CN103255236B - H7n9禽流感病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。发明人针对H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，分别设计了PCR引物和荧光TaqMan探针，构成专门针对H7亚型和N9亚型禽流感病毒的引物组和探针组，组合成二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，既可确定单个H7亚型或N9亚型禽流感病毒感染，也可一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。本发明及其检测方法充分利用了PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否为H7N9禽流感病毒感染。

Description

H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纤突，分别具有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的活性。这两个基因是病毒的特异性抗原，根据HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1-H16）和9个N亚型（N1-N9）。

由于禽流感病毒其基因组呈节段复制，通过依赖RNA聚合酶完成复制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒发生基因突变的频率极高。自2013年2月以来，华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。这是首次发现H7N9禽流感病毒感染人的病例，目前，急需建立H7N9禽流感病毒的快速检测方法和研发相应试剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、快速方便的H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。

引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1：1：2：1：1：1。

上述H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括反转录反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；反转录反应液每管16μL，含有5×ReverseTranscriptaseBuffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor1μL和5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL；PCR反应液每管11.4μL，含有2×PremixExTaq10μL，20μMH7亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针分别0.2μL、0.2μL、0.4μL，20μMN9亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针各0.2μL；DEPC水和超纯水各1mL。

发明人针对H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，通过PrimerExpress3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其特异性和引物之间的二聚体，筛选出了2套荧光TaqMan探针和引物，构成专门针对H7亚型和N9亚型禽流感病毒的引物组和探针组，组合成二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，既可确定单个H7亚型或N9亚型禽流感病毒感染，也可一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。本发明在常规PCR的基础上添加了一条标记两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时，报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，在荧光定量RT-PCR反应的退火过程中，探针优先结合到DNA模板上，当引物延伸到探针结合位置时，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，反应结果可以直接通过电脑实时观察，从而实现对H7N9禽流感病毒的快速检测，并根据试验结果判定H7N9禽流感病毒感染，同时还可确定H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒感染，根据本发明建立标准曲线，还可确定待检样品中H7N9禽流感病毒拷贝数。

实验证明，一方面，本发明及其检测方法充分利用了PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否为H7N9禽流感病毒感染；另一方面，若非H7N9禽流感病毒感染，还可确定是否是H7亚型禽流感病毒或N9亚型禽流感病毒感染。

附图说明

图1是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的特异性试验（FAM通道）结果图。

图2是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的特异性试验（ROX通道）结果图。

图3是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验（FAM通道）结果图。

图4是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验（FAM通道）的标准曲线。

图5是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验（ROX通道）结果图。

图6是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验（ROX通道）的标准曲线。

图7是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的重复性试验（FAM通道）结果图。

图8是应用本发明的二重荧光定量RT-PCR的重复性试验（ROX通道）结果图。

具体实施方式

实施例1引物和探针的设计及试剂盒的制备

禽流感病毒（H2N3、H4N5、H7N2、H8N4和H10N3）RNA由香港大学惠赠；禽流感病毒（H1N7、H5N1、H11N9）RNA由美国宾夕法尼亚大学惠赠；H7N9禽流感病毒的阳性RNA由广西壮族自治区疫病控制中心惠赠。禽流感病毒（H3N2、H6N6、H9N2）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)由广西壮族自治区兽医研究所分离保存。

1、引物和探针的设计

根据基因库中H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，进行比对，确定H7亚型禽流感病毒HA基因保守序列（genbank：KC853766.1的第1054-1157位核苷酸）和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列（genbank：KC853765.1的第427-509位核苷酸），采用PrimerExpress3.0软件设计引物对及探针，引物序列为：

H7亚型禽流感病毒正向引物（引物1）：5’-GGATGGGAAGGTCTSATTGA-3’（SEQ.ID.No.1）

H7亚型禽流感病毒反向引物（引物2）：5’-TGATCWATTGCAGATTGGGTGC-3’（SEQ.ID.No.2）

H7亚型禽流感病毒TaqMan探针（探针A）：

5’-CAAAATGCACAAGGRGARGGAACTGC-3’（SEQ.ID.No.5）

H7亚型禽流感病毒TaqMan探针的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；

特异性地针对N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列的引物和TaqMan探针的核苷酸序列为：

N9亚型禽流感病毒正向引物（引物3）：5’-GGAACAATACACGATAGRTCCCA-3’（SEQ.ID.No.3）

N9亚型禽流感病毒反向引物（引物4）：5’-CCTGCTGTTGTAYACTGTGGG-3’（SEQ.ID.No.4）

N9亚型禽流感病毒TaqMan探针（探针B）：

5’-CGCGCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’（SEQ.ID.No.6）

N9亚型禽流感病毒TaqMan探针的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。

FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测是否含有H7亚型禽流感病毒；

ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测是否含有N9亚型禽流感病毒。

2、样本的制备

参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，分别提取禽流感病毒（H3N2、H4N5、H6N6和H9N2）、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒RNA，提取传染性喉气管炎病毒的DNA。

3、H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的配制

将引物对和探针采用灭菌双蒸水进行溶解，上下游引物和探针的浓度均为20μM。

H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒包括反转录试剂和荧光PCR反应试剂，反转录试剂包括5×ReverseTranscriptaseBuffer、50pmol9merRandomPrimer、10mMdNTPMixture、40URibonucleaseInhibitor、5U/μLAMVReverseTranscriptase和DEPC水；反转录反应液具体每管16μL：5×ReverseTranscriptaseBuffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL。进行反转录时，加入1pg-1μgRNA模板，DEPC水补足至50μL，将其反转录成cDNA。反转录的最佳反应模式是25℃10min，然后42℃50min，最后95℃2min。

荧光PCR反应试剂组成为：H7亚型禽流感病毒正向引物、H7亚型禽流感病毒反向引物、H7亚型禽流感病毒TaqMan探针、N9亚型禽流感病毒正向引物、N9亚型禽流感病毒反向引物、N9亚型禽流感病毒TaqMan探针、PremixExTaq（大连宝生物工程有限公司，产品目录号为：RR390A）和RNase-free水；荧光PCR反应液具体每管11.4μL（2×PremixExTaq10μL，20μM引物1、引物2和探针A分别为0.2μL、0.2μL、0.4μL，20μM引物3、引物4和探针B各0.2μL，即引物1、引物2、引物3、引物4和探针B在反应液中的终浓度分别均为0.2μM；探针A在反应液中的终浓度为0.4μM。进行荧光PCR反应时，加入2μLcDNA模板，RNase-free水补足至20μL。

试剂盒中包含上述独立包装的H7亚型禽流感病毒正向引物、H7亚型禽流感病毒反向引物、H7亚型禽流感病毒TaqMan探针、N9亚型禽流感病毒正向引物、N9亚型禽流感病毒反向引物、N9亚型禽流感病毒TaqMan探针；也可直接包含上述反应液。

实施例2引物及其试剂盒在二重荧光RT-PCR检测H7N9禽流感病毒的应用

1、引物和探针在H7N9禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测中的特异性

以上述cDNA为模板，在装有11.4μL上述反应液样品管中分别加入2μL模板,以超纯水补足构成20μL反应体系，将上述各样品管放入Roche公司LightCycler2.0PCR仪后，设置如下条件进行反应：94℃预变性30s；然后采用两步法进行反应：94℃变性5s，60℃退火20s，40个循环，每个循环结束后采集荧光信号，最后40℃结束反应。反应结束后根据扩增曲线判定结果。

FAM通道（在530nm激发光下）的结果见图1，显示的是H7亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR试验扩增曲线，图中1为H7N9、2为H7N2、3为H11N9、4为H1N7、5为H2N3、6为H3N2、7为H4N5、8为H5N1、9为H6N6、10为H8N4、11为H9N2、12为H10N3、13为NDV、14为IBV、15为ILTV、16为阴性对照（以无菌水为模板），可以看出，对H7N9和H7N2禽流感病毒的检测均为阳性（明显S型曲线），而对其他亚型禽流感病毒（H11N9、H1N7、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N6、H8N4、H9N2和H10N3）和常见禽病病原体新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的检测结果均为阴性，说明该引物及方法特异性高。

ROX通道（在610nm激发光下）的结果见图2，显示的是N9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR试验扩增曲线，图中1为H7N9、2为H7N2、3为H11N9、4为H1N7、5为H2N3、6为H3N2、7为H4N5、8为H5N1、9为H6N6、10为H8N4、11为H9N2、12为H10N3、13为NDV、14为IBV、15为ILTV、16为阴性对照（以无菌水为模板），可以看出，对H7N9和H11N9禽流感病毒的检测均为阳性（明显S型曲线），而对其他亚型禽流感病毒（H7N2、H1N7、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N6、H8N4、H9N2和H10N3）和常见禽病病原体新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的检测结果均为阴性，说明该引物及方法特异性高。

因此，本发明H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒用于检测待测样本时，反应结果的判断如下：

反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；

若FAM通道（在530nm激发光下）的反应结果为S型曲线，且ROX通道（在610nm激发光下）的反应结果为S型曲线，则样品中含有H7N9禽流感病毒；

若FAM通道（在530nm激发光下）的反应结果为S型曲线，而ROX通道（在610nm激发光下）的反应结果为直线，则待测样本中含有H7亚型禽流感病毒，而不含有N9亚型禽流感病毒；

若ROX通道（在610nm激发光下）的反应结果为S型曲线，而FAM通道（在530nm激发光下）的反应结果为直线，则说明样品中含有N9亚型禽流感病毒，而不含有H7亚型禽流感病毒。

2、引物和探针在H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测中的敏感性和标准曲线

1）、标准品的制备：以H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因全长引物分别与对应的cDNA模板进行PCR扩增。阳性产物经胶回收纯化后，连接到pGEM-TEasy载体，提取阳性克隆质粒，送至大连宝生物公司进行测序，根据分子量及浓度计算H7和N9质粒的拷贝数。将上述得到的H7质粒按10倍递减稀释成1×10⁷copies/μL-1×10⁰copies/μL；将上述得到的N9质粒按10倍递减稀释成1×10⁷copies/μL-1×10⁰copies/μL。

2）、然后按照上述反应体系和反应条件进行荧光RT-PCR反应。

FAM通道（在530nm激发光下）的检测结果如图3和图4，检测H7亚型禽流感病毒的敏感性及标准曲线，1-7分别为荧光定量RT-PCR检测方法的检测限为1×10⁷-1×10¹copies/μL，8为空白对照（RNase-free水）；ROX通道（在610nm激发光下）的检测结果表明如图5和图6，检测N9亚型禽流感病毒的敏感性及标准曲线，1-6分别为1×10⁷-1×10²copies/μL，7为空白对照（RNase-free水）。荧光定量RT-PCR检测方法的检测限为10²copies/μL，意即H7N9禽流感病毒检测限为10²copies/μL。

从图中的荧光曲线可见，对H7亚型禽流感病毒和N9亚型禽流感病毒的检测100拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对H7N9禽流感病毒的灵敏度为100拷贝，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。

3、引物和探针在H7N9禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测中的重复性

按照上述反应体系和反应条件进行二重荧光定量RT-PCR，模板是H7N9禽流感病毒的cDNA阳性样品。

分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差和变异系数来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。在第四天、第七天后重复检测保存于-20℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。

批内重复性试验检测结果见图7和图8，图7为FAM通道，在530nm激发光下检测H7亚型禽流感病毒cDNA通道，图中1-3为H7亚型禽流感病毒cDNA的3个重复；4为空白对照；图8为ROX通道，在610nm激发光下检测N9亚型禽流感病毒cDNA通道，图中1-3为N9亚型禽流感病毒cDNA的3个重复；4为空白对照。批间重复性试验结果显示，三次不同时间检测H7N9禽流感病毒cDNA模板的Ct值变异系数均小于3%，可以看出，H7亚型和N9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR重复性良好，即该方法检测H7N9禽流感病毒具有良好的准确性和重复性。

Claims (3)

1.一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别是序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别是序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列；该试剂盒包括反转录反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；

所述反转录反应液每管16μL，含有5×ReverseTranscriptaseBuffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40URibonucleaseInhibitor1μL和5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL；

所述PCR反应液每管11.4μL，含有2×PremixExTaq10μL，20μMH7亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针分别0.2μL、0.2μL、0.4μL，20μMN9亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针各0.2μL；

所述DEPC水和超纯水各1mL。

2.根据权利要求1所述的H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。

3.根据权利要求2所述的H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1：1：2：1：1：1。