CN104894125B

CN104894125B - 一种检测葡萄a病毒的rt‑lamp试剂盒及其专用引物

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Publication number: CN104894125B
Application number: CN201510346262.8A
Authority: CN
Inventors: 张永江; 辛言言; 乾义柯; 李桂芬
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: CN104894125A

Abstract

本发明公开了一种检测葡萄A病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其专用引物。本发明所提供的检测葡萄A病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的专用引物由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。实验证明，本发明提供的一种检测葡萄A病毒的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物能特异性地检测葡萄A病毒，与其他病毒无交叉反应，对葡萄A病毒的RNA的最小检测限为78.6pg。

Description

一种检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物。

背景技术

葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)为线形病毒科(Flexiviridae)葡萄病毒属(Vitivirus)病毒，是葡萄皱木复合病(rugose wood complex disease)的重要病原之一，可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等症状。葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)分布范围很广，目前在世界多个国家和地区均有发生，自然寄主为葡萄，可导致被侵染的葡萄植株出现卷叶，叶缘和叶柄变红，茎的局部隆起和碎裂等症状，可以通过机械接种、嫁接和无性繁殖材料传播。自然条件下由粉蚧以半持久方式传播，也可以由介壳虫(Neopulvinaria innumerabilis)传播。葡萄生产周期长且长期无性繁殖，带毒种苗常造成病毒病广泛流行，严重影响葡萄产量和品质。栽培无病毒苗木是防治果树病毒病的有效途径之一，而病毒检测水平的高低直接影响无病毒苗的推广。为了有效提高检测效率，需要建立相应的检测技术。

目前葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)常采用的检测方法有两种，一种是血清学检测方法，如DAS-ELISA，但该方法不仅灵敏度较差，而且特异性也较低；另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是需要特殊的仪器，如PCR仪。而且上述两种方法的检测需要较长的时间，如血清学方法大约需要2天，分子生物学方法大约需要5小时，无法满足现场快速检疫的要求。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计了针对特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。由于LAMP反应的扩增效率很高，在少量cDNA存在的条件下就可进行核酸的大量扩增，所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶，通过逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)就可以完成RNA的检测。RT-LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展RT-LAMP试剂盒的应用推广。目前RT-LAMP技术已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌及寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决技术问题是如何检测葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)。

本发明首先提供了一种成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成，它们的核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。其中，序列表的序列1由20个核苷酸组成，序列表的序列2由19个核苷酸组成，序列表的序列3由39个核苷酸组成，序列表的序列4由39个核苷酸组成，序列表的序列5由19个核苷酸组成，序列表的序列6由20个核苷酸组成。所述成套引物可以对葡萄A病毒的总RNA进行特异性的逆转录环介导等温扩增。

所述成套引物中，所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB的摩尔比可为1:1:8:8:4:4。

所述成套引物中，各引物的量如下：0.2μmol所述引物F3、0.2μmol所述引物B3、1.6μmol所述引物FIP、1.6μmol所述引物BIP、0.8μmol所述引物LF、0.8μmol所述引物LB。。

所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。

所述成套引物中各条引物可分别单独包装。所述成套引物中各条引物可按照所述摩尔比混合在一起。所述成套引物中各条引物可按照所述量混合在一起。

所述成套引物的用途为如下a)或b)或c)或d)：a)制备用于检测或辅助检测葡萄A病毒的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有葡萄A病毒；c)制备用于鉴定或辅助鉴定葡萄A病毒的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的葡萄A病毒。所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感染病毒的葡萄叶片、感染了葡萄A病毒的葡萄叶片、感染了葡萄斑点病毒的葡萄叶片、感染了葡萄卷叶病毒的葡萄叶片或感染了沙地葡萄茎痘相关病毒的葡萄叶片。所述待测病毒可为葡萄A病毒、葡萄斑点病毒、葡萄卷叶病毒或沙地葡萄茎痘相关病毒。

本发明还保护所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d)：a)制备用于检测或辅助检测葡萄A病毒的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有葡萄A病毒；c)制备用于鉴定或辅助鉴定葡萄A病毒的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的葡萄A病毒。所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感染病毒的葡萄叶片、感染了葡萄A病毒的葡萄叶片、感染了葡萄斑点病毒的葡萄叶片、感染了葡萄卷叶病毒的葡萄叶片或感染了沙地葡萄茎痘相关病毒的葡萄叶片。所述待测病毒可为葡萄A病毒、葡萄斑点病毒、葡萄卷叶病毒或沙地葡萄茎痘相关病毒。

本发明还保护含有以上任一所述成套引物的试剂盒。所述试剂盒的用途为如下e)或f)：e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有葡萄A病毒；f)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的葡萄A病毒。所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感染病毒的葡萄叶片、感染了葡萄A病毒的葡萄叶片、感染了葡萄斑点病毒的葡萄叶片、感染了葡萄卷叶病毒的葡萄叶片或感染了沙地葡萄茎痘相关病毒的葡萄叶片。所述待测病毒可为葡萄A病毒、葡萄斑点病毒、葡萄卷叶病毒或沙地葡萄茎痘相关病毒。

所述试剂盒还可包括2×反应缓冲液(RM)和/或酶溶液。所述2×反应缓冲液(RM)和/或所述酶溶液(EM)可为北京蓝谱生物科技有限公司产品目录号为LMP221的“RT-LAMP逆转录环介导等温扩增试剂盒”中的组件。

所述试剂盒中，所述2×反应缓冲液(RM)和/或所述酶溶液还可替换为链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg²⁺和/或反转录酶。所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶大片段。所述反转录酶具体可为M-MLV反转录酶。

所述试剂盒还可包括荧光显色剂。所述荧光显色剂具体可为SYBR Green I核酸染料。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下e)或f)：e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有葡萄A病毒；f)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的葡萄A病毒。所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感染病毒的葡萄叶片、感染了葡萄A病毒的葡萄叶片、感染了葡萄斑点病毒的葡萄叶片、感染了葡萄卷叶病毒的葡萄叶片或感染了沙地葡萄茎痘相关病毒的葡萄叶片。所述待测病毒可为葡萄A病毒、葡萄斑点病毒、葡萄卷叶病毒或沙地葡萄茎痘相关病毒。

本发明还提供了一种检测待测样品是否含有葡萄A病毒的方法，包括如下步骤：

提取待测样品的总RNA，以以上任一所述成套引物进行逆转录环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则待测样品中含有或疑似含有葡萄A病毒；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有葡萄A病毒。

所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感染病毒的葡萄叶片、感染了葡萄A病毒的葡萄叶片、感染了葡萄斑点病毒的葡萄叶片、感染了葡萄卷叶病毒的葡萄叶片或感染了沙地葡萄茎痘相关病毒的葡萄叶片。

所述“检测待测样品是否感染葡萄A病毒的方法”具体可为方法一，包括如下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测葡萄A病毒的逆转录环介导等温扩增成套引物进行环介导等温扩增，如果浊度曲线呈现为典型的“S型”、则待测样品中含有或疑似含有葡萄A病毒，如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似不含有葡萄A病毒。

所述“检测待测样品是否感染葡萄A病毒的方法”具体可为方法二，包括如下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测葡萄A病毒的逆转录环介导等温扩增成套引物进行环介导等温扩增，得到待测样品反应液，然后加入荧光显色剂，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测样品中含有或疑似含有葡萄A病毒，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测样品中不含有或疑似不含有葡萄A病毒。

所述荧光显色剂具体可为SYBR Green I核酸染料。

本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为候选的葡萄A病毒的方法，包括如下步骤：

提取待测病毒的总RNA，以权利要求1-4中任一所述成套引物进行逆转录环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则待测病毒为候选的葡萄A病毒；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则所述待测病毒为候选的非葡萄A病毒。

所述待测病毒为葡萄A病毒、葡萄斑点病毒、葡萄卷叶病毒或沙地葡萄茎痘相关病毒。

所述“辅助鉴定待测病毒是否为葡萄A病毒的方法”具体可为方法三，包括如下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测葡萄A病毒的逆转录环介导等温扩增成套引物进行环介导等温扩增，如果浊度曲线呈现为典型的“S型”、则待测病毒为候选的葡萄A病毒，如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测病毒为候选的非葡萄A病毒。

所述“辅助鉴定待测病毒是否为葡萄A病毒的方法”具体可为方法四，包括如下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测葡萄A病毒的逆转录环介导等温扩增成套引物进行环介导等温扩增，得到待测样品反应液，然后加入荧光显色剂，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测病毒为候选的葡萄A病毒，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测病毒为候选的非葡萄A病毒。

上述任一所述环介导等温扩增可在60-65℃条件下进行。更具体可在65℃条件下进行。

实验证明，本发明提供的一种检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物能特异性地检测葡萄A病毒，而且与其他病毒无交叉反应，如葡萄斑点病毒、葡萄卷叶病毒、沙地葡萄茎痘相关病毒。同时，本发明提供一种检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物对葡萄A病毒的RNA的最小检测限为78.6pg。

附图说明

图1为检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒的检测结果。

图2为检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒的特异性检测结果。

图3为检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒的灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

下述实施例中感染葡萄A病毒(Grapevine Virus A，GVA)的葡萄(Hosta spp.)叶片、感染葡萄斑点病毒(Grapevine Fleck Virus，GFKV)的葡萄(Hosta spp.)叶片、感染葡萄卷叶病毒(Grapevine leafRoll associated Virus，GLRaV)的葡萄(Hosta spp.)叶片和感染沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)的葡萄(Hosta spp.)叶片分别记载在如下文献中：葡萄A病毒的IC-RT-PCR检测研究.北方园艺，2015，01：99-103、美国爱达荷州首次报道葡萄斑点病毒侵染葡萄.植物检疫，27(2)：100、3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测.中国果树，2012，4：43-46和Completegenome sequences of two new variants of Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and comparative analyses.Journal of General Virology，2005，86：1555-1560。公众可从中国检验检疫科学研究院(即申请人处)获得上述材料。在下文中感染葡萄A病毒(Grapevine Virus A，GVA)的葡萄(Hosta spp.)叶片、感染葡萄斑点病毒(Grapevine Fleck Virus，GFKV)的葡萄(Hosta spp.)叶片、感染葡萄卷叶病毒(GrapevineleafRoll associated Virus，GLRaV)的葡萄(Hosta spp.)叶片和感染沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)的葡萄(Hostaspp.)叶片分别简称为感染葡萄A病毒的叶片、感染葡萄斑点病毒的叶片、感染葡萄卷叶病毒的叶片和感染沙地葡萄茎痘相关病毒的叶片。

下述实施例中的SYBR Green I核酸染料为Solarbio公司产品。

下述实施例中的浊度仪为Eiken Chemical公司LA-320C实时浊度仪。

下述实施例中的2×反应缓冲液(RM)和酶溶液(EM)均为北京蓝谱生物科技有限公司产品目录号为LMP221的“RT-LAMP逆转录环介导等温扩增试剂盒”中的组件。

实施例1、检测葡萄A病毒的RT-LAMP成套引物的制备

本实施例的检测葡萄A病毒的RT-LAMP成套引物由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成，它们的核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

制备引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB。

实施例2、利用检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒检测待测样品

一、检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒的制备

制备检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒，包括试剂盒C或试剂盒D：

试剂盒C为将反应试剂、荧光试剂、空白对照和阴性对照组装在一起得到的产品；

试剂盒D为将反应试剂、空白对照和阴性对照组装在一起得到的产品。

其中，所述反应试剂，包括2倍反应缓冲液(RM)12.5μl、酶溶液(EM)1μl、去离子水(DW)4.5μl、引物F3(浓度为10pmol/μl)和引物B3(浓度为10pmol/μl)各0.5μl、引物FIP(浓度为40pmol/μl)和引物BIP(浓度为40pmol/μl)各1μl、引物LF(浓度为20pmol/μl)和引物LB(浓度为20pmol/μl)各1μl。共23μl。

所述荧光试剂为向1μl SYBR Green I核酸染料中加入49μl去离子水得到的试剂。使用时加荧光试剂1μl。

所述阴性对照为未感染病毒的葡萄叶片的总RNA，使用时加入2μl。

所述空白对照为灭菌超纯水，使用时加入2μl。

二、利用步骤一制备的试剂盒D检测待测样品

1、提取感染葡萄A病毒的叶片总RNA和未感染病毒的葡萄叶片的总RNA，RNA的浓度分别为393ng/μl和193ng/μl。

2、RT-LAMP

具体的检测方法如下：

(1)向试管中加入23μl反应试剂和2μl步骤1提取的感染葡萄A病毒的叶片总RNA得到反应液，然后将反应液于65℃反应60分钟。以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线A，命名为GVA。

按照上述方法，将感染葡萄A病毒的叶片总RNA分别替换为步骤1提取的未感染病毒的葡萄叶片的总RNA和灭菌超纯水，其它步骤均不变，得到浊度曲线B和C，分别命名为NC和BC。

(2)结果观察和判定：如果浊度曲线呈现典型的“S型”、则待测样品中含有或疑似含有葡萄A病毒；如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似不含有葡萄A病毒。

RT-LAMP结果见图1，加入感染葡萄A病毒的叶片总RNA的试管进行RT-LAMP得到典型的“S型”浊度曲线，而加入未感染病毒的葡萄叶片的总RNA或灭菌超纯水的试管进行RT-LAMP得到的浊度曲线为水平的直线。结果表明，本发明提供的检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒可准确的检测葡萄A病毒。

实施例3、实施例2的检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒的特异性

以实施例2检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒C进行特异性实验，具体步骤如下：

1、提取感染葡萄A病毒的叶片总RNA、感染葡萄斑点病毒的叶片总RNA、葡萄卷叶病毒的叶片总RNA、沙地葡萄茎痘相关病毒的叶片总RNA和未感染病毒的葡萄叶片的总RNA，RNA的浓度依次为393ng/μl、367ng/μl、258ng/μl、191ng/μl和193ng/μl。

2、RT-LAMP

具体的检测方法如下：

(1)向试管中加入23μl反应试剂和2μl步骤1提取的感染葡萄A病毒的叶片总RNA得到反应液，然后将该反应液65℃反应60分钟。反应结束后，加入1μl荧光试剂，然后观察颜色变化。

按照上述方法，将感染葡萄A病毒的叶片总RNA分别替换为感染葡萄斑点病毒的叶片总RNA、葡萄卷叶病毒的叶片总RNA、沙地葡萄茎痘相关病毒的叶片总RNA、未感染病毒的葡萄叶片的总RNA和灭菌超纯水，其它步骤均不变，观察反应液的颜色变化。

(2)结果观察和判定：如果加入荧光试剂后目测颜色为绿色、则待测样品中含有或疑似含有葡萄A病毒；如果加入荧光试剂后目测颜色为橙色、则所述待测样品中不含有或疑似不含有葡萄A病毒。

实验结果见图2(图2中2a为感染葡萄A病毒的叶片，2b为感染葡萄斑点病毒的叶片，2c为葡萄卷叶病毒的叶片，2d为沙地葡萄茎痘相关病毒的叶片，2e为未感染病毒的葡萄叶片，2f为无菌超纯水)。结果表明，本发明提供的检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒可特异的检测葡萄A病毒。

实施例4、实施例2的检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒的灵敏度

以实施例2检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒C进行灵敏度实验，具体步骤如下：

1、提取感染葡萄A病毒的叶片总RNA，命名为RNA1。RNA1中RNA的浓度为786ng/2μl。

2、吸取1ml RNA1加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到RNA2；以此类推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6和RNA7。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，分别为78.6ng/2μl、7860pg/2μl、786pg/2μl、78.6pg/2μl、7860fg/2μl、786fg/2μl。

3、RT-LAMP

向试管中加入23μl反应试剂和2μl步骤1制备的RNA1得到反应液，然后将反应液于65℃反应60分钟。反应结束后，以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线1。

按照上述方法，将RNA1分别替换为步骤1制备的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6和RNA7，其它步骤均不变，分别得到浊度曲线2、浊度曲线3、浊度曲线4、浊度曲线5、浊度曲线6和浊度曲线7。

RT-LAMP结果见图3(图3中1为浊度曲线1，2为浊度曲线2、3为浊度曲线3、4为浊度曲线4、5为浊度曲线5、6为浊度曲线6、7为浊度曲线7)：向反应试剂中加入RNA1、RNA2、RNA3、RNA4和RNA5进行RT-LAMP均得到典型的“S型”浊度曲线，而向反应试剂中加入RNA6和RNA7进行RT-LAMP得到的浊度曲线均为水平的直线。结果表明，本发明提供的检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒对葡萄A病毒RNA的最小检测限为78.6pg。

Claims

1.一种成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

2.如权利要求1所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中，所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

3.如权利要求1或2所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中，各引物的量如下：0.2μmol所述引物F3、0.2μmol所述引物B3、1.6μmol所述引物FIP、1.6μmol所述引物BIP、0.8μmol所述引物LF、0.8μmol所述引物LB。

4.如权利要求3所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中各条引物分别单独包装，或，所述成套引物中各条引物按照权利要求2所述比例混合在一起，或，所述成套引物中各条引物按照权利要求3所述量混合在一起。

5.含有权利要求1至4中任一所述成套引物的试剂盒。