CN112626267A - 一种检测禽流感病毒h5、h7和h9亚型的多重荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒 - Google Patents

一种检测禽流感病毒h5、h7和h9亚型的多重荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT‑PCR引物探针组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组包括检测禽流感病毒H5亚型、检测禽流感病毒H7亚型和检测禽流感病毒H9亚型的引物探针及内参引物探针。本发明引物探针组加入MS2内参质控核酸提取和扩增的过程，可有效避免假阴性结果，可用于禽类血液、组织、咽喉拭子、泄殖腔拭子等样品中的禽流感病毒H5、H7和H9亚型核酸检测，为禽流感病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

Description

一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物 探针组和试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒引起的禽类(家禽或野禽)及部分哺乳动物的动物传染病。
禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异快，宿主范围广，各亚型间交叉保护性差，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的毁灭性疫病的病原之一。尤其是高致病性禽流感病毒(HPAIV)，是OIE规定的法定报告A类动物疫病病原。其中H5NX亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。H9亚型禽流感并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型的禽流感病毒。
目前国内外检测禽流感病毒最经典、最常用的方法是使用鸡胚进行病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。以分子生物学技术为基础的荧光PCR方法已成为病原核酸检测的主要方法，其灵敏度和精确度不断提高，但是仍存在操作误差、核酸提取效率未知等因素，影响检测结果的可靠性和可比性，不利于检测方法标准化。因此，目前仍缺乏一种高效可靠的标准化禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测诊断方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒。本发明所述引物探针组具有特异性强、敏感性高、准确性高、省时省力等优点，可为禽流感病毒不同亚型的诊断提供了一种快速检测方法，为禽流感病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
本发明提供了一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组，所述引物探针组包括检测禽流感病毒H5亚型的BD-H5-F、BD-H5-R和BD-H5-LP；检测禽流感病毒H7亚型的O-H7-F1、O-H7-R1和O-H7-LP1；检测禽流感病毒H9亚型的O-H9-F、O-H9-R和O-H9-P；和内参MS2-F、MS2-R和MS2-P；所述BD-H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述BD-H5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述BD-H5-LP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述O-H7-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述O-H7-R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述O-H7-LP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述O-H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述O-H9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述O-H9-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述MS2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述MS2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述MS2-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述BD-H5-LP、O-H7-LP1、O-H9-P和MS2-P的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端均标记MGB。
优选的是，所述荧光基团包括FAM、VIC、ROX和Cy-5。
优选的是，待检测的样品包括禽类的血液、组织、咽喉拭子和泄殖腔拭子。
本发明还提供了一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组。
优选的是，所述试剂盒还包括阳性对照、RT-PCR反应液A、RT-PCR反应液B、RT-PCR反应液C、RT-PCR内参，阴性对照。
优选的是，所述阳性对照为阳性质粒，所述阳性质粒包括禽流感病毒H5阳性质粒、禽流感病毒H7阳性质粒和禽流感病毒H9阳性质粒，所述禽流感病毒H5阳性质粒中含有禽流感病毒H5亚型HA2基因的保守序列，所述禽流感病毒H7阳性质粒中含有禽流感病毒H7亚型HA2基因的保守序列，所述禽流感病毒H9阳性质粒中含有禽流感病毒H9亚型HA2基因的保守序列。
优选的是，所述阳性质粒的骨架载体包括pUC-57质粒。
优选的是，所述试剂盒的荧光RT-PCR反应程序为：50℃，20min；95℃，3min；95℃，10s，54～58℃30s，40个循环；在不同的相应的荧光通道下采集荧光信号。
本发明提供了一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组。本发明所述引物探针组具有特异性强、敏感性高、准确性高、省时省力等优点，可为禽流感病毒不同亚型的诊断提供一种快速检测方法，为禽流感病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。本发明组装了用于检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR试剂盒。本发明所述试剂盒可为禽流感病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
附图说明
图1为本发明提供的阳性质粒检测结果；
图2为本发明提供的灵敏度检测结果；
图3为本发明提供的特异性验证的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组，所述引物探针组包括检测禽流感病毒H5亚型的BD-H5-F、BD-H5-R和BD-H5-LP；检测禽流感病毒H7亚型的O-H7-F1、O-H7-R1和O-H7-LP1；检测禽流感病毒H9亚型的O-H9-F、O-H9-R和O-H9-P；和内参MS2-F、MS2-R和MS2-P；所述BD-H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述BD-H5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述BD-H5-LP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述O-H7-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述O-H7-R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述O-H7-LP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述O-H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述O-H9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述O-H9-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述MS2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述MS2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述MS2-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述BD-H5-LP、O-H7-LP1、O-H9-P和MS2-P的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端均标记MGB。在本发明中，所述荧光基团优选包括FAM、VIC、ROX和Cy-5。在本发明中，更优选的，所述BD-H5-LP的5’端标记FAM，3’端标记MGB；所述O-H7-LP1的5’端标记VIC，3’端标记MGB；所述O-H9-P的5’端标记ROX，3’端标记MGB；所述MS2-P的5’端标记Cy-5，3’端标记MGB。本发明针对禽流感病毒H5、H7和H9亚型的HA2基因序列进行引物和探针的设计，由于禽流感病毒具有高度变异性，HA基因容易发生基因缺失、插入、漂移等突变，本申请通过针对HA2基因的特定位置，设计得到的引物探针具有更广的检测范围，防止临床假阴性的发生。发明采用TaqMan-MGB探针技术，提高检测的特异性，避免假阳性结果。所述引物探针组具有特异性强、敏感性高、准确性高、省时省力等优点，每次可检3个亚型，大大提高检测效率。
现有兽医临床检测方法中，并无对核酸提取、反转录阶段进行质控，容易造成临床上因提取或反转失败而导致的假阴性。为提高检测准确性，本发明引入MS2噬菌体作为内参，参与核酸的提取和扩增，对每个检测步骤进行严格控制，能够避免因核酸提取或者操作误差造成的假阴性结果，确保检测结果的可靠性。本发明引入MS2噬菌体作为内参对检测过程进行质控，可有效区分禽流感病毒H5、H7和H9亚型。在本发明中，所述RT-PCR内参基因为MS2噬菌体靶基因序列片段如下：
TTACATGACAAATCCTTGTCATGGGATCCGGATGTTTCCGGATGTTTTACAAACCATTATTGGCAACCTCCTCTCTGGCTACCGATCGTCGTTGTTTGGGCAATGCACGTTCTCCAACGGTGCCTCTATGGGGCACAAGTTGCAGGATGCAGCGCCTTACAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTTA。
在本发明中，待检测的样品包括禽类的血液、组织、咽喉拭子和泄殖腔拭子。在本发明中，检测前，所述样品需用商品化核酸提取试剂盒进行RNA核酸的提取，提取RNA核酸后方可加样检测。
本发明还提供了一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性对照(即阳性质粒)、阴性对照、RT-PCR反应液和RT-PCR内参。在本发明中，所述RT-PCR反应液优选包括RT-PCR反应液A、RT-PCR反应液B和RT-PCR反应液C。其中RT-PCR反应液A为禽流感病毒H5、H7、H9亚型引物探针以及MS2内参的引物探针混合物；RT-PCR反应液B为5×RT-PCR缓冲液，主要含有MgCl2(25nmol/L)、dNTPs(25nmol/L)；RT-PCR反应液C为酶混液，包含反转录酶(Reversedtranscriptiveenzyme)200U/μl，DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)2.5U/μl，UNG酶,2U/μl；RT-PCR内参为MS2噬菌体与TE的混合物，噬菌体效价为106PFU/ml；阴性对照为pUC57空载质粒，浓度为103copies/μl。
在本发明中，所述阳性对照为阳性质粒，所述阳性质粒优选包括禽流感病毒H5阳性质粒、禽流感病毒H7阳性质粒和禽流感病毒H9阳性质粒，所述禽流感病毒H5阳性质粒中含有禽流感病毒H5亚型HA2基因的保守序列，所述禽流感病毒H7阳性质粒中含有禽流感病毒H7亚型HA2基因的保守序列，所述禽流感病毒H9阳性质粒中含有禽流感病毒H9亚型HA2基因的保守序列。在本发明中，在本发明中，所述阳性质粒的骨架载体优选包括pUC-57质粒。
禽流感病毒H5亚型HA2基因保守序列：AACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATTGTGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA(SEQ ID NO.14)。
禽流感病毒H7亚型HA2基因保守序列：
AGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTGAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAA(SEQ ID NO.15)。
禽流感病毒H9亚型HA2基因保守序列：
AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACAAAATCCTCACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGATTGCAATGGGGTTTGCTGCCTTCTTGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA(SEQID NO.16)。
在本发明具体实施例中，为方便检测，本发明将上述三种亚型的病毒的HA2基因保守序列构建在了一个治理上。
在本发明中，所述试剂盒的荧光RT-PCR反应程序优选为：50℃，20min；95℃，3min；95℃，10s，54～58℃30s，40个循环；在不同的相应的荧光通道下采集荧光信号。在本发明中，退火温度为54℃～58℃，优选为54℃。在本发明具体实施例中，荧光通道优选为FAM(H5)/VIC(H7)/ROX(H9)/Cy-5(MS2内参)。
在本发明中，当使用本发明所述引物探针组或试剂盒对禽流感病毒H5、H7和H9进行检测时，本发明对RT-PCR扩增得到的扩增曲线进行分析，确定样本中是否有禽流感病毒H5、H7、H9亚型核酸，具体结果判定方法为(以ABI7500实时荧光定量PCR仪为例)：
基线和阈值设定：根据荧光定量PCR仪器自动分析结果。曲线发生异常时，基线起始值一般可在3～15范围内调节，终止值一般可在5～20范围内调节；阈值：根据仪器噪声情况进行调整，或以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数即为Ct值。
质量控制：阳性对照应有典型的扩增曲线且Ct值≤30，阴性对照应无特定的扩增曲线且无Ct值；否则试验视为无效。
样品判定
(1)阳性：若待检样品FAM通道有典型的扩增曲线，且Ct值＜35.0，判为禽流感病毒H5亚型核酸阳性；待检样品VIC通道有典型的扩增曲线，且Ct值＜35.0，判为禽流感病毒H7亚型核酸阳性；待检样品ROX通道有典型的扩增曲线，且Ct值＜35.0，判为禽流感病毒H9亚型核酸阳性；当待检样品为阳性时，对内参的Ct值不做要求。
(2)可疑：若待检样品35≤Ct值≤38，且有扩增曲线时，复检一次，若结果仍为该结果则判定为阳性，否则判为阴性；
(3)阴性：若待检样品未检测到Ct值或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。待检样品为阴性时，应同时满足Cy-5(MS2内参)Ct值≤35，否则结果无效，需重新进行核酸提取和检测；若复检结果Cy-5(MS2内参)仍不正常，则表明样本含有抑制物。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
引物探针的设计
本组引物探针是针对禽流感病毒H5、H7和H9亚型设计的，比对GenBank上收录大量禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因序列，确定不同亚型中HA2基因序列中的保守区域，针对该区域设计引物探针。其中H5亚型参考的变异毒株序列，包含近年来出现的clade2.2，clade7.2，clade2.3.2.1，clade2.3.4，clade2.3.4.4，clade 2.3.2.1a，clade 2.3.2.1c，clade 2.3.4.4d，clade2.3.2.1d等分支及亚分支；H7亚型参考毒株序列包含HPAI和LPAIH7N9基因序列，比较其保守序列；H9亚型参考毒株序列包含国内3大分支：A/Chicken/Beijing/1/94(BJ94)或A/Duck/HongKong/Y280/97(Y280)、A/Quail/HongKong/G1/97(G1)、A/Duck/Hong Kong/Y439/97(Y439)以及近几年在中国鸡群中流行病毒株A/chicken/Zhejiang/HJ/2007(G57分支)。由于序列变异较多，引物设计简并碱基，增加覆盖范围广泛。引物、探针序列如下：
BD-H5-F:5’-AATTTATTCAACAGTGGC-3’(SEQ ID NO.1)；
BD-H5-R:5’-AAATTCTGCANTGTAAYGA-3’(SEQ ID NO.2)；
BD-H5-LP:5’-CATCCATAAAGATA-3’(SEQ ID NO.3)；
所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。
O-H7-F1:5’-AAATAGAATACAGATTRACCC-3’(SEQ ID NO.4)；
O-H7-R1:5’-TGAAGACAAGGCCCATT-3’(SEQ ID NO.5)；
O-H7-LP1:5’-TATGAAACATGATGC-3’(SEQ ID NO.6)；
所述探针序列5’端标记的荧光基团为VIC，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。
O-H9-F2:5’-CTGGAATCTGANGGRACTTACA-3’(SEQ ID NO.7)；
O-H9-R2:5’-AAGGCAGCAAACCCCATT-3’(SEQ ID NO.8)；
O-H9-LP2:5’-TCGCCTCATCTCTTG-3’(SEQ ID NO.9)；
所述探针序列5’端标记的荧光基团为ROX，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。
实施例2
MS2内参的引入
本发明在样本核酸的提取前加入定量的MS2噬菌体内参，内参与样品一同提取扩增，对RNA逆转录和PCR扩增进行监控，对整个反应过程进行质控，避免因核酸提取或者操作误差造成的假阴性结果，确保检测结果的可靠性。本发明用于检测MS2噬菌体的荧光RT-PCR引物、探针组，所述引物组和探针的核苷酸序列为：
MS2-F:5’-AATCCTTGTCATGGGATCCG-3’(SEQ ID NO.10)；
MS2-R:5’-TTCAGCGAACTTCTTGTAA-3’(SEQ ID NO.11)；
MS2-P:5’-TTCTCCAACGGTGC-3’(SEQ ID NO.12)；
所述探针序列5’端标记的荧光基团为Cy-5，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。
实施例3
荧光RT-PCR阳性对照的构建
人工合成禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的HA2的靶基因序列，均连接至pUC-57质粒载体上，将重组载体DNA作为PCR模板，用引物、探针将靶序列进行扩增。
靶基因序列(SEQ ID NO.13)：
AACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATTGTGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAAAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTGAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAACAGAAAATAGAAGGGGTCAAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACAAAATCCTCACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGATTGCAATGGGGTTTGCTGCCTTCTTGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAA。
制备的阳性质粒稀释浓度至104copies/μl，作为试剂盒中阳性对照。用实施例1所述禽流感病毒H5、H7和H9亚型3组引物探针在以下条件下对稀释好的质粒进行荧光PCR扩增。反应总体系25μl，其中、RT-PCR反应液A9μl、RT-PCR反应液B10μl、RT-PCR反应液C1μl、阳性对照5μl。同时设置阴性对照。扩增程序为：50℃，20min；95℃，3min；95℃，10s，54℃，30s，40个循环，采集荧光信号，荧光通道FAM(H5)/VIC(H7)/ROX(H9)，获得扩增曲线。阳性质粒检测结果如图1所示。
结果判定：对扩增曲线进行分析，确定样本中是否有禽流感病毒H5、H7、H9亚型核酸，由图1可知，三种亚型的禽流感病毒检测结果均为阳性。
结果判定方法为：
(1)结果判定
①基线和阈值设定
根据仪器自动分析结果。曲线发生异常时，基线起始值一般可在3～15范围内调节，终止值一般可在5～20范围内调节；阈值：根据仪器噪声情况进行调整，或以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数即为Ct值。
②质量控制
阳性对照应有典型的扩增曲线且Ct值≤30，阴性对照应无特定的扩增曲线且无Ct值；否则实验视为无效。
③样品判定
阳性：若待检样品FAM通道有典型的扩增曲线，且Ct值＜35.0，判为禽流感病毒H5亚型核酸阳性；待检样品VIC通道有典型的扩增曲线，且Ct值＜35.0，判为禽流感病毒H7亚型核酸阳性；待检样品ROX通道有典型的扩增曲线，且Ct值＜35.0，判为禽流感病毒H9亚型核酸阳性；当待检样品为阳性时，对内参的Ct值不做要求。
可疑：若待检样品35≤Ct值≤38，且有扩增曲线时，复检一次，若结果仍为该结果则判定为阳性，否则判为阴性；
阴性：若待检样品未检测到Ct值或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。待检样品为阴性时，应同时满足Cy-5(MS2内参)Ct值≤35，否则结果无效，需重新进行核酸提取和检测；若复检结果内参仍不正常，则表明样本含有抑制物。
实施例4
本试剂盒灵敏度的验证
阳性对照(浓度为104copies/μl)，用ddH2O对阳性对照进行10倍倍比稀释，稀释范围为10-1～10-3，分别作为模板进行PCR检测。按试剂盒的反应体系配制试剂和设置反应程序，反应总体系25μl，其中RT-PCR反应液A9μl、RT-PCR反应液B10μl、RT-PCR反应液C1μl、模板5μl。扩增程序为：50℃，20min；95℃，3min；95℃，10s，54℃，30s，40个循环，采集荧光信号，荧光通道FAM(H5)/VIC(H7)/ROX(H9)，获得扩增曲线。结果如图2(灵敏度检测结果)所示，结果显示，本试剂盒的最低检出限为10copies/μl。
实施例5
本试剂盒特异性的验证
待检样品有新城疫活疫苗(LaSota株)、鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)、鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)、鸡传染性喉气管炎活疫苗(K317株)、鸡减蛋综合征灭活疫苗(京911株)，健康鸡组织：SPF鸡胚，SPF鸡气管组织研磨液、肺脏组织研磨液、小肠组织研磨液。
以上样品前处理时加入2μlRT-PCR内参，一同提取，制备出含有内参核酸和待检样本核酸的溶液，使用试剂盒对提取的核酸样品进行检测。试剂盒体系配制试剂和设置反应程序为反应总体系25μl，其中RT-PCR反应液A9μl、RT-PCR反应液B10μl、RT-PCR反应液C1μl、待检核酸样品5μl。扩增程序为：50℃，20min；95℃，3min；95℃，10s，54℃，30s，40个循环，采集荧光信号，荧光通道FAM(H5)/VIC(H7)/ROX(H9)/Cy-5(MS2内参)，获得扩增曲线。结果如图3(特异性验证的检测结果)所示，检测结果均为阴性，本试剂盒特异性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatttattca acagtggc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaattctgca ntgtaayga 19
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catccataaa gata 14
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatagaata cagattracc c 21
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaagacaag gcccatt 17
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatgaaacat gatgc 15
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctggaatctg anggractta ca 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaggcagcaa accccatt 18
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgcctcatc tcttg 15
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatccttgtc atgggatccg 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcagcgaac ttcttgtaa 19
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttctccaacg gtgc 14
<210> 13
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt tccctagcac tggcaatcat 60
tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg ttacaatgca gaatttgcat 120
ttaaaggcaa tgcaaaatag aatacagatt gacccagtca aactaagcag cggctacaaa 180
gatgtgatac tttggtttag cttcggggca tcatgtttca tacttctagc cattgtaatg 240
ggccttgtct tcatatgtgt gaagaatgga aacatgcggt gcactatttg tatataacag 300
aaaatagaag gggtcaagct ggaatctgaa ggaacttaca aaatcctcac catttattcg 360
actgtcgcct catctcttgt gattgcaatg gggtttgctg ccttcttgtt ctgggccatg 420
tccaatggat cttgcagatg caacatttgt atataa 456
<210> 14
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt tccctagcac tggcaatcat 60
tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg ttacaatgca gaatttgcat 120
ttaa 124
<210> 15
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc tacaaagatg 60
tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt gtaatgggcc 120
ttgtcttcat atgtgtgaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata taa 173
<210> 16
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagctggaat ctgaaggaac ttacaaaatc ctcaccattt attcgactgt cgcctcatct 60
cttgtgattg caatggggtt tgctgccttc ttgttctggg ccatgtccaa tggatcttgc 120
agatgcaaca tttgtatata a 141

Claims (8)

1.一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括检测禽流感病毒H5亚型的BD-H5-F、BD-H5-R和BD-H5-LP；检测禽流感病毒H7亚型的O-H7-F1、O-H7-R1和O-H7-LP1；检测禽流感病毒H9亚型的O-H9-F、O-H9-R和O-H9-P；和内参MS2-F、MS2-R和MS2-P；所述BD-H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述BD-H5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述BD-H5-LP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述O-H7-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述O-H7-R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述O-H7-LP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述O-H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述O-H9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述O-H9-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述MS2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述MS2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述MS2-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述BD-H5-LP、O-H7-LP1、O-H9-P和MS2-P的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端均标记MGB。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、VIC、ROX和Cy-5。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，待检测的样品包括禽类的血液、组织、咽喉拭子和泄殖腔拭子。
4.一种检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的多重荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物探针组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A、RT-PCR反应液B、RT-PCR反应液C和RT-PCR内参。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为阳性质粒，包括禽流感病毒H5阳性质粒、禽流感病毒H7阳性质粒和禽流感病毒H9阳性质粒，所述禽流感病毒H5阳性质粒中含有禽流感病毒H5亚型HA2基因的保守序列，所述禽流感病毒H7阳性质粒中含有禽流感病毒H7亚型HA2基因的保守序列，所述禽流感病毒H9阳性质粒中含有禽流感病毒H9亚型HA2基因的保守序列。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒的骨架载体包括pUC-57质粒。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的荧光RT-PCR反应程序为：50℃，20min；95℃，3min；95℃，10s，54～58℃30s，40个循环；在不同的相应的荧光通道下采集荧光信号。
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