CN110669872A

CN110669872A - H9和h10亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及方法

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Publication number: CN110669872A
Application number: CN201911063093.1A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 李丹; 李孟; 谢丽基; 罗思思; 张艳芳; 张民秀; 黄娇玲; 范晴; 王盛; 谢志勤; 邓显文; 曾婷婷
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2020-01-10

Abstract

本发明提供了H9和H10亚型禽流感病毒三重RT‑PCR检测引物组、试剂盒及方法，本发明设计针对H9与H10亚型AIV HA基因及M基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。本发明的引物和检测方法通过一次PCR反应便可同时确定样品中H9与H10亚型AIV的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H9与H10亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

Description

H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase,NA)的差异可以将AIV划分为18种不同的HA亚型(H1～H18)和11种不同的NA亚型(N1～N11)。另外，依据其对鸡致病性的不同，还可将AIV分为高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。H9亚型AIV自1966年在美国威斯康星州首次被发现，目前已经在全球给家禽养殖业造成了严重的经济损失。1998年在中国广东首次发现H9N2亚型AIV直接感染人的病例，此后H9N2亚型AIV感染人病例也不断有报道。H10亚型AIV自1949年在德国鸡体内首次被发现，研究表明H10亚型AIV感染宿主主要为水鸟和其它陆生禽类。,目前感染人的亚型主要是H10N7和H10N8亚型，已经有报道的国家包括澳大利亚、埃及和中国。更为严重的是江西南昌地区已经于2013年12月发现一例H10N8直接感染人的病例。近年来的低致病性禽流感的流行病学的监测中发现H9和H10亚型禽流感病毒混合感染普遍存在，研究还表明部分H9N2亚型AIV可以为H5N6、H10N8及H7N9等感染人亚型禽流感病毒提供内部基因。因此，H9与H10亚型AIV对家禽养殖及人类健康卫生具有重要意义。

传统的禽流感病毒检测方法是将病毒分离培养后再进行血清学方法鉴定，培养周期长，且要用到较多标准阳性血清，但是禽流感病毒不同亚型血清相互之间又存在不同程度的交叉免疫保护反应，其结果的准确性具有局限性，所以目前禽流感病毒较多的采用分子生物学方法进行检测。分子生物学方法特别是RT-PCR检测技术具有快速、简便和准确等优点，在禽流感的诊断及大规模监测过程中应用广泛。由于AIV感染动物后具有相似的临床症状，混合感染的现象也普遍存在，所以在日常诊断中难以及时准确的对其进行鉴别确诊。近年来，随着分子生物学技术的发展，多重PCR技术的应用也越来越多，特别是在禽流感诊断领域中，但关于三重RT-PCR检测区分H9与H10亚型AIV混合感染的方法还见报道。

发明内容

本发明的目的是提供H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测的引物组、试剂盒及方法。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种可通过三重RT-PCR检测H9和H10亚型禽流感病毒的引物组，包括引物M-F、引物M-R、引物H9-F、引物H9-R、引物H10-F和引物H10-R。引物M-F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物M-R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物H9-F的序列如SEQ ID NO.3所示，引物H9-R的序列如SEQ ID NO.4所示，引物H10-F的序列如SEQ ID NO.5所示，引物H10-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

含有上述引物组的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述引物组在通过三重RT-PCR检测H9和H10亚型禽流感病毒的方法。

所述的方法，进一步包括以下步骤：

(1)提取待测样品的cDNA；

(2)建立三重RT-PCR反应体系，利用上述引物组进行三重RT-PCR反应；

(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出669bp和490bp条带时，说明该样品为H9亚型禽流感病毒；当样品扩增出669bp和272bp条带时，说明该样品为H10亚型禽流感病毒；当样品只扩增出669bp时，说明该样品为其它亚型禽流感病毒。

其中，步骤(2)中RT-PCR反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL、引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)的加入量为0.7μL，引物H10-F及H10-R(20pmol/μL)的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。

其中，步骤(2)中三重RT-PCR反应条件为：94℃3min；进入94℃30s，53℃45s，72℃1min，共35个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。

本发明提供了上述引物组或含有该引物组的试剂盒在检测H9和H10亚型禽流感病毒中的应用。

本发明的有益效果

本发明设计针对H9与H10亚型AIV HA基因及M基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。本发明的引物和检测方法通过一次PCR反应便可同时确定样品中H9与H10亚型AIV的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H9与H10亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

附图说明

图1为特异性试验结果

图2为敏感性试验结果

图3为部分临床样品检测结果

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1引物开发和合成

根据不同亚型禽流感病毒的M基因序列、H9和H10亚型AIV的HA基因序列的特异性保守区域，设计并通过验证筛选出3对针对M基因、H9和H10亚型AIV HA基因进行扩增的特异性引物，包括引物M-F、引物M-R、引物H9-F、引物H9-R、引物H10-F和引物H10-R。引物M-F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物M-R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物H9-F的序列如SEQ IDNO.3所示，引物H9-R的序列如SEQ ID NO.4所示，引物H10-F的序列如SEQ ID NO.5所示，引物H10-R的序列如SEQ ID NO.6所示。引物由宝生物(大连)有限公司进行合成。

实施例2三重RT-PCR反应体系的建立及优化和特异性试验

1、毒株：AIV毒株(H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、ARV及ILTV均由广西兽医生物技术重点实验室保存；AIV(H7N2、H14N5、H15N9和H16N3)的cDNA模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠；AIV毒株(H5N1)cDNA模板均由美国康涅狄格州立大学惠赠；其它AIV毒株(H2N3、H4N5、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5)毒株或cDNA模板均由香港大学惠赠；

2、试剂：试验所用SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，DL1000bp DNA Marker、感受态细胞、PCR产物快速连接载体、胶回收试剂盒及小量质粒抽提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。MLV逆转录酶、随机引物、10mmoldNTP、RNA抽提试剂盒、2×PCR Mix及RNA抑制剂均购自宝生物(北京)有限公司。其它试剂均购自商业公司。

3、病原RNA/DNA的提取与cDNA合成：参照核酸抽提试剂盒使用说明书对本研究中所用到的AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV的DNA进行抽提，抽提后的核酸模板用33μL RNA-free水溶解。RNA模板参照宝生物反转录试剂盒的说明书进行cDNA的合成，所有核酸模板均置-30℃低温保存备用。

4、三重RT-PCR反应体系的建立及优化：建立25μL的PCR反应体系：2×PCR Mix12.5μL，H9与H10亚型AIV cDNA模板各1μL，引物M-F、M-R、H9-F、H9-R、H10-F和H10-R(20pmol/μL)分别加入0.1～1.0μL，共设置10个试验梯度，每个梯度递增0.1μL，进行两个引物组合浓度的优化，最后用RNA-free补足至25μL。同时根据浓度实验的效果再对退火温度及反应时间进行组合优化，最终确定该方法最佳的反应体系及条件。

最终确定三重RT-PCR反应的最佳体系为：2×PCR Mix 12.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL、引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)的加入量为0.7μL，引物H10-F及H10-R(20pmol/μL)的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。最佳反应条件为：94℃3min；进入94℃30s，53℃45s，72℃1min，共35个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。

5、运用上述所建立的三重RT-PCR检测方法按照对H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N2、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N3、NDV、ARV、IBV和ILTV的cDNA/DNA进行检测，验证所建方法的特异性。PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图1，在图1中各泳道分别为：M.DL1000 DNA Marker；1.H9N2+H10；2.H9N6+H10；3.H9N6；4.H9N2；5.H10N3；6.H1N2；7.H2N3；8.H3N2；9.H5N1；10.H6N2；11.H7N2；12.H8N4；13.H11N3；14.H12N5；15.H13N5；16.H14N5；17.H15N5；18.H16N3；19.IBV；20.ARV；21.ILTV；22.NDV；23.阴性对照。从图1可以看出，用所建立的三重RT-PCR法从H9及H10亚型AIV混合样品分别检测出3条特异性的条带，分别为669bp(通用)、490bp(H9亚型)及272bp(H10亚型)；对H9N2和H9N6亚型AIV PCR检测的结果仅出现2条特异性条带，片段大小分别为669bp和490bp；对H10N3亚型AIV进行扩增只检测出2条特异性条带，片段大小分别为669bp和272bp；对其它亚型AIV只有一条669bp的特异性条带，常见的禽病病原体均未扩增出任何条带，结果表明该方法具有良好的特异性。

实施例3敏感性试验

1、标准品的制备：参考[Hoffmann E,Stech J,Guan Y,et al.Universal primerset for the full-length amplification of all influenza A viruses[J].ArchVirol,2001,146:2275-2289]中HA全长基因的引物，分别以H9N2与H10N3毒株cDNA为模板进行M基因和HA基因RT-PCR的扩增，得到其全长目的片段，并将目的片段分别连接到载体上并送公司进行测序。将插入有H9与H10亚型AIV的HA基因和M基因全长片段并测序正确的重组质粒分别命名为M-T、H9-T和H10-T。用商品化的质粒抽提试剂盒分别提取含有M-T、H9-T和H10-T的质粒，并用微量核酸检测仪对其浓度进行测定，根据相关公式计算样品相对应的拷贝数，同时将M-T、H9-T与H10-T质粒等拷贝数混合，并将混合好的样品进行10倍的倍比稀释，以便获得M-T、H9-T与H10-T质粒DNA浓度均为5×10⁷～5×10²拷贝/μL的标准品。

2、敏感性试验运用上述优化好的三重RT-PCR检测方法对制备好的浓度为5×10⁹至5×10¹拷贝/μL的M-T、H9-T与H10-T质粒样品进行扩增，验证该检测方法的敏感性。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图2，在图2中各泳道分别为：M.DNA标准DL1000；1.5×10⁷拷贝/μL；2.5×10⁶拷贝/μL；3.5×10⁵拷贝/μL；4.5×10⁴拷贝/μL；5.5×10³拷贝/μL；6.5×10²拷贝/μL；7.阴性对照，从图2中可以看出，对浓度为5×10⁷～5×10²拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型的AIV均有3条明显的特异性扩增条带出现，片段大小分别为669bp、490bp和272bp；对浓度等于或小于5×10³拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型AIV均无扩增条带。由此可见，该法最低能同时检测到质粒模板量为5×10⁴拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型AIV，说明本方法的检测灵敏度高。

实施例4临床样品检测

1、检测样品：从南宁、柳州和防城港不同活禽市场采集到的152份鸡和鸭咽喉及泄殖腔拭子样品，提取样品RNA后再反转录得到cDAN。

2、PCR反应体系和反应条件：

反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL、引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)的加入量为0.7μL，引物H10-F及H10-R(20pmol/μL)的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。

反应条件为：94℃3min；进入94℃30s，53℃45s，72℃1min，共35个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。

3、PCR反应产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，检测的结果显示有13份样品为H9与H10亚型AIV混合感染阳性，阳性率为8.55％；28份样品能扩增出490bp的目的条带，为H9NxAIV，阳性率为18.42％；6份样品能扩增出272bp的目的条带，为H10Nx AIV，阳性率为3.95％；其余有18份只有669bp的目的条带，为除H10Nx和H9Nx外的其它亚型禽流感病毒。部分活禽市场棉拭子样品PCR检测的结果见图3，在图3中，M泳道为DNA标准DL1000，5、20为H10亚型AIV阳性产物，4、13、16、18为H9亚型AIV阳性产物，5为H9与H10亚型AIV的阳性产物，2、7、11、14为其它亚型AIV的阳性产物，其余为阴性产物。上述样品检测结果与经典的鸡胚病毒分离鉴定，及其HA基因和M基因测序结果100％相符。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及方法

<130> ZYWS

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、试剂盒及方法(ArtificialSequence)

<400> 1

gtgagcgagg actgcagcgt ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<400> 2

ggccctcttt tcaaaccgta tt 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<400> 3

gcagcagata gagactcaac c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<400> 4

caagagatga ggcgacagt 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<400> 5

acgaacactt acagaaacac gga 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<400> 6

ctcggtgcta tcagacccc 19

Claims

1.一种H9和H10亚型禽流感病毒的三重RT-PCR检测引物组，包括引物M-F、引物M-R、引物H9-F、引物H9-R、引物H10-F和引物H10-R；

引物M-F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物M-R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物H9-F的序列如SEQ ID NO.3所示，引物H9-R的序列如SEQ ID NO.4所示，引物H10-F的序列如SEQ IDNO.5所示，引物H10-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

2.含有权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒。

3.使用三重RT-PCR检测H9和H10亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，三重RT-PCR所用的引物为权利要求1所述的引物组。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的cDNA；

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中RT-PCR反应体系为：2×PCR Mix12.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物M-F和M-R加入量为0.6μL、引物H9-F和H9-R的加入量为0.7μL，引物H10-F及H10-R的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中三重RT-PCR反应条件为：94℃3min；进入94℃30s，53℃45s，72℃1min，共35个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。

7.权利要求1所述的引物组或含有该引物组的试剂盒在检测H9和H10亚型禽流感病毒中的应用。