CN108950081A - 一种h7亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种h7亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

Description

一种H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法
技术领域
本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种H7亚型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR的检测方法，包括鉴定H7亚型流感病毒的引物对和探针。
背景技术
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)，该类病毒可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。近年来时有H7亚型流感病毒爆发，如1999～2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡，造成重大经济损失。2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感，不仅造成了重大的经济损失，而且感染89人。自2013年2月以来，我国华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。
近年来，在我国还出现了致死禽类的高致病性H7N9禽流感病毒。这些事件表明H7亚型禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏，还对人类健康构成潜在的威胁。
发明内容
本发明的目的是提供一种H7亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。
本发明首先提供一种检测H7亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定H7亚型禽流感病毒HA基因的引物对H7forward、H7reverse和探针H7probe，其引物对和探针序列信息如下：
正向引物序列H7forward：
5′-GCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(SEQ ID NO:1)
反向引物序列H7reverse：
5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:2)
探针序列H7probe：
5′-CCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTA-3′(SEQ ID NO:3)
其中探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。
本发明再一个方面提供检测临床样品中H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，10pmol/μL H7forward、H7reverse和H7probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL。
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。
附图说明
图1：H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物位置由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图2：本发明引物和探针的灵敏度检测结果图；
图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。
具体实施方式
实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：H7亚型禽流感病毒检测引物及探针设计与筛选
根据H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)编码基因HA基因进行引物设计，通过NCBI查找到918条公开的H7亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1451-1620的碱基(参考序列GenBank登录号：KJ549786)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。
设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，上游引物所在区域对应的参考序列第1515位碱基，在918条序列中对应该位置的碱基有A和G两种，因此引物序列中设计成简并碱基R；下游引物所在区域对应的参考序列第1578位碱基，在918条序列中对应该位置的碱基有T和C两种，下游引物取参考序列的反向互补序列，对应A和G，因此引物序列中设计成简并碱基R。引物序列如下：
上游引物H7-F1：5′-GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(26bp)
上游引物H7-F2：5′-GCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(23bp)
下游引物H7-R1：5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(24bp)
下游引物H7-R2：5′-AAGCTAAACCARAGTATCACA-3′(25bp)
以引物组对应目的条带区间为模板设计2条探针，进行最佳探针筛选，探针序列所在区域对应的参考序列第1542位碱基，在918条序列中对应该位置的碱基有A和G两种，因此探针序列中设计成简并碱基R；对应的参考序列第1557位、1560位和1563位碱基，在918条序列中对应该位置的碱基均为T和C两种，因此探针序列中设计成简并碱基Y。探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。修饰后探针序列如下：
H7-P1：5′-FAM-ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA-BHQ1-3′(29bp)
H7-P2：5′-FAM-CCRGTCAAACTAAGCAGYGGYTA-BHQ1-3′(24bp)
2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。
组合1：H7-F1、H7-R1和H7-P1
组合2：H7-F1、H7-R2和H7-P1
组合3：H7-F2、H7-R1和H7-P1
组合4：H7-F2、H7-R2和H7-P1
组合5：H7-F1、H7-R1和H7-P2
组合6：H7-F1、H7-R2和H7-P2
组合7：H7-F2、H7-R1和H7-P2
组合8：H7-F2、H7-R2和H7-P2
引物对和探针的筛选包括如下步骤
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，10pmol/μL H7forward、H7reverse和H7probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8μL，待检测的样品RNA模板2μL。
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
实验结果表明，相同反应条件，组合7的扩增效率优于其他7个组合，因此将组合7的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：
正向引物H7forward：5′-GCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(SEQ ID NO:1)
反向引物H7reverse：5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:2)
探针H7probe：5′-CCRGTCAAACTAAGCAGYGGYTA-3′(SEQ ID NO:3)
其中探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。
实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性
检测灵敏度
设置7组不同浓度的H7亚型禽流感病毒RNA模板，进行荧光定量RT-PCR最适条件下的核酸扩增。
参照RNA提取试剂盒说明书提取H7亚型流感病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度(1ng/μL)，按照10倍梯度稀释成10-1ng/μL，10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，10-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行荧光定量RT-PCR核酸扩增。
结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA终浓度10-4ng/μL。
检测特异性
根据前述反应体系添加各组分，H7亚型流感病毒RNA模板(H7N3亚型禽流感病毒，H7N9亚型禽流感病毒)浓度分别为1ng/μL，非特异性病毒(H1N2亚型禽流感病毒，H3N2亚型禽流感病毒，H4N2亚型禽流感病毒，H5N1亚型禽流感病毒，H5N2亚型禽流感病毒，H5N6亚型禽流感病毒，H6N2亚型禽流感病毒，H9N2亚型禽流感病毒，H10N7亚型禽流感病毒，H11N2亚型禽流感病毒，新城疫病毒，传染性支气管炎病毒)RNA模板浓度分别为1ng/μL。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。结果显示，除了H7亚型流感病毒RNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线(H7N3对应Ct值为14.57，H7N9对应Ct值为18.12)，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对H7亚型禽流感病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。
实施例3：对实际样品的检测应用
1.样品采集：
采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用PBS液(pH7.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA 5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。
2.样品制备
将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。
3.核酸提取
参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。
4.鉴定
4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒。
4.2样品检测
采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。
4.3检测结果
结果显示，采用国标方法鉴定结果为3号和10号样品临床样品有FAM荧光信号，Ct值分别为21.8和24.3，判定为H7阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为3号和10号样品临床样品有FAM荧光信号，Ct值分别为22.3和24.6，判定为H7阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现FAM荧光信号，结果准确可信。
综上所述，这30份临床样品中，10号样品可以判定为H7阳性，3号样品为H7阳性但是N9阴性，其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定H7亚型禽流感病毒，对我国当前流行的新型H7N9亚型禽流感病毒也有较高的鉴别准确度，满足了当前对于H7N9亚型禽流感病毒检测的需求。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcratgcaaa atagaataca gat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagctaaacc aragtatcac atc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccrgtcaaac taagcagcgg yta 23

Claims (5)

1.一种检测H7亚型禽流感病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对和探针序列信息如下：
正向引物：
5′-GCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(SEQ ID NO:1)
反向引物：
5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:2)
探针：
5′-CCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTA-3′(SEQ ID NO:3)。
2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。
3.权利要求1所述的引物对和探针组在制备检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。
4.一种用于检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物对和探针组。
5.一种检测临床样品中H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，10pmol/μL权利要求1所述的引物对和探针各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL；
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；保存文件，运行；
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
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