CN107236826A

CN107236826A - 一种检测百合无症病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN107236826A
Application number: CN201710590207.2A
Authority: CN
Inventors: 赵凯; 蔡友铭; 张永春; 梁洁玲; 范小瑞; 赵笑; 杨丹; 杜亚楠; 赵庆; 史斌; 赵桓震; 赵斌安; 潘磊; 张琪; 张晓霞
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2017-10-10

Abstract

一种检测百合无症病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，根据Genbank中查找到LSV的CP序列进行引物设计，该LAMP引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，该LAMP引物组特异性强，与常见侵染百合的7种病毒无交叉，灵敏度高，可在模板纯度只有10¹拷贝数下进行扩增，建立的百合无症病毒的LAMP诊断方法，具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点，可用于环介导逆转录等温扩增，直接检验百合样品总RNA，减少实验假阴性或假阳性实验结果发生，在保证实验结果准确性的同时，更加经济节约，高效，非常易于临床推广。

Description

一种检测百合无症病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测百合无症病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

百合无症病毒(Lily symptomles virus，LSV)属于线性病毒科(Flexiviridae)、麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus),是危害百合的主要病毒之一。由美国Brierley和Smith1944年首次从俄勒冈州带来的坏死斑点的百合中分离得到，此病毒是弯曲的细丝状，长610-700nm，直径12-15nm，螺旋对称结构。病毒基因组为单分子ssRNA，长8394nt，含6个ORF，其中ORF5编码32kD外壳蛋白，基因组RNA 3’端有一个Poly。LSV的传播范围比较狭窄，主要侵染百合科植物，能够被蚜虫以非持续性的方式或者被棉蚜以持续的方式传播，也可以通过花叶的相互接触和汁液接种传播。单独浸染时植株一般不会出现明显的症状，但会使鳞茎变小，严重退化。与其他病毒复合侵染时则可引起严重的田间症状，且对不同的寄主产生相应的症状。当和黄瓜花叶病毒一起复合侵染时在百合中引起坏死斑点。当和郁金香碎色病毒复合侵染时，在鳞茎状百合属植物中引起棕色环斑，在药百合植物叶片中引起碎斑。由于百合种球生产的主要是扦插和分球等无性繁殖方式，百合一旦感染LSV病毒后，在开放的环境中，病毒就会在该范围内积累扩散传播，直接影响了百合的花和球茎质量，严重影响花卉生产的经济效益。

目前，LSV的诊断方法主要有：电镜观察法、血清学检测法和分子生物学检测法，包括免疫吸附电镜法(ISEM)、酶联免疫吸附法(ELISA)、核酸分子杂交技术(PCR)、反转录PCR技术(RT-PCR)以及基因芯片技术等。

电镜观察快速、简单和直接，但电镜操作需要一定技能，而且工作比较集中，样本数量大则不易处理。ISEM技术结合了电镜与血清学技术，利用电镜高度放大率和分辨能力，能直接看到抗原与抗体之间特异性反应和免疫复合物的形态学特征，敏感性高和特异性强。但需要较高倍数的电子显微和高制备样品费用。

ELISA具有灵敏度高、特异性强、安全、快速及容易观察结果等优点。但在样品加工过程中，蛋白质易受破坏而影响检测结果的准确性；操作较繁琐，需要特殊仪器，检测费用高，而且存在着假阳性或假阴性现象。

PCR技术检测专一性强、灵敏度高、特异性好、操作简单，但检测中某些关键性限制因素极易造成假阳性或假阴性结果出现。LSV为RNA病毒，在逆转录的过程中，极易受到RNA酶的污染，出现假阴性。而在PCR过程中样品的非特异性扩增都有可能出现假阳性结果。

RT-PCR具备PCR优点的同时减少了逆转录的步骤，但需要严格的操作环境并且价格相对较高。而且对于携带微量病毒的植物组织，RT-PCR的检测灵敏度还不能达到要求。

此外，基因芯片技术也具备有灵敏性高特异性强的特点，但基因芯片制作昂贵，而且还需高昂价格的激光共聚焦扫描仪。在操作复杂、费时的同时，对操作人员的专业要求较高，使得该技术的推广受到了限制。综上所述，由于百合无症病毒广泛存在于百合花卉市场中，所需检测量大，需寻求一种更加简单高效、经济、快捷的检测方法。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi在2000年提出的一种等温核酸扩增技术，现已被广泛应用。该技术主要依靠一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNA polymerase)和四条能够识别靶序列上六个特异区域的引物，在恒温条件下就能实现目标条带的10⁹-10¹⁰倍扩增。4条引物FIP/BIP、F3/B3需在靶基因上的6个不同部位完全匹配才进行扩展，具有高特异性。

此外，LAMP具高灵敏度，产物检测便捷，且较少受到培养介质和生物学物质的影响，此外，该技术成本低廉，操作简单，极易于在基层推广。

然而，百合无症病毒是RNA单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，因此，利用LAMP技术检测百合无症病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高时，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。

目前，LAMP技术还未被应用于百合无症病毒的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测百合无症病毒的LAMP引物、试剂盒及检测方法，该引物特异性强，与常见侵染百合的其它7种病毒无交叉，灵敏度高，可在模板纯度只有10¹拷贝数下进行扩增，依此建立的百合无症病毒的LAMP诊断方法，具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种用于检测百合无症病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5'端到3'端，具体序列如下：

F3:5'-TGTTAGAGCAACGACTAACC-3'；

B3:5'-TTGTTCAGTGGTTGCCAT-3'；

FIP:5'-CTCGAAAGCCACATTTCGCAGTTTTGCTGATCGAGAAGCTCAA-3'；

BIP:5'-CGAACCCCTACGGGAGATTCTTTTGTTGTTAGATACGACGCCA-3'。

本发明提供一种包含所述LAMP引物组的百合无症病毒的LAMP检测试剂盒。

进一步，所述LAMP检测试剂盒包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、10×buffer、Mg²⁺、dNTPs、Bst DNA聚合酶和甜菜碱，其中，内引物与外引物的浓度之比范围为1-16：1。

进一步，所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP0.8-1.6μM，内引物BIP 0.8-1.6μM，外引物F3 0.1-0.8μM，外引物B3 0.1-0.8μM，Mg²⁺1.0-2.0mM，dNTPs 0.2-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.48U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比为1-16：1。

优选地，所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.0μM，内引物BIP 0.8-1.0μM，外引物F3 0.5-0.8μM，外引物B3 0.5-0.8μM，Mg²⁺1.3-1.7mM，dNTPs 0.3-0.4mM，甜菜碱0.5-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.32U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比范围为1-16：1。

更优选地，所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8μM，内引物BIP 0.8μM，外引物F3 0.8μM，外引物B3 0.8μM，Mg²⁺1.5mM，dNTPs 0.4mM，甜菜碱0.6M，BstDNA聚合酶0.16U/μL。

一种百合无症病毒的LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品RNA，将总RNA的50ng-5μg用全式基因逆转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA；

2)配制LAMP反应体系

所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.6μM，内引物BIP0.8-1.6μM，外引物F3 0.1-0.8μM，外引物B3 0.1-0.8μM，Mg²⁺ 1.0-2.0mM，dNTPs 0.2-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.48U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比为1-16：1；

3)进行LAMP扩增反应

LAMP扩增反应反应程序为：58.5℃59min，80℃3min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)LAMP扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有百合无症病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含百合无症病毒。

进一步，所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.0μM，内引物BIP 0.8-1.0μM，外引物F3 0.5-0.8μM，外引物B3 0.5-0.8μM，Mg²⁺1.3-1.7mM，dNTPs 0.3-0.4mM，甜菜碱0.5-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.32U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比范围为1-16：1。

将本发明所述的LAMP引物用于百合无症病毒的RT-LAMP检测中。

进一步，所述的RT-LAMP检测反应体系中，以待测样品RNA为模板，反应体系中各成分的终浓度为：内引物FIP 1.2-1.6μM，内引物BIP1.2-1.6μM，外引物F3 0.5-0.8μM，外引物B3 0.5-0.8μM，10×buffer，Mg²⁺ 1.3-1.7mM，dNTPs 0.3-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst酶0.15-0.35U/μL，DTT 0.15-0.2mM，逆转录酶3-4U/μL，待测样品RNA 20ng-5μg，反应程序为：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。

本发明的LAMP或RT-LAMP反应体系中，10×buffer的添加遵循本领域中的常规添加原则，通常为反应总体积的十分之一。

本发明根据百合无症病毒(LSV)CP基因序列(GenBank登录号为AJ564641.1)，在选择保守区域时避开所有的突变位点，使引物具有高特异性，设计筛选出2对引物，其为内引物FIP、BIP和外引物F3、B3。

利用本发明的FIP、BIP、F3和B3引物，在恒温条件下，经过高活性链置酶Bst酶的作用，DNA不断循环扩增，主要可分2个阶段，启动阶段和循环扩增阶段，LAMP扩增原理参见图1和图2。

在启动阶段，引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，释放单链。如图1所示，双链DNA模板在等温(60～65℃)的条件下，内部引物FIP退火，FIP中的F2序列跟模板链上Flc位点结合，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下启动核酸的合成。外部引物F3与模板F3c区域结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链，并置换释放一条单链DNA；单链DNA一端自动形成环的结构，可作为BIP引物的模板，BIP启动链的合成，随后B3引物退火，同模板链杂交，引导链置换反应产生一条双链DNA和一条两端成环的单链DNA，形成一个哑铃环的结构；此后，3’端自动引导DNA的合成，快速形成一种茎环的结构，该结构作为LAMP反应中循环反应的起始结构，进入LAMP反应的循环扩增阶段。

第2阶段是扩增循环阶段，主要由内部引物FIP和BIP作用，如图2所示：以茎环状结构为模板，引物FIP退火，与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2区域与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同茎长度茎结构的DNA和带有许多环的类似花椰菜结构DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列，因此LAMP电泳条带为一系列不同大小的梯状条带。

本发明对LAMP反应温度和反应体系进行了详尽、可靠的研究。首先，对反应温度进行了研究，由于反应中Bst DNA聚合酶的最佳反应温度为60℃左右，温度过高或过低都会对酶的活性产生较大影响，本发明对百合无症病毒的LAMP反应温度在55℃-65℃之间进行了筛选优化，确定合适的退火温度范围为：57-62℃，在该温度范围内，LAMP反应效率和产物产量较高。

LAMP反应中，不同的引物比例的扩增效率不同，本发明对引物比例进行优化筛选，最终确定的内引物与外引物比例范围为1-16：1，在该引物比例范围内，可以使用凝胶电泳法检测出明显的阳性梯状条带。

本发明对LAMP反应体系中各物质的终浓度进行了四因素三水平优化，最终确定各物质的终浓度范围为：dNTPs 0.2-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.48U/μL，在该浓度范围内，能获得良好的反应效率和产物产量。

利用本发明的LAMP引物组，可以直接采用样品中提取的总RNA进行环介导逆转录等温实验RT-LAMP，将LAMP和逆转录实验相结合，利用逆转录酶ReverTra Ace(Toyobo)和Bst酶极大地缩短了反应时间。以RNA作为模板，减少了将RNA逆转录成cDNA的步骤，既减少了逆转录的中间过程和人为操作带来的误差，又克服了以往LAMP易出现的假阳性结果。

LAMP阳性扩增反应时，产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸絮状沉淀，可以采取多种检测方法。如凝胶电泳，浊度仪根据产物浑浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析，还可以直接肉眼检测或者在反应体系加入荧光染料，通过观察颜色的变化进行判断。

与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：

本发明的百合无症病毒LAMP引物特异性强，与常见侵染百合的7种病毒，具体包括百合斑驳病毒样品、黄瓜花叶病毒样品、苹果茎沟病毒样品、南芥菜花叶病毒样品、蚕豆萎蔫病毒样品、百合X病毒样品和水仙花叶病毒样品，经过测试，不会产生交叉感染。

本发明的LAMP检测方法特异性好，灵敏度高，在百合无症病毒的诊断中，可在模板纯度只有10¹拷贝数下进行扩增，产物检测便捷，较少受到培养介质和生物学物质的影响，具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。

本发明的LAMP试剂盒中设置阴性对照以证明反应体系未被百合无症病毒目的序列污染，设置阳性对照以对比测定结果的正确性，进行LSV的LAMP可视化快速检测，操作简捷，向产物中直接加入荧光染料，依据颜色变化进行结果判定，实现反应结果的可视化、易判定、易于推广应用。

本发明可用于环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)，直接检验百合样品总RNA，减少实验假阴性或假阳性实验结果发生，在保证实验结果准确性的同时，更加经济节约，高效，非常易于临床推广。

附图说明

图1为本发明中LAMP扩增中第1扩增阶段示意图。

图2为本发明中LAMP扩增中第2扩增阶段示意图。

图3为本发明实施例2中LAMP扩增结果可视化结果示意图。

图4为本发明实施例2中LAMP扩增结果电泳检测示意图。

图5为对比例的LAMP扩增示意图。

图6为本发明实施例4中LAMP灵敏度电泳结果示意图。

图7为本发明实施例4中PCR灵敏度电泳结果示意图。

图8为本发明实施例4中LAMP灵敏度可视化结果示意图。

图9为本发明实施例5中LAMP特异性电泳示意图。

图10为本发明实施例5中LAMP特异性可视化结果示意图。

图11为本发明实施例6中RT-LAMP电泳结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1一种用于检测百合无症病毒(LSV)的LAMP引物组的获得

根据Genbank中查找到LSV的coat protein gene(CP)序列(GenBank登录号为AJ564641.1)进行引物设计，设计原理如下：

由于LAMP主要依靠链置换而成，所以靶序列长度应小于300bp，若是大于500bp将很难扩增，本发明根据靶基因的六个区域3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3，设计了4条特异性引物FIP、BIP、F3和B3。

FIP引物为上游内部引物(Forward Inner Primer)，由TTTT序列链接F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。BIP引物为下游内部引物(Backward Inner Primer)，由TTTT序列连接B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。

F3引物为上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。B3引物为下游外部引物(Backward Outer Primer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

具体序列如下：

F3:5'-TGTTAGAGCAACGACTAACC-3'；

B3:5'-TTGTTCAGTGGTTGCCAT-3'；

FIP:5'-CTCGAAAGCCACATTTCGCAGTTTTGCTGATCGAGAAGCTCAA-3'；

BIP:5'-CGAACCCCTACGGGAGATTCTTTTGTTGTTAGATACGACGCCA-3'。

实施例2一种百合无症病毒的LAMP检测方法

1)使用总RNA提取试剂盒(上海博满生物科技有限公司)，并参照

试剂盒说明书，提取感染百合无症病毒的百合植株样品总RNA。

2)将提取的50ng-5μg总RNA使用全式基因逆转录试剂盒，进行逆

转录，获得cDNA；

3)配制LAMP反应体系

设置阴性对照(ddH₂O)体系和阳性对照(包含百合无症病毒目的序列的质粒)体系，设置阴性对照以证明反应体系未被百合无症病毒目的序列污染，设置阳性对照以对比测定结果的正确性。

为防止实验出现假阳性结果，配制LAMP反应体系和两个对照体系时，进行分区操作。

配制反应体系时，不添加模板，先将ddH₂O、dNTPs、10×buffer、FIP、BIP、F3、B3和甜菜碱配制好，分成三组，分别加入阴性对照(ddH₂O)、待测样品cDNA模板和阳性对照(包含百合无症病毒目的序列的质粒)，加入待测样品的成为反应体系，加入阴性对照的成为阴性对照体系，加入阳性对照的成为阳性对照体系，将各体系的混合物涡旋混匀、瞬离，在95℃水浴锅中加热5min，再冰浴5min后，再加入Bst酶，其中，Bst酶需与DNA模板和阳性对照质粒隔离放置。

25μL的LAMP反应体系中，含有：ddH₂O 6.0μL，浓度2.5mM的1×dNTPs 3μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的FIP 4.0μL，浓度10μM的引物BIP 4.0μL，浓度10μM的引物F3 0.5μL，浓度10μM的引物B3 0.5μL，浓度5M甜菜碱2μL，8U/μL的Bst酶1.5μL，逆转录所得cDNA 1μL。

4)进行LAMP扩增反应

配制好反应体系后进行LAMP扩增反应，反应程序为：58.5℃59min，80℃3min；

5)鉴定扩增结果

步骤3)LAMP扩增反应结束后，向扩增产物中加入2μL SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色绿色的样品为阳性，含有百合无症病毒；显色橘色的样品为阴性，不含百合无症病毒，参见图3。

或者取5μL LAMP扩增产物在Goldview染色的2％的琼脂糖凝胶上进行电泳后在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察。出现特征性的梯状条带的样品为阳性，含有百合无症病毒；无条带出现的样品为阴性，不含百合无症病毒，结果参见图4。

由图3-4可以看出，显色结果和电泳结果表明百合无症病毒(LSV)和阳性对照质粒(P)均显示为阳性结果，阴性对照(N)均表现为阴性结果，且百合无症病毒的LAMP可视化快速检测与电泳结果一致。

对比例

除LAMP反应体系与本实施例不同外，其余操作及反应条件与实施例2相同。

其中，所用的LAMP反应体系为：ddH₂O 10.0μL，浓度2.5mM的1×dNTP 2.0μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的FIP 0.5μL，浓度10μM的引物BIP 0.5μL，浓度10μM的引物F3 2.0μL，浓度10μM的引物B3 2.0μL，浓度5M甜菜碱3μL，8U/μL的Bst酶1.5μL，逆转录所得cDNA 1μL。

所扩增的产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见图5，其中，泳道LSV为使用本对比例反应体系来检测百合无症病毒。

结果表明，利用对比例的反应体系，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，梯状条带在紫外光下几乎不能识别，反应效率很低。

实施例3百合无症病毒的LAMP检测试剂盒组装

1、包装规格：200次

2、试剂盒组成如表1：

表1

*：内含Buffer、dNTPs Mix和甜菜碱。

3、运输及保存方法：

低温运输，避光保存。短期使用放至4℃避光保存，长期保存请置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。

4、使用注意事项：

a)凡是接触过病毒材料的物品，为保证实验室不被污染和对检测人员的健康安全均需要被合理处理。

b)把整个实验分区域进行操作，严禁器材和试剂倒流，以免污染。

c)显色剂低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套。

d)注意不要让试剂盒中的各个成分受到污染，可进行分装使用。

e)操作过程中移液取样、定时等全部过程必须精确。严格遵守操作说明可以获得最好的结果。

实施例4灵敏度验证

本发明将经测序验证过LSV的质粒按照靠拷贝数进行稀释实验，按照LSV质粒10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10¹拷贝分别进行LAMP和PCR检测。

LAMP反应体系：ddH₂O 6.0μL，浓度2.5mM的1×dNTP 4.0μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的FIP 2.0μL，浓度10μM的引物BIP 2.0μL，浓度10μM的引物F3 2.0μL，浓度10μM的引物B3 2.0μL，浓度5M甜菜碱3μL，8U/μL的Bst酶0.5μL，逆转录所得cDNA 1.0μL。

PCR反应体系：ddH₂O 17μL，浓度2.5mM的1×dNTPs 2.0μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的引物F3 1.0μL，浓度10μM的引物B3 1.0μL，浓度逆转录所得cDNA 1μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL。

PCR反应程序：95℃预变性10分钟，进入PCR反应循环：95℃变性60秒，47℃退火40秒，72℃延伸35秒，共进行35个循环，最后在72℃总延伸7分钟。

LAMP反应程序和结果显示方法参见实施例2，PCR结果采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测，目的片段长为218bp，检测结果如图6-8所示，其中，10⁷为LSV质粒10⁷拷贝，10⁶为LSV质粒10⁶拷贝，10⁵为LSV质粒10⁵拷贝，10⁴为LSV质粒10⁴拷贝，10³为LSV质粒10³拷贝，10²为LSV质粒10²拷贝，10¹为LSV质粒10¹拷贝，N为阴性对照。

图6-7结果表明，本发明的LAMP可以检验出10¹而PCR只能检验出10³拷贝，说明本发明LAMP检测法能够检测出的最低浓度比PCR检测低2个数量级，这证明本发明中LAMP方法具有极高的灵敏度。

由于使用LAMP技术检测百合无症病毒的灵敏度较高，采用良好的防污染措施可避免假阳性结果。

同时，由图8可证，百合无症病毒的LAMP可视化快速检测与电泳结果一致，且呈一定的梯度变化。

实施例5特异性验证

百合在田间栽培过程中，除受自然因素的影响，还常受到病毒的侵染，而导致百合叶片过早脱落花芽和花早衰，寿命缩短等现象，严重影响百合产量和品质，成为百合种植过程中的的主要影响因素。在侵染百合的病毒中，除百合无症病毒外，还有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus，LMOV)等。据沈淑琳统计，侵染百合的病毒种类有14种，王继华统计有16种。本次为验证该试剂盒的特异性，专门选取7种常见侵染百合的病毒进行检验，除百合无症病毒质粒和cDNA外，具体包括百合斑驳病毒样品、黄瓜花叶病毒样品、苹果茎沟病毒样品、南芥菜花叶病毒样品、蚕豆萎蔫病毒样品、百合X病毒样品和水仙花叶病毒样品。

本实施例采用含LAMP引物的试剂盒进行，反应体系为：ddH₂O 6.0μL，浓度2.5mM的1×dNTPs 4.0μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的FIP 4.0μL，浓度10μM的引物BIP4.0μL，浓度10μM的引物F3 0.25μL，浓度10μM的引物B3 0.25μL，浓度5M甜菜碱2.0μL，逆转录所得cDNA模板1μL，8U/μL的Bst酶1.0μL。

结果判定方法参见实施例2，电泳结果图9，显色结果图10，其中，LSV为百合无症病毒cDNA，P为LSV质粒，N为阴性对照，LMoV为百合斑驳病毒样品，CMV为黄瓜花叶病毒样品，ASGV为苹果茎沟病毒样品，ArMV为南芥菜花叶病毒样品，BBWV为蚕豆萎蔫病毒样品，LVX为百合X病毒样品，NMV为水仙花叶病毒样品。

电泳结果图9和显色结果图10表明，百合无症病毒(LSV)和阳性对照质粒(P)均显示为阳性结果，阴性对照(N)和其他感染百合的病毒样品均表现为阴性结果，且百合无症病毒的LAMP可视化快速检测与电泳结果一致。

因此，本发明百合无症病毒的LAMP可视化快速检测试剂盒的特异性好，不会与其他病毒产生交叉感染，同时说明，加入荧光染料后，可视化结果与电泳结果一致。

实施例6利用LSV的LAMP检测试剂盒进行RT-LAMP检测

百合无症病毒LSV为RNA病毒，在现有技术中进行常规PCR检测时，需要先提取总RNA，再进行逆转录成cDNA进行实验。

本发明直接采用样品中提取的总RNA，进行环介导逆转录等温实验RT-LAMP，将LAMP和逆转录实验相结合，具体步骤如下：

全部反应体系共29.5μL，包括：ddH₂O 0μL，浓度2.5mM的1×dNTPs 4.0μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，浓度10μM的FIP 4.0μL，浓度10μM的引物BIP 4.0μL，浓度10μM的引物F3 2.0μL，浓度10μM的引物B3 2.0μL，浓度5M甜菜碱3μL，8U/μL的Bst酶1.0μL，5mM DTT 1μL，待测样品RNA 50ng，100U/μL的ReverTra Ace(Toyobo)1μL。

将所有反应体系于冰上加入PCR管后，涡旋，混匀，然后立即放入PCR仪。

RT-LAMP反应程序：65℃59min，80℃3min。

产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测，观察是否出现梯状条带，若是出现梯状条带，则证明RT-LAMP实验成功，结果参见图11，其中，RNA表示百合无症病毒LSV RNA经过RT-LAMP所得产物，N为阴性对照。。

由图11可见，百合无症病毒LSV RNA经过RT-LAMP反应后显示为阳性，说明本发明RT-LAMP方法检测百合无症病毒具有良好的特异性。

由于百合无症病毒本身属于易降解的RNA病毒，易受到空气或者是实验器具上RNA酶的作用，所以在提取和逆转录过程中要时时刻刻小心RNA酶的污染，给实验增加了很多繁琐的步骤，如使用的移液器等器具需用DEPC-H₂O处理，枪头要多次灭菌等等，即使再小心，也易出现假阴性结果。

而本发明则可极大的减轻这些繁琐的步骤，直接采用样品中提取的总RNA进行环介导逆转录等温实验RT-LAMP，将LAMP和逆转录实验相结合，利用逆转录酶ReverTra Ace(Toyobo)和Bst酶极大地缩短了反应时间。以RNA作为模板，既减少了逆转录的中间过程和人为操作带来的误差，又克服了以往LAMP易出现的假阳性结果。

Claims

1.一种用于检测百合无症病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5'端到3'端，具体序列如下：

F3:5'-TGTTAGAGCAACGACTAACC-3'；

B3:5'-TTGTTCAGTGGTTGCCAT-3'；

FIP:5'-CTCGAAAGCCACATTTCGCAGTTTTGCTGATCGAGAAGCTCAA-3'；

BIP:5'-CGAACCCCTACGGGAGATTCTTTTGTTGTTAGATACGACGCCA-3'。

2.一种包含权利要求1所述LAMP引物组的百合无症病毒的LAMP检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述百合无症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、10×buffer、Mg²⁺、dNTPs、Bst DNA聚合酶和甜菜碱，其中，内引物与外引物的浓度之比的范围为1-16：1。

4.根据权利要求3所述百合无症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.6μM，内引物BIP 0.8-1.6μM，外引物F3 0.1-0.8μM，外引物B3 0.1-0.8μM，Mg²⁺1.0-2.0mM，dNTPs 0.2-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.48U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比为1-16：1。

5.根据权利要求3所述百合无症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.0μM，内引物BIP 0.8-1.0μM，外引物F3 0.5-0.8μM，外引物B3 0.5-0.8μM，Mg²⁺1.3-1.7mM，dNTPs 0.3-0.4mM，甜菜碱0.5-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.32U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比范围为1-16：1。

6.根据权利要求3所述百合无症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，LAMP反应体系中，各成分终浓度为：内引物FIP 0.8μM，内引物BIP0.8μM，外引物F3 0.8μM，外引物B3 0.8μM，Mg²⁺1.5mM，dNTPs 0.4mM，甜菜碱0.6M，Bst DNA聚合酶0.16U/μL。

7.一种百合无症病毒的LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

2)配制LAMP反应体系

以ddH₂O为阴性对照，以包含百合无症病毒目的序列的质粒为阳性对照，配制LAMP反应体系；

所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.6μM，内引物BIP 0.8-1.6μM，外引物F3 0.1-0.8μM，外引物B3 0.1-0.8μM，Mg²⁺ 1.0-2.0mM，dNTPs 0.2-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.48U/μL，逆转录得到的cDNA模板1μL，其中，内引物与外引物的浓度比范围为1-16：1；

3)进行LAMP扩增反应

LAMP扩增反应反应程序为：57-62℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)中LAMP扩增反应结束后，向扩增产物中加入显色剂SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有百合无症病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含百合无症病毒；

或者取LAMP扩增产物，在Goldview染色的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察，若出现特征性的梯状条带，则样品为阳性，含有百合无症病毒；无条带出现的样品为阴性，不含百合无症病毒。

8.根据权利要求7所述百合无症病毒的LAMP快速检测方法，其特征在于，LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.0μM，内引物BIP 0.8-1.0μM，外引物F3 0.5-0.8μM，外引物B3 0.5-0.8μM，Mg²⁺1.3-1.7mM，dNTPs 0.3-0.4mM，甜菜碱0.5-0.6M，Bst DNA聚合酶0.16-0.32U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比范围为1-16:1。

9.如权利要求1所述LAMP引物组在百合无症病毒的RT-LAMP检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述RT-LAMP检测反应体系中，以待测样品RNA为模板，反应体系中各成分的终浓度为：内引物FIP 1.2-1.6μM，内引物BIP1.2-1.6μM，外引物F3 0.5-0.8μM，外引物B3 0.5-0.8μM，10×buffer，Mg²⁺1.3-1.7mM，dNTPs 0.3-0.4mM，甜菜碱0.4-0.6M，Bst酶0.15-0.35U/μL，DTT 0.15-0.2mM，逆转录酶3-4U/μL，待测样品RNA 20ng-5μg，反应程序为：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。