KR101310873B1

KR101310873B1 - Ａ형 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 ａ형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 ａ형 인플루엔자 바이러스 검출 방법

Info

Publication number: KR101310873B1
Application number: KR1020110009383A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김재홍
Original assignee: 재단법인차세대융합기술연구원
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2013-09-25
Also published as: KR20120099816A

Abstract

본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 진단에 관한 것으로, 보다 구체적으로, A형 인플루엔자 바이러스 유전자에 특이적인 프라이머, 이를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 검출 키트, 및 상기 프라이머를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ａ형 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 Ａ형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 Ａ형 인플루엔자 바이러스 검출 방법 {Primer set for detecting type A influenza virus, composition and kit for detecting type A influenza virus comprising the primer set, and method for detecting type A influenza virus using the same}

인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체이다. 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질(hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제(neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2(matrix, M₁, M₂), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2(polymerase subunit A, B1, B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2(nonstructural protein 1, 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.

인플루엔자 바이러스는 NP와 M 단백질의 항원성에 따라 A형, B형 및 C형 바이러스로 분류되며, 같은 A형 바이러스는 NP나 M 단백질의 항원성이 같다. 이 중 A형은 다시 HA(hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형까지, NA 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류 된다 (Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987).

인플루엔자 바이러스를 진단하기 위해, 바이러스를 분리하는 방법, 단백 항원이나 유전자를 검출하는 방법 및 혈청학적 검사법 등이 이용되고 있다. 이 중 가장 기준이 되는 방법은 바이러스 분리 후에 간접면역형광법이나 혈구응집억제시험법 등을 이용하여 동정을 하는 방법이지만, 최근에는 인플루엔자 바이러스 특이 유전자를 검출하는 분자생물학적인 진단법이 많이 사용되고 있다.

인플루엔자 바이러스의 분자진단 기술은 인플루엔자 바이러스의 형 및 아형을 구분하기 위해서, 검체 시료로부터 바이러스 RNA 를 추출한 후 18개 내지 60개의 뉴클레오타이드로 이루어진 NP, M 또는 HA 등의 바이러스 유전자에 특이적인 프라이머(primer)나 유전자 프로브(probe)를 사용하여, 역전사 중합효소 연쇄반응법(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), NASBA(nucleic acid sequence based amplification), DNA칩 등을 통하여 해당 유전자를 검출하게 된다(Fouchier et al., J. Clin. Microbiol., 38: 4096-4101, 2000). 따라서, 인플루엔자 바이러스의 분자진단의 효율을 높이기 위해서는 바이러스 게놈을 농축 및 정제하는 기술과, 민감성과 특이성이 뛰어난 프라이머나 프로브를 제조하는 기술이 필수적으로 요구되고 있다.

이 중, 바이러스 게놈을 농축 및 정제하는 기술로서, 자당 쿠션(sucrose cushion)이나 자당 밀도구배 원심분리(sucrose gradient)를 이용한 초원심분리법, PEG 농축법, 닭 혈구흡착법 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 모두 인플루엔자 바이러스에 특이적이지 않고, 특히 초원심분리법, PEG 농축법은 분자진단을 위한 바이러스 게놈 농축-정제에는 적당하지 않다는 단점이 있다. 또한, NP는 바이러스 게놈 RNA 를 감고 있으면서 RNA 복합체를 형성하고 있어 이 복합체를 RNP(RNA-nucleoprotein complex)로 부르고 있는데, 바이러스 게놈을 농축 및 정제하기 위해서는 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 RNP 를 농축 및 정제하는 기술이 요구되는 실정이다.

또한, 민감성과 특이성이 뛰어난 프라이머나 프로브를 제조하는 기술 역시 요구되는데, 이러한 분자진단의 민감성과 특이성을 결정하는 것은 상기 프라이머나 유전자 프로브의 염기서열이 얼마나 다양한 인플루엔자 바이러스의 해당 염기서열과 일치 하는가 이며, 민감성과 특이성을 높이기 위해서는 다양한 인플루엔자 바이러스의 유전자를 비교하여 가장 보존되어 있으면서도 미세한 염기서열의 변이에 의해 민감성과 특이성이 영향을 받지 않는 프라이머를 설계할 필요가 있다. 그러나 지금까지 인플루엔자 바이러스 진단을 위해 발표된 프라이머를 살펴보면 소수의 인플루엔자 바이러스의 유전자를 근거로 설계되었기 때문에 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 없는 문제점을 가지고 있다.

구체적으로, 분자진단에 있어 가장 중요한 것은 프라이머와 유전자 탐침의 표적 유전자와의 적합도인데 16-mer의 프라이머에서 중간에 부적합이 있는 경우 대부분의 조건에서 표적 유전자에 상보적으로 결합 되지 않으며 부적합이 3'-말단에 있는 경우, 즉 G-T, C-T 및 T-T 부적합인 경우 200, 1,400, 2,500배 DNA 합성 효율이 감소되는 것으로 알려져 있다(Petruska J, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85, 6252-6256; Sambrook J, et al., Working with synthetic oligonucleotide probes. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. pp. 11.6-11.7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989). 기존에 보고 된 인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머들의 염기서열을 Los Alamos National Laboratory의 인플루엔자 바이러스 유전자 데이터베이스의 유전자 염기서열과 비교한 결과 정방향(forward) 프라이머의 경우 30.2%-88.9%의 유사성을 보였고, 역방향(reverse) 프라이머의 경우 26.0%-84.0%의 유사성을 보였다. WHO에서는 Fouchier 등(Fouchier RAM., J. Clin. Microbiol., 38(11): 4096-4101, 2000)의 프라이머를 인플루엔자 진단용 프라이머로 추천하고 있으나 역방향 프라이머의 경우 데이터베이스 63.7%의 바이러스들만이 100% 동일한 염기서열을 보였고, 100% 염기서열이 동일하지 않은 경우에도 상당수에서 증폭이나 상보적인 결합에 영향을 주는 중간 부분이나 3'-말단 부분에서의 부적합이 관찰되어 진단용으로 사용하기에는 문제가 있다. 또한, 최근 실시간 RT-PCR에 가장 많이 사용되고 있는 Spackman 등(Spackman E, et al., J Clin Microbiol 2002, 40:3256-3260)의 역방향 프라이머의 경우 데이터베이스의 26.0% 바이러스에 대해서만 100% 동일한 염기서열을 보였고, 정방향 프라이머의 경우 30.2%의 바이러스에 대해서만 동일한 염기서열을 가지고 있어 다양한 바이러스에 적용할 수 없을 것으로 평가되었다(표 1 참조).

표 1은 기존에 알려진 프라이머와 데이터베이스의 인플루엔자 바이러스 M 유전자와 일치도를 비교한 결과를 정리한 것이다. 프라이머의 위치는 시작 코돈인 ATG의 A를 1번으로, A 이전의 뉴클레오타이드를 -1로 하여 번호를 붙여 각 프라이머의 위치를 표시하였다.

비교논문	프라이머(위치)	일치도 (일치된 유전자 수/ 전체 유전자 수)	서열번호
Van Elden et al., J Clin Microbiol 2001, 39:196-200	정방향: GGACTGCAGCGTAGACGCTT(217-236)	88.9%(4471/5030)	22
	역방향: CATYCTGTTGTATATGAGGCCCAT(382-405)	29.9%(1504/5030)	23
Spackman, et al., J Clin Microbiol 2002, 40:3256-3260	정방향: AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG(-2-22)	30.2%(1399/4635)	24
	역방향: TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCTG(76-99)	26.0%(894/3441)	25
Fouchier et al, J. Clin. Microbiol., 38: 4096-4101, 2000	정방향: CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA(7-29)	82.3%(3813/4635)	26
	역방향: AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA (228-251)	63.7%(3205/5030)	27
Lau et al, Biochem Biophysic Res Com 2004, 313:336-342	정방향: CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA(7-29)	82.3%(3813/4635)	28
	역방향: ARGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA(271-248)	84.0%(4225/5030)	29
Borm et al., Avian Dis 2007, 51:213-220	정방향: GAGTCTTCTAACCGAGGT(3-20)	56.2%(2603/4635)	30
	역방향: GATCACTTGAATCGCTGCA(761-743)	41.2%(2072/5030)	31
Trani et al., 2006, 6:87(doi:10.1186/1471-23634--6-87)	정방향: CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA(7-29)	82.3%(3813/4635)	32
	역방향: GGATTGGTCTTGTCTTTAGCCA(133-154)	80.1%(4030/5030)	33

이에, 본 발명자들은 보다 효율적이고 정확한 인플루엔자 바이러스의 분자진단 기술을 확립하기 위하여, 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 유전자를 농축 및 정제하고 인플루엔자 바이러스 유전자에 대하여 민감성과 특이성이 뛰어난 프라이머를 제조하고자 노력한 결과, 인플루엔자 바이러스 유전자를 농축 및 정제하는 최적의 반응 조건을 규명하고 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머를 설계할 수 있었으며, 이들을 이용하여 최적의 분자진단 조건을 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 A형 인플루엔자 바이러스의 M(matrix) 유전자와 상보적으로 결합가능한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 A형 인플루엔자 바이러스의 게놈을 농축 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 M(matrix) 유전자와 상보적으로 결합가능한 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "A형 인플루엔자 바이러스"란 오소믹소바이러스에 속하며 인플루엔자 바이러스 타입 A 를 유발하는 바이러스로서, 혈구응집 단백질(hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제(neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M₁, M₂), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2(polymerase subunit A, B1, B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2(nonstructural protein 1, 2; 각각 NS1, NS2)를 코딩하는 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 가지고 있다. 이의 진단방법으로는 PCR을 이용한 방법 등이 있으나, 기존 PCR을 이용한 진단 방법은 사용되는 프라이머의 민감도 및 특이도가 낮아 이로 인한 위양성 및 위음성의 소지가 존재하였다. 본 발명은 상기와 같은 진단 방법에 있어서, 모든 유전자 군을 검출할 수 있는 축퇴성(degenerate) 프라이머를 제공하며, 기존의 인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머들에 비해 다양한 인플루엔자 바이러스를 민감하게 검출할 수 있다는 장점을 갖는다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 M 유전자와 상보적으로 결합가능한 서열번호 1 의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 12 의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트에 관한 것이다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 서열번호 1 및 서열번호 12의 프라이머 세트를 필수로 포함하되, 여기에 서열번호 2 내지 서열번호 6 의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 서열번호 16 의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 서열번호 1 및 서열번호 12의 프라이머 세트를 필수로 포함하되, 서열번호 7 내지 서열번호 11 의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 17 내지 서열번호 21 의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다.

또는, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 서열번호 1 및 서열번호 12의 프라이머 세트를 필수로 포함하되, 여기에 서열번호 2 내지 서열번호 6 의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 서열번호 16 의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 추가로 포함하며, 여기에 서열번호 7 내지 서열번호 11 의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 17 내지 서열번호 21 의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 더욱 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머(primer)" 란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 목적상 프라이머는, A형 인플루엔자 바이러스의 M 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머이다. 따라서, 본 발명의 프라이머는 상기 유전자에 상보적으로 결합 가능한 7 내지 60, 보다 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍으로 이루어져 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및 서열번호 12의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 의하여 A형 인플루엔자 바이러스의 M 유전자가 특이적으로 증폭될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명자들은 A형 인플루엔자 바이러스 유전자 데이터베이스의 5,030개 유전자를 비교하여 가장 보존되어 있는 2개 부분을 선정하였고, 뉴클레오타이드 염기서열에 따라 유전자 군으로 분류한 후 모든 유전자 군을 검출할 수 있는 축퇴성(degenerate) 프라이머를 설계할 수 있었다.

본 발명에서 용어, "축퇴성(degenerate) 프라이머"란 염기서열 상의 유사성을 고려하여 유사한 염기서열에 결합할 수 있도록 하나의 위치에 두 개 이상의 염기가 존재하는 프라이머를 말한다. 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 11의 정방향 축퇴성 프라이머, 및 서열번호 12 내지 서열번호 21의 역방향 축퇴성 프라이머를 각각 표 5 및 표 6에 나타내었다. 축퇴성 프라이머에서 R 은 아데닌(a) 또는 구아닌(g), Y는 시토신(c) 또는 티민(t), M은 아데닌(a) 또는 시토신(c), K는 구아닌(g) 또는 t, S는 구아닌(g) 또는 시토신(c), W는 아데닌(a) 또는 티민(t), V는 아데닌(a), 시토신(c) 또는 구아닌(g), H는 아데닌(a), 티민(t), 또는 시토신(c), B는 구아닌(g), 티민(t) 또는 시토신(c), D는 구아닌(g), 아데닌(a) 또는 티민(t), 그리고 N은 아데닌(a), 시토신(c), 구아닌(g) 또는 티민(t)을 나타낸다.

본 발명의 프라이머 세트로 PCR을 수행한 경우, A형 인플루엔자 바이러스의 M 유전자를 특이적으로 검출할 뿐만 아니라 10^-7 배 희석된 RNA까지 검출할 정도로 아주 민감하다는 것을 확인할 수 있었다. 상기에서, '민감도(sensitivity)'는 질병이 있는 사람을 양성으로 검출하는 비율, 즉 병이 있는 사람을 병이 있다고 판단하는 비율을 의미한다. '특이도(specificity)'는 건강한 사람을 음성으로 검출하는 비율, 즉 정상인 사람을 정상이라고 판단하는 비율 또는 다른 질병과 구분하여 목적하는 질병만을 검출하는 비율을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있을 정도로 바이러스 분리주들 간에 보존되어 있고 뉴클레오타이드 변이에도 영향을 받지 않아 정확한 진단이 가능하다는 특징이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머 혼합물은 RNA 를 10^-7 배 희석한 경우에도 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있었으므로 그 민감도가 우수하며(도 3), 기존에 바이러스 유전자와의 일치도가 가장 높은 것으로 알려진 보인 Lau 등(Lau et al, Biochem Biophysic Res Com 2004, 313:336-342)의 프라이머와 비교하여도 더 우수한 민감도를 나타내었다(도 9). 또한, 본 발명의 프라이머 혼합물은 다른 공지된 바이러스는 검출하지 않고 인플루엔자 바이러스만을 특이적으로 검출하였으며(도 4), 다양한 H9N2 형 인플루엔자 바이러스는 물론(도 5), H1N1, H2N2, H3N2, H4N6, H5N3, H7N1, H8N4, H10N7, H11N9, H13N6의 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있어 특이도가 우수하였다(도 6).

따라서 상기 프라이머는 기존의 프라이머들에 비해 다양한 인플루엔자 바이러스를 민감하게 검출할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스의 감염여부, 감염된 인플루엔자 바이러스의 유전형의 확인, A형 인플루엔자 바이러스의 역학조사, A형 인플루엔자 바이러스의 백신의 유효성 및 위해도 조사 등에 효과적으로 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.

바람직한 양태로서 본 발명은 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수를 추가적으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출 및 정량용 조성물 및 키트일 수 있다. 또한, 상기 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소 등이 제한없이 사용될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 조성을 갖는 조성물을 제조하여 높은 민감도 및 특이도를 갖고 A형 인플루엔자 바이러스의 검출 및 정량할 수 있음을 확인하였다.

바람직하게 추가되는 효소는 Taq 중합효소일 수 있다. Taq 중합효소는 열 처리에 의해 활성화되는 효소로서 활성 부위에 효소가 부착되어 실온에서는 효소가 불활성을 나타내게 되므로, 증폭 과정에서 잘못된 프라이머가 신장 (extend)되지 않아, 일반적인 DNA 중합효소와 비교하여 높은 특이성과 높은 수율을 나타낼 수 있다. 그 외에도, T7 RNA 중합효소 또는 RNase 를 추가로 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, A형 인플루엔자 바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 개체의 생물학적 시료를 준비하는 단계; 및 상기 프라이머 세트를 사용하여 준비된 생물학적 시료 내의 A형 인플루엔자 바이러스의 M 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 A형 인플루엔자 바이러스로 감염되거나, 감염을 의심받는 개체 또는 A형 인플루엔자 바이러스 백신으로 백신화된 개체의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 A형 인플루엔자 바이러스 의심 개체의 혈액으로부터 수득되는 시료임이 바람직하다.

본 발명의 A형 인플루엔자 바이러스 M 유전자를 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법은 상기의 프라이머를 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다.

이런 방법에는 특정한 가닥의 프라이머를 사용하여 이를 검출하는 A형 인플루엔자 바이러스 DNA의 직접 확인법이 있고, 서던 블럿팅(southern blotting), 도트 블럿팅(dot blotting) 및 FISH(filter in situ hybridization) 등을 예로 들 수 있다. 다른 방법으로는 프라이머 쌍을 사용하여 A형 인플루엔자 바이러스 cDNA의 증폭을 이용하는 방법이 있고, 유전형-특이적 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR), 일반화된-프라이머(general-primer) PCR 등을 그 예로 들 수 있다. 보다 바람직하게는 PCR, RT-PCR, one-step RT-PCR, NASBA((nucleic acid sequence based amplification), 실시간 RT-PCR, 또는 DNA 칩에 의한 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)"은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 1985년 물리스(Mullis) 등에 의해 개발되었고, DNA 분자의 어느 부분이든지 그 경계 서열만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 변성, 결합 및 신장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제 1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시키는 변성단계이고, 제 2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시키는 결합단계이며, 제 3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 25 내지 30회 반복하는 신장단계이다.

바람직하게, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 임상 검체로부터 추출한 RNA로부터 역전사 반응을 통해 cDNA를 생성한 후 증폭시키는 역전사 중합효소 연쇄반응법(reverse transcription PCR; RT-PCR), 또는 상기 증폭 후 생성된 산물을 실시간으로 분석 검출하는 실시간-역전사 중합효소 연쇄반응법(real time RT-PCR)을 수행할 수 있다. 이러한 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR) 분석은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 수행될 수 있다.

PCR 결과의 신뢰성을 결정하는 가장 큰 요소는 프라이머로, 프라이머 서열에 따라서는 비특이적 증폭에 의해 잘못된 결과를 내릴 수도 있다. 그런 점에서, 본 발명은 신뢰할 수 있는 프라이머 쌍을 제공하는데 의의가 있다. 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 각 유전형별 A형 인플루엔자 바이러스를 정확하게 검출 가능하고 아주 적은 양까지도 민감하게 정량 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타낸다. 즉, 본 발명의 프라이머 쌍은 타당도(validity)와 신뢰도(reliability)가 높은 프라이머로, 이를 이용하여 얻은 결과를 신뢰할 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 개체의 생물학적 시료로부터 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP(RNA-nucleoprotein complex)를 농축 및 정제한 후 이로부터 추출한 RNA 로부터 M 유전자를 검출할 수 있다.

상기 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP의 농축 및 정제는 개체의 생물학적 시료에 1.0 %(v/v) 내지 5 %(v/v)농도의 Triton X-100(폴리에틸렌 글리콜 터트-옥틸페닐 에테르)을 처리하여 인플루엔자 바이러스 RNP를 농축 및 정제하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP의 농축 및 정제는 개체의 생물학적 시료에 1.0 %(v/v) 내지 5 %(v/v) 농도의 Triton X-100 을 처리하는 단계; NP 에 대한 항체를 처리하는 단계; 및 NP 에 결합한 항체를 특이적으로 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP의 농축 및 정제 방법을 통하여 A형 인플루엔자 바이러스로부터 게놈 RNA를 많은 양으로 수득할 수 있으므로, 본 발명의 프라이머를 사용하여 A 형 인플루엔자 바이러스 유전자를 검출하는 방법의 전단계에 유용하게 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 게놈을 농축 및 정제하는 방법에 관한 것이다. A형 인플루엔자 바이러스 게놈의 농축 및 정제는 바이러스의 RNP 의 농축 및 정제를 통하여 이루어질 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 개체의 생물학적 시료에 1.0 %(v/v) 내지 5 %(v/v) 농도의 Triton X-100 을 처리하는 단계를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP를 농축 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 RNP 를 농축 및 정제하는 방법은, 보다 구체적으로, 개체의 생물학적 시료에 1.0 %(v/v) 내지 5 %(v/v) 농도의 Triton X-100 을 처리하는 단계; NP 에 대한 항체를 처리하는 단계; 및 NP 에 결합한 항체를 특이적으로 분리 및 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 NP에 대한 항체는 1분 내지 30분 처리하는 것이 좋다.

본 발명에서 용어, "Triton X-100 이란 비이온계 계면활성제로서, 원래는 상품명으로 사용되었으나 고유명사로 굳어진 것이며, 그 화학식은 C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)n, 화합물명은 폴리에틸렌 글리콜 터트-옥틸페닐 에테르(Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)이다.

본 발명자들은 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP를 농축 및 정제하기를 위해 다양한 농도의 Triton X-100을 처리하여 바이러스 엔벨롭을 용해시켜 RNP를 노출시켰고, 바이러스 게놈 RNA를 감고 있어 RNP를 형성하는 NP(nucleoprotein)에 특이적인 단클론항체를 첨가하여 노출된 RNP와 반응한 후 2차 항체를 접합시킨 자성구(magnetic bead)와 결합시켜 이들을 자석으로 분리함으로써 RNP-단클론항체 복합체를 분리하였다. 이로부터 RNA를 추출하여 실시간 RT-PCR을 수행한 결과 Triton X-100를 1.5%(v/v) 내지 5%(v/v)를 처리했을 때 RNA 양이 8배 내지 64배 많은 것을 확인하였으며, 이로써 인플루엔자 바이러스의 RNP를 둘러싸고 있는 엔벨롭을 완벽하게 용해하면서도 단클론항체와 RNP와의 결합을 방해하지 않고 RNA 분해 효소의 작용을 최소화 할 수 있는 최적의 Triton X-100 농도 조건을 확립할 수 있었다.

본 발명의 바이러스 농축-정제 기술과 분자진단용 프라이머의 제공은 기존의 기술 보다 간편하고 특이적이며 다양한 아형의 A형 인플루엔자 바이러스 검출에 적용할 수 있어 인플루엔자 분자진단법의 정확성과 민감성을 향상시킬 수 있다.

도 1은 바이러스 배양액 내 바이러스를 농축-정제하는 경우와 그렇지 않은 경우의 바이러스 농축 정도를 실시간 RT-PCR로 비교한 결과이다.
도 2는 바이러스 분변 내 바이러스를 농축-정제하는 경우와 그렇지 않은 경우의 바이러스 농축 정도를 실시간 RT-PCR로 비교한 결과이다.
도 3은 MFN1-MFN6 프라이머 혼합물(mix)/MRON1-MRON5 프라이머 mix(FN1-11/RON1-10)를 사용한 RT-PCR의 민감도를 EID₅₀로 환산한 결과이다.
도 4는 MFN1-MFN11 프라이머 혼합물/MRON1-MRON10 프라이머 혼합물 (FN1-11/RON1-10)의 특이성을 확인한 결과이다.
도 5는 FN1-11/RON1-10 프라이머 혼합물의 검출능력을 알아보기 위해 국내에서 분리된 H9N2 바이러스를 RT-PCR로 검출한 결과이다.
도 6은 다양한 아형의 조류인플루엔자 바이러스에 대한 FN1-11/RON1-10 프라이머 혼합물의 검출능력을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행한 결과이다.
도 7은 H9N2 아형의 조류인플루엔자 바이러스(KBNP-0028)를 인공감염 시킨 후 맹장편도(cecal tonsil, CT) 시료로부터 RNA를 추출하여 개체 별로 FN1-11/RON1-10 프라이머 혼합물을 사용하여 RT-PCR로 검출한 결과이다.
도 8은 H9N2 아형의 조류인플루엔자 바이러스(KBNP-0028)를 인공감염 시킨 후 맹장편도(cecal tonsil, CT) 시료로부터 RNA를 추출하여 pooling 한 후 10진 희석하여 FN1-11/RON1-10 프라이머 혼합물을 사용하여 RT-PCR로 검출한 결과이다.
도 9는 Lau의 정방향 프라이머 서열과 A/New York/105/2002(H3N2) (GenBank 등록번호: CY001129) 바이러스의 게놈 염기서열 중 상기 프라이머와 결합하는 부분의 염기서열을 나타낸 것이다. 상기 서열 중 부적합을 보이는 뉴클레오타이드를 굵게 밑줄을 그어 표시하였다. 또한, A/New York/105/2002(H3N2) 바이러스와의 부적합을 PR8 바이러스 RNA로 재현하기 위해, Lau(Lau et al, Biochem Biophysic Res Com 2004, 313:336-342) 의 정방향 프라이머의 9번째 C를 T로 치환시킨 돌연변이 정방향 프라이머(mutant forward primer)의 서열을 나타낸 것이다.
도 10은 Lau 의 프라이머와 본 발명의 프라이머의 RRT-PCR 을 통한 증폭 능력을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인플루엔자 바이러스의 농축 및 정제

<1-1> 바이러스 배양액 농축-정제

KBNP-0028 바이러스 (기탁번호: KCTC 10866BP, 한국등록특허 제0708593호)를 10일령 SPF 발육란에 접종하여 37℃에서 3일간 배양한 후 4℃에서 종야로 정치한 후 요막액을 수확하여 10^-9까지 10진 희석하였다. 상기 10^-6 내지 10^- ⁹의 각 희석액 200㎕ 씩을 4개의 SPF(specific pathogen free) 발육란 (SPAFAS)의 요막강 경로로 접종하여 3일간 오전과 오후에 캔들링하여 계태아의 생존여부를 조사하였고, 3일째 4℃에 종야로 정치한 후 수확한 요막액 50㎕와 0.5%의 닭혈구 50㎕를 혼합하여 혈구응집여부를 조사하였다. 각 희석배수에서 혈구응집 양성수를 조사하여 Reed-Muench 방법으로 50% 계태아 감염역가 (EID₅₀/200㎕)를 측정한 결과 10^8.16/200㎕ 이었고, 바이러스는 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

대조군으로서, 요막액을 인산완충용액으로 100배 희석한 후 100 ㎕로부터 RNA를 QIAGEN 사의 RNeasy kit를 사용하여 추출하여 40㎕의 DEPC-처리 멸균 3차 증류수에 용출하였다. 실험군으로서, 바이러스 RNP 농축-정제를 위해 100배 희석된 바이러스 10ml에 Triton X-100을 0.3%(v/v), 0.5%(v/v), 0.7%(v/v), 1.0%(v/v), 1.5%(v/v) 되도록 첨가한 후 바이오노트 사(영통, 대한민국)의 NP 특이 단클론 항체(#16, 4.09mg/ml) 5㎕(20㎍)와 항-생쥐 IgG 면양 항체를 표면에 결합시킨 자성구(magnetic beads, Dynabeads^®-280, 6.7x10⁸ beads/ml) 5㎕(3.35x10⁶beads)를 첨가하여 실온에서 30분간 교반한 후 자석을 이용하여 자성구를 포집한 후 수용액을 제거하였고, 자성구에 인산완충용액 100㎕ 를 첨가한 후 QIAGEN사의 RNeasy kit를 사용하여 동일한 방식으로 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA의 상대적인 양을 비교하기 위해 Real-time RT-PCR을 수행하였다. QIAGEN 사의 QuantiTect^®SYBR^®Green RT-PCR kit의 SYBR 반응 혼합액 5㎕와 RT 혼합액 0.2㎕, MFN1-11 0.2㎕, MRON1-10 0.2㎕, DEPC-처리 멸균 3차 증류수 0.6㎕, RNA 4㎕를 혼합한 후 Applied Biosystems 사의 StepOne^TM Real-time PCR system을 사용하여 50℃-2분-95℃-5분 배양한 후 95℃-15초-50℃-20초-68℃-25초 반응을 40회 반복한 후 95℃-15초-60℃-1분-95℃-15초 반응하며 Tm 값을 측정하였다.

그 결과, 농축과정 없이 100㎕ 로부터 RNA를 추출한 경우 C_T (Threshold of Cycles) 값으로 24.95를 보인 반면 0.3%(v/v)와 0.5%(v/v) Triton X-100을 처리한 경우 20.93과 21.93, 0.7%(v/v)의 경우 19.95, 1.0%와 1.5%의 경우 18.95와 18.96의 C_T 값을 보여 1.0%(v/v)와 1.5%(v/v)의 Triton X-100을 처리하는 경우 특이적인 증폭산물이 100㎕ 로부터 RNA를 추출한 경우보다 6 cycles (18.95-24.95=6, 2⁶=64) 앞서 검출되어 RNA의 양이 약 64배 많은 것으로 평가되었다. 이는 RNP 정제를 10ml를 가지고 했으므로 실제 100㎕ 로부터 RNA를 추출한 경우 대비 100배 양이므로 수득율은 64%에 해당하였다(도 1 참조). Triton X-100의 농도는 1%(v/v) 이상을 사용하는 경우 가장 좋은 결과를 보였다.

Triton X-100은 바이러스의 엔벨롭을 녹여 바이러스를 불활화 하는 능력을 가지고 있으므로, Triton X-100 의 희석 배수에 따른 항바이러스 효과를 확인하기 위하여, 96-웰 세포배양용기에서 배양한 계태아 신장세포에 KBNP-0028 바이러스 100배 희석액을 첨가하고 여기에 Triton X-100를 무첨가하거나 0.3%(v/v) 및 0.5%(v/v) Triton X-100를 각각 첨가한 후, 이를 각각 10진 희석하여(10^-1내지 10^-7) 각 희석배수에 대해 4개 웰씩 접종하였다.

그 결과, Triton X-100 무첨가군의 경우 10^-5희석했을 때 4개 웰 중 1개 웰에서 바이러스 증식이 확인되었으나 0.3%(v/v) 및 0.5%(v/v)의 Triton X-100을 처리한 군에서는 바이러스의 증식이 전혀 관찰되지 않았다. 즉, Triton X-100을 0.3%(v/v) 이상 처리하는 경우 시료 내 인플루엔자 바이러스를 모두 불활화 할 수 있어 Triton X-100을 1%(v/v) 이상 첨가하는 경우 인플루엔자 바이러스 RNP를 효율적으로 노출시켜 농축 및 정제 효율을 높일 수 있으면서 시험자의 안전에도 도움이 될 것으로 평가되었다(표 2 참조).

표 2는 희석 배수에 따른 Triton X-100의 항-인플루엔자 효과를 나타낸 것이다.

희석배수	0	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7
Triton X-100 첨가군	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	1/4	0/4	0/4
Triton X-100 0.3%(v/v)	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4
Triton X-100 0.5%(v/v)	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4

<1-2> 분변 내 바이러스 농축-정제

닭의 신선한 분변 25g에 상기의 KBNP-0028 바이러스 100배 희석액 100㎕를 첨가한 후 25ml 의 인산완충용액을 첨가하여 고르게 부유시켜 2,000xg에서 15분간 원심분리 한 후 상층액을 받아 다시 탁상용 원심분리기(한일과학)로 14,000rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 수확하였다. 상층액을 인산완충용액으로 10배 희석한 후, 대조군으로서 상기 희석액 100㎕ 로부터 QIAGEN 사의 RNeasy kit를 사용하여 RNA를 추출하였고, 실험군으로서 50ml 원심분리용 용기 6개에 희석된 바이러스 10ml 씩 분주하고 Triton X-100을 1.0%(v/v), 2.0%(v/v), 4.0%(v/v), 6.0%(v/v), 8.0%(v/v) 및 10%(v/v) 되도록 첨가한 후, 상기의 자성구와 단클론항체를 각각 10㎕씩 첨가하고 실온에서 30분간 교반한 후 자석을 이용하여 자성구를 포집한 후 수용액을 제거하였고, 자성구에 인산완충용액 100㎕ 를 첨가한 후 QIAGEN사의 RNeasy kit를 사용하여 동일한 방식으로 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 의 상대적인 양을 비교하기 위하여 RRT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 정제하지 않고 100㎕에서 RNA를 추출한 경우 C_T =27.31을 보인 반면 Triton X-100을 1.0%(v/v), 2.0%(v/v), 4.0%(v/v), 6.0%(v/v), 8.0%(v/v) 및 10%(v/v) 되도록 첨가한 경우 각각 C_T =25.64, C_T =24.34, C_T =24.05, C_T =24.64, C_T =25.93, C_T =26.13을 보여 4.0%(v/v)일 때 가장 RNP 수득율이 좋았는데 정제하지 않은 경우 대비 8배의 수득율 (27.31-24.05=3, 2³=8)을 보였다 (표 3 참조). Triton X-100을 5%(v/v) 첨가하여 동일한 방법으로 실험을 수행한 결과 C_T =18.72를 보여 정제하지 않고 100㎕에서 RNA 추출한 경우 (C_T =24.34) 보다 16배 이상의 수득율 (22.34-18.72=3, 2³=16)을 보였다 (도 2 참조).

표 3은 Triton X-100 농도에 따른 분변 내 인플루엔자 RNP 농축 효율을 비교한 것이다.

Triton X-100 농도	Triton X-100 무첨가군 (100㎕)	Triton X-100 1.0%(v/v)	Triton X-100 2.0%(v/v)	Triton X-100 4.0%(v/v)	Triton X-100 6.0%(v/v)	Triton X-100 8.0%(v/v)	Triton X-100 10%(v/v)
C_T 값	27.31	25.64	24.34	24.05	24.64	25.93	26.13

실시예 2. 프라이머의 제조

<2-1> 데이터 마이닝

인플루엔자 바이러스 유전자 데이터베이스(Los Alamos National Laboratory의 인플루엔자 바이러스 유전자 데이터베이스; http://www.fludb.org)에서 5,219개의 M(matrix) 유전자 염기서열을 FASTA 포맷으로 다운로드 받았다. 참고로 상기 인플루엔자바이러스를 타입 별로 분류하여 하기 표 4에 기재하였다.

표 4는 분석에 사용한 인플루엔자바이러스의 다양성을 나타낸다. 단, 198개(5,219-5,021)는 타이핑 되지 않아 포함되지 않았다.

	N1	N2	N3	N4	N5	N6	N7	N8	N9	합계
H1	588	93	2	0	2	5	1	0	1	692
H2	16	79	19	1	9	0	4	3	20	151
H3	10	1844	6	3	4	49	0	79	2	1,997
H4	4	14	5	2	2	75	0	22	6	130
H5	1029	68	29	4	0	1	3	5	1	1,140
H6	58	71	6	6	17	11	0	43	3	214
H7	26	61	69	3	2	0	27	4	3	195
H8	0	0	0	9	0	0	0	0	0	9
H9	10	318	1	0	5	3	0	2	1	340
H10	3	1	1	2	4	2	19	5	1	38
H11	6	10	6	2	0	5	0	4	30	63
H12	1	1	0	3	15	0	0	1	1	22
H13	0	5	1	0	0	10	2	1	1	20
H14	0	0	0	0	1	1	0	0	0	2
H15	0	0	0	0	0	0	0	0	3	3
H16	0	0	5	0	0	0	0	0	0	5
합계	1,751	2,565	150	35	61	162	56	168	73	5,021

<2-2> 인플루엔자 바이러스의 보존적 서열( conservative sequence ) 탐색

상기 <실시예 2-1>에서 FASTA 포맷으로 전환된 유전자 염기서열을 다중배열하여 보존적 서열을 탐색하였다. 구체적으로 상기 M 유전자 염기서열 중 300개를 MEGA ver. 3.0 프로그램을 사용하여 다중 배열하여 비교하였다. 그 결과 80% 이상의 일치도를 보인 Van Elden 등(Van Elden et al., J Clin Microbiol 2001, 39:196-200) 의 정방향 프라이머와 Lau 등(Lau et al, Biochem Biophysic Res Com 2004, 313:336-342) 및 Trani 등(Trani et al., 2006, 6:87)의 진단용 정방향 프라이머로 사용된 Fouchier 등(Fouchier et al, J. Clin. Microbiol., 38: 4096-4101, 2000)의 정방향 프라이머는 바이러스 RNA와의 결합을 저해하는 부적합이 관찰되어 개선이 필요하였고, 역방향 프라이머의 경우 Lau 등의 프라이머가 가장 보존되어 있었으나 역시 부적합이 관찰되었으나 이 프라이머와 겹치지 않으나 조금 앞 쪽에 보다 보존된 부분이 존재한다는 사실을 확인하였다.

<2-3> 프라이머의 제작

상기 <실시예 2-2>에서 밝힌 인플루엔자 바이러스의 보존적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 가급적 GC 함량이 50%가 되면서 19내지 21개의 뉴클레오타이드를 가지며 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 상보적이지 않도록 직접 비교하여 설계하였다. 상기와 같이 설계된 프라이머의 종류를 하기 표 5 와 6에 기재하였다. 밑줄친 염기는 축퇴성(degeneracy) 부위를 나타낸다.

프라이밍 사이트에서의 뉴클레오티드 다양성	데이터베이스 검색된 건수	프라이머 서열(7-27)	서열의 증폭가능성
CTTCTAACCGAGGTCGAAACG CTTCTAAC A GAGGTCGAAACG CTTCT G ACCGAGGTCGAAACG CTTCT G AC A GAGGTCGAAACG T TTCTAACCGAGGTCGAAACG A TTCTAACCGAGGTCGAAACG	3933 491 121 1 4 1	MFN1 CTTCT R AC M GAGGTCGAAACG\ (서열번호 1)	98.2%　 (4551/4635)
CTTCTAACCGAGGT T G G AACG CTTCTAACCGAGGT T GAAACG CTTCTAACCGAGGT T GA C ACG	2 20 2	MFN2 CTTCTAACCGAGGTTG RM ACG (서열번호 2)	0.52% (24/4635)
CTTCTA C CCGAGGTCGAAACG CTTCTAAC T GAGGTCGAAACG T TTCTA C CCGAGGTCGAAACG	7 10 1	MFN4 CTTCTA M C Y GAGGTCGAAACG (서열번호 4)	0.39% (18/4635)
CTT T TAACCGAGGTCGAAACG CTTC C AACCGAGGTCGAAACG T TT T TAACCGAGGTCGAAACG	8 4 2	MFN5 CTT YY AACCGAGGTCGAAACG (서열번호 5)	0.30% (14/4635)
CTTCT G ACCGAGGT T GAAACG CTTCT T ACCGAGGTCGAAACG	2 8	MFN6 CTTCTKACCGAGGTYGAAACG (서열번호 6)	0.21% (10/4635)
CTTCTAACCGA A GTCGAAACG CTTCTAACCGAGGTC A AAACG	3 1	MFN3 CTTCTAACCGA R GTC R AAACG (서열번호 3)	0.09% (4/4635)
합계	4,623		99.7% 4621/4635
CTTCTAACCGAGGTCGAAAC T CTTCTAAC A GAGGTCGAAAC A CTTCTAACCGAGGTCGAAAC A	2 3 1	MFN7 CTTCTAAC M GAGGTCGAAAC W (서열번호 7)	0.30% (12/4635)
CTTCTAAC G GAGGTCGAAACG CTTCTAA T CGAGGTCGAAACG	1 1	MFN8 CTTCTAA YS GAGGTCGAAACG (서열번호 8)
CTTCTAACCGAGGT A GAAACG CTTCTAACCGAGGTCGAAA A G	1 1	MFN9 CTTCTAACCGAGGT M GAAA M G (서열번호 9)
CTTCTAACCG GA GTCGAAACG	1	MFN10 CTTCTAACCGGAGTCGAAACG (서열번호 10)
CTTCTA C C G GAGGTCGAAACG	1	MFN11 CTTCTACCGGAGGTCGAAACG (서열번호 11)
총 합계	4633		99.9%

프라이밍 사이트에서의 뉴클레오티드 다양성	데이터베이스 검색된 건수	프라이머 서열(207-225) (역-상보적)	서열의 증폭가능성
CAGTGAGCGAGGACTGCAG CAGTGAGCG G GGACTGCAG CAGTGA A CGAGGACTGCAG CAGTGAGCGAGGACTGCA A	4253 567 68 70	MRON1 CTGCAGTCC Y CG Y TCACTG (서열번호 12)	98.6% (4958/5030)
CAG C GAGCGAGGACTGCAG CAG C GAGCG G GGACTGCAG	20 2	MRON5 CTGCAGTCC Y CGCTCGCTG (서열번호 16)	0.44% (22/5030)
C G GTGAGCGAGGACT T CAG CAGTGAGCGAGGACT T CAG CAGTGAGCGAGGACT A CAG	1 11 1	MRON6 CTG W AGTCCTCGCTCAC Y G (서열번호 17)	0.26% (13/5030)
CAGTGAGCG G GGACTGCA A CAGTGAGC A AGGACTGCAG	3 7	MRON4 CTGCAGTCC YY GCTCACTG (서열번호 15)	0.20% (10/5030)
A AGTGAGCGAGGACTGCAG T AGTGAGCG G GGACTGCAG T AGTGAGCGAGGACTGCAG	8 1 1	MRON7 CTGCAGTCC Y CGCTCACT W (서열번호 18)	0.20% (10/5030)
CA C TGAGCGAGGACTGCAG CA C TGAGCGAGGACTGCA T CAGTGAGCGAGGAC A GCAG	2 1 3	MRON3 CTGC W GTCCTCGCTCA S TG (서열번호 14)	0.12% (6/5030)
합계	5,019		99.8% (5019/5030)
CA A TGAGCGAGGACTGCAG CAGTGAGCGAGG G CTGCAG	3 2	MRON8 CTGCAG Y CCTCGCTCA Y TG (서열번호 19)	0.20% (11/5030)
CAGT A AGCGAGGACTGCAG CAGT C AGCGAGGACTGCAG	1 1	MRON2 CTGCAGTCCTCGCT K ACTG (서열번호 13)
CAGTGAGCGAGGA G TGCAG C G GTGAGCGAGGACTGCAG	1 1	MRON9 CTGCA S TCCTCGCTCAC Y G (서열번호 20)
CAGTGAGCGA A GACTGCAG CAGTGAGC C AGGACTGCAG	1 1	MRON10 CTGCAGTC Y T S GCTCACTG (서열번호 21)
총 합계	5030		100%

상기 표 5와 표 6에 기재된 바와 같이, MFN1 및 MRON1 프라이머는 각각 98.2%와 98.6%의 인플루엔자 바이러스 유전자를 증폭할 수 있을 것으로 분석되었다. 또한 MFN1내지 MFN6 프라이머의 혼합물(이하 'FN'이라 함)과 MRON1, MRON3, MRON4, MRON5, MRON6, MRON7 프라이머의 혼합물(이하 'RON'이라 함)은 각각 99.7%와 99.8%의 인플루엔자 바이러스 유전자를 증폭할 수 있을 것으로 분석되었다.

특히, MFN1 내지 MFN11 프라이머의 혼합물(이하 'MFN1-11' 이라 함)과 MRON1 내지 MRON10 프라이머의 혼합물(이하 'MRON1-10' 이라 함)은 모든 인플루엔자 바이러스 유전자를 증폭할 수 있을 것으로 분석되었다.

상기와 같이, 본 연구에서 개발된 프라이머들 중 MFN1과 MRON1은 각각 98.2%와 98.6%의 인플루엔자 바이러스 유전자를 증폭할 수 있어, 상기 표 1에 기재된 종전 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 보다 높은 검출율을 가질 수 있음을 알 수 있었다. 특히 MFN1 내지 MFN11 및 MRON1 내지 MRON10 프라이머를 모두 혼합하여 사용하는 경우 거의 모든 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 프라이머의 검출한계 평가 ( One - step RT - PCR )

MFN1-6/MRON1-5 혼합물(mix)를 사용하여 본 발명의 프라이머의 검출한계를 평가하였다. 구체적으로, 조류 인플루엔자 바이러스 KBNP-0028로 감염된 요막액 150㎕에서 RNA를 추출(QIAamp Viral RNA mini kit)하였다. 상기 추출한 RNA를 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7배희석하고, one-step RT-PCR 키트(QIAGEN 사)를 이용하여 50℃에서 30분, 95℃에서 15분으로 1차 사이클을 수행하고, 94℃에서 10초, 46℃에서 20초, 68℃에서 20초로 구성된 2차 사이클을 40회 반복한 다음, 72℃에서 3분 동안 3차 사이클을 수행하였다. 상기 RT-PCR을 수행한 결과를 도 3에 기재하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 혼합물은 RNA를 10^-7배 희석한 경우에도 조류 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있었다. 따라서 본 발명의 프라이머 혼합물을 이용한 검출 방법은 종래 계태아 접종에 의한 바이러스 분리법 (1 EID₅₀, 50% 계태아 감염 역가)보다 민감도가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 4. 프라이머를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출

<4-1> 인플루엔자 바이러스 검출 특이성

MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물의 인플루엔자 바이러스 검출 특이성을 살펴보기 위해, 조류 인플루엔자 바이러스(SNU-AIV-0037, H9N2 AIV; Kwon 등, Avian Pathology, 35:309-315, 2006)와 다른 공지된 바이러스(SNU-NDV-0125, 조 선희, 서울대학교 박사학위 논문 2007; KM91, 김재홍, 서울대학교 박사학위 논문 1994; SNU-IBV-7001 서울대학교 조류질병학실 2007년 분리된 전염성기관지염 바이러스)를 대상으로 RT-PCR을 수행하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물은 조류 인플루엔자 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-2> 다양한 인플루엔자 바이러스 검출

서울대학교 조류질병학실에서 분리한 H9N2형의 조류 인플루엔자 바이러스들에 대해 MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물로 RT-PCR을 수행하고 그 결과를 도 5에 기재하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 혼합물은 다양한 H9N2형의 조류 인플루엔자 바이러스들을 검출할 수 있었다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물은 H1N1, H2N2, H3N2, H4N6, H5N3, H7N1, H8N4, H10N7, H11N9, H13N6의 다양한 아형의 조류 인플루엔자 바이러스(홋카이도대학, Kida 교수님 제공)를 검출할 수 있었다.

<4-3> 조직 내 인플루엔자 바이러스 검출

6주령 SPF(Specific Pathogenic Free) 닭(4 마리)에 인플루엔자 바이러스로 공지된 조류 인플루엔자 H9N2형 바이러스(A/chicken/Korea/01310/2001, 한국등록특허 제0790801호)를 마리당 10^6.5EID₅₀ /100㎕ 로 점안과 비강 투여하였다. 상기 투여 후 5일이 지나 닭을 안락사 시키고 맹장편도 상하 0.5cm 부분을 절제하여 10% 유제액을 각각 제조하였다. 상기 유제액을 3,000g에서 30분간 원심 분리한 후, 3개의 SPF 발육란에 접종하여 37℃에서 3일간 배양하였다. 상기 배양 후, 발육란을 4℃에서 냉장하고 요막액을 채취한 다음, 평판혈구응집법으로 인플루엔자 바이러스를 검출하여 분리하였다. 그 결과 모든 개체에서 바이러스가 분리되었다.

상기의 원심 분리한 각 유제액 150㎕에서 RNA를 추출(Viral Gen-Spin, iNtRON biotechnology)하고, 본 발명의 MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 그 결과를 도 7과 도 8에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물은 모든 개체에서 인플루엔자 바이러스를 검출하였으며 발육란에 접종하여 바이러스를 분리한 결과와 일치하였다.

또한 도 8에 기재된 바와 같이, 본 발명의 MFN1-MFN11 및 MRON1- MRON10 프라이머 혼합물은 RNA를 10^-4배 희석한 경우에도 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-4> 프라이머의 민감성 비교

본 발명의 프라이머들과 기존의 프라이머들과의 민감성을 비교하기 위하여, 상기 표 1에 제시한 기존의 프라이머들 중 데이터베이스 내 M 유전자들과 82.3%(정방향 프라이머) 및 84.0%(역방향 프라이머)에서 일치율을 보인 Lau 등(Lau et al, Biochem Biophysic Res Com 2004, 313:336-342)의 프라이머와 민감성을 비교하였다.

Lau 등의 정방향 프라이머와 부적합을 보이는 바이러스의 염기서열 중 가장 빈발하는 염기서열(371/3441=10.8% 빈도)의 RT-PCR 증폭 효율을 알아보기 위해서는 부적합을 갖는 바이러스[예: A/New York/105/2002(H3N2)]의 RNA를 추출하여 Lau 등의 프라이머로 RT-PCR을 수행하여야 하나 검역문제로 해당 바이러스를 확보할 수 없는 문제가 있다. 따라서, 도 9에 나타낸 같이 PR8(H1N1, Hoffmann 등, 2004) 바이러스의 RNA를 사용하여 실험하되 같은 부적합이 이루어지도록 Lau의 정방향 프라이머의 9번째 C를 T로 치환한 프라이머를 합성하여, Lau 등의 역방향 프라이머와 함께 RRT-PCR을 수행하는 경우와 본 발명의 프라이머를 사용하여 하여 RRT-PCR을 수행하는 경우에 있어서 PR8 바이러스 RNA 증폭능력을 비교하였다.

그 결과, 본 발명의 프라이머 중 MFN1/MRON1을 사용한 경우에는 C_T(Cycle of thereshold) 값이 17.44, MFN1-11/MRON1-10 혼합물을 사용한 경우 C_T 값이 18.32를 보인 반면, 바이러스 염기와 부적합을 갖는 Lau 등의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용한 경우에는 C_T 값이 22.11을 보여, 본 발명의 프라이머를 사용하는 경우 16배 내지 32배 더 민감한 결과를 보였다. 따라서, 본 발명의 프라이머가 기존 프라이머 대비 뚜렷한 개선 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 10 참조).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) A형 인플루엔자 바이러스의 M(matrix) 유전자와 상보적으로 결합가능한 서열번호 1 의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 12 의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 및 (b) 서열번호 2 내지 서열번호 6 의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 서열번호 16 의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트.
삭제
제1항에 있어서, 서열번호 7 내지 서열번호 11 의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 17 내지 서열번호 21 의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 추가로 포함하는 프라이머 세트.
제1항 또는 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.
제4항의 조성물을 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
제5항에 있어서, 완충용액, dNTP, Taq 중합효소 또는 증류수를 추가적으로 포함하는 키트.
제4항의 조성물을 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 A형 인플루엔자 바이러스 의 M 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 검출은 PCR(polymerase chain reaction), RT(reverse transcription)-PCR, one-step RT-PCR, NASBA(nucleic acid sequence based amplification), 실시간 RT-PCR, 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 개체의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨인 방법.
제7항에 있어서, 개체의 생물학적 시료로부터 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP(RNA-nucleoprotein complex)를 농축 및 정제한 후 이로부터 추출한 RNA 로부터 M 유전자를 검출하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP의 농축 및 정제는 개체의 생물학적 시료에 1.0 %(v/v) 내지 5 %(v/v) 농도의 Triton X-100(폴리에틸렌 글리콜 터트-옥틸페닐 에테르)을 처리하여 인플루엔자 바이러스 RNP를 농축 및 정제하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스의 RNP의 농축 및 정제는 개체의 생물학적 시료에 1.0 %(v/v) 내지 5 %(v/v) 농도의 Triton X-100 을 처리하는 단계; NP(nucleocapsid protein) 에 대한 항체를 처리하는 단계; 및 NP 에 결합한 항체를 특이적으로 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제4항의 조성물을 사용하여 개체의 생물학적 시료로부터 A형 인플루엔자 바이러스 의 M 유전자를 검출하는 단계를 포함하는, A형 인플루엔자 바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
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