CN105316431B - 同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。发明人基于GeXP系统研究设计了5对特异性引物和1对通用引物，据此建立了同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒。应用本发明可同时鉴别感染人的三种H5亚型H5N1、H5N2和H5N6禽流感病毒，灵敏度为102拷贝/μL。本发明具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对三种H5亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。

Description

同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检 测引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，同时某些亚型禽流感病毒也能感染人类。禽流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原关系差异，可将其分为16种HA亚型和9种NA亚型。根据其致病性可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亚型。特别是近年来频繁爆发的H5亚型禽流感疫情给许多国家和地区的养禽业带造成了巨大的经济损失。H5亚型禽流感病毒的一些亚型组合除了其对禽类的高致病性外，还能跨种间传播感染人。1997年香港地区首次出现人感染H5N1禽流感病例，2003年之后多个国家相继出现H5N1禽流感病毒感染人事件，自2003年以来，H5N1高致病性禽流感开始在东南亚地区广泛流行，数月间传播到了周边以前未有该病报道的8个国家。该病在2005年期之前都只在东南亚的动物和人流行感染，但之后病毒开始从该地区经过中亚传播到了欧洲和中东地区。目前已有16个国家650人感染发病，患者死亡率高达60％以上。OIE报道了在至少60个国家的家禽和野生鸟类中暴发了H5N1的感染。H5N2亚型禽流感病毒在禽类中广泛存在，该病毒在鸡体内经过传代以后，可以发生突变，有可能变为高致病性禽流感病毒，同时野鸟和家禽也间接给H5N2亚型低致病性禽流感病毒在野鸟内的跨种间传播提供了机会。另外，H5N2亚型流感病毒还能够感染哺乳动物，甚至是人类，对公共卫生安全构成了极大的威胁。据报道日本至少有77人感染低致病H5N2型禽流感病毒，这些人没有出现感染禽流感病毒的症状。2014年5月中国四川省检测出一例人感染h5n6禽流感病例，患者死亡，这是全球首例人感染H5N6禽流感的个案。2014年12月23日，国家卫生计生委向WHO通报广东省发生一例人感染H5N6禽流感实验室确诊病例，患者经救治后康复。2015年2月9日和2015年7月11日国家卫生计生委分别向WHO通报云南省发生两例人感染H5N6禽流感实验室确诊病例，两名患者均死亡。上述事实表明H5N1、H5N2、H5N6三种H5亚型禽流感病毒组合能够感染人，并且H5N1和H5N6亚型组合可以导致人类死亡。
目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。虽然多重PCR有着能同时扩增出多个目的因片段进而实现多种病原体的快速诊断并降低检验成本的优点，但是普通多重PCR在扩增的过程中容易受到目的基因模板的特性、引物浓度和比例及PCR所用的试剂之间的相互作用等的影响，进而导致样品扩增效率不一致使得检测结果的准确性大大降低。GeXP多基因遗传表达分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(Multiplex reverse transcription-polymerase chainreaction,mRT-PCR)是由通用引物(上游加荧光标记)和特异性嵌合引物(基因特异性引物5'末端连接通用引物序列)相结合建立多重逆转录聚合酶链反应体系，采用通用引物引发的策略，可以克服普通多重PCR存在的扩增效率不一的问题。此外，该方法利用毛细管电泳进行产物的分离，大大提高了检测结果的灵敏度和可靠性。
由于H5N1、H5N2、H5N6三种感染人的H5亚型禽流感病毒组合感染人具有相似的临床症状，现有的的诊断技术又很难在较短时间内对其作出准确的分型和判定，不利于其防控及应急措施的制订。目前，检测H5亚型AIV的核酸检测方法多是针对其HA基因，同时检测H5N1、H5N2、H5N6三种感染人的H5亚型禽流感病毒组合并进行分型的技术尚未见有报道。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对感染人的H5N1、H5N2和H5N6 3种亚型组合禽流感病毒进行检测和分型，达到可以快速诊断和鉴别3种感染人H5亚型禽流感病毒的目的，对3种H5亚型禽流感流行病学调查及其防控，保障人类公共卫生的安全和健康持续发展具有重要意义。
本发明要解决的技术问题是提供一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组，包括5对特异性引物，分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的序列。
作为优选，所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组，还包括1对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag-F，下游通用引物为Tag-R，分别具有如SEQ ID No.11至SEQ ID No.12所示的序列。
一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含有5×ReverseTranscriptase Buffer、50pmol Random Primer(12mer)、10mM dNTP Mixture、40URibonuclease Inhibitor和5U/μL AMV Reverse Transcriptase；所述的PCR反应液含有10×PCR buffer、25mM MgCl2、10mM dNTP Mixture，5对特异性引物混合物，10μM/L上、下游通用引物混合物，JumpStart Taq DNA Polymerase；所述的5对特异性引物分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2；1对通用引物分别为Cy5-Tag-F和Tag-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示的序列。
作为优选，所述的5对特异性引物中引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为150nmol/L、150nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、150nmol/L；所述的1对通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。
作为优选，所述的反转录RT反应液每管9μL，含有5×Reverse TranscriptaseBuffer 5μL、50pmol Random Primer(12mer)1μL、10mM dNTP Mixture 2μL、40URibonuclease Inhibitor 0.5μL和5U/μL AMV Reverse Transcriptase 0.5μL；所述的PCR反应液每管9.7μL，含有10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl22.5μL，10mM dNTP Mixture 1μL，5对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1.25μL，JumpStart TaqDNA Polymerase 1.2μL；所述的DEPC水和超纯水各1mL。
本发明还提供了所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组或所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒在鉴别H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立了一种能同时检测三种H5亚型禽流感病毒多重逆转录－聚合酶链反应(mRT-PCR)方法。首先对反应条件和多重反应体系进行优化，然后分别用已验证的阳性模板对多重PCR体系进行特异性验证。多重检测体系可以同时检测出H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒，灵敏度为102拷贝/μL。该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。
2.本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒的进行检测和分型，达到快速鉴别感染人危害最大的H5N1、H5N2和H5N6禽流感病毒的目的，对H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感的流行病学调查及其防控，保障养禽业的健康持续发展具有重要意义。
附图说明
图1为GeXP多重PCR的毛细管电泳分析图；
图2为对临床单一感染H5N6亚型禽流感病毒的检测结果；
图3为对临床单一感染H5N1亚型禽流感病毒的检测结果；
有关附图标记的说明：
横坐标-PCR扩增产物的碱基数；纵坐标-荧光信号值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的禽流感毒株及其他禽类病毒参考株均由广西壮族自治区兽医研究所保存。
实施例1：禽流感病毒多重RT-PCR引物设计
参考相关文献从GenBank数据库中下载禽流感病毒M、H5、N1、N2和N6 5个基因的序列，利用DNAStar分别对各个基因核苷酸序列进行分析和比较，寻找出适合设计特异性引物的保守区域，利用GeXP express profiler工具设计针对禽流感病毒5个基因的特异性引物(见表1)，设计好的引物采用Primer Premier 5.0、NCBI PrimerBlast和Oligo7.0进行分析和筛选，然后在全部正向引物和反向引物的5'端分别加入一段非同源性独特序列作为通用引物(Uni-Primer)，上游通用引物5'端标记荧光染料Cy5，即Cy5-Tag-F，由上海Invitrogen公司合成，HPLC纯化。
表1引物信息
表1中，兼并碱基代码R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，下划线表示的是上、下游通用引物序列；荧光染料Cy5标记上游通用引物标签，下游引物不标记。根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统(如GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪)的误差，使用上述引物对A-E及GeXP通用引物对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上下波动3bp。
实施例2：多重PCR检测体系的建立
2.1模板及含靶基因的单克隆质粒标准品的制备
按照TaKaRa公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(目录号DV819A)说明书从提取不同亚型(H 1-16和N 1-9)禽流感病毒和其他禽类病毒的核酸，获得50μL的核酸样品，分装置于-80℃保存。RT反应体系参照TaKaRa公司逆转录酶(目录编号D2639A)说明书进行，将获得的RNA样品分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作为总RNA的对照。
反转录RT反应液每管9μL：含有5×Reverse Transcriptase Buffer 5μL、50pmolRandom Primer(12mer)1μL、10mM dNTP Mixture 2μL、40U Ribonuclease Inhibitor 0.5μL和5U/μL AMV Reverse Transcriptase 0.5μL。
反转录温度42℃1.5h，置于-20℃保存。用PCR分别扩增含有M、H5、N1、N2和N6 5个目的基因区域的片段，扩增后得到的的PCR阳性产物克隆到T-easy载体中构建成质粒，经测序证实这5个重组质粒为T-easy载体分别插入了一种上述基因的重组质粒，且分别为上述5对引物对A-E的靶基因。
2.2使用单重RT-PCR法验证引物
2.2.1单重特异性引物(SP-Primer)稀释至工作浓度1μmol/L，Cy5-Tag-F和Tag-R稀释至工作浓度10μmol/L。
PCR反应液每管9.7μL：含有10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2.5μL，10mMdNTP Mixture 1μL，5对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1.25μL，JumpStart Taq DNA Polymerase 1.2μL。
反应条件为：94℃5min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，65℃30s，10个循环；94℃30s，52℃30s，72℃30s，20个循环；72℃延伸3min，置于4℃。
2.2.2毛细管电泳
使用GenomeLab GeXP遗传分析系统的各PCR产物同时进行毛细管电泳检测，操作步骤如下：用甲酰胺为上样缓冲液(美国贝克曼库尔特公司,目录编号608082)，DNA sizestandard Kit-400Base Pairs(美国贝克曼库尔特公司,目录编号608098)与上样缓冲液按体积比1:(80-160)彻底混匀，在样品板上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃,120s；注入样品：2.0KV，30s；分离：6.0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遗传分析系统确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。
2.2.3引物对A-E的单重特异性检测
用引物对A-E分别扩增实施例1中获得的cDNA样品：用引物对A扩增H5N1，引物对B扩增H5N1,引物对C扩增H5N1，引物对D扩增H9N2，引物对E扩增H6N6。PCR扩增和毛细管电泳的结果显示单重特异性引物只对靶基因有良好扩增且未见有杂峰。
不同靶基因片段扩增后的大小范围为：AIV M，210-212bp；AIV-H5，223-225bp；AIV-N1，161-163bp；AIV-N2，188-190bp；AIV-N6，240-242bp。
2.3GeXP多重PCR体系的建立
将引物对A、B、C、D和E混合成多重混合引物(Mix-Primer)工作液，通过对引物浓度的优化，使靶基因M、H5、N1、N2和N6的引物在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为150nmol/L、150nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、150nmol/L；通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。其余成分与引物验证的相同。以多株已知病毒核酸的单一阳性标本作为模板或多种病原的混合cDNA样品作为模板，进行多引物PCR反应，反应程序及电泳与引物验证的相同。
2.4结果
5对引物对A-E混合后分别对单一cDNA或混合cDNA进行检测。
如图1所示，结果表明多引物单模版分别检出了161.67bp、188.59bp、210.99bp、224.56bp、240.32bp的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物；多引物多模板结果表明5个靶基因可被同时检出，经GeXP system多重检测体系分析，可检出与实际相符的5个目的峰且无其他杂峰，同时可通过产物片段大小来区分所检测的H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒。结果也验证了多重检测检测体系中的引物特异性。
实施例3：GeXP system多重检测体系特异性检测
按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0说明书从尿囊液中分别提取HA(1-16)和NA(1-9)亚型禽流感病毒核酸，同时提取IBV、NDV和ILTV等禽类常见病毒的核酸分别加入到实施例2建立的GeXP多重检测体系中，检测该方法的特异性。多重PCR完成后，PCR产物上机进行GeXP毛细管电泳分析，结果显示每个反应只出现特异信号，无交叉反应。HA基因除H5亚型，NA基因除N1、N2和N6亚型外的其他NA亚型，以及NDV、IBV、ILTV和空白对照均无反应信号，提示所建立的方法特异性强，与其他检测对象无交叉反应。
实施例4：GeXP system多重检测体系的灵敏度试验和检测临床样本能力的分析
4.1GeXP system多重检测体系的灵敏度试验
用Promega公司RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒(目录号P1300)按其说明书分别使用SpeI和PvuII对实时例2中构建的含有M、H5、N1、N2和N6基因的质粒进行酶切，将上述5个含有不同目的基因线性化质粒进行体外转录合成RNA。利用DU 800UV/Vis分光光度计对体外转录RNA浓度进行测定和定量。根据核酸浓度和分子量计算RNA的拷贝数。将M、H5、N1、N2和N6基因的体外转录RNA等比例混合后进行10倍连续稀释至106-10拷贝/μL。以稀释产物为待检测样品，以实施例2建立的方法进行GeXP多重检测体系灵敏度的检测与分析。试验在不同日重复3次。
非同日的3次重复试验表明，该方法对于M、H5、N1、N2和N6基因最低可以检测至100拷贝/μL的核酸样本。
4.2GeXP system多重检测体系检测临床样本的能力
从实施例1随机选择H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的cDNA，经实施例2中步骤二的方法进行检测。
H5N6亚型禽流感病毒的检测结果如图2,可以同时检测出211.01、223.93和240.17三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有H5N6亚型禽流感病毒的模板，与实际相符。
H5N1亚型禽流感病毒的检测结果如图3,可以同时检测出161.52、210.71和224.49三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有H5N1亚型禽流感病毒的模板，与实际相符。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (6)

1.一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组，其特征在于：由5对特异性引物组成，分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2，其分别为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的序列。
2.根据权利要求1所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组，其特征在于：还包括1对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag-F，下游通用引物为Tag-R，分别为SEQ ID No.11至SEQ ID No.12所示的序列。
3.一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR 反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含有5×反转录酶缓冲液、50pmol 12mer的随机引物、10mM dNTP 混合液、40U RNA酶抑制剂和5U/μL AMV 反转录酶；所述的PCR 反应液含有10×PCR 缓冲液、25mM MgCl2、2.5mM dNTP 混合液，5对特异性引物混合物，10μM/L上、下游通用引物混合物，JumpStart DNA聚合酶；其特征在于：所述的5对特异性引物分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2；1对通用引物分别为Cy5-Tag-F和Tag-R，其分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示的序列。
4.根据权利要求3所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒，其特征在于：所述的5对特异性引物中引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2在PCR反应体系中对应的摩尔浓度分别为150 nmol/L、150nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L、150 nmol/L；所述的1对通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为500 nmol/L。
5.根据权利要求3所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒，其特征在于：所述的反转录RT反应液每管9μL，含有5×反转录酶缓冲液 5μL、50pmol 12mer的随机引物1μL、10mM dNTP 混合物 2μL、40U RNA酶抑制剂 0.5μL 和 5U/μLAMV 反转录酶 0.5μL；所述的PCR 反应液每管9.7μL，含有10×PCR 缓冲液 2.5μL，25mMMgCl2 2.5μL，10mM dNTP 混合物 1μL，5对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1.25μL，JumpStart DNA聚合酶 1.2μL；所述的DEPC水和超纯水各1mL。
6.根据权利要求1-2任一所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组或权利要求3-5任一所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒在制备鉴别H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒试剂盒中的应用。
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