CN102373294B - 肠道病毒71型rt-lamp核酸检测试剂盒 - Google Patents

肠道病毒71型rt-lamp核酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术应用领域，特别涉及一种肠道病毒71型RT-LAMP核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括含四条RT-LAMP引物的RT-LAMP反应液，进一步还包括10000×SYBR Green I染料。具有特异性好、灵敏度高、操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点，能较好满足目前对手足口病现场检测的迫切需要，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构的现场快速检测，易于在基层单位大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

肠道病毒71型RT-LAMP核酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术应用领域，具体地说涉及肠道病毒71型各种标本(粪便、肛拭、咽拭、疱疹液、脑脊液)核酸检测用引物及试剂盒。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus 71，简称EV71)为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picoranviridae)肠道病毒属。肠道病毒71型与柯萨奇病毒A16(CoxsackievirusA16，CA16)同为儿童手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的两大主要病原。EV71感染除主要引起患者手足口病以外，还常常引起较为严重的并发症，如无菌性脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹等神经系统疾病和死亡，已在全世界范围内引起10多次大的暴发和流行。目前，人类是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播。近年来，EV71在亚太地区的流行呈逐年上升的趋势，且重症和死亡病例的报道也逐渐增多，进一步引起人们的重视与关注。
手足口病于2008年5月2日已被中国卫生部纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。目前，经典的检测肠病毒的方法多采用细胞分离培养、中和抗体检测、免疫组织化学法，这些方法步骤烦琐，检测周期长，而且一些肠道病毒难以在细胞中进行增殖，容易出现漏检；基于EV71核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)等在病原微生物的检测以及疫病诊断方面发挥着重大作用，但这些方法或者需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于现场样品的检测，不利于在基层推广，无法满足简单、快速、准确诊断的要求；而疫病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此，建立一种快速、准确的新型诊断技术对于疫病的诊断就显得尤为重要。
环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi等于2000年报道的一种新型核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温(60～65℃)的条件下高效、特异、快速的扩增目的基因。目前，LAMP技术已经被广泛应用病原微生物的诊断中，包括人类致病细菌和病毒，动植物病毒和寄生虫的检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于肠道病毒71型RT-LAMP检测的引物组和试剂盒，以能够简单、快速、准确地检测样品中是否含肠道病毒71型，满足目前对手足口病现场检测的需要。
本发明提供的用于检测肠道病毒71型的RT-LAMP引物组，包括四条引物，所述四条引物的核苷酸序列为：
F3：TCCCTTGCATGGCAAACC；
B3：GGGTACTTGGACTTGGAGGT；
FIP：GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-TTGTCAAGCTGTCAGACCCT；
BIP：ATCCCACATTCGGGGAACACAA-ACTGAGAACGTGCCCATCA。
本发明提供的肠道病毒71型的RT-LAMP检测试剂盒，包括上述RT-LAMP引物组。
本发明提供的一种肠道病毒71型的RT-LAMP检测试剂盒，包括含有上述RT-LAMP引物组的RT-LAMP反应液，23μl所述RT-LAMP反应液的配置为：10×buffer2.5μl，25mM MgCl2 6μl，10mM each dNTPs 3.5μl，5M Betaine 4μl，5U/μlAMV逆转录酶0.5μl，8U/μl Bst DNA polymerase 1μl，EDPC H2O 2.5μl，40μM所述FIP 1μl，40μM所述BIP 1μl，10μM所述F3 0.5μl，10μM所述B3 0.5μl。
上述试剂盒还可以包括10000×SYBR Green I染料。
上述试剂盒的最佳检测反应条件是63℃恒温反应60min，80℃反应5min。操作时只需将RT-LAMP反应液和待检RNA混匀，63℃恒温反应60min即可完成逆转录和扩增过程，80℃反应5min使酶灭活，反应结束后结果判断可取扩增产物电泳检测，或者在扩增产物管内加入SYBR Green I荧光染料，根据反应液颜色的变化来判定结果。
与现有的EV71 RT-PCR、Real-time RT-PCR相比，本发明EV71 RT-LAMP以待检样品RNA为摸板，只需一步就可以完成在等温环境中的循环置换扩增反应，省略了单独的逆转录步骤和模板的变性、退火和延伸反应过程中温度变化的耗时，而且在恒温水浴锅中就能进行，不需要复杂的仪器，最后用电泳检测或加荧光染料后肉眼或紫外灯下就可以观察结果，具有操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点。同时，本发明EV71 RT-LAMP特异性好，灵敏度高。因此，本发明试剂盒及其EV71RT-LAMP检测技术能较好满足目前对手足口病现场检测的迫切需要，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构的现场快速检测，易于在基层单位大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1是EV71 RT-LAMP、RT-PCR、Real-time RT-PCR灵敏度实验的结果图；其中，
图1-A是EV71 RT-LAMP产物加染料后在可见光下观察的结果(上排A1)和紫外光下观察的结果(下排A2)，图中，1-8：分别为100TCID50标准品100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释后提取RNA的RT-LAMP产物，9：阴性对照；
图1-B是EV71 RT-LAMP产物电泳条带，图中，M：DL2000 Marker，1-8：分别为100TCID50标准品100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释后提取RNA的RT-LAMP产物，9：阴性对照；
图1-C是EV71 RT-PCR灵敏度实验的结果图，图中，M：DL2000 Marker，1-8：分别为100TCID50标准品100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释后提取RNA的RT-PCR产物，9：阴性对照；
图1-D是EV71 RT-PCR Real-time灵敏度实验的结果图；
图2是EV71 RT-LAMP技术引物特异性实验的结果图；其中，
图2-A是LAMP产物加染料后在可见光下观察的结果(上排A1)和紫外光下观察的结果(下排A2)，图中，1-9：EV71病毒，10-12：CA16病毒，13-15：灭活的脊髓灰质炎病毒Polio I、Polio II、PolioIII，16：轮状病毒，17：诺如病毒，18：阴性对照；
图2-B是LAMP产物电泳条带，图中，M：DL2000 Marker，1-9：EV71病毒，10-12：CA16病毒，13-15：灭活的脊髓灰质炎病毒Polio I、Polio II、PolioIII，16：轮状病毒，17：诺如病毒，18：阴性对照；
图3是EV71 RT-LAMP技术扩增产物特异性实验的结果图，图中，M：DL2000Marker，1-9：分别是图2-B中9株EV71阳性RT-LAMP产物的酶切产物；
图4是EV71 RT-LAMP方法的可重复性检测实验的结果图；其中，
图4-A是LAMP产物加染料后在可见光下观察的结果(上排A1)和在紫外光下观察的结果(下排A2)，图中，1，3，5，7：分别为EV71阳性标准品的四次重复，2，4，6，8：分别为1，3，5，7四次重复性实验的阴性对照；
图4-B是LAMP产物电泳图，其中，M：DL2000 Marker，1，3，5，7：分别为EV71阳性标准品的四次重复，2，4，6，8：分别为1，3，5，7四次重复性实验的阴性对照。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
LAMP引物的设计和合成：
根据GenBank公布的EV71 VP1基因序列，利用生物软件CLAST分析其相对保守区，利用LAMP在线设计软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)针对相对保守序列区设计了4条引物，两条外引物FIP(F2+F1C)和BIP(B2+B1C)，两条内引物F3和B3，分别与靶序列中6个结合区匹配，在利用Oligo 6软件和BLAST对引物进行评价。
引物序列为：
F3(正向内引)：5’-TCCCTTGCATGGCAAACC-3’
B3(反向内引)：5’-GGGTACTTGGACTTGGAGGT-3’
FIP(F1C+F2，正向外引)：
GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-TTGTCAAGCTGTCAGACCCT
BIP(B1C+B2，反向外引)
ATCCCACATTCGGGGAACACAA-ACTGAGAACGTGCCCATCA
F2：5’-TTGTCAAGCTGTCAGACCCT-3’
F1C：5’-GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-3’
B2：5’-ACTGAGAACGTGCCCATCA-3’
B1C：5’-ATCCCACATTCGGGGAACACAA-3’
RNA的提取：
病毒样品RNA的抽提使用High Pure viral RNA kit(Roche，Germany)，步骤按其操作说明书进行，病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取；粪便样品、肛拭子和咽喉拭子需经过预处理，在抽提前需加Hank’Balanced Salt Solution，其中，0.1g粪便样品(100μl液态)加1ml Hank’s液，然后将悬液8000rpm离心5min，取200μl上清液进行RNA抽提，用50μl Elution Buffer洗脱，于-80℃保存。
EV71 RT-LAMP扩增方法的建立：
1、EV71 RT-LAMP反应体系
以待检样品RNA为模板，进行RT-LAMP反应。
EV71RT-LAMP反应体系
  组分   体积
  RT-LAMP反应液   23μl
  待检样品RNA   2μl
  总量   25μl
其中，RT-LAMP反应液配制参见表2。
表2EV71RT-LAMP反应液的配方
  组分   终浓度   工作浓度   体积
  10X buffer   1X   2.5μl
  MgCl2   6mM   25mM   6μl
  dNTPs   1.4mM each   10mM each   3.5μl
  Betaine   0.8M   5M   4μl
  FIP   1.6μM   40μM   1μl
  BIP   1.6μM   40μM   1μl
  F3   0.2μM   10μM   0.5μl
  B3   0.2μM   10μM   0.5μl
  AMV   2.5U   5U/μl   0.5μl
  Bst DNA polymerase   8U   8U/μl   1μl
  EDPC H2O   2.5μl
表2中的终浓度是指在EV71RT-LAMP反应体系中(即包括RT-LAMP反应液和待检样品RNA)的终浓度。
2、RT-LAMP反应条件
可将样品管放入63℃(60℃-65℃均可扩增)水浴锅或干浴器恒温反应1h，或放入PCR仪设置63℃1h，80℃5min(灭活酶活性)，产物4℃保存。
3、试验结果
反应结束后结果判断：
①取3-5μl扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见LAMP产物特异性梯状条带；
②或者在扩增产物管内加入0.5μl 10000×SYBR Green I，荧光信号的增加与LAMP产物的增加完全同步，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，荧光信号增强，肉眼观察反应液呈绿色，紫外灯下观察发出绿色荧光，判为阳性；而不掺入链中的SYBR Green I染料分子荧光不变，呈黄色，判为阴性；若结果反应液颜色与绿色或黄色不符，应重新检测。
EV71 RT-LAMP灵敏度实验：
为了评价RT-LAMP方法的灵敏度，用100TCID50 EV71毒株作为标准品(编号SHZH98)，按Karber方法计算EV71 100TCID50为3.14x109，取一个单位的100TCID5010倍系统稀释成100～10-7共8个梯度稀释度，取200μl各个稀释度的培养液，提取病毒RNA，提取方法同上，将上述提取的RNA作为模板，进行RT-LAMP扩增，测定其灵敏度，并与RT-PCR，Real-time RT-PCR结果进行比较，同时设阴性对照，RNA用量均为5μl。结果证实EV71病毒检测的RT-LAMP、RT-PCR、Real-time RT-PCR最低检测限分别为1.6×102、1.6×103、1.6×101copies/ml，即该RT-LAMP方法检测极限是RT-PCR方法的10倍，是Real-time RT-PCR的1/10倍，可见本发明敏感度高，参见图1。
EV71 RT-LAMP特异性实验：
1、引物特异性
利用建立起的RT-LAMP反应体系对5种不同的人类病毒共17株进行检测，结果如图2所示，9株EV71病毒均出现相应的LAMP特异性梯状条带，加入荧光染料后均呈绿色，呈阳性反应；而其他8株人类病毒(包括3株CA16病毒，3株灭活的脊髓灰质炎病毒Polio I、PolioII、PolioIII，1株轮状病毒，1株诺如病毒)则均没有特异性梯状条带，加入荧光染料后均呈黄色，判为阴性。结果表明，所设计的引物只对目的病毒特异，与其它检测对象无交叉反应。
2、产物特异性
虽然LAMP反应的扩增产物为大小不同的梯状条带，但是根据其设计原理，所有的产物均是以反应开始所形成的哑铃状茎环结构为基本扩增单位，也就是模板F2到B2之间的区域，因此为了验证扩增产物的正确性，本实验在所检测目标基因的F2到B2区间的序列中选择一个限制性酶切位点EcoR V酶进行酶切，上述9株EV71阳性的LAMP纯化产物均能够被所选的特异性内切酶切断，且酶切产物片段与预期的相同，102bp和132bp，见图3。
EV71RT-LAMP重复性实验：
为了验证RT-LAMP方法的可重复性，本方法采用同一操作者在同一实验室使用同一台仪器，按照优化好的RT-LAMP反应体系以及相同的反应试剂和条件，在较短时间内对同一标准品的RNA进行4次重复性测定，每次均设立阴性对照，结果如图4所示，表明本方法具有较好的可重复性。
Figure ISA00000229975200011

Claims (2)

1.一种肠道病毒71型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括含有F3、B3、FIP和BIP四条引物的RT-LAMP反应液，23μl所述RT-LAMP反应液的配置为
组分 终浓度 工作浓度 体积 10X buffer 1X 2.5μl MgCl2 6mM 25mM 6μl dNTPs 1.4mM each 10mM each 3.5μl Betaine 0.8M 5M 4μl FIP 1.6μM 40μM 1μl BIP 1.6μM 40μM 1μl F3 0.2μM 10μM 0.5μl B3 0.2μM 10μM 0.5μl AMV 2.5U 5U/μl 0.5μl Bst DNA polymerase 8U 8U/μl 1μl EDPC H2O 2.5μl
所述四条引物的核苷酸序列为：
F3：TCCCTTGCATGGCAAACC；
B3：GGGTACTTGGACTTGGAGGT；
FIP：GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-TTGTCAAGCTGTCAGACCCT；
BIP：ATCCCACATTCGGGGAACACAA-ACTGAGAACGTGCCCATCA；
所述试剂盒的检测反应条件是63℃恒温反应60min，80℃反应5min。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括10000×SYBR Green I染料。
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