CN106916896B - 一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测麦角菌的试剂盒，其包括引物、Bst DNA聚合酶、反应缓冲液和核酸染料。本发明还提供了一种检测麦角菌的LAMP方法。使用本发明的LAMP试剂盒或方法能够快速、准确地对麦角菌进行鉴定和检测，具有高特异性、耗时短、灵敏度高、鉴定简便等优点，适于实验室或田间检验使用。
Description
本发明是申请号为201610268387.8、申请日为2016年4月27日、发明名称为“一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法”的专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法。
背景技术
麦角菌(Claviceps purpurea)属麦角菌科、麦角菌属，是一类主要以禾本科杂草和粮谷类植物为寄生宿主的真菌。其寄生于宿主的子房内，受侵染的子房不形成种子而是形成坚硬的菌核。菌核结构比较致密，并且外面包有一层角状外壳，由此得名“麦角”(Ergots)(Alderman,1999)。麦角菌在高湿度、高水分条件下生长旺盛，容易感染植株。大部分麦角病菌的麦角是其宿主植物种子的1-4倍。由麦角病菌及其菌核所导致宿主植物所发生的病一般称为“麦角病”(Ergot diseases)。麦角病是麦类和禾本科植物牧草的重要病害，不但使麦类大幅度减产，而且麦角中的生物碱对人、畜有毒，历史上因误食含麦角的谷物而引起中毒事件时有发生，如牲畜误食带麦角的饲草中毒死亡，人摄入过多含麦角的谷物食品也会发生流产甚至死亡现象。因此，需要开发适于田间或实验室对麦角菌进行快速检测的试剂盒或方法。
目前分子生物学检测以其快速、灵敏的特点，在微生物检测领域逐渐取代传统的形态学鉴定，成为热门研究方向。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification of DNA,LAMP)是日本学者Notomi于2000年建立的一种新型的核酸扩增技术。该技术针对靶基因6个区域设计4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，产物是两端带有茎环结构的哑铃状DNA分子。与实验室常规检测的PCR方法相比，LAMP技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在食品、动植物检验检疫中被广泛应用于各种病原检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测麦角菌的LAMP试剂盒及LAMP方法。
为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示:
外引物F3：CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID NO:1)
外引物B3：CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2)
内引物FIP：TGGGGTTCGTTTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID NO:3)
内引物BIP：GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID NO:4)。
优选地，所述反应缓冲液由2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成。
优选地，所述核酸染料为1000×SYBR Green I。
优选地，本发明的试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
优选地，所述DNA提取试剂例如CTAB抽提缓冲液。
在另一个方面中，本发明提供了引物在制备用于检测麦角菌的LAMP试剂盒中的应用。所述引物如序列SEQ ID NOs:1-4所示。
在又一个方面中，本发明还提供了一种检测麦角菌的LAMP方法，其中使用本发明的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；
(2)在PCR管中制备LAMP反应体系，包括0.2μmol/μl的外引物F3 1μl、0.2μmol/μl的外引物B3 1μl、1.2μmol/μl的内引物FIP 1μl、1.2μmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以麦角菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
(3)将步骤(2)中的PCR管于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料SYBRGreen I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，食品中不含麦角菌，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
本发明的发明人针对麦角菌序列的6个区域设计出4条引物，灵敏度高、特异性好。本发明用于检测麦角菌的LAMP试剂盒及方法能够准确鉴定食品、谷物、田间的麦角菌，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，成本低、操作简单、鉴定简便，适于基础实验室和现场检测，值得推广应用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本领域技术人员应当领会的是，可以在不偏离本发明精神的情况下进行多种修改，这些修改将包含在本发明的范围内。
实施例1本发明的试剂盒的制备
1.1试剂
引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自Takara；SYBR Green I购自Invitrogen；其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。
1.2试剂盒的制备：
获得以下试剂，以制备本发明的试剂盒：
CTAB抽提缓冲液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1MNaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB，调整pH值至7.2；
反应缓冲液：按照以下配方配制：2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱、6mM MgSO4；
引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。其中外引物F3和B3的浓度为0.2μmol/μl，内引物FIP和BIP的浓度为1.2μmol/μl。
浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；
核酸染料：1000×SYBR Green I；
阳性对照：麦角菌基因组DNA；
阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
实施例2麦角菌特异性检测
2.1 LAMP特异性检测
2.1.1待测植株
待测植株包括来自河北省农林科学院的麦角病植株8株(包括黑麦3株、大麦5株)、炭疽病黄瓜2株、白粉病豌豆2株以及健康的大麦2株。麦角病植株穗上均可见麦角形成。
2.1.2样品预处理：
将麦角病植株从茎基部剪断，将上部用无菌水冲洗后，用消毒剪刀将其剪成小段，置于PDA培养基上，25度恒温培养，直至形成菌落。
用接种环刮取白粉病豌豆植株叶片上的白色霉层，接种于PDA平板上，划线培养。用消毒剪刀剪下炭疽病黄瓜叶片适量，在PDA培养基上分离培养炭疽病菌。
挑取上述病菌菌落的菌丝少量，在光学显微镜下观察其形态学特征。观察显示，培养所得菌落均符合相应病菌的菌落特征。
2.1.3 LAMP检测
使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤进行检测：
(1)收集PDA平板上的菌落并离心，加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；
(2)在PCR管中制备LAMP反应体系，其中四种引物各1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、步骤(1)所得模板DNA2μl，加水补充至25μl，并以麦角菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
(3)将步骤(2)中PCR管置于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl 1000×SYBR GreenI，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
2.2检测结果
8株麦角病植株以及阳性对照的PCR管中均呈现绿色，而豌豆、黄瓜、健康大麦以及阴性对照的显色结果均为橙色，表明引物能够准确地鉴定出携带麦角菌的病害植株，具有很强的特异性。
实施例3麦角菌灵敏度检测
3.1 LAMP灵敏度检测
按照实施例2的步骤(1)提取麦角菌DNA，紫外分光光度计测量其OD值，并以10倍浓度系列稀释法稀释成10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共6个梯度。
LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2第2.1.3节的步骤(2)-(4)。
3.2检测结果
麦角菌DNA浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的PCR管中均呈现绿色，表明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pg DNA，灵敏度很高。
序列表
<110> 苏茂顺
<120> 一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法
<130> HZS-2012-005
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
cggacactca agatcgacc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
cgatatcggg ccttgtgaat 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
tggggttcgt ttcggcttga agacaagcgt gcttgaccaa t 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
gagaatctga ggccggctac tgtccttcct atgccctgct 40
Claims (1)
1.一种用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其特征在于，包括特异性引物组、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示：
外引物F3： CGGACACTCAAGATCGACC（SEQ ID NO: 1）
外引物B3： CGATATCGGGCCTTGTGAAT（SEQ ID NO: 2）
内引物FIP：TGGGGTTCGTTTCGGCTTGAA-GACAAGCGTG
CTTGACCAAT（SEQ ID NO: 3）
内引物BIP：GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTAT
GCCCTGCT（SEQ ID NO: 4）；
其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成；
进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照；
其中所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液。
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