CN102816870B

CN102816870B - 柯萨奇病毒a6型rt-lamp核酸检测引物及试剂盒

Info

Publication number: CN102816870B
Application number: CN201210319290.7A
Authority: CN
Inventors: 何雅青; 陈惠玲; 舒柏华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102816870A

Abstract

本发明涉及生物检测技术应用领域，特别是柯萨奇病毒A6型RT-LAMP核酸检测用引物组及试剂盒，所述引物组包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、以及两条环引物LF和LB，所述试剂盒包括该引物组。本发明CA6RT-LAMP特异性强，灵敏度高，而且具有操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点，能够较好满足现场快速检测的要求，易于在基层单位推广应用，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构在手足口病等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

柯萨奇病毒A6型RT-LAMP核酸检测引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术应用领域，具体地说涉及柯萨奇病毒A6（Coxsackievirus A6，简称CA6）各种标本（粪便、肛拭，咽拭、疱疹液、脑脊液）核酸检测用引物及试剂盒。

背景技术

柯萨奇病毒A6为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picoranviridae)。CA6可引起手足口病和疱疹性咽峡炎等疾病。虽然通常不认为CA6是手足口病的主要病原，但近年在新加坡、芬兰、台湾和日本等国家和地区都有CA6导致手足口病暴发的报道，而且CA6引起的手足口病与其它型别肠道病毒所引起的更可能引起博氏线（Beau’s lines）和甲脱落等症状，其机制尚不清楚，但可能表示CA6较其它型别肠道病毒有更广的细胞感染谱，因此，CA6感染应受到重视。

手足口病于2008年5月2日已被纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。目前，经典的检测肠道病毒的方法多为采用细胞分离培养、特异性抗体检测，该方法步骤繁琐，检测周期长，而且一些肠道病毒难以在细胞中进行增殖，容易出现漏检；基于CA6核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR（real-timefluorescent RT-PCR）等在病原微生物的检测以及疫病诊断方面发挥着重大作用，但这些方法或者需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于现场样品的检测，不利于在基层推广，无法满足简单、快速、准确诊断的要求；而疫情的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此，建立一种快速、准确的新型诊断技术对于疫病的诊断就显得尤为重要。

环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi等于2000年报道的一种新型核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在等温（60～65℃）的条件下高效、特异、快速的扩增目的基因。目前，LAMP技术已经被广泛应用病原微生物的诊断中，包括人类致病细菌和病毒，动植物病毒和寄生虫的检测。

发明内容

本发明目的在于提供用于柯萨奇病毒A6型逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测的引物及试剂盒，以能够简单、快速、准确地检测样品中是否含柯萨奇病毒A6型，满足现场快速检测的需要。

本发明提供的用于检测柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP引物组，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、以及两条环引物LF和LB，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

本发明提供的柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，包括上述的RT-LAMP引物组。

本发明提供的一种柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，包括含有上述RT-LAMP引物组的RT-LAMP反应液，23μl所述RT-LAMP反应液的配置为：10×buffer 2.5μl，25mM MgCl₂ 5μl，10mM each dNTPs 3.5μl，40μM所述FIP 1μl，40μM所述BIP1μl，10μM所述F3 0.5μl，10μM所述B3 0.5μl，40μM所述LF 0.5μl，40μM所述LB 0.5μl，5U/μl AMV逆转录酶0.5μl，8U/μl Bst DNA polymerase 1μl，DEPC H₂O 6.5μl。

优选地，所述柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒还包括SYBR Green Ⅰ荧光染料。

上述柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒的最佳检测反应条件是63℃恒温反应40min，80℃反应5min。具体地，操作时只需将RT-LAMP反应液和待检RNA混匀，63℃反应40min即可完成逆转录和等温扩增过程，80℃反应5min使酶灭活，反应结束后结果判断可取扩增产物电泳检测，或者在扩增产物管内加入SYBR Green Ⅰ荧光染料，根据反应液颜色的变化来判定结果。

与现有的CA6RT-PCR、Real-time RT-PCR相比，本发明建立了CA6RT-LAMP检测技术，它以样品（粪便、肛拭，咽拭、疱疹液、脑脊液）RNA为模板，省略了单独的逆转录步骤和模板的变性、退火和延伸反应过程中温度变化的耗时，只需一步就可以完成在等温环境中的循环置换扩增反应，不需要复杂的仪器，最后用电泳或加荧光染料后肉眼、紫外光下就可以观察结果，具有操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点。同时，本发明CA6RT-LAMP特异性强，灵敏度高。因此，本发明试剂盒及CA6RT-LAMP检测技术能够快速、简单、准确地判断样品是否有CA6感染，能够较好满足现场快速检测的要求，易于在基层单位推广应用，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构在手足口病等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1是CA6RT-LAMP、RT-PCR灵敏度实验的结果图；其中，

图1-A和图1-B分别是CA6RT-LAMP产物加荧光染料后在可见光下观察的结果和紫外光下观察的结果，图中，1-8：分别为标准品RNA的10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6,10^-7,10^-8梯度稀释的RT-LAMP产物，9：阴性对照；

图1-C是CA6RT-LAMP产物电泳条带，图1-D是CA6RT-PCR产物电泳条带，LaneM：100bp DNA Ladder Marker(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1500bp)；Lane1-8：分别为标准品RNA的10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6,10^-7,10^-8梯度稀释的RT-LAMP产物；Lane 9：阴性对照；

图2是CA6RT-LAMP引物特异性实验的结果图；其中，

图2-A和图2-B分别是CA6RT-LAMP产物加荧光染料后在可见光下观察的结果和紫外光下观察的结果，图中，1-12：CA6病毒，13–24：分别为CA2,CA4,CA5,CA8,CA10,CA12,CA16,CB1,CB3,Echo9,Echo14及EV71病毒，25：阴性对照；

图2-C是CA6RT-LAMP产物电泳条带，Lane M：100bp DNA Ladder Marker；Lanes1–12：CA6病毒；Lanes 13–24：分别为CA2,CA4,CA5,CA8,CA10,CA12,CA16,CB1,CB3,Echo9,Echo14及EV71病毒；Lane 25：阴性对照；

图3是CA6RT-LAMP方法的可重复性检测实验的结果图；其中，

图3-A和图3-B分别是CA6RT-LAMP产物加荧光染料后在可见光下观察的结果和紫外光下观察的结果，图中，1、3、5、7：分别为CA6阳性标准品4次重复；2、4、6、8：分别为4次重复实验的阴性对照；

图3-C是CA6RT-LAMP产物电泳条带，Lane M：100bp DNA Ladder Marker；Lane 1、3、5、7：分别为CA6阳性标准品4次重复；Lane2、4、6、8：分别为4次重复实验的阴性对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：LAMP引物的设计和合成

根据GenBank公布的CA6VP1基因序列，利用生物软件CLAST分析其相对保守区，利用LAMP在线设计软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)针对相对保守序列区设计了6条引物，包括两条内引物FIP（F2+F1C）和BIP(B2+B1C)、两条外引物F3和B3、以及两条环引物LF和LB，分别与靶序列中8个结合区匹配，在利用Oligo 6软件和BLAST对引物进行评价。

引物序列为：

F3（正向外引）：5’-ACTCGCTGTGTGATGAATCG-3’；即SEQ ID NO:1

B3（反向外引）：5’-GCGTTGTGCTATCATTGAGG-3’；即SEQ ID NO:2

FIP(F1C+F2,正向内引）：

5’-CCTTCACCTCCACAACTCCTACTGAGGCGAGTGTGGAACA-3’；即SEQ ID NO:3

BIP(B1C+B2,反向内引)：

5’-TTGGCCCATAGATGTGATGGGCGGCATCAAAGCGCATGT-3’；即SEQ ID NO:4

LF：5’-GCCCTGCACGAGAGTAAAAG-3’；即SEQ ID NO:5

LB：5’-GCGGCGTAAACTGGAGCTGT-3’；即SEQ ID NO:6

其中，F2：5’-TGAGGCGAGTGTGGAACA-3’；即SEQ ID NO:7

F1C：5’-CCTTCACCTCCACAACTCCTAC-3’；即SEQ ID NO:8

B2：5’-CGGCATCAAAGCGCATGT-3’；即SEQ ID NO:9

B1C：5’-TTGGCCCATAGATGTGATGGG-3’；即SEQ ID NO:10

实施例2：RNA的提取

病毒样品RNA的抽提使用Roche High Pure Viral RNA Kit，步骤按照其操作说明书进行，具体步骤：1.在200μl样品处理液中加入400μl Binding Buffer，混匀后转移到滤柱上，8000g/min离心15s；2.弃滤液，更换收集管，加入500μl Inhibitor Removal Buffer，8000g/min离心1min；3.弃滤液，更换收集管，加入450μl Wash Buffer，8000g/min离心1min；4.重复步骤3一次；5.弃滤液，更换收集管，以离心机最大转速离心10s；6.将滤柱转移至1.5ml EP管，加入50μl Elution Buffer，8000g/min离心1min，洗脱液即为提纯核酸。病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取；粪便样品、肛拭子和咽喉拭子需经过预处理，在抽提前需加Hank’Balanced Salt Solution，其中，0.1g粪便样品（100μl液态）加1ml Hank’s液，充分振荡后将悬液8000rpm离心5min，取200μl上清液进行RNA抽提，用50μl Elution Buffer洗脱，于-80℃保存。

实施例3：CA6RT-LAMP扩增方法的建立

1、CA6RT-LAMP反应体系

以待检样品RNA为模板，进行RT-LAMP反应。

表1CA6RT-LAMP反应体系

组分	体积
		RT-LAMP反应液	23μl
RNA	2μl
		总体积	25μl

其中，RT-LAMP反应液配制参见表2。

表2CA6RT-LAMP反应液的配方

组分	终浓度	工作浓度	体积
				10×buffr	1×		2.5μl
MgCl₂	5mM	25mM each	5μl
				dNTPs	1.4mM each	10mM each	3.5μl
FIP	1.6μM	40μM	1μl
				BIP	1.6μM	40μM	1μl
F3	0.2μM	10μM	0.5μl
				B3	0.2μM	10μM	0.5μl
LF	0.8μM	40μM	0.5μl
				LB	0.8μM	40μM	0.5μl
AMV	2.5U	5U/μl	0.5μl
				Bst DNA polymerase	8U	8U/μl	1μl
DEPC H₂O			6.5μl

表2中的终浓度是指在CA6RT-LAMP反应体系中（即包括RT-LAMP反应液和待检样品RNA）的终浓度。

2、RT-LAMP反应条件

可将样品管放入63℃（60℃-65℃均可扩增）水浴锅恒温反应40min，或放入PCR仪设置63℃40min，80℃5min(灭活酶活性)，产物4℃保存。

3、试验结果

反应结束后结果判断：

①取3-5μl扩增产物电泳检测，可见LAMP产物特异性阶梯状条带；

②或者在扩增产物管内加入2.5μl 10×SYBR Green Ⅰ，荧光信号的增加与LAMP产物的增加完全同步，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，荧光信号增强，肉眼观察反应液呈绿色，紫外灯下观察发出绿色荧光，判为阳性；而不掺入链中的SYBR GreenI染料分子荧光不变，呈橙黄色，判为阴性；若结果反应液颜色与绿色或橙黄色不符，应重新检测。

实施例4：CA6RT-LAMP灵敏度实验

为了评价RT-LAMP方法的灵敏度，用CA6阳性RNA作为标准品，核酸定量仪测定OD260/280为2.0，RNA浓度为3ng/μl，换算成核酸拷贝数为1.5×10⁹copies/μl，将标准品RNA 10倍系统稀释成10^-1～10^-8共8个梯度稀释度，进行RT-LAMP扩增，测定其灵敏度，并与RT-PCR结果进行比较，结果证实CA6病毒检测的RT-LAMP、RT-PCR最低检测限分别为1.5×10²、1.5×10⁴copies/ube，即该RT-LAMP方法检测极限是RT-PCR的100倍，本发明灵敏度高，参见图1。

实施例5：CA6RT-LAMP特异性实验

利用建立起的RT-LAMP反应体系对13种不同的肠道病毒共24株进行检测，结果如图2所示，12株CA6病毒均出现相应的LAMP特异性梯状条带，加入荧光染料后均呈黄绿色，呈阳性反应；而其它12株肠道病毒（包括CA2,CA4,CA5,CA8,CA10,CA12,CA16,CB1,CB3,Echo9,Echo14和EV71病毒各1株）则均没有特异性梯状条带，加入荧光染料后均呈黄色，判为阴性。结果表明，所设计的引物只对目的病毒特异，与其它检测对象无交叉反应。

实施例6：CA6RT-LAMP重复性实验

为了验证RT-LAMP方法的可重复性，本方法采用同一操作者在同一实验室使用同一台仪器，按照优化好的RT-LAMP反应体系以及相同的反应试剂和条件，在较短时间内对样品进行同一标准品的4个平行重复性测定，结果如图3所示，表明本方法具有较好的可重复性。

<110> 何雅青

陈惠玲

舒柏华

<120> 柯萨奇病毒A6型RT-LAMP核酸检测引物及试剂盒

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

actcgctgtg tgatgaatcg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

gcgttgtgct atcattgagg 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ccttcacctc cacaactcct actgaggcga gtgtggaaca 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

ttggcccata gatgtgatgg gcggcatcaa agcgcatgt 39

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

gccctgcacg agagtaaaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

gcggcgtaaa ctggagctgt 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

tgaggcgagt gtggaaca 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

ccttcacctc cacaactcct ac 22

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 9

cggcatcaaa gcgcatgt 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 10

ttggcccata gatgtgatgg g 21

Claims

1.一种柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括含有F3、B3、FIP、BIP、LF和LB六条引物的RT-LAMP反应液，23μl所述RT-LAMP反应液的配置为

组分终浓度工作浓度体积 10×buffer 1× 2.5μl MgCl₂ 5mM 25mM each 5μl dNTPs 1.4mM each 10mM each 3.5μl FIP 1.6μM 40μM 1μl BIP 1.6μM 40μM 1μl F3 0.2μM 10μM 0.5μl B3 0.2μM 10μM 0.5μl LF 0.8μM 40μM 0.5μl LB 0.8μM 40μM 0.5μl AMV逆转录酶 2.5U 5U/μl 0.5μl Bst DNA polymerase 8U 8U/μl 1μl DEPC H₂O 6.5μl

所述六条引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

所述试剂盒的检测反应条件是63℃恒温反应40min，80℃反应5min。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括SYBR GreenⅠ荧光染料。