CN104498627A - H3n8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

H3n8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别H3亚型AIV和N8亚型AIV两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，可用于H3N8亚型AIV的快速诊断和监测，因此本发明对H3N8亚型禽流感病毒的防治有重要意义。

Description

H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于PCR检测病毒技术领域，尤其涉及一种H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
禽流感(Avian influenza,AI)是危害禽类养殖的一类重要传染病，其病原体AIV为单股负链分节段的RNA病毒，其中血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是两个比较重要的基因节段，Susan等的研究表明HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。H3是目前已知的人类流行的主要亚型之一，血清学分析显示，从马等频繁分离到的H3N8亚型早在18世纪的人类中间流行，同时马可以通过实验感染H3N8亚型AIV这一事实，说明不应低估H3N8亚型AIV在自然界中的作用，应注意防止马、禽及人类H3亚型AIV的感染，对于H3N8亚型AIV的防控应予以高度重视。目前，针对AIV的检测方法为传统血清学试验，存在检测耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，针对H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR方法未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定量H3N8亚型禽流感病毒，为H3N8亚型AIV的监测提供技术支撑。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE；探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE。
引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3：3：3：2：2：2。
该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；
B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.6μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.4μM。
针对目前缺乏对H3N8亚型AIV进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：
1)检测时间短
应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约30分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；
2)检测敏感性高且特异性强
当H3亚型AIV和N8亚型AIV同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对H3亚型AIV和N8亚型AIV的检出及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性非常高，均能检测到100个拷贝的H3N8亚型AIV，比常规PCR方法敏感性高100倍，可用于H3N8亚型AIV的快速诊断和监测，因此本发明对H3N8亚型禽流感病毒的防治有重要意义。
附图说明
图1是荧光定量PCR检测H3亚型禽流感病毒的敏感性(FAM通道)结果图，图中：1～7分别为1×108～1×102拷贝/μl，8阴性对照。
图2是荧光定量PCR检测H3亚型禽流感病毒的敏感性(FAM通道)的标准曲线。
图3是荧光定量PCR检测N8亚型禽流感病毒的敏感性(ROX通道)结果图，图中：1～7分别为1×108～1×102拷贝/μl，8阴性对照。
图4是荧光定量PCR检测N8亚型禽流感病毒的敏感性(ROX通道)的标准曲线。
图5是荧光定量PCR检测H3亚型禽流感病毒的特异性(FAM通道)结果图，图中：1-12分别为H3N8、H1N1、H3N2、H3N6、H4N2、H4N5、H5N1、H6N1、H6N6、H6N8、H7N2、H9N2亚型AIV；13.NDV；14.IBV；15.ILTV；16.MG；17.ARV；18.空白对照。
图6是荧光定量PCR检测N8亚型禽流感病毒的特异性(ROX通道)结果图，图中：1-12分别为H3N8、H1N1、H3N2、H3N6、H4N2、H4N5、H5N1、H6N1、H6N6、H6N8、H7N2、H9N2亚型AIV；13.NDV；14.IBV；15.ILTV；16.MG；17.ARV；18.空白对照。
图7是荧光定量PCR检测H3亚型禽流感病毒的批内重复性(FAM通道)结果图，图中：1-3为1×108拷贝/μL；4.阴性对照。
图8是荧光定量PCR检测N8亚型禽流感病毒的批内重复性(ROX通道)结果图，图中：1-3为1×108拷贝/μL；4.阴性对照。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche)。胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物公司；DNA/RNA抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
H3N2、H6N8亚型禽流感病毒记载在“Visual detection of H3subtype avian influenzaviruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay”，Virol J,2011,8:337，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H1N1亚型禽流感病毒记载在“利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”，病毒学报,2013,29(2):154-159,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H3N6亚型禽流感病毒记载在基因库NCBI中，登录号为“KM186122-KM186129”，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H3N8亚型禽流感病毒记载在“Genetic Characterization of a NaturalReassortant H3N8Avian Influenza Virus Isolated from Domestic Geese in Guangxi,Southern China”，Genome Announc.2014,2(4):e00747-14，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H4N2亚型禽流感病毒记载在基因库NCBI中，登录号为“KJ881013-KJ881020”，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H4N5、H5N1、H7N2亚型禽流感病毒记载在“H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立”，动物医学进展，2013,34(12):1-5，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H6N1记载在“Complete genome sequence analysis of an H6N1avian influenza virusisolated from Guangxi pockmark ducks”，J.Virol.2012,86:13868–13869，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H6N6亚型禽流感病毒和鸡毒霉形体(MG)S6株记载在“Epidemiological Surveillanceof Low Pathogenic Avian Influenza Virus(LPAIV)from PoμLtry in Guangxi Province,Southern China”PLOS ONE,2013,8(10):1-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H9N2禽流感病毒记载在“Characterization of an avain influenza virus H9N2strainisolated from a wild bird in southern China.Genome Announc”，2014,2:e00600-14，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
新城疫病毒(NDV F48E9株)记载在“新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立”中国兽医科学，2011,41(09):917-922，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡传染性支气管炎病毒(IBV H52株)记载在“鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立”，中国农学通报，2012,28(20):83-87，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV北京株)记载在“鸡传染性喉气管炎病毒LAMP检测方法的建立”.兽医科技，2012,44(11):52-55，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
禽呼肠孤病毒(ARV S1733株)记载在“禽呼肠孤病毒S1733株单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立”，畜牧与兽医，2013,45(5)，49-52，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
根据GenBank中H3亚型AIV和N8亚型AIV病毒的保守序列，采用Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，选定两对特异性引物和两条Taqmam探针(表1)。
表1引物和TaqMan探针序列(5’-3’)
实施例2、一步法实时荧光定量RT-PCR检测的建立
一、一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的确定
1、样本的制备
核酸的提取与反转录
参照DNA/RNA抽提试剂盒说明书抽提ILTV、MG的DNA，同时提取各亚型AIV及NDV、IBV和ARV的RNA，并用随机引物进行反转录,反转录体系为50μL，包括5μL 10×PCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL 10mM dNTP(四种碱基)，1μL RNA抑制剂(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL随机引物(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL AMV反转录酶(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，待检总RNA模板40μL，瞬离后水浴锅42℃90min，将制备的cDNA置-30℃保存备用。
2、标准品的制备
以上述得到的H3N8亚型AIV cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(25μL ExTaq(TaKaRa RR902)、1μmol/L引物(表2)、4μL cDNA，加ddH2O补足50)，反应条件为：94℃预变性4min，94℃40s，50℃50s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min,4℃结束反应。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pGEM-T Easy载体，提取阳性克隆质粒pGEM-H3和pGEM-N8,送至大连宝生物工程(大连)有限公司进行测序，并计算质粒拷贝数。
将pGEM–H3质粒和pGEM-N8质粒，37℃Sal Ⅰ单酶切过夜，使质粒线性化，琼脂糖凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒DNA线性化产物，用于体外转录，按T7体外转录试剂盒说明加入反应试剂37℃作用2h，然后加DNase Ⅰ酶1μL，37℃消化转录产物中未转录的DNA20min，70℃灭活DNase Ⅰ酶15min，用等体积盐酸饱和苯酚、氯仿抽提，再用等体积氯仿抽提，取上清用0.5倍体积5M醋酸氨和2倍体积冰乙醇沉淀，再用75％冰乙醇洗沉淀，最后用DEPC水溶解，得到H3-RNA和N8-RNA，紫外分光光度计测其浓度和纯度，-70℃保存备用。
表2标准品制备所用引物序列
3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立
用H3-RNA和N8-RNA(二者的拷贝比为1:1)作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8μmol/L之间，进行不同浓度的配比进行一步法荧光定量PCR，选择引物和探针的最佳浓度。
扩增反应总体积为20μL，其中2×One Step RT-PCR Buffer III(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)10μL；Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μL；PrimeScript RT Enzyme Mix II(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μL；2μL模板，终浓度均为0.2-0.8μmol/L的AIV H3-F、AIV H3-R和AIV H3-P；终浓度均为0.2-0.8μmol/L的AIV N8-F、AIV N8-R和AIV N8-P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：42℃5min；95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃结束反应。
结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，H3亚型AIV上、下游引物及探针终浓度分别为0.6μmol/L，N8亚型AIV上、下游引物及探针终浓度分别为0.4μmol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。
因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20μL，其中2×One Step RT-PCR Buffer III(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)10μL；Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μL；PrimeScript RT Enzyme Mix II(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μL；2μL模板，终浓度均为0.6μM的AIV H3-F、AIV H3-R和AIV H3-P；终浓度均为0.4μM的AIV N8-F、AIV N8-R和AIV N8-P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：42℃5min；95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃结束反应。
FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测H3亚型AIV；ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测N8亚型AIV。
二、荧光定量RT-PCR的敏感性试验
分别以10倍系列稀释的H3-RNA和N8-RNA标准品，得到拷贝数均为1×108-1×102拷贝/μL，再将相同拷贝数的标准品混合作为模板进行一步法荧光定量PCR扩增，扩增体系和条件如上。
在530nm激发光下的结果(FAM)如图1和2所示；在610nm激发光下的结果(ROX)如图3和4所示。从图中的荧光曲线可见，对H3N8亚型AIV的检测100拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对H3N8亚型AIV的灵敏度均为100拷贝，比常规PCR方法敏感性高100倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。
三、荧光定量RT-PCR的特异性试验(图5和6)
利用优化好的一步法荧光定量PCR反应体系，对各亚型AIV和上述常见禽病病原体进行扩增，以ddH2O为模板作为阴性对照，对仪器中的每个检测孔同时收集FAM和ROX两种荧光信号。
结果显示，H3N8亚型AIV在FAM和ROX荧光通道均产生扩增曲线，H3N2、H3N6亚型AIV在FAM荧光通道(530nm激发光下)出现扩增曲线，在ROX荧光通道(610nm激发光下)为直线，H6N8亚型AIV在ROX荧光通道出现扩增曲线，在FAM荧光通道为直线，其它亚型AIV和常见禽呼吸道疾病病毒在FAM和ROX荧光通道检测均为直线，这说明一步法实时荧光定量RT-PCR反应结果的判断如下：
反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；
若在530nm激发光下(FAM)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有H3亚型AIV；反之，则样品中不含有H3亚型AIV；若在610nm激发光下(ROX)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有N8亚型AIV；反之，则样品中不含有N8亚型AIV；
若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均为S型曲线，则样品中含有H3N8亚型AIV；若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有H3和N8亚型AIV。
四、重复性试验
按照优化好的一步法实时荧光定量RT-PCR，以1×108拷贝/μL的AIV-H3和AIV-N8质粒混合物作为模板，分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来验证实时荧光定量PCR的批内重复性(图7和8，表3)。在第4天、7天后重复检测保存于-20℃的模板，验证模板的稳定性及实时荧光定量PCR的批间重复性(表4)。
批内重复性检测结果见图7和8所示为530nm激发光(FAM)下检测H3亚型AIV通道，和610nm激发光(ROX)下检测N8亚型AIV通道，表3为同一浓度多个重复检测的Ct值，批间重复性见表4为同一模板不同检测时间的Ct值，可以看出，组内重复性和组间重复性变异系数均小于3％。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。
表3组内重复性试验
表4组间重复性试验
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.6μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.4μM。
B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
实施例4、临床病料的检测
待测样本为广西地区收集的96份临床样品，分别提取样品的RNA并反转录为cDNA。按照建立的一步法荧光定量PCR方法进行进行荧光定量PCR扩增。
参照上述判断标准评价检测结果如下：
检出H3N8亚型AIV 1份(阳性率为1.04％)，检出单H3亚型AIV 4份(阳性率为4.17％)，检出单N8亚型AIV 2份(阳性率为2.08％)，其他样本均未检出H3亚型AIV和N8亚型AIV。
检测结果与病毒分离鉴定结果一致，说明该H3N8亚型AIV一步法荧光定量PCR方法的建立，对广西地区H3N8亚型AIV的防控有指导意义。

Claims (6)

1.H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
2.一种H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE；所述探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE。
4.根据权利要求2所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3：3：3：2：2：2。
5.根据权利要求3所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；
B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
6.根据权利要求5所述的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.6μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.4μM。
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