CN102899424A

CN102899424A - 同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN102899424A
Application number: CN2012104077395A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 罗思思; 谢丽基; 邓显文; 谢志勤; 庞耀珊; 刘加波; 范晴
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CN102899424B

Abstract

本发明公开了一种同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒。该试剂盒是基于GeXP系统使用的，包含10种PCR引物对，用于同时鉴别检测禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌，特异性好，灵敏度高，均可检到100拷贝/μl，与病原体分离和血凝抑制实验或血清学实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。本发明为常见的主要鸡呼吸道病及其病原体的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和检测体系，更符合实际的需要，应用前景广阔。

Description

同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒。

背景技术

H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和传染性鼻炎是严重危害鸡的9种主要呼吸道传染性疾病。主要临床表现为：啰音、咳嗽、气喘、伸颈、张口呼吸、甩头和呼吸困难等症状。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状却十分相似，无法鉴别。鉴别诊断这些呼吸道疾病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐、费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些呼吸道病的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR一般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限（多在2-4个基因），使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目的。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国BeckmanCoulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设计引物的GeXP eXpression Profiler软件和用于结果分析的GenomeLabTM GeXPGenetic Analysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（即基因特异性引物5’端连接通用引物序列）相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段（DNA Size Standard,DSS）迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。GeXP系统可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能同时鉴别多种病原体的检测方法和检测试剂盒，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测家禽多种呼吸道传染性疾病病原体的试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的GeXP快速检测的试剂或试剂盒，含有如下十种PCR引物对的十种、任意九种、任意八种、任意七种、任意六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种：鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对A，鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR引物对B，鉴定或辅助鉴定H7亚型禽流感病毒的PCR引物对C，鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对D，鉴定或辅助鉴定新城疫病毒的PCR引物对E，鉴定或辅助鉴定传染性支气管炎病毒的PCR引物对F、鉴定或辅助鉴定传染性喉气管炎病毒的PCR引物对G，鉴定或辅助鉴定鸡毒支原体的PCR引物对H，鉴定或辅助鉴定滑液囊支原体的PCR引物对I，鉴定或辅助鉴定副鸡嗜血杆菌的PCR引物对J；

所述PCR引物对A由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对D由序列表序列7所示的单链DNA和序列表序列8所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对E由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对F由序列表序列11所示的单链DNA和序列表序列12所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对G由序列表序列13所示的单链DNA和序列表序列14所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对H由序列表序列15所示的单链DNA和序列表序列16所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对I由序列表序列17所示的单链DNA和序列表序列18所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对J由序列表序列19所示的单链DNA和序列表序列20所示的单链DNA组成。

在上述试剂或试剂盒中，所述PCR引物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度相同。

在上述试剂或试剂盒中，所述PCR引物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度均分别为10nM。

本发明所提供的试剂或试剂盒中的引物对可检测的病原体种类分别如下：PCR引物对A可检测16种HA亚型禽流感病毒，即H1—H16亚型的禽流感病毒；PCR引物对B可检测H5亚型禽流感病毒；PCR引物对C可检测H7亚型禽流感病毒；PCR引物对D可检测H9亚型禽流感病毒；PCR引物对E可检测新城疫病毒；PCR引物对F可检测传染性支气管炎病毒；PCR引物对G可检测传染性喉气管炎病毒；PCR引物对H可检测鸡毒支原体；PCR引物对I可检测滑液囊支原体；PCR引物对J可检测副鸡嗜血杆菌；

本发明所提供的试剂或试剂盒中的引物对可检测的病原体来源分别如下：PCR引物对A可检测禽源的禽流感病毒，PCR引物对B可检测禽源的H5亚型禽流感病毒，PCR引物对C可检测禽源的H7亚型禽流感病毒，PCR引物对D可检测禽源的H9亚型禽流感病毒，PCR引物对E可检测禽源的新城疫病毒，PCR引物对F可检测禽源的传染性支气管炎病毒病毒，PCR引物对G可检测禽源的传染性喉气管炎病毒，PCR引物对H可检测鸡、火鸡源鸡毒支原体；PCR引物对I可检测鸡、火鸡源的滑液囊支原体，PCR引物对J可检测禽源的副鸡嗜血杆菌，所述禽源具体可为鸡源或鸭源，但不限于上述病毒的上述来源。

本发明保护如下引物对A-J在制备鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的试剂盒中的应用；

所述PCR引物对J由序列表序列19所示的单链DNA和序列表序列20所示的单链DNA组成；

所述病原体为禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和/或副鸡嗜血杆菌。

使用本发明所提供的基于GeXP系统的试剂或试剂盒中的10种引物对同时检测禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌的特异性强，灵敏度为100拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。本发明为常见的主要鸡呼吸道病及其病原体的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和检测体系，更符合实际的需要，应用前景广阔。

附图说明

图1为H5、H9亚型禽流感病毒cDNA混合模板的GeXP十重PCR的毛细管电泳分析图。

图2为传染性支气管炎cDNA和鸡毒支原体DNA混合模板的GeXP十重PCR的毛细管电泳分析图。

图3为9种呼吸道病原的GeXP十重PCR的毛细管电泳分析图。

图1—3中，横坐标为PCR扩增产物的碱基数，纵坐标为荧光信号值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PCR引物对的设计

以GenBank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用DNASTAR软件进行序列比对，选取针对各个靶基因高度保守与特异的基因片段，由premier 5.0软件设计了10重特异性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物（下划线标出的序列），引物方向均为从5’-3’端，具体如下：

1）、以禽流感病毒(AIV)M基因为靶基因的引物对A：

AIV-F1:AGGTGACACTATAGAATAAGCCGAGATCGCGCAGA（序列表序列1）；

AIV-R1:GTACGACTCACTATAGGGACGCTCACTGGGCACGGT（序列表序列2）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为190bp；

靶序列为Genbank DQ485227的第88-104和第224-240位。

2）、以H5亚型禽流感病毒(AIV-H5)HA基因为靶基因的引物对B：

AIV-H5-F1:AGGTGACACTATAGAATAGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTA（序列表序列3）；

AIV-H5-R1:GTACGACTCACTATAGGGACACATCCATAAAGAYAGACCAGC（序列表序列4，其中的Y为兼并碱基，代表C或T）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为223bp；

靶序列为Genbank DQ095615.1的第1485-1508和第1648-1670位。

3）、以H7亚型禽流感病毒(AIV-H7)HA基因为靶基因的引物对C：

AIV-H7-F1:AGGTGACACTATAGAATAAGTGGAAACAAGTTGATAACAGT（序列表序列5序列）；

AIV-H7-R1:GTACGACTCACTATAGGGATGCCCCATTGAAASTGAA（序列表序列6序列，其中的S为兼并碱基，代表C或G）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为175bp；

靶序列为Genbank EU742995.2的第616-638和第736-753位。

4）、以H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)HA基因为靶基因的引物对D：

AIV-H9-F1:AGGTGACACTATAGAATAACCATTTATTCGACTGTCGCCT（序列表序列7序列）；

AIV-H9-R1:GTACGACTCACTATAGGGACATTGGACATGGCCCAGAA（序列表序列8序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为116bp；

靶序列为Genbank DQ485224的第1609-1630和第1669-1687位。

5）、以新城疫病毒(NDV)F基因为靶基因的引物对E：

NDV-F1:AGGTGACACTATAGAATAAGCATTGCTGCAACCAATGA（序列表序列9序列）；

NDV-R1:GTACGACTCACTATAGGGAACAAACTGCTGCATCTTCCC（序列表序列10序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为126bp；

靶序列为Genbank ABG29388的第469-488和第538-557位。

6）、以传染性支气管炎病毒（IBV）N基因为靶基因的引物对F：

IBV-F1:AGGTGACACTATAGAATAGGAGGACCTGATGGTAATTTCC（序列表序列11序列）；

IBV-R1:GTACGACTCACTATAGGGATGCGAGARCCCTTCTTCTGCT（序列表序列12序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为239bp；

靶序列为Genbank GU393338.1的第26380-26401和第26561-26581位。

7）、以传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因为靶基因的引物对G：

ILTV-F1:AGGTGACACTATAGAATAGTGCAGTTTTGCTCCGAGTT（序列表序列13序列）；

ILTV-R1:GTACGACTCACTATAGGGAATAGACGGCAACCTCTCCAA（序列表序列14序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为182bp；

靶序列为Genbank HM230797.1的第1072-1091和第1197-1216位。

8）、以鸡毒支原体(MG)16rRNA基因为靶基因的引物对H：

MG-F1:AGGTGACACTATAGAATACAAGGAAGCGCATGTCTAGG（序列表序列15序列）；

MG-R1:GTACGACTCACTATAGGGACTGGGTTTTAATTGTTTCACCG（序列表序列16序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为200bp；

靶序列为Genbank JN935873.1的第1400-1419和第1541-1562位。

9）、以滑液囊支原体(MS)VLHA基因为靶基因的引物对I：

MS-F1:AGGTGACACTATAGAATAGACCCTGTAGAGRCTGCTAAAA（序列表序列17序列，其中的R为兼并碱基，代表A或G）；

MS-R1:GTACGACTCACTATAGGGAGCTTCAACTTGTCTTTTTAATGC（序列表序列18序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为138bp；

靶序列为Genbank GU084387.1的第384-405和第462-484位。

10)、以副鸡嗜血杆菌HA基因为靶基因的引物对J：

IC-F1:AGGTGACACTATAGAATATCTGATTATAAACCAACTAAAAGAGCA（序列表序列19序列）；

IC-R1:GTACGACTCACTATAGGGAGCAAGTTCTGGTAATGATGGTAAGTT（序列表序列20序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为156bp；

靶序列为GenbankAF491820.1的第388-414和第481-506位。

根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统如GenomeLabTM GeXP GeneticAnalysis System毛细管电泳仪的误差，使用上述引物对A-G及GeXP通用引物对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上下波动3bp。

实施例2、PCR引物对的特异性检测

一、模板的制备

1、病毒RNA提取及cDNA的获得

1）病毒RNA提取

使用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0（大连TaKaRa公司，产品编号为DV819A）按照试剂盒说明书，分别从如下病毒毒株的鸡胚尿囊液中提取RNA（以提取阴性鸡胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）：禽流感病毒毒株：Duck/HK/717/79-d1（H1N3亚型）、Duck/HK/77/76（H2N3亚型）、Duck/HK/526/79/2B（H3N6亚型）、Duck/HK/668/79（H4N5亚型）、Duck/HK/531/79（H6N8亚型）、Turkey/ont/6118/68（H8N4亚型）、Duck/Guangxi/1/00（H9N2亚型）、Duck/HK/147/77（H9N6）、Duck/HK/876/80（H10N3亚型）、Duck/HK/661/79（H11N3亚型）、Duck/HK/862/80（H12N5亚型）、Gull/MD/704/77（H13N5亚型）文献：ZhixunXie,Yao-shan Pang,Jiabo Liu,et al.A multiplex RT-PCR for detection of type Ainfluenza virus and differentiation of avian H5,H7,and H9 hemagglutininsubtypes[J].Molecular and Cellular Probes,2006,20(3-4):245-249.）；10种新城疫病毒毒株F48E9株、Mukteswar株、C₃₀株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02、GX7/02（文献：陈安莉,谢芝勋,周辰瑜,等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41(09):917-922.）；8种传染性支气管炎病毒毒株:Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas (Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52、广西分离株GXIB/02（文献：谢志勤,谢芝勋,吕华刚.等.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报,2008,21(6):1733-1736.）。

2）cDNA的获得

将步骤1）获得的RNA样品分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系（20μL）：5×Reverse Transcriptase Buffer 4μL,Random Primer(9mer)50pmol、dNTP Mixture(10mM)2μL,Ribonuclease Inhibitor 20U,AMV ReverseTranscriptase,模板RNA 1μg，DEPC水补足至20μL。

用反转录试剂Random Primer(9mer)、dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor、Reverse Transcriptase XL(AMV)（均购自大连TaKaRa公司，目录号分别为D3802、D4030RA、D2313A、D2620）。

反应条件：抽提的总RNA加完DEPC水和Random Primer(9mer)后，瞬离，70℃10min后立即冰浴5min。加完其余四样后，瞬离，42℃ 1.5h，置于-20℃保存。

3）禽流感病毒毒株Chicken/Guangxi/1/04（H5N1亚型）、Duck/HK/313/78（H5N3亚型）和Duck/HK/47/76（H7N2亚型）分别是以cDNA形式留存的样品，并已经HA基因测序证实（记载上述毒株的文献如下：Zhixun Xie,Yao-shan Pang,Jiabo Liu,et al.Amultiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiationof avian H5,H7,and H9 hemagglutinin subtypes[J].Molecular and CellularProbes,2006,20(3-4):245-249）。

2、基因组DNA的提取

使用血液组织细胞基因组提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，产品编号DP304），按照试剂盒说明书，分别从如下病毒毒株的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组DNA（以提取阴性鸡胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）：5种传染性喉气管炎病毒毒株：北京株、台湾疫苗株、美国标准株、以色列疫苗株、广西分离株（文献：谢芝勋,谢志勤,庞耀珊.等.采用二温氏聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究[J].中国兽医科技,2000,30(9):5-7）；分别从如下病原体毒株或菌株的培养物中提取基因组DNA（以提取阴性培养物获得的样品为阴性对照样品）：7种鸡毒支原体毒株：S6、A5969、K2221、K1501、PG31、F2F10和F-K810（文献：罗思思,谢芝勋,邓显文.等.鸡毒支原体强弱毒株LAMP可视化鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学2012,42(09):943-948.）；5种滑液囊支原体毒株：K-1415、MS-28、FMT、PMS-122和PMS-156（文献：谢志勤,谢芝勋,庞耀珊.等.应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究[J].畜牧与兽医,2000,32(05):4-6）；2种副鸡嗜血杆菌菌株CVCC253和CVCC256（购自中国兽医药品监察所）。

3、测定核酸含量

用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

二、各引物对单重PCR的特异性检测

1、引物对A的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对A对步骤一中1获得的13种HA亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及步骤一中2获得的5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品分别进行PCR扩增，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序如下：

反应体系（20μL）：GenomeLabTM GeXP StartKit 5×PCR Buffer(含GeXP通用引物对，美国贝克曼公司，PN A85017)4μL,引物对A（每条引物在反应体系中的终浓度为10nM）、25mM MgCl₂ 4μL(美国贝克曼公司,PN A25395)、Thermo-Start DNAPolymerase 0.7μL(美国贝克曼公司,PN A25395),模板cDNA或DNA 0.5pg-0.5μg,加灭菌水至20μL。每个cDNA/DNA设置3个重复。

反应程序：95℃预变性10min；95℃30s，50℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；72℃延伸10min；4℃终止。

2）毛细管电泳

使用GenomeLab GeXP遗传分析系统对步骤1）的各PCR产物同时进行毛细管电泳检测，操作步骤如下：用甲酰胺为上样缓冲液（美国贝克曼库尔特公司,目录编号608082），DNA size standard Kit-400 Base Pairs（美国贝克曼库尔特公司,目录编号608098）与上样缓冲液按体积比1:（80-160）彻底混匀，在样品板上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃,120s；注入样品：2.0KV，30s；分离：6.0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遗传分析系统分析检测结果。

结果：13种HA亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品均可扩增得到190—192bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对A的靶序列；非禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对A的特异性很好，可特异检出13种HA亚型（H1—H13亚型）的禽流感病毒。另外，将引物对A的序列与H14、H15、H16亚型禽流感病毒的RNA序列进行NCBI BLASA比对，同源性很高，如引物对A的序列与H14N6（登录号：CY005394）、H14N5（登录号为：CY014605）、H14N5（登录号为：GU052253）、H15N9（登录号CY077617）、H15N6（登录号为：GU052261）、H15N9（登录号为：CY005406）、H16N3（登录号为：HM060055）的靶引物序列同源性均为100.00％，说明引物对A也可检出H14、H15、H16亚型禽流感病毒。

2、引物对B的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对B对步骤一中1的H5亚型（H5N1和H5N3）禽流感病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：2种H5亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到223-226bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对B的靶序列；非H5亚型禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对B的特异性很好，可以特异检出H5亚型禽流感病毒。

3、引物对C的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对C对步骤一中1的H7亚型（H7N2）禽流感病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3和H9N2亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：H7亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到175—177bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对C的靶序列；非H7亚型禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对C的特异性很好，可以特异检出H7亚型禽流感病毒。

4、引物对D的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对D对步骤一中1的H9亚型（H9N2和H9N6）禽流感病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3和H7N2亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：H9亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到118bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对D的靶序列；非H9亚型禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对D的特异性很好，可以特异检出H9亚型禽流感病毒。

5、引物对E的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对E对步骤一中1的10种新城疫病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亚型禽流感病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：10种新城疫病毒毒株的cDNA样品均扩增得到126—129bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对E的靶序列；非新城疫病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对E的特异性很好，可以特异检出新城疫病毒。

6、引物对F的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对F对步骤一中1的8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亚型禽流感病毒毒株和10种新城疫病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品均扩增得到239—241bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对F的靶序列；非传染性支气管炎病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对F的特异性很好，可以特异检出传染性支气管炎病毒。

7、引物对G的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对G对步骤一中2的5种传染性喉气管炎病毒毒株的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株、和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：5种传染性喉气管炎病毒毒株的DNA样品均扩增得到182—185bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对G的靶序列；非传染性喉气管炎病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对G的特异性很好，可以特异检出传染性喉气管炎病毒。

8、引物对H的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对H对步骤一中2的7种鸡毒支原体毒株的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：7种鸡毒支原体毒株的DNA样品均扩增得到200—203bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对H的靶序列；非鸡毒支原体及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对H的特异性很好，可以特异检出鸡毒支原体。

9、引物对I的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对I对步骤一中2的5种滑液囊支原体毒株的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：5种滑液囊支原体毒株的DNA样品均扩增得到136-139bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对I的靶序列；非滑液囊支原体及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对I的特异性很好，可以特异检出滑液囊支原体。

10、引物对J的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对J对步骤一中2的2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株和8种传染性支气管炎病毒毒株的cDNA样品以及5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株和5种滑液囊支原体毒株的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品以及阴性培养物的DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：2种副鸡嗜血杆菌菌株的DNA样品均扩增得到156—159bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对J的靶序列；非副鸡嗜血杆菌及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对J的特异性很好，可以特异检出副鸡嗜血杆菌。

三、十种引物对混合的特异性检测

1）将引物对A、B、C、D、E、F、G、H、I和J同时加入同一个PCR反应体系，分别对步骤一获得的2种H5亚型禽流感病毒毒株、1种H7亚型禽流感病毒毒株、1种H9亚型禽流感病毒毒株、10种新城疫病毒毒株、8种传染性支气管炎病毒毒株、5种传染性喉气管炎病毒毒株、7种鸡毒支原体毒株、5种滑液囊支原体毒株和2种副鸡嗜血杆菌菌株的cDNA或DNA样品进行扩增反应，以步骤一获得的阴性鸡胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序如下：

反应体系（20μL）：GenomeLabTM GeXP Start Kit 5×PCR Buffer(含GeXP通用引物对，美国贝克曼公司，PN A85017)4μL,引物对A、B、C、D、E、F、G、H、I和J（各引物对中的每条引物在反应体系中的终浓度均为10nM）、25mM MgCl₂ 4μL(美国贝克曼公司,PN A25395)、Thermo-Start DNA Polymerase 0.7μL(美国贝克曼公司,PNA25395),模板cDNA或DNA 0.5pg-0.5μg,加灭菌水至20μL。每个cDNA/DNA设置3个重复。

反应程序：95℃预变性10min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；72℃延伸10min；4℃终止。

2）毛细管电泳：与“步骤二”中的“步骤1中2）”相同。

结果：七种引物对A-J混合后分别对9种病原体（H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌）的单一cDNA或DNA样品检测，分别检出了192bp和223bp、192bp和177bp、192bp和118bp、128bp、240bp、184bp、202bp、137bp和158bp的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物。

上述结果表明：引物对A—J混合后对各引物对的特异性无影响，可用于特异地检出禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌中的每种病原体。

实施例3、PCR引物对的灵敏度检测

一、制备含靶基因的单克隆质粒标准品

分别以实施例2中步骤一获得的禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌的cDNA或DNA样品为模板，将PCR扩增获得的禽流感病毒M基因、H5亚型禽流感病毒HA基因、H7亚型禽流感病毒HA基因、H9亚型禽流感病毒HA基因、新城疫病毒ND基因、传染性支气管炎病毒N基因和传染性喉气管炎病毒TK基因、鸡毒支原体16rRNA基因、滑液囊支原体VLHA基因和副鸡嗜血杆菌HA基因的全长cDNA或DNA片段，分别与质粒pGEM-T Easy Vector连接（购自Promega公司）连接，获得七种重组质粒PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、PI和PJ，经测序证实这十种重组质粒为质粒pGEM-T Easy Vector分别插入了一种上述基因的重组质粒，且分别可作为上述10种引物对A—J的靶基因。

利用紫外分光光度计测定各含靶基因重组质粒的浓度，并根据重组质粒的分子量和浓度计算相应的拷贝数。将高浓度的各重组质粒分别稀释成靶基因浓度为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL的单一质粒稀释液。将各重组质粒混合，制成在混合溶液中各质粒的浓度均为10⁵拷贝/μL的混合液，再按10倍比稀释为10⁴、10³、10²拷贝/μL的混合质粒稀释液。

二、十种引物对混合的灵敏度检测

1.以引物对A—J混合为引物，不同浓度的不同单一质粒稀释液为模板，按照实施例2中步骤三的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H5亚型禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测H7亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H9亚型禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测新城疫病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测传染性支气管炎病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测传染性喉气管炎病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸡毒支原体的灵敏度为100拷贝/μL，检测滑液囊支原体的灵敏度为100拷贝/μL，检测副鸡嗜血杆菌的灵敏度为10拷贝/μL。

2.以引物对A—J混合为引物，不同浓度的混合十种质粒稀释液为模板，按照实施例2中步骤三的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H5亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H7亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H9亚型禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测新城疫病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测传染性支气管炎病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测传染性喉气管炎病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸡毒支原体的灵敏度为100拷贝/μL，检测滑液囊支原体的灵敏度为100拷贝/μL，检测副鸡嗜血杆菌的灵敏度为10拷贝/μL。

实施例4、引物对检测的准确率

一、十种引物对混合检测的准确率

分别取经HA基因测序鉴定为H5亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感病毒的cDNA样品，经病毒分离、血凝抑制试验、中和试验等常规实验方法分别鉴定为H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的抗原液（按照实施例2中步骤一的方法分别提取cDNA或DNA），经常规PCR方法分别鉴定为鸡毒支原体、滑液囊支原体、副鸡嗜血杆菌的培养物（按照实施例2中步骤一的方法分别提取cDNA或DNA），按照实施例2中步骤三的方法分别对上述单一病原体的cDNA或DNA样品、上述病原体模拟临床感染的样品、上述9种病原体cDNA或DNA样品的混合模板进行PCR扩增和电泳检测，具体结果如下：

1、9种单一病原体的cDNA或DNA样品均可检出相应病原体的目的峰，无其他杂峰，与上述测序、病毒分离、血凝抑制试验、中和试验和PCR等常规实验方法的检测结果相符合。

2、模拟临床感染

从上述9种病原体的cDNA或DNA样品中随机选择两种病原体的cDNA或DNA混合，分如下两组试验：

第1组：H5亚型禽流感病毒的cDNA和H9亚型禽流感病毒的cDNA混合作为模板，

第2组：传染性支气管炎病毒的cDNA和鸡毒支原体的DNA混合作为模板；

经实施例2中步骤三的方法检测，第1组可检出116.89bp、190.26bp和223.37bp三个目的峰（图1），表明样品中含有H5和H9亚型禽流感病毒的模板，与实际相符；第2组可检出202.03bp和240.50bp两个目的峰，无其他杂峰，表明样品中含有传染性支气管炎病毒和鸡毒支原体的模板（图2），与实际相符。

3、9种病原体混合

可检出10个目的峰（如图3所示），无其他杂峰，表明检测样品中含有H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体、副鸡嗜血杆菌的全部病原体的cDNA或DNA模板，与实际相符。

Claims

1.鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的GeXP快速检测的试剂或试剂盒，含有如下十种PCR引物对中的十种、任意九种、任意八种、任意七种、任意六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任意一种：鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对A，鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR引物对B，鉴定或辅助鉴定H7亚型禽流感病毒的PCR引物对C，鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对D，鉴定或辅助鉴定新城疫病毒的PCR引物对E，鉴定或辅助鉴定传染性支气管炎病毒的PCR引物对F、鉴定或辅助鉴定传染性喉气管炎病毒的PCR引物对G，鉴定或辅助鉴定鸡毒支原体的PCR引物对H，鉴定或辅助鉴定滑液囊支原体的PCR引物对I，鉴定或辅助鉴定副鸡嗜血杆菌的PCR引物对J；

2.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述PCR引物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度相同。

3.根据权利要求1或2所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述PCR引物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度分别均为10nM。

4.如下引物对A-J在制备鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的试剂盒中的应用；