及的物种之间的基因和基因家族的比较分析、构建系统发育图谱,来揭示基因、基因家族差异性和多样化的机制。比较基因组学研究有助于进一步阐明物种进化的分子基础,在探索基因起源机制的同时,从基因进化的角度研究基因序列与功能的多样性的关系。随着基因组测序爆炸性增长，比较基因组学已逐渐成为每个物种尤其是首次被破译基因组的物种的必备研究内容之一。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是英国TwistDx公司发明的可以替代PCR的核酸检测技术。因其能够在15min内进行常温下的单分子核酸检测且对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、生物安全、农业等领域。这种方法是在靶基因上设计一对可以扩增不超过500bp片段的特异性引物，利用重组酶和引物形成的微丝，在模板DNA上寻找与之完全互补配对的序列，并在单链DNA结合蛋白的帮助下使模板DNA解链，启动引物与模板DNA配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。反应温度控制在37-42℃之间，一般可在10min之内获得可检出水平的扩增产物。由于RPA扩增过程依赖长链的特异性引物，所以反应特异性强，并且核酸扩增过程是在常温条件下进行，普通水浴锅或保温设备就能满足反应要求，检测成本大大降低，可以真正实现便携式的快速核酸检测。

便携且操作简单是分离鉴定到生防菌或其他病原菌的必要条件，基于重组酶聚合酶扩增技术检测寡雄腐霉菌不需要精密昂贵的温控设备，所需时间短，操作简单，因此重组酶聚合酶扩增检测方法已成为实际生产中生防菌检测的热点。但是筛选特异性强灵敏度高的引物组合物是基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的关键。

发明内容

针对现有技术中寡雄腐霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种基于生物信息学分析工具，利用比较基因组学和重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的特异性引物、探针设计和试剂盒应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括正向引物oilF、反向引物B-oilR和探针T-oil；

所述正向引物oilF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物B-oilR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所探针T-oil的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种包含上述引物探针组合物的检测寡雄腐霉菌的试剂盒，所述试剂盒基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌。

优选的，所述试剂盒中还包括重组酶聚合酶扩增试剂。

优选的，所述重组酶聚合酶扩增试剂包括Rehydration Buffer、DEPC处理水、MgAC和酶干粉。

本发明还提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的试剂盒，包括以下浓度的工作液：10μM的正向引物oilF、10μM的反向引物B-oilR、10μM的探针T-oil、Rehydration Buffer、DEPC处理水、280mM MgAC和酶干粉。

本发明还提供了上述引物探针组合物和上述试剂盒在检测寡雄腐霉菌中的应用。

本发明还提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的方法，以待检测样品的基因组DNA作为反应模板，与上述的引物探针组合物配制重组酶聚合酶扩增反应体系进行重组酶聚合酶扩增反应，然后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果：当检测线和控制线上都出现指示带时，则表示待测菌种为寡雄腐霉菌。

优选的，所述重组酶聚合酶扩增反应体系以50μL计，包括：2μL的反应模板、2.1μL10μM的正向引物oilF、2.1μL 10μM的反向引物B-oilR、0.6μL 10μM的探针T-oil、29.5μLRehydration Buffer、11.2μL DEPC处理水、2.5μL 280mM MgAC和酶干粉。

优选的，所述重组酶聚合酶扩增反应的温度为25～45℃，时间为25min。

优选的，所述侧流层析试纸条的样品端携带有纳米金粒颗粒，检测线含有生物素抗体。

有益效果：(1)实用性好：普通PCR反应需要精密昂贵的温控设备，产物进行凝胶电泳很容易造成扩散，这是实验室污染的主要来源之一；而且溴化乙锭(EB)有剧毒，可积累致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而重组酶聚合酶扩增反应只需在恒温水浴锅或保温设备中进行，反应结束之后通过试纸条检测线指示带的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值。

(2)实现了常温扩增，不像PCR法和环介导等温扩增技术(LAMP)必须经过热循环或高温孵育，这样就摆脱了对热循环仪器和稳定热源的依赖，只要在常温下重组酶聚合酶扩增反应就可以发生，极大的扩展了其使用范围。重组酶聚合酶扩增反应能在常温下反应主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。

(3)检测速度快：传统寡雄腐霉检测技术是根据形态特征来进行鉴定，操作繁琐且耗时冗长。普通PCR反应以及LAMP等检测技术也需要1-2个小时的检测时间。而重组酶聚合酶扩增反应整个过程进行得非常快，一般可在10-20min之内获得可检出水平的扩增产物，侧流层析试纸条检测扩增产物仅需5min。重组酶聚合酶扩增技术的使用不受检测场地的限制，尤其适合基层对生防菌的快速检测。

(4)本发明提供的寡雄腐霉菌的重组酶聚合酶扩增检测方法，克服了传统寡雄腐霉生物学检测方法繁琐、费时费力、特异性差、所需周期长的问题，PCR和LAMP检测技术需要热循环仪器及高温孵育设备，无法快速检测寡雄腐霉菌的问题。本发明中的检测方法在25-45℃的恒温条件，在25min内快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测寡雄腐霉菌，不需要复杂仪器，能很好的满足对寡雄腐霉菌进行现场检测的要求，为寡雄腐霉菌的检测提供了新的技术平台，可快速鉴定到具有促生和拮抗双重效果的生防有益菌。

附图说明

图1为寡雄腐霉菌的重组酶聚合酶检测的引物探针组合物的特异性验证结果：使用寡雄腐霉的特异性引物探针组合对亲缘关系较近的菌种进行重组酶聚合酶扩增反应，随后使用侧流层析试纸条对反应产物进行结果判定，结果显示：只有寡雄腐霉菌的检测线和控制线上都出现指示带，表示阳性检测结果，而其它菌种的检测线没有出现指示带，表示阴性检测结果；

图2为寡雄腐霉菌重组酶聚合酶检测的灵敏度验证结果：扩增不同浓度寡雄腐霉菌的基因组DNA：从左到右为50μL的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg DNA和不含基因组DNA的扩增结果，检测线条带判定寡雄腐霉菌重组酶聚合酶检测的灵敏度，结果显示：50μL的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg寡雄腐霉菌DNA的检测线可以观察到条带，呈阳性反应；50μL的反应体系中含有10fg寡雄腐霉DNA和不含DNA的检测线无条带，呈阴性反应；试纸条检测线条带显色结果表明寡雄腐霉菌重组酶聚合酶检测的灵敏度为100fg；

图3为土壤样品中寡雄腐霉的重组酶聚合酶检测结果：对使用传统方法分离培养并鉴定得到寡雄腐霉的土壤样品进行DNA提取，然后分别进行重组酶聚合酶检测，结果显示：十份土壤样品中有四份样品的检测线和控制线上都出现指示带，表示阳性检测结果，其余六份样品的检测线没有出现指示带，表示阴性检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

基于生物信息学工具，利用比较基因组学方法，在寡雄腐霉基因组上鉴定序列特异的基因作为检测靶标。首先将寡雄腐霉菌基因组上的15913个基因的核酸序列通过Blast的方法比对其余九种已测序的腐霉菌(Pythium irregulare、Pythium insidiosum、Pythium vexans、Pythium myriotylum、Pythium brassicum、Pythium ultimum、Pythiumarrhenomanes、Pythium guiyangense、Pythium iwayamai)的所有基因组序列，找到了189个寡雄腐霉基因在其它腐霉菌中没有同源基因。然后再通过与NCBI的NR数据库Blast对比，选择了其中6个相对特异的基因作为检测靶标，设计了6组引物和探针组合，通过普通PCR扩增的方式最终筛选到1组能够实现对寡雄腐霉菌的特异性扩增的引物探针组合物。该引物探针组合物由正向引物oilF、反向引物B-oilR和探针T-oil组成，各引物和探针的序列如下所示：

正向引物oilF(SEQ ID NO.1)：CATGGTCATTTCGATTTCTCATTCCTTCCGCCAG；

反向引物B-oilR(SEQ ID NO.2)：Biotin-CCAGTATGATGGTGACGATGGTTGTTCTTACTAT；

探针T-oil(SEQ ID NO.3)：

FAM-AGAAGACGAACAAGAAGAGCTCCTCATGTG-N-GACGGCTGTGACTGC-C3 space，其中N为THF。

上述的引物探针组合物在制备用于检测寡雄腐霉菌的试剂盒中的应用。

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物探针组合物。作为一种优选技术方案，该试剂盒中各试剂的浓度和用量为：2.1μL 10μM的正向引物oilF、2.1μL 10μM的反向引物B-oilR、0.6μL 10μM的探针T-oil、29.5μLRehydration Buffer、11.2μL DEPC处理水、2.5μL 280mM MgAC和酶干粉，配成48μL的反应体系。

上述的试剂盒在检测寡雄腐霉菌中的应用。

上述的引物探针组合物在检测寡雄腐霉菌中的应用。

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的方法，提取待检测样品的基因组DNA作为反应模板，采用上述的引物探针组合物进行重组酶聚合酶扩增，然后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果：当检测线和控制线上都出现指示带时，则表示待测病菌为寡雄腐霉菌。作为一种优选技术方案，该方法的具体工艺参数为：提取待检测样品的基因组DNA，取2μL待检微生物的DNA作为反应模板，加入48μL所述的试剂盒中的检测溶液进行重组酶聚合酶扩增，反应程序为：25～45℃反应扩增25min。

该方法的具体步骤为：提取待检测样品的基因组DNA，取2μL样品DNA作为反应模板，利用上述的检测试剂盒体系进行重组酶聚合酶扩增反应；由于探针包含羧基荧光素(FAM)标记和3’端阻断物，下游引物包含生物素B，RPA反应体系中核酸外切酶可以特异性地识别并切割探针序列中的THF分子，剪切后的探针与下游引物形成既带有FAM标记也带有生物素B的双标记扩增子。取5μl扩增产物与95μl的HybriDetect assay buffer混合，将一根侧流层析试纸条垂直放置，样品端浸入混合液中，室温放置3min后观察结果。

侧流层析试纸条样品端携带有纳米金粒颗粒，检测线含有生物素抗体。利用生物素标记的引物和FAM标记的探针对目的基因扩增后，将试纸条样品端浸入扩增液，在检测线上会形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体而呈现暗红色条带。因此，反应结束后通过侧流层析试纸条上检测线的颜色变化，来判断寡雄腐霉的有无；检测线和控制线都出现指示带表示检测为阳性，存在寡雄腐霉菌；只有控制线出现指示带，检测线未出现条带表示检测为阴性，不存在寡雄腐霉菌。

实施例1：寡雄腐霉菌的特异性引物和探针组合物的设计、筛选及验证

为了获得寡雄腐霉菌特异的引物和探针组合物，首先基于生物信息学工具，利用比较基因组学方法，在寡雄腐霉菌基因组上鉴定序列特异的基因作为检测靶标。首先寡雄腐霉菌基因组上的所有基因的核酸序列通过Blast的方法比对其余九种已测序的腐霉菌(Pythium irregulare、Pythium insidiosum、Pythium vexans、Pythium myriotylum、Pythium brassicum、Pythium ultimum、Pythium arrhenomanes、Pythium guiyangense、Pythium iwayamai)的所有基因序列，找到了189个畸雌腐霉菌基因在其它腐霉菌中没有同源基因。然后再通过与NCBI的NR数据库Blast对比，选择了其中6个相对特异的基因作为检测靶标，设计了6组引物组合物，

引物组合物1：

F1(SEQ ID NO.1)：CATGGTCATTTCGATTTCTCATTCCTTCCGCCAG，

R1(SEQ ID NO.2)：CCAGTATGATGGTGACGATGGTTGTTCTTACTAT；

引物组合物2：

F2(SEQ ID NO.4)：TTGCGATCGCTTAACTGTTTAATCATTGTCTCTG，

R2(SEQ ID NO.5)：AGATTCTAAGTAATAGAGCAGCACGAAGAAGCAC；

引物组合物3：

F3(SEQ ID NO.6)：CCTTCATTGTAGCTTATTGTAAGGTTTGGTGACG，

R3(SEQ ID NO.7)：GATGCTAAGCTTGTACGCCAAGAGGAGGACAGCC。

引物组合4：

F4(SEQ ID NO.8)：TTTTCAACAAACCACAAAGATATTGGTACTTTAT，

R4(SEQ ID NO.9)：GATATACAGTCCAACCAGTACCAGCACCTGAT；

引物组合5：

F5(SEQ ID NO.10)：TCATCATTTATATAATGTTGTTGTTACAGCACAT，

R5(SEQ ID NO.11)：GGTCACCTCCACCTGAAGGATCATAAAAAGAAG；

引物组合6：

F6(SEQ ID NO.12)：CTTTAATGATTGGTGCACCAGATATGGCTTTTC，

R6(SEQ ID NO.13):AAAATTAAAACATAAACTTCTGGGTGTCCGAA。

然后先通过普通PCR扩增的方式来筛选特异性强灵敏度高的引物组合物，结果显示只有来源于Ypt1基因的引物组合物1能够实现对寡雄腐霉菌的特异性扩增，而其它的引物组合物要么不能实现对寡雄腐霉菌的特异性扩增，要么扩增效率极低。于是采纳引物组合物1用于后续的寡雄腐霉菌的重组酶聚合酶检测，F1即为所述的正向引物oilF，R1即为反向引物B-oilR，并在此基础上设计了特异的探针T-oil。

实施例2：寡雄腐霉菌的引物和探针组合物的特异性试验

用于检测寡雄腐霉菌的引物和探针组合：所述的正向引物oilF具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，所述的反向引物B-oilR具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述的探针T-oil具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

采用上述的引物探针组合物制备试剂盒，该试剂盒中各试剂的浓度和用量为：2.1μL 10μM的正向引物oilF、2.1μL 10μM的反向引物B-oilR、0.6μL 10μM的探针T-oil、29.5μLRehydration Buffer、11.2μL DEPC处理水、2.5μL 280mM MgAC和酶干粉，配成48μL的反应体系。

提取待检测样品的基因组DNA，取2μL样品DNA作为反应模板，加入48μL试剂盒中的检测溶液进行重组酶聚合酶扩增，反应程序为：39℃反应扩增25min，然后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果。

为了验证寡雄腐霉菌引物和探针的特异性，以寡雄腐霉菌和其它五种亲缘关系较近的疫霉菌(Phytophthora sojae,Phytophthora infestans,Phytophthora capsici,Pythium ultimum,Phytophthora cactorum)为供试菌株评估特异性。检测结果显示：只有寡雄腐霉菌的检测线和控制线上都出现指示带，表示阳性检测结果，而其它疫霉菌的检测线没有出现指示带，表示阴性检测结果(图1)。

实施例3：寡雄腐霉菌重组酶聚合酶检测的灵敏度试验

为了确定重组酶聚合酶检测方法的灵敏度，将寡雄腐霉菌的基因组DNA用分光光度计测定浓度后进行10倍梯度稀释，设置DNA浓度范围为10ng-10fg，分别取稀释后的各浓度DNA稀释液2μL作为模板，DEPC处理水作为阴性对照，加入48μL试剂盒溶液进行重组酶聚合酶扩增反应，反应程序为：39℃孵育25min。反应结束后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，根据检测线指示带颜色变化，判断检测结果。结果显示：DNA浓度在10ng-100fg的范围都可以观察到试纸条检测线处有条带，DNA浓度为10fg以及阴性对照试纸条检测线没有条带，说明当寡雄腐霉DNA浓度为100fg时就足以用重组酶聚合酶方法检测出来(图2)。

实施例4：为土壤样品中寡雄腐霉的重组酶聚合酶检测试验

为了评估建立的重组酶聚合酶检测方法的实用性，对分离出寡雄腐霉菌的土壤样品进行检测。对十份土壤样品分别提取DNA，然后进行重组酶聚合酶扩增反应，随后使用侧流层析试纸条对反应产物进行结果判定。结果显示：四份样品的检测线和控制线上都出现指示带，表示阳性检测结果，而其余六份样品的检测线没有出现指示带，表示阴性检测结果(图3)。以上说明建立的重组酶聚合酶检测方法可以在土壤环境中检测到寡雄腐霉菌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catggtcatt tcgatttctc attccttccg ccag 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagtatgat ggtgacgatg gttgttctta ctat 34

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaagacgaa caagaagagc tcctcatgtg ngacggctgt gactgc 46

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgcgatcgc ttaactgttt aatcattgtc tctg 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agattctaag taatagagca gcacgaagaa gcac 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttcattgt agcttattgt aaggtttggt gacg 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgctaagc ttgtacgcca agaggaggac agcc 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttcaacaa accacaaaga tattggtact ttat 34

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatatacagt ccaaccagta ccagcacctg at 32

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcatcattta tataatgttg ttgttacagc acat 34

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtcacctcc acctgaagga tcataaaaag aag 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctttaatgat tggtgcacca gatatggctt ttc 33

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaattaaaa cataaacttc tgggtgtccg aa 32

Claims

1.一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括正向引物oilF、反向引物B-oilR和探针T-oil；

所述正向引物oilF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物B-oilR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针T-oil的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种包含权利要求1所述引物探针组合物的检测寡雄腐霉菌的试剂盒，所述试剂盒基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括重组酶聚合酶扩增试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增试剂包括Rehydration Buffer、DEPC处理水、MgAC和酶干粉。

5.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的试剂盒，其特征在于，包括以下浓度的工作液：10μM的正向引物oilF、10μM的反向引物B-oilR、10μM的探针T-oil、Rehydration Buffer、DEPC处理水、280mM MgAC和酶干粉；所述正向引物oilF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物B-oilR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针T-oil的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.权利要求1所述引物探针组合物和权利要求2～4所述试剂盒或权利要求5所述试剂盒在检测寡雄腐霉菌中的应用。

7.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测寡雄腐霉菌的方法，其特征在于：以待检测样品的基因组DNA作为反应模板，与权利要求1所述的引物探针组合物配制重组酶聚合酶扩增反应体系进行重组酶聚合酶扩增反应，然后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果：当检测线和控制线上都出现指示带时，则表示待测菌种为寡雄腐霉菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增反应体系以50μL计，包括：2μL的反应模板、2.1μL 10μM的正向引物oilF、2.1μL 10μM的反向引物B-oilR、0.6μL 10μM的探针T-oil、29.5μL Rehydration Buffer、11.2μL DEPC处理水、2.5μL 280mMMgAC和酶干粉。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增反应的温度为25～45℃，时间为25min。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述侧流层析试纸条的样品端携带有纳米金粒颗粒，检测线含有生物素抗体。