CN110484654A - 一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法 - Google Patents

一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110484654A
CN110484654A CN201910804140.7A CN201910804140A CN110484654A CN 110484654 A CN110484654 A CN 110484654A CN 201910804140 A CN201910804140 A CN 201910804140A CN 110484654 A CN110484654 A CN 110484654A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
hypotype
influenza virus
avian influenza
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910804140.7A
Other languages
English (en)
Inventor
王楷宬
王素春
黄保续
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Original Assignee
CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER filed Critical CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority to CN201910804140.7A priority Critical patent/CN110484654A/zh
Publication of CN110484654A publication Critical patent/CN110484654A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的是提供一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重实时荧光RT‑PCR的检测方法，以实现对通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重荧光RT‑PCR检测方法，以实现对通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

Description

一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒检测方法
技术领域
本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重实时荧光RT-PCR的检测方法，包括分别用于鉴定通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的引物对和探针。
背景技术
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，根据致病力可以把禽流感病毒分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)，该类病毒可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。
Perroncito于1878年在意大利首次报道了H5亚型高致病性禽流感。H5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。H5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性H5N1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染H5N1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染H5N1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染H5N1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。
近年来时有H7亚型流感病毒爆发，如1999～2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡，造成重大经济损失。2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感，不仅造成了重大的经济损失，而且感染89人。自2013年2月以来，我国华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。在我国还出现了致死禽类的高致病性H7N9禽流感病毒。这些事件表明H7亚型禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏，还对人类健康构成潜在的威胁。
我国常见的低致病性禽流感主要是由H9亚型禽流感病毒引起，近几年在世界上许多国家都暴发了H9亚型禽流感疫情。H9亚型禽流感病毒已经能传播至哺乳动物，包括猪和人类，可在家禽、野鸟、猪和人群中造成不同程度的致病力和毒力。我国自1994年首次报道从鸡群中分离到H9亚型禽流感病毒以来，目前绝大部分省市都有H9亚型禽流感的流行，给我国的养禽业造成巨大的经济损失。由于高致病性禽流感的高度破坏性，并且已被列入政府强制免疫计划的疫病，养鸡户对其防控很重视，而忽视了对低致病性禽流感的防范，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业的持续危害。
H9亚型AIV在世界范围内广泛分布，在遗传进化上，可以分为北美系和欧亚系两大分支，而欧亚系又进一步衍生出以BJ/94-like或Y280-like、G1-like、Y439-like以及F/98-like等为代表的病毒亚群。根据新的亚系命名系统，我国H9亚型AIV分离毒株主要来源于H9.4.2分支，而4.2分支又演化为4.2.1～4.2.6分支。近年来，我国分离的H9亚型AIV毒株主要为H9.4.2.5分支。
流感病毒是RNA病毒，变异速度快，尤其是用于分型的HA基因。以往的流感病毒检测方法多是针对某一特定亚型，并不能覆盖我国当前流行的最新分支。为全面了解禽流感病毒在我国的流行情况，实际应用中需要建立一种可以快速检测禽流感病毒，并同时区分H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重实时荧光RT-PCR的检测方法，以实现对通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。
本发明首先提供一种检测通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的引物对AIV-M forward、AIV-M reverse和探针AIV-M probe，H5 forward、H5 reverse和探针H5 probe，H7forward、H7 reverse和探针H7 probe，H9 forward、H9 reverse和探针H9 probe，其引物对和探针序列信息如下：
通用型正向引物AIV-M forward：
5′-TGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(SEQ ID NO:1)
通用型反向引物AIV-M reverse：
5′-GCRTTYTGGACAAASCGTCTACGC-3′(SEQ ID NO:2)
通用型探针AIV-M probe：
5′-CTGCAGTCCTCGCTCACTGG-3′(SEQ ID NO:3)
H5亚型正向引物H5 forward：
5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA-3′(SEQ ID NO:4)
H5亚型反向引物H5 reverse：
5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(SEQ ID NO:5)
H5亚型探针H5 probe：
5′-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-3′(SEQ ID NO:6)
H7亚型正向引物H7 forward：
5′-GCRATGCAAAATAGRATACAGAT-3′(SEQ ID NO:7)
H7亚型反向引物H7 reverse：
5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:8)
H7亚型探针H7 probe：
5′-CCRGTCAAACTAAGCAGYGGYTA-3′(SEQ ID NO:9)
H9亚型正向引物H9 forward：
5′-CCTCACCATTTATTCGACTGT-3′(SEQ ID NO:10)
H9亚型反向引物H9 reverse：
5′-AYCCATTGRACATGGCCCAG-3′(SEQ ID NO:11)
H9亚型探针H9 probe：
5′-CAARAAGGCAGCAAACCCCATT-3′(SEQ ID NO:12)。
其中通用型探针AIV-M probe的5′端进行羧基荧光素ROX标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记；
H5亚型探针H5 probe 5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；
H7亚型探针H7 probe 5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；
H9亚型探针H9 probe 5′端进行羧基荧光素CY5标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记。
上述的引物对和探针用于制备荧光RT-PCR检测试剂盒。
本发明再一个方面提供检测临床样品中通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重荧光RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管50μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ25.0μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 1.0μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1.0μL，10pmol/μL AIV-M forward、AIV-Mreverse和AIV-M probe各1.0μL，10pmol/μL H5 forward、H5 reverse和H5 probe各1.0μL，10pmol/μL H7 forward、H7 reverse和H7 probe各1.0μL，10pmol/μL H9 forward、H9reverse和H9 probe各1.0μL，RNase Free dH2O 7.0μL，待检测的样品RNA模板4μL；
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36.0，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
本发明提供一种基于分子生物学的快速检测通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重荧光RT-PCR检测方法，以实现对通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。
附图说明
图1：通用型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图2：H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图3：H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图4：H9亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图5：M基因通用型检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μL，10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，10-6ng/μL，由图可知M基因检测的灵敏度为10-5ng/μL；
图6：H5亚型检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μL，10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，10-6ng/μL，由图可知H5亚型检测的灵敏度为10-5ng/μL；
图7：H7亚型检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μL，10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，10-6ng/μL，由图可知H7亚型检测的灵敏度为10-5ng/μL；
图8：H9亚型检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μL，10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，10-6ng/μL，由图可知H9亚型检测的灵敏度为10-5ng/μL；
图9：本发明引物和探针的特异性检测结果图。
具体实施方式
实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。多重PCR也称复合PCR，是在一个反应体系中加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部分，最终扩增出一条以上目的片段。多重PCR扩增原理与单重PCR相同，但并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系，需要考虑到每对引物之间的相互配合，包括引物特异性、引物长度、退火温度及引物结构设计等因素。
本发明是检测禽流感病毒的四重RT-PCR反应，禽流感病毒核酸分8个节段，分别编码不同的蛋白质，其中HA基因变异较大是禽流感病毒亚型的主要分型基因，不同亚型的禽流感病毒HA基因差异较大，因而选择该基因为模板设计H5亚型、H7亚型和H9亚型对应的引物和探针探针，可以对禽流感病毒进行型特异型性检测，而M基因相对比较保守，选择保守区域设计引物和探针，可以检测所有禽流感病毒。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：引物及探针设计与筛选
申请人选择流感病毒较为保守的M基因设计通用检测方法的引物和探针，选择HA基因设计H5亚型、H7亚型和H9亚型流感病毒的分型检测引物及探针。
从NCBI数据库中查找并下载1641条公开的包含目前已报到的禽流感病毒流行亚型的M基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于124-275的碱基(参考序列GenBank登录号：KU042441)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针组见图1。
从NCBI数据库中查找并下载4636条公开的H5亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1476-1680的碱基(参考序列GenBank登录号：DQ320884)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针组见图2。
从NCBI数据库中查找并下载918条公开的H7亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1451-1620的碱基(参考序列GenBank登录号：KJ549786)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针组见图3。
从NCBI数据库中查找并下载1766条公开的H9亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1525-1670的碱基(参考序列GenBank登录号：KY441003)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针组见图4。
分别对禽流感病毒通用型、H5亚型、H7亚型和H9亚型对应的引物对和探针进行筛选包括如下步骤
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，10pmol/μL forward、reverse和probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8μL，待检测的样品RNA模板2μL。
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
结果描述及判定:无Ct值并且无荧光扩增曲线，样品判为禽流感病毒阴性；出现ROX荧光扩增曲线，且Ct值≤36，没有HEX荧光、FAM荧光和CY5荧光扩增曲线，则判定为其他亚型禽流感病毒阳性；出现ROX荧光扩增曲线，且Ct值≤36，同时出现HEX荧光、FAM荧光和CY5荧光扩增曲线中的一种或多种，则判定为该荧光对应亚型的禽流感病毒阳性；无ROX荧光扩增曲线，但出现HEX荧光、FAM荧光和CY5荧光扩增曲线中的一种或多种，则需要重新检测进行复核。
相同反应条件，同时用H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒核酸为模板，分别对通用型、H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒检测引物和探针进行筛选验证，确保筛选出的通用型引物探针可以同时检测出H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒核酸，而H5亚型、H7亚型和H9亚型检测引物和探针只能检测出与之相对应亚型的禽流感病毒核酸，避免在同一个体系中出现交叉扩增反应。通过筛选和验证，最终确定的引物和探针的序列信息如下：
通用型正向引物AIV-M forward：
5′-TGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(SEQ ID NO:1)
通用型反向引物AIV-M reverse：
5′-GCRTTYTGGACAAASCGTCTACGC-3′(SEQ ID NO:2)
通用型探针AIV-M probe：
5′-CTGCAGTCCTCGCTCACTGG-3′(SEQ ID NO:3)
H5亚型正向引物H5 forward：
5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA-3′(SEQ ID NO:4)
H5亚型反向引物H5 reverse：
5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(SEQ ID NO:5)
H5亚型探针H5 probe：
5′-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-3′(SEQ ID NO:6)
H7亚型正向引物H7 forward：
5′-GCRATGCAAAATAGRATACAGAT-3′(SEQ ID NO:7)
H7亚型反向引物H7 reverse：
5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:8)
H7亚型探针H7 probe：
5′-CCRGTCAAACTAAGCAGYGGYTA-3′(SEQ ID NO:9)
H9亚型正向引物H9 forward：
5′-CCTCACCATTTATTCGACTGT-3′(SEQ ID NO:10)
H9亚型反向引物H9 reverse：
5′-AYCCATTGRACATGGCCCAG-3′(SEQ ID NO:11)
H9亚型探针H9 probe：
5′-CAARAAGGCAGCAAACCCCATT-3′(SEQ ID NO:12)；
其中通用型探针AIV-M probe的5′端进行羧基荧光素ROX标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记；H5亚型探针H5 probe 5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；H7亚型探针H7 probe 5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；H9亚型探针H9 probe 5′端进行羧基荧光素CY5标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记。
实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性
1)检测灵敏度
分别设置7组不同浓度的对应通用型、H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒的RNA模板，进行荧光定量RT-PCR最适条件下的核酸扩增。
参照RNA提取试剂盒说明书分别提取通用型、H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度，按照比例稀释至1ng/μL，再按照10倍梯度稀释成10- 1ng/μL，10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，10-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量RT-PCR核酸扩增。
结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，通用型禽流感病毒检测引物和探针的检测灵敏度为RNA终浓度10-5ng/μL；H5亚型禽流感病毒检测引物和探针的检测灵敏度为RNA终浓度10-5ng/μL通用型禽流感病毒检测引物和探针的检测灵敏度为RNA终浓度10-5ng/μL通用型禽流感病毒检测引物和探针检测灵敏度为RNA终浓度10-5ng/μL。
2)检测特异性
配制荧光定量RT-PCR反应体系：反应液每管50μL，含有2×One Step RT-PCRBufferⅢ25.0μL，5U/μL TaKaRa Ex Taq HS 1.0μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1.0μL，10pmol/μL AIV-M forward、AIV-M reverse和AIV-M probe各1.0μL，10pmol/μL H5forward、H5 reverse和H5 probe各1.0μL，10pmol/μL H7 forward、H7 reverse和H7 probe各1.0μL，10pmol/μL H9 forward、H9 reverse和H9 probe各1.0μL，RNase Free dH2O 7.0μL，待检测的样品RNA模板4μL。
选择13株各亚型禽流感病毒(包括H1亚型禽流感病毒1株，H3亚型禽流感病毒1株，H5亚型禽流感病毒5株，H6亚型禽流感病毒1株，H7亚型禽流感病毒4株，H9N2亚型禽流感病毒1株，)、3株新城疫病毒和3株传染性支气管炎病毒的RNA为模板。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。
结果显示，13株各亚型禽流感病毒RNA模板在M基因对应的通道均出现了有效荧光检测曲线，其中H5亚型5株，H7亚型4株，H9亚型1株，在各自对应的通道及M基因对应的通道同时出现了有效的荧光检测信号。新城疫病毒，传染性支气管炎病毒及阴性对照对应的通道均未出现扩增曲线。
结果表明，本实验筛选的引物和探针通过四重荧光RT-PCR方法检测禽流感病毒的特异性强，相互之间没有交叉反应，可以有效地检测禽流感病毒并同时对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒进行分型检测。
实施例3：对实际样品的检测应用
1.样品采集：
采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共90份。采用PBS液(pH7.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。
2.样品制备
将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。
3.核酸提取
参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的90份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。
4.鉴定
4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》《GB/T 19438.2-2004H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》《GB/T 19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》《GB/T 19438.4-2004H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的检测试剂盒。
4.2样品检测
采用国标方法和本发明方法，同时检测此临床样品。
4.3检测结果
结果显示，采用国标方法鉴定时是单重荧光RT-PCR，结果显示其中15份样品在禽流感病毒通用荧光检测通道和H9亚型禽流感病毒荧光检测通道出现荧光信号，判定为H9亚型禽流感病毒阳性，其余样品均没有荧光信号，H5亚型禽流感病毒荧光检测通道和H7亚型禽流感病毒荧光检测通道均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为同样的15份样品同时出现了ROX荧光信号和CY5荧光信号，没有FAM荧光信号和HEX荧光信号，判定为H9亚型禽流感病毒阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现相应的荧光信号，结果准确可信。
综上所述，这90份临床样品中，其中15份样品判定为H9亚型禽流感病毒阳性，其余样品均为禽流感病毒阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定禽流感病毒，并同时对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒进行分型检测，满足了当前对于禽流感病毒检测的需求，为禽流感病毒监测发挥重要作用。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggartggmt aaagacaaga ccaat 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcrttytgga caaascgtct acgc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcagtcct cgctcactgg 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgtatract ayccgcarta ttca 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaccagcya ycatgattgc c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaacagtgg cgagytccct 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcratgcaaa atagrataca gat 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagctaaacc aragtatcac atc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccrgtcaaac taagcagygg yta 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctcaccatt tattcgactg t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ayccattgra catggcccag 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaraaggca gcaaacccca tt 22

Claims (7)

1.一种检测通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的引物对和探针组，其中包含有：
1)鉴定通用型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:1、反向引物的序列为SEQID NO:2、探针的序列为SEQ ID NO:3；
2)鉴定H5亚型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:4、反向引物的序列为SEQID NO:5、探针的序列为SEQ ID NO:6；
3)鉴定H7亚型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:7、反向引物的序列为SEQID NO:8、探针的序列为SEQ ID NO:9；
4)鉴定H9亚型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:10、反向引物的序列为SEQID NO:11、探针的序列为SEQ ID NO:12。
2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针分别用不同的荧光RT-PCR检测用的荧光素进行标记。
3.如权利要求2所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的鉴定通用型禽流感病毒的探针的5′端进行羧基荧光素ROX标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记；
鉴定H5亚型禽流感病毒的探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；
鉴定H7亚型禽流感病毒的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；
鉴定H9亚型禽流感病毒探针的5′端进行羧基荧光素CY5标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记。
4.权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组在制备荧光RT-PCR检测试剂盒中的应用。
5.一种荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中使用了权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组。
6.一种非疾病诊断治疗目的地的检测禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法使用了权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系：
反应液每管50μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ25.0μL，5U/μL TaKaRa Ex TaqHS 1.0μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1.0μL，10pmol/μL AIV-M forward、AIV-Mreverse和AIV-M probe各1.0μL，10pmol/μL H5forward、H5 reverse和H5 probe各1.0μL，10pmol/μL H7 forward、H7 reverse和H7 probe各1.0μL，10pmol/μL H9 forward、H9reverse和H9 probe各1.0μL，RNase Free dH2O 7.0μL，待检测的样品RNA模板4μL；
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增：
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；
3)结果判定：
结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线样品判为阳性。
CN201910804140.7A 2019-08-28 2019-08-28 一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法 Pending CN110484654A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910804140.7A CN110484654A (zh) 2019-08-28 2019-08-28 一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910804140.7A CN110484654A (zh) 2019-08-28 2019-08-28 一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110484654A true CN110484654A (zh) 2019-11-22

Family

ID=68555223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910804140.7A Pending CN110484654A (zh) 2019-08-28 2019-08-28 一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110484654A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176112A (zh) * 2020-11-13 2021-01-05 南京农业大学 一种禽流感病毒h5，h7，h9亚型三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN112626267A (zh) * 2020-11-25 2021-04-09 扬州大学 一种检测禽流感病毒h5、h7和h9亚型的多重荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒
CN114214437A (zh) * 2021-11-24 2022-03-22 西湖大学 一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020037507A1 (en) * 1999-12-16 2002-03-28 Walkerpeach Cindy R. Compositions, methods and kits for allele discrimination
CN101240352A (zh) * 2008-03-13 2008-08-13 上海科华生物工程股份有限公司 同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒
CN108950081A (zh) * 2018-08-10 2018-12-07 中国动物卫生与流行病学中心 一种h7亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109207643A (zh) * 2018-11-13 2019-01-15 中国动物卫生与流行病学中心 一种禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109468411A (zh) * 2018-12-05 2019-03-15 中国动物卫生与流行病学中心 一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109706269A (zh) * 2019-02-06 2019-05-03 浙江农林大学 能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020037507A1 (en) * 1999-12-16 2002-03-28 Walkerpeach Cindy R. Compositions, methods and kits for allele discrimination
CN101240352A (zh) * 2008-03-13 2008-08-13 上海科华生物工程股份有限公司 同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒
CN108950081A (zh) * 2018-08-10 2018-12-07 中国动物卫生与流行病学中心 一种h7亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109207643A (zh) * 2018-11-13 2019-01-15 中国动物卫生与流行病学中心 一种禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109468411A (zh) * 2018-12-05 2019-03-15 中国动物卫生与流行病学中心 一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109706269A (zh) * 2019-02-06 2019-05-03 浙江农林大学 能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176112A (zh) * 2020-11-13 2021-01-05 南京农业大学 一种禽流感病毒h5，h7，h9亚型三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN112626267A (zh) * 2020-11-25 2021-04-09 扬州大学 一种检测禽流感病毒h5、h7和h9亚型的多重荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒
CN114214437A (zh) * 2021-11-24 2022-03-22 西湖大学 一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Phylogenetic diversity among low-virulence Newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates
CN110484654A (zh) 一种通用型、h5亚型、h7亚型及h9亚型禽流感病毒检测方法
CN105907893A (zh) 一种荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和应用
CN108977582B (zh) 一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN102337351B (zh) 一种流感病毒分型检测试剂盒
CN103074449B (zh) 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN109234462A (zh) 一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法
Tang et al. A multiplex RT-PCR assay for detection and differentiation of avian H3, H5, and H9 subtype influenza viruses and Newcastle disease viruses
CN101240352A (zh) 同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒
CN109207643A (zh) 一种禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN108950081A (zh) 一种h7亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN104388594B (zh) 一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒
CN101363063B (zh) 三重荧光定量rt-pcr检测a、b和h5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及方法
CN104498627A (zh) H3n8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒
Reid et al. Detection of non-notifiable H4N6 avian influenza virus in poultry in Great Britain
CN109468411A (zh) 一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN105950785A (zh) 禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针
CN102329890B (zh) 用于检测小鼠腺病毒的引物、探针及其方法
CN108411041A (zh) 一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用
CN105525038B (zh) 新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光rt-pcr检测试剂盒
Cheung et al. Long-Term Epidemiology and Evolution of Swine Influenza Viruses, Vietnam
CN101575644B (zh) 玉米丝黑穗病菌pcr检测试剂盒及其制备方法
CN102329889B (zh) 用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法
Mirzaei et al. Development and evaluation of Real-time RT-PCR test for the quantitative and qualitative recognition of current H9N2 subtype avian influenza viruses in Iran.
CN101230405B (zh) H5型和h9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191122

RJ01 Rejection of invention patent application after publication