CN111518953A - H7和n2亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

H7和n2亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法，本发明设计针对H7和N2亚型AIV基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H7和N2亚型AIV的方法。本发明的引物和检测方法通过一次纳米PCR反应便可同时确定样品中H7与N2亚型AIV的混合感染及单一感染情况，特别是采用了纳米PCR这种新型的PCR技术，比普通PCR更敏感，比实时荧光定量PCR更方便快捷。该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H7与N2亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

Description

H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种高度传染性疫病，在全球范围内持续传播。禽流感病毒是正黏病毒科成员，根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase,NA)的差异可以将AIV划分为18种不同的HA亚型(H1～H18)和11种不同的NA亚型(N1～N11)。HA和NA之间可以自由组合，理论计算流感病毒的亚型有198种。另外，依据其致病力的不同，还可将AIV分为高致病性AIV(HPAI)和低致病性AIV(LPAI)。
H7亚型病毒有9种不同亚型组合，已知的亚型包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8和H7N9。在世界各地的野生鸟类和家禽中发现的大多数H7病毒是LPAI病毒。H7病毒感染在人类中是罕见的。与人类感染相关的最常见H7病毒是亚洲谱系的A型禽流感(H7N9)病毒，2013年首次在中国发现。虽然人类感染很少，但这些感染通常导致严重呼吸道疾病和死亡。H7N2在美国东北部的活禽市场流行数十年，2002年在火鸡中大规模暴发，80位职业人群均出现流感样症状，并检测到H7N2的抗体，这也是北美地区首次证明北美谱系的H7病毒(LPAI H7N2)感染人。2003年从美国一名住院的免疫受损患者的呼吸道分离到一株H7N2病毒，2007年英国威尔士农场发现H7N2亚型禽流感病毒，2012年～2015年从浙江和湖南省活禽市场分离到的3株鸭源H7N2亚型AIV，2013年3月31日中国的上海和安徽两地首次发现人感染新型重配H7N9病毒的报道，至目前已经造成1568人感染，提醒我们H7亚型禽流感病毒特别是H7N2亚型AIV对养禽业和公众健康的威胁不容忽视。因此建立能迅速、有效的鉴别H7和N2亚型禽流感病毒的检测方法对于禽流感的防控及保证人类健康的安全具有重要意义。
目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。纳米技术是20世纪80年代后期诞生并发展起来的一个新兴、高科技领域，是利用纳米科学知识研究纳米尺度物质的特性和相互作用，以及利用这些特性和现象的多学科的科学和技术。纳米PCR技术是在PCR反应的buffer中添加一定量的粒径为1～100nm的纳米金属颗粒，从而形成纳米流体，纳米流体具有极高的导热性，比普通流体要高得多，因此在添加了纳米金属颗粒的PCR热循环中，PCR反应能够更快地达到目标温度，从而缩短了在非目标温度停留的时间，不仅减少了非特异扩增，也提高了反应的特异性。随着纳米PCR技术的发展，人们不断地进行改良和优化。目前，纳米PCR技术检测动物病毒已经有报道，而双重纳米PCR(nano-dPCR)技术反应同时扩增H7和N2基因来检测和鉴别H7N2亚型AIV的核酸检测技术尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种可通过双重纳米PCR检测H7和N2亚型禽流感病毒的引物组，包括引物H7-F、引物H7-R、引物N2-F、引物N2-R。引物H7-F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物H7-R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物N2-F的序列如SEQ ID NO.3所示，引物N2-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
含有上述引物组的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述引物组在通过双重纳米PCR检测H7和N2亚型禽流感病毒的方法。
所述的方法，进一步包括以下步骤：
(1)提取待测样品的cDNA；
(2)建立双重纳米PCR反应体系，利用上述引物组进行双重纳米PCR反应；
(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出723bp和314bp条带时，说明该样品为H7N2亚型禽流感病毒；当样品只扩增出723bp条带时，说明该样品为H7Ny(y≠2)亚型禽流感病毒；当样品只扩增出314bp时，说明该样品为HxN2(x≠7)亚型禽流感病毒。
其中，步骤(2)中双重纳米PCR反应体系为：2×Nano-QPCR buffer 12.5μL，TaqDNA polymerase(5U/μL)0.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物H7-F和H7-R(20pmol/μL)加入量为1μL，引物N2-F和N2-R(20pmol/μL)加入量为0.8μL，加入ddH2O补足至终体积至25μL。
其中，步骤(2)中双重纳米PCR反应条件为：94℃3min；进入94℃20s，48℃20s，72℃30s，共30个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。
本发明提供了上述引物组或含有该引物组的试剂盒在检测H7和N2亚型禽流感病毒中的应用。
本发明的有益效果
本发明设计针对H7与N2亚型AIV基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对双重纳米PCR反应体系中的引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H7与N2亚型AIV的方法。
本发明的引物和检测方法通过一次纳米PCR反应便可同时确定样品中H7与N2亚型AIV的混合感染及单一感染情况，特别是采用了纳米PCR这种新型的PCR技术，比普通PCR更敏感，比实时荧光定量PCR更方便快捷。该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H7与N2亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。
附图说明
图1为双重纳米PCR退火温度优化琼脂糖凝胶电泳结果
图2为H7亚型和N2亚型AIV目的基因双重纳米PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果
图3为特异性试验结果
图4为双重纳米PCR的敏感性试验结果
图5为双重普通PCR的敏感性试验结果
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1引物开发和合成
对比H7亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的核苷酸序列，对两种目的基因进行特异性保守区域的筛选，设计并筛选出分别针对两种目的基因的2对特异性引物，包括引物H7-F、引物H7-R、引物N2-F、引物N2-R。引物H7-F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物H7-R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物N2-F的序列如SEQ ID NO.3所示，引物N2-R的序列如SEQ IDNO.4所示。引物由赛默飞广州分公司合成。
实施例2双重纳米PCR反应体系的建立及优化和特异性试验
1、毒株：AIV毒株H1N1、H3N6、H6N6、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV和ChPV均由广西兽医生物技术重点实验室保存；H14N5、H15N9、H16N3、H13N6、H7N2和H7N9亚型AIV的cDNA模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠；H4N5和H5N1亚型AIV的cDNA模板由美国康涅狄格州立大学惠赠；其它AIV(H2N3、H8N4、H10N3、H12N5和H11N3)毒株或cDNA模板均由香港大学惠赠。
2、主要试剂和仪器：纳米PCR试剂盒(NPK02)购自上海沪峥生物科技有限公司；DNA/RNA共提试剂盒、小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、感受态细胞、PCR产物快速连接载体和DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；试剂M-MLV、随机引物、dNTP及RNA抑制剂购自宝生物(北京)有限公司；PCR仪购自美国Bio-Rad Laboratories公司；超微量分光光度计购自美国Thermo公司。
3、病毒RNA/DNA的提取与cDNA合成：参照核酸抽提试剂盒使用说明书对本研究中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV、ILTV和CHPV的DNA/RNA进行抽提，抽提后的核酸模板用33μLRNA-free水溶解。RNA模板参照宝生物反转录试剂盒的说明书进行cDNA的合成，所有核酸模板均置-30℃低温保存备用。
4、双重纳米PCR反应体系的建立及优化：建立25μL的双重纳米PCR反应体系：2×Nano-QPCR Mix 12.5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，H7与N2亚型AIV cDNA模板各1μL，引物H7-F、H7-R、N2-F、N2-R(20pmol/μL)分别加入0.1～1.0μL，共设置10个试验梯度，每个梯度递增0.1μL，进行引物组合浓度的优化，最后用RNA-free水补足至25μL。同时根据浓度试验的效果再对退火温度及反应时间进行组合优化，试验退火温度为46～53℃，琼脂糖凝胶电泳结果见图1，在图1中，各泳道分别为：M.DNA Marker 100bp DNA Ladder；1～8泳道，分别为53℃、52℃、51℃、50℃、49℃、48℃、47℃和46℃；9.阴性对照。由图1可知，48～49℃条件下双重纳米PCR扩增效果均良好，最终选择48℃为最佳退火温度，最终确定该方法最佳的反应体系及条件。
最终确定双重纳米PCR反应的最佳体系为：2×Nano-QPCR buffer 12.5μL，TaqDNA polymerase(5U/μL)0.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物H7-F和H7-R(20pmol/μL)加入量为1μL，引物N2-F和N2-R(20pmol/μL)加入量为0.8μL，加入ddH2O补足至终体积至25μL。最佳反应条件为：94℃3min；进入94℃20s，48℃20s，72℃30s，共30个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。
运用上述最佳反应条件通过双重纳米PCR方法分别对H7亚型AIV和N2亚型AIV的目的基因进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图为图2，在图2中各泳道分别为：M.DNAMarker 100bp DNA Ladder；1.H7+N2亚型目的基因；2.N2亚型目的基因；3.H7亚型目的基因；4.阴性对照；从图2可看出，H7+N2亚型基因扩增获得723bp、314bp的目的片段，H7亚型基因扩增获得了723bp的目的片段，N2亚型基因扩增获得了314bp的目的片段，与预期相符。
5、运用上述所建立的双重纳米PCR检测方法按照对H1N1、H2N3、H3N6、H4N5、H5N1、H6N6、H7N2、H7N9、H8N4、H9N2、H10N3、H11N3、H12N5、H13N6、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV、ILTV和ChPV的cDNA/DNA进行检测，验证所建方法的特异性，PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图3，对扩增出的目的片段进行纯化回收，PCR产物快速连接载体上并转化到感受态细胞中进行克隆，挑选阳性单克隆菌送赛默飞广州分公司进行测序验证。
在图3中各泳道分别为：M.DNA Marker 100bp DNA Ladder；1.H7N2；2.H9N2；3.H7N9；4.H5N1；5.H3N6；6.H4N5；7.H1N1；8.H2N3；9.H15N9；10.H16N3；11.H6N6；12.H2N3；13.H8N4；14.H14N5；15.H10N3；16.H11N3；17.H12N5；18.H13N6；19.NDV；20.IBV；21.ILTV；22.ChPV.23.阴性对照。
从图3可以看出，用所建立的双重纳米PCR法从H7及N2亚型AIV混合样品检测出2条特异性的条带，分别为723bp(H7亚型)及314bp(N2亚型)；对H7N9亚型AIV即H7Ny(y≠2)亚型AIV扩增结果仅出现1条特异性条带，片段大小为723bp；H9N2亚型AIV即HxN2(x≠7)亚型AIV仅扩增出1条特异性条带，片段大小为314bp，对其他亚型AIV以及常见的禽病病原体的扩增均未出现条带，结果表明该方法具有良好的特异性。
实施例3敏感性试验
准备初始浓度分别为6×108和6×108拷贝/μL的H7-T和N2-T(即重组质粒模板)，经过ddH2O 10倍系列稀释，取每个稀释度的重组质粒模板，运用上述优化好的双重纳米PCR检测方法进行双重纳米PCR和双重普通PCR检测，验证该检测方法的敏感性。
PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，双重纳米PCR结果的电泳图为图4，双重普通PCR结果的电泳图为图5。在图4和图5中各泳道分别为：M泳道.DNA Marker 100bp DNA Ladder；；1～9泳道的H7-T质粒浓度分别为6×108至6拷贝/μL，N2-T质粒浓度分别为6×108至6拷贝/μL；10泳道.阴性对照。
从图4和图5中可以看出敏感性试验结果表明双重纳米PCR可检测H7亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的最低拷贝数分别为6×102和6×102拷贝/μL，而使用双重普通PCR方法检测的最低拷贝数分别为6×104和6×104拷贝/μL。双重纳米PCR检测方法的敏感性比双重普通PCR检测灵敏度方法高100倍。
实施例4临床样品检测
1、检测样品：从南宁活禽市场采集到的130份鸡口腔及泄殖腔拭子样品，提取样品RNA后再反转录得到cDNA。
2、PCR反应体系和反应条件：
反应体系为：2×Nano-QPCR buffer 12.5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物H7-F和H7-R(20pmol/μL)加入量为1μL，引物N2-F和N2-R(20pmol/μL)加入量为0.8μL，加入ddH2O补足至终体积至25μL；
反应条件为：94℃3min；进入94℃20s，48℃20s，72℃30s，共30个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。
3、PCR反应产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示，H7亚型AIV阳性率为0.7％，N2亚型AIV的阳性率为20.6％。所有样品经鸡胚分离方法和基因测序进行检测及验证，其结果与双重纳米PCR方法的检测结果相一致。为进一步确定所建立方法检测的准确性，将双重纳米PCR获得的产物测序分析。测序结果显示，双重纳米PCR获得的723bp是H7亚型AIV HA基因来源的特异性片段，314bp是N2亚型AIV NA基因来源的特异片段。
由检测结果可知，N2亚型AIV在鸡群中存在普遍感染，N2亚型AIV的阳性率远高于H7亚型AIV的阳性率。此外，在本次检测中未出现H7亚型AIV和N2亚型AIV的混合感染现象，这提示在禽流感防制的过程中应对不同来源的H7亚型AIV和N2亚型AIV给予一定的关注。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法
<130> JC
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tgcaaacaac tcgacagagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gaccattccg gcactctgat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgcatgccgt gagcatcata 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
attgggtgat tggcccactt 20

Claims (7)

1.一种H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测引物组，包括引物H7-F、引物H7-R、引物N2-F、引物N2-R；
所述引物H7-F的序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物H7-R的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物N2-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物N2-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
2.含有权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒。
3.使用双重纳米PCR检测H7和N2亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，双重纳米PCR所用的引物为权利要求1所述的引物组。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的cDNA；
(2)建立双重纳米PCR反应体系，利用上述引物组进行双重纳米PCR反应；
(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出723bp和314bp条带时，说明该样品为H7N2亚型禽流感病毒；当样品只扩增出723bp条带时，说明该样品为H7Ny(y≠2)亚型禽流感病毒；当样品只扩增出314bp时，说明该样品为HxN2(x≠7)亚型禽流感病毒。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中双重纳米PCR反应体系为：2×Nano-QPCR buffer 12.5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，待测样品cDNA模板2μL，引物H7-F和H7-R(20pmol/μL)加入量为1μL，引物N2-F和N2-R(20pmol/μL)加入量为0.8μL，加入ddH2O补足至终体积至25μL。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中双重纳米PCR反应条件为：94℃3min；进入94℃20s，,48℃20s，72℃30s，共30个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。
7.权利要求1所述的引物组或含有该引物组的试剂盒在检测H7和N2亚型禽流感病毒中的应用。
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