CN101608242A - 一种基于rt-lamp技术的h3亚型流感快速检测分型方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于RT－LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，一、对流感病毒基因组序列数据库中H3亚型流感病毒的HA基因序列进行序列分析，设计出高特异的、高度保守的RT－LAMP专用引物，6条引物针对靶基因的8个区域，其中4条引物为FIP、BIP，F3和B3，另2条为loop引物LP1，LP2；二、对待检样本进行预处理后，提取样本的总RNA作为反应模板；三、配置RT－LAMP反应体系；四、将RNA模板本混入RT－LAMP反应体系中，置于水浴中，恒温条件下进行RT－LAMP扩增；五、将扩增后的反应产物进行判定，呈阳性则表示含有H3亚型流感病毒，呈阴性则表示H3亚型流感病毒。

Description

一种基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法

发明内容

本发明涉及一种基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法。

背景技术

流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流行性感冒病毒(Influenza virus)引起的一种急性呼吸道传染病，潜伏期为1-3天，临床表现为突然发病、高热、寒颤、头痛、肌痛、全身不适。一般患者一周左右可以康复，但对于某些特殊人群，如年龄低于2岁的婴幼儿，65岁以上的老人，原有基础疾病或免疫受抑制的病人等，这些人群发生严重流感和并发症的几率提高，病死率也相应增加。长期以来，流感一直是危害人类健康和公众安全的严重传染病，每年由此造成的经济损失也十分巨大。据世界卫生组织估计，每年全球流感患者约为6-12亿，其中约有3-5百万是重症流感患者，每年约有30-50万人死于流感。流感病毒在分类上属于正粘病毒科，根据核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)抗原性的不同，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流感病毒可以感染多种动物，是人类流感和动物流感的主要病原。B型和C型流感症状较A型轻，且仅感染人类，其中B型流感常呈地方流行性，C型流感一般散发。A型流感病毒根据其表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，可分为不同的亚型，目前在水禽中已发现16种HA亚型和9种NA亚型。在过去的一个世纪里，A型流感病毒引发4次人类流感大流行。自1977年以来，在全球流行的人类流感病毒主要是H1N1、H3N2、H1N2和B型病毒。A型病毒不仅血清型复杂，遗传变异也十分活跃，变异的方式主要有核苷酸点突变积累引起的抗原漂移和不同毒株基因节段重配引起的抗原转换两种。研究表明，每1-2年，H1和H3亚型流感病毒在人群免疫压力下都会发生一次大的抗原漂移，使疫苗接种预防效果和血清学诊断结果大打折扣。

近十多年来，禽流感病毒，包括H5N1、H9N2和H7N7亚型，特别是H5N1亚型病毒，在全球家禽中持续爆发流行。一般认为流感病毒具有宿主限制性，即禽流感病毒一般不易突破宿主种间屏障直接感染人。但近年来发生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，越来越多的证据表明禽流感病毒，特别是H5N1病毒，已经逐步获得直接感染人的能力。自1997年香港禽流感事件，截止2006年底，全球已有217例感染了H5N1病毒，其中死亡125例。根据以往大流感的经验和当前高致病性禽流感肆虐的严峻现实，H5N1病毒一旦获得在人际间传播的能力或与现在流行的人病毒基因重配，就可能引发新的流感大流行。因此必须面对的问题是应该采取何种策略和技术储备来应对可能到来的大流感。

流感病毒的有效检测技术对于指导临床预防和治疗流感具有重要意义，同时也是流感监测和控制世界性流感大流行的重要技术支撑。除了流感病毒，临床上引致人呼吸道疾病的病原体还有很多，包括某些病毒、细菌、支原体、螺旋体、寄生虫等，因此轻型流感及散发流感在临床上与普通感冒及其它病原引起的呼吸道疾病较难鉴别，对流感的确诊主要依靠实验室检测手段。自1933年流感病毒被第一次分离以来，发展出了许多不同的诊断方法，这些方法各有优缺点。目前流感的实验室诊断方法有病毒分离培养、检测抗体的血清学方法、检测抗原的免疫学方法和基于PCR的分子生物学方法。用鸡胚或细胞分离培养病毒是流感病毒鉴定的“黄金标准”，敏感性强，但需要3-7天时间，不适合早期诊断。血清学方法可以检测抗体，主要包括血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)、酶免疫试验(EIA)和间接免疫荧光法(IF)等。血清学检测需要采集患者急性期和康复期双份血清，属于回顾性诊断，具有流行病学意义，但对于急性早期诊断意义不大，且敏感性低。直接检测抗原方法有直接或间接荧光试验、酶联免疫试验等，时间为2小时-1天，适合早期快速诊断，但敏感性低，且不能进行大样本检测。分子生物学方法是针对病原核酸分子检测的一系列试验手段，主要包括RT-PCR、多重PCR、real-time PCR、NASBA等，这些方法都具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，可以对病毒进行定量和分型鉴定，但缺点是不能对大量临床标本进行同时平行检测和筛查。

在敏感性、特异性、快速、标本大量检测及病毒分型等方面，上述所有的检测方法都存在着一定缺陷，在临床确诊和流行病学监测中的应用都受到限制。RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测技术已被广泛采用，结果可靠，但荧光定量RT-PCR检测时间较短，但需要昂贵的检测仪器，很难在一线检测单位使用，常规的RT-PCR所需的PCR仪器成本虽比不上定量RT-PCR仪，但成本也可观，而且所需时间也要2-3小时才能出结果。基因芯片检测所需相关仪器更为昂贵，还需要专业的技术人员。

发明内容

本发明提供了一种一种基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，它不但特异性好，灵敏度高，而且检测的过程简单，成本低，耗时短，结果容易判断，适宜推广。

本发明采用以下技术方案：一种基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，它包括以下步骤：步骤一，检索流感病毒基因组序列数据库，对流感病毒基因组序列数据库中H3亚型流感病毒的HA基因序列进行序列分析，设计出6条高特异的、高度保守的RT-LAMP专用引物针对靶基因的8个区域，其中4条引物针对靶基因的6个区域，这4条引物为FIP、BIP，F3和B3，其余2条为loop引物LP1，LP2，loop引物LP1，LP2针对靶基因的2个区域；步骤二，收取待检样本进行预处理，然后从预处理后的待检样本中提取总RNA作为反应模板，总RNA在低温条件下进行保存待用；步骤三，配置RT-LAMP反应体系，首先在反应管中依次加入反应buffer，dNTPs，然后再加入LAMP专用引物FIP、BIP、F3、B3、LP1和LP2，逆转录酶和DNA扩增酶；步骤四，将步骤二中总RNA反应模板混入步骤三所配制的RT-LAMP反应体系置于水浴中，恒温条件下进行RT-LAMP扩增；步骤五，将步骤四中扩增后的反应产物进行判定，呈阳性则表示样本中含有H3亚型流感病毒，呈阴性则表示不含有H3亚型流感病毒。

本发明步骤二中采用Trizol法或总RNA提取试剂盒来提取待检样本的总RNA。本发明步骤一中各引物的序列表为：

序号	引物名	序列(5’→3’)
			1	FIP	GCTTCCATTTGGAGTGATGCATTCCGAAGTGGGAAAAGCTCAAT
2	BIP	GTAAACAGGATCACATATGGGGCGCATCCCTGTTGCCARTT
			3	F3	AATTGCTCCTCGGGGTTA
4	B3	CCGAATATGCCTCTAGTTTG

5	LP1	GCCAATGGGTGCATCTGAC
			6	LP2	GTCCCAGATATGTTAAGCAAAACAC

本发明步骤二中的预处理的过程为：首先对待检样本进行称重，然后再对待检样本进行研磨，保存总RNA的温度为-80℃。

本发明步骤三中各引物的浓度为：

序号	引物名	浓度(pmol)
			1	FIP	1-120
2	BIP	1-120
			3	F3	1-120
4	B3	1-120
			5	LP1	0.1-50
6	LP2	0.1-50

本发明所述的步骤四中反应的恒温的范围为55-65℃，反应时间范围为30-60min。本发明步骤五中的判定方法可以采用电泳法、浊度法或荧光法。

本发明具有以下有益效果：本发明是将目前先进的LAMP技术与逆转录技术进行综合形成RT-LAMP技术，它可以将逆转录与DNA扩增置于同一反应管中，整个反应只需一次加样过程，无需先逆转录成cDNA，再吸出此cDNA作模板进行DNA扩增，因而RT-LAMP技术在客观上最大程度地减少核酸的污染机会。LAMP法还具有以下优点：(1)扩增条件简便：只需在恒定温度的条件下进行扩增反应，不需要特定的扩增仪及其相关试剂，也不需要预先进行双链DNA的变性；(2)具有高特异性：它应用了6个区段、4种引物，并且这6个区段的顺序也有规定；因而LAMP法扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，即能够进行细菌或病毒的定性检测；(3)快速、高效地进行扩增：整个扩增在不到60min即可完成，若在引物上再进一步改进，可大大提高其扩增效率，扩增时间在原来的基础上减少1/3～1/2，本发明的loop引物，将RT-LAMP总反应时间控制在45min内；(4)灵敏度高：扩增模板可达1～10拷贝；(5)步骤简单：扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，就能够完全像DNA基因扩增那样，这样可以一步就实现RNA扩增；(6)鉴定简便：本发明可采用电泳法、或浊度法或荧光法，检测比较简单，结果判定通过肉眼或简易紫外灯即可作出准确判断，快速确认样本中是否含有H3亚型流感病毒，结果也很容易判定，检测灵敏度近似荧光定量RT-PCR。另外本发明不但耗时短，针对H3亚型流感的RT-LAMP仅45min，成本低，所用试剂比同类荧光定PCR的检测试剂相比要低，而且敏感性好，它可以针对H3亚型流感的RT-LAMP检测效果检测出RT-PCR漏检的样本。

附图说明

图1为本发明的流程示意图

图2为本发明采用电泳法的检测结果图

图3为本发明采用荧光法的检测结果图

具体实施方式

环介导等温扩增LAMP(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术特点是针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物[FIP(F1+F2C)BIP(B1C+B2)，F3，B3，]，利用一种链置换DNA聚合酶——Bst(Bacillusstearothermophilus)DNA polymerase，全反应过程在恒温条件(55-65℃)进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15～60min扩增10⁹～10¹⁰倍；特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的。

扩增原理：DNA在55-65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3′末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3′末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链，一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段，于是发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3′端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3′端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成LAMP法基因扩增循环的起点结构。LAMP法基因扩增循环：首先在哑铃状结构中，以3′末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。经过相同的过程，又形成环状结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。

LAMP扩增产物的检测：(1)荧光定量检测：利用SYBR Green工荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强800～1000倍的荧光的原理，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。在核酸大量合成时，SYBR Green I能自动掺入双链DNA，通过检测所产生的荧光强度，获取Ct值，比照标准曲线，可确定模板DNA的起始拷贝数。(2)副产物——焦磷酸镁的浊度检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀。反应方程式如下：(DNA)n一+dNTP一(DNA)n一1+P₂O₇+2Mg一Mg₂P₂O₇(沉淀)，具有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪在400nm光下，检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。

在图1中，本发明为一种基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，它是将常规RNA逆转录成cDNA技术和LAMP扩增技术进行综合，实现一步法(逆转录和LAMP于同一反应管中直接反应，无需先逆转录再进行LAMP扩增)，具体的操作步骤如下：

步骤一，检索流感病毒基因组序列数据库，对流感病毒基因组序列数据库中H3亚型流感病毒的HA基因序列进行序列分析，设计出6条高特异的、高度保守的RT-LAMP专用引物针对靶基因的8个区域，其中4条引物针对靶基因的6个区域，这4条引物为FIP、BIP，F3和B3，其余2条为loop引物LP1，LP2，loop引物LP1，LP2针对靶基因的2个区域，各引物的序列表为：

序号	引物名	序列(5’→3’)
			1	FIP	GCTTCCATTTGGAGTGATGCATTCCGAAGTGGGAAAAGCTCAAT
2	BIP	GTAAACAGGATCACATATGGGGCGCATCCCTGTTGCCARTT
			3	F3	AATTGCTCCTCGGGGTTA
4	B3	CCGAATATGCCTCTAGTTTG
			5	LP1	GCCAATGGGTGCATCTGAC
6	LP2	GTCCCAGATATGTTAAGCAAAACAC

各引物的浓度为：

序号	引物名	浓度(pmol)
			1	FIP	1-120
2	BIP	1-120
			3	F3	1-120
4	B3	1-120
			5	LP1	0.1-50
6	LP2	0.1-50

步骤二，收取待检样本进行预处理，预处理的过程为：(1)对待检样本进行称重，(2)对待检样本进行研磨，然后从预处理后的待检样本中提取总RNA，在待检样本中提取总RNA作为反应模板，本发明采用Trizol法或总RNA提取试剂盒来提取总RNA，以Trizol法提取总RNA为例，步骤如下：(1)取1.5mLEppendorf管，吸取200μL的样品液于管中；(2)加入700μLTrizol液，混匀后室温静置10min；加入200μL氯仿，震荡摇匀，室温静置10min，4℃12000rpm离心15min；(3)将上清液转移至新1.5mLEppendorf管中，加入与上清液等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃12000rpm离心10min，弃上清；(4)向沉淀中加入1mL 75％乙醇洗涤，4℃ 12000rpm离心5min，弃上清；(5)DEPC水溶解沉淀，得Total RNA溶液，提取的总RNA在-80℃下进行保存待用；

步骤三，配置RT-LAMP反应体系，首先在反应管中依次加入反应buffer，dNTPs，然后再加入LAMP专用引物FIP、BIP、F3、B3、LP1和LP2，逆转录酶和DNA扩增酶，下面以配置25μLRT-LAMP反应体系为例：

试剂	体积(μL)
		10×buffer	2.5
dNTPs	3
		betaine	3
FIP	1
		BIP	1
F3	1
		B3	1
LP1	1
		LP2	1
逆转录酶	0.5
		DNA扩增酶	1
ddH2O	4
		模板(RNA)	5
总体积	25

步骤四，将总RNA反应模板混入步骤三所配制的RT-LAMP反应体系，置于水浴中，在55-65℃的温度条件下进行RT-LAMP扩增，时间为30-60min；

步骤五，将步骤四中的扩增后的反应产物进行判定，呈阳性则表示样本中含有H3亚型流感病毒，呈阴性则表示不含有H3亚型流感病毒。

本发明采用的判定方法可以采用电泳法、浊度法或荧光法：

(1)电泳法：参见图2，从反应管中取出5μl反应产物，于1％核酸电泳胶中，120V电泳20分钟，在凝胶成像仪中看电泳结果，阳性样本(含有H3亚型流感病毒)应出现梯带状电泳条带，见图2中1表示的为阳性，而阴性结果则无任何电泳条带，见图2中2表示的为阴性，；

(2)浊度法：反应完成以，在阳性结果(含有H3亚型流感病毒)的反应管可以见到白色浊物，阴性的则没有；

(3)荧光法：参见图3，在配制反应液时加入适量的本发明所配制的荧光物质，其它的反应液同于上述的RT-LAMP组分及用量，待反应结束后，即可置于紫外灯下，观察荧光情况，阳性样本(含有H3亚型流感病毒)应出现绿色荧光，见图3中1表示的为阳性，而阴性结果则无荧光，见图3中2表示的为阴性，图3中2表示的为阴性对照(ddH₂O)。

Claims (7)

1、一种基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，它包括以下步骤：

步骤一，检索流感病毒基因组序列数据库，对流感病毒基因组序列数据库中H3亚型流感病毒的HA基因序列进行序列分析，设计出6条高特异的、高度保守的RT-LAMP专用引物针对靶基因的8个区域，其中4条引物针对靶基因的6个区域，这4条引物为FIP、BIP，F3和B3，其余2条为loop引物LP1，LP2，loop引物LP1，LP2针对靶基因的2个区域；

步骤二，收取待检样本进行预处理，然后从预处理后的待检样本中提取总RNA作为反应模板，总RNA在低温条件下进行保存待用；

步骤三，配置RT-LAMP反应体系，首先在反应管中依次加入反应buffer，dNTPs，然后再加入LAMP专用引物FIP、BIP、F3、B3、LP1和LP2，逆转录酶和DNA扩增酶；

步骤四，将步骤二中总RNA反应模板混入步骤三所配制的RT-LAMP反应体系置于水浴中，恒温条件下进行RT-LAMP扩增；

步骤五，将步骤四中扩增后的反应产物进行判定，呈阳性则表示样本中含有H3亚型流感病毒，呈阴性则表示不含有H3亚型流感病毒。

2、根据权利要求1中所述的基于RT-LAMP技术的H 3亚型流感快速检测分型方法，其特征是步骤二中采用Trizol法或总RNA提取试剂盒来提取待检样本的总RNA。

3、根据权利要求1中所述的基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，其特征是步骤一中各引物的序列表为：

  序号   引物名   序列(5’→3’)   1   FIP   GCTTCCATTTGGAGTGATGCATTCCGAAGTGGGAAAAGCTCAAT   2   BIP   GTAAACAGGATCACATATGGGGCGCATCCCTGTTGCCARTT   3   F3   AATTGCTCCTCGGGGTTA   4   B3   CCGAATATGCCTCTAGTTTG

  5   LP1   GCCAATGGGTGCATCTGAC   6   LP2   GTCCCAGATATGTTAAGCAAAACAC

4、根据权利要求1中所述的基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，其特征是所述的步骤二中的预处理的过程为：首先对待检样本进行称重，然后再对待检样本进行研磨，保存总RNA的温度为-80℃。

5、根据权利要求1中所述的基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，其特征是所述的步骤三中各引物的浓度为：

  序号   引物名   浓度(pmol)   1   FIP   1-120   2   BIP   1-120   3   F3   1-120   4   B3   1-120   5   LP1   0.1-50   6   LP2   0.1-50

6、根据权利要求1中所述的基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，其特征是所述的步骤四中反应的恒温的范围为55-65℃，反应时间范围为30-60min。

7、根据权利要求1中所述的基于RT-LAMP技术的H3亚型流感快速检测分型方法，其特征是所述的步骤五中的判定方法可以采用电泳法、浊度法或荧光法。

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