CN107937611A

CN107937611A - 检测禽流感病毒亚型h5、h7和h9的引物探针组

Info

Publication number: CN107937611A
Application number: CN201711367849.2A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 王彦威; 王晓艳; 张志强
Original assignee: Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: CN107937611B

Abstract

本公开提供了重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案能显著地提高对三种感染人的禽流感病毒亚型检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类传染病，由于其具有众多的血清型，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间无交叉保护性，导致频繁爆发禽流感疫情，严重威胁禽类养殖业。根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶结构的不同，禽流感病毒分为16种HA亚型和9种NA亚型，共可产生144种不同的病毒亚型组合。其中H5、H7和H9等几个亚型对家禽最为致命，也能引起人类感染，是感冒病毒中致病性较高的亚型。H5和H7亚型的某些毒株可以造成禽类很高的发病率和死亡率，被称为高致病性禽流感(HPAI)病毒，高致病性禽流感可导致高达100％的发病率和死亡率，并可直接感染人并致人死亡。

因此建立快速、准确、简便、特异的禽流感检测和分型技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有重要意义。

发明内容

本公开的目的是提供一种禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术的禽流感病毒H5、H7和H9亚型的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。

为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。

本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；

a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H5亚型；

b)若VIC荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H7亚型；

c)若CY5荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H9亚型。

本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。

本发明的有益效果在于：

本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型的检测方法，能够实现形态学、免疫学、LAMP以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：

(一)耗时短

逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)不需将RNA转化为cDNA再进行扩增反应，只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应约20min即可完成，而RT-PCR、Real-time PCR、LAMP等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。

(二)对仪器平台要求低

RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了禽流感病毒H5、H7、H9亚型的现场应急检测。

(三)特异性好

RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-time PCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本发明所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括甲型H1N1流感病毒、H3亚型人类流感病毒、乙型流感(Victoria和Yamagata系)、副流感病毒1、2、3、4型，人鼻病毒，呼吸道合胞病毒A型、B型，人冠状病毒229E、OC43、NL63、HKU1、人偏肺病毒、人博卡病毒以及埃博拉病毒、MERS病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。

(四)最低检出限

本发明所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。

(五)成本较低

本发明所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件可以仅为一步39℃，无需复杂操作。

(六)预防假阴性结果

本发明反应体系中添加的阳性内对照，可以有效的提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ IDNO.7-9所示核苷酸序列的探针；

本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段分别能够全面覆盖禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型。而且设计过程中要充分考虑不同目标基因的引物探针在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物探针设计时要综合的考虑到Tm值一致性、GC含量均一化，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于RPA对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。

表1禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型检测引物探针

检测禽流感病毒H5型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.7所示。

检测禽流感病毒H7型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.8所示。

检测禽流感病毒H9型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.9所示。

检测阳性内对照的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12所示。其中，SEQ ID NO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有ROX发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。

在本公开的一种实施方式中，涉及一种重组酶聚合酶扩增(PRA)检测禽流感病毒H5型、H7型和H9型的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；

在本公开的一种实施方式中，用于进行内质控样本检测的引物探针为SEQ IDNO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针；并且，SEQ ID NO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有ROX发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。

PRA引物探针浓度及反应体系配置如下：

总体系50μL，缓冲液29.5μL，包括3-5U/μL的逆转录酶，2-6U/μL的重组酶，2-6U/μL的聚合酶，12-16mmol/L的醋酸镁，1-10⁵拷贝/μL的RNA模板，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μM。

在本公开的一种实施方式中，RPA反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增15-25min。在本公开的一种特别优选的实施方式中，为了提高反应的灵敏度及特异性，RPA反应的条件包括在39℃下恒温扩增20min。

本公开的检测方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。

本公开还提供了一种含有前述RPA检测引物探针组的试剂盒。

优选的，所述试剂盒中还含有内质控序列模板。

在本公开的一种实施方式中，所述试剂盒还包括5×反应体系缓冲液、冻干重组酶粉、冻干聚合酶粉、逆转录酶、10×引物探针混合物、阳性对照和超纯水。

以下，通过实施例进一步详细说明本公开。

实施例1

委托试剂公司合成表2所示的引物探针。

表2

实施例2特异性验证

选择甲型H1N1流感病毒(购自武汉病毒所，IVCAS 6.2138)、H3亚型人类流感病毒(购自武汉病毒所，IVCAS 6.2139)、乙型流感(购自武汉病毒所，IVCAS 5.2335)、副流感病毒1、2、3、4型(购自武汉病毒所，编号分别为IVCAS 6.2245、IVCAS 2.2367、IVCAS 2.2567、IVCAS 2.6746)，人鼻病毒，呼吸道合胞病毒A型、B型，人冠状病毒229E、OC43、NL63、HKU1、人偏肺病毒、人博卡病毒以及体外转录的埃博拉病毒、MERS病毒的核酸，用于特异性评估，将上述每个样本作为特异性检测模板，进行RT-RPA扩增。

RT-RPA反应体系配制：本试剂盒包括阳性内质控在内共有4个检测目标，包括禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型以及IAC。总体系50μL，向含有RPA冻干酶粉(货号：TAEXO02KIT)的0.2mLTwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液29.5μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，引物各2μL(10μmol/L)，探针0.5μL(10μmol/L)，逆转录酶1μL(200U/μL)，模板5μL，剩余用水补足。

RT-RPA反应程序如下：选择FAM、VIC、CY5和ROX作为报告基团，每个循环为3个39℃、10s，在循环结束时收集荧光，共进行40个循环。

RT-RPA反应结果判断：空白对照、内质控IAC成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针有非特异性扩增；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针有非特异性扩增；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针有非特异性扩增。

结果显示均未出现非特异性扩增。

实施例3最低检出限验证：

使用浓度均为10⁴拷贝/μL的禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型的核酸等比例混合作为模板I、同样方法配制浓度均为10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、2拷贝/μL、10⁰拷贝/μL的3种禽流感病毒等比例混合核酸作为模板II、III、IV、V、VI。体系配制和RPA反应条件同实施例2特异性评估。使得在反应体系中，病毒的浓度分别为5×10⁴拷贝/体系、5×10³拷贝/体系、5×10²拷贝/体系、50拷贝/体系、10拷贝/μL和5拷贝/体系。

RT-RPA反应结果判断：空白对照、内质控IAC成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针可检测出该浓度的模板；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针可检测出该浓度的模板；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针可检测出该浓度的模板。

结果显示本试剂盒对于目标禽流感H5、H7、H9亚型病毒的最低检出限均达到了5拷贝/体系(即为1拷贝/μL)。

实施例4样本耐受性检测

以乙醇沉淀法提取禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型各10株的，提取的RNA作为模板，根据以上所述的反应体系与反应程序进行扩增。

RT-RPA反应结果判断：空白对照、IAC成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针可检测出该模板；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针可检测出该模板；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针可检测出该模板。

结果显示本发明试剂盒对如上所述的以乙醇简单提取的RNA为模板扩增均获得阳性结果，本发明试剂盒对样本的耐受性极好。

实施例5覆盖度检测

以禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型各5株毒株分别作为模板进行覆盖度检测，根据如上所述反应体系和反应程序进行扩增。

RT-RPA反应结果判断：空白对照、内质控IAC成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针可检测出该模板；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针可检测出该模板；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针可检测出该模板。

结果显示本发明试剂盒对所有15株禽流感病毒均可覆盖检测出。

对比例1

(1)引物、探针合成

委托试剂公司合成表3所示的引物探针组。

表3

(2)特异性评估：

选择以下样本作为模拟干扰样本：甲型H1N1流感病毒、H3亚型人类流感病毒、乙型流感(Victoria和Yamagata系)、副流感病毒1、2、3、4型，人鼻病毒，呼吸道合胞病毒A型、B型，人冠状病毒229E、OC43、NL63、HKU1、人偏肺病毒、人博卡病毒以及体外转录的埃博拉病毒、MERS病毒等的核酸，用于特异性评估，将上述样本的核酸混合物作为特异性检测模板，进行扩增。

RT-RPA反应体系配制、RT-RPA的反应程序、反应结果判断均与实施例2中的特异性验证相同。

结果显示，以上反应结果均为阴性，对比例的引物、探针特异性较好。

(3)最低检出限验证：

使用浓度均为10⁴拷贝/μL的禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型的核酸等比例混合作为模板I、同样方法配制浓度均为10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10拷贝/μL、2拷贝/μL、10⁰拷贝/μL的3种禽流感病毒等比例混合核酸作为模板II、III、IV、V、VI。按照以上所述反应体系分别加入模板I-VI，并按照以上所述的反应程序进行试验。

反应结果判断与实施例1中的最低检出限验证相同。

结果显示对比例中禽流感病毒的最低检出限为100拷贝/体系(20拷贝/μL)。

(4)样本耐受性检测

以乙醇沉淀法提取禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型各10株的核酸，以提取的RNA作为模板，根据以上所述的反应体系与反应程序进行扩增。

反应结果判断与实施例1中的样本耐受性验证相同。

结果显示对比例对乙醇简单提取的核酸也可以获得阳性结果。

(5)覆盖度检测

反应结果判断与实施例5中的覆盖度检测相同。

结果显示对比例漏检禽流感H5亚型1例、H9亚型2例。

经过实施例与对比例可以看出，本发明所建立的检测方法可以一次性的检测3种禽流感病毒H5、H7、H9。本发明试剂盒可识别引物结合区的单个核苷酸突变位点(SNP)，对非检测目标有极强的辨识能力。并且本试剂盒对于样本中禽流感病毒H5、H7、H9检测能力更强，本发明试剂盒的最低检出限以及覆盖度显著优于对比例。

以上描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司

<120> 检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组

<130> 7074ABT

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agtaacggga attttatagc tcctgaatat gc 32

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

catactggaa tttatagcac ctaatggag 29

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agctgactac aaaagcaccc aatctgcaat agat 34

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tacgaccata cctcagtcat tgagtctcgt 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

agtctcaaac ttgcagttgg tctgaggaat g 31

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

attgcctttt gagttgagtc tctatctgct gcc 33

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tacaaaattg tcaagaaagg agattcagca atcatgagaa gtgagttaga gtatg 55

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tgattgacaa aacaaatcag cagtttgagc tgatagacaa tgagttcag 49

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cagggtttat agagggaggt tggtcaggac tagtcgctgg ttggtatggg 50

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atcaagacca attaaaattt taactagatt aac 33

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tttctgtctt tggaaaaact gcaacaacat catag 35

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cggatccatc tcactgcaat gttttgagag tcatacttct tcaaggg 47

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

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<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tctgacattt ggtgtcacag ttaccat 27

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agattcagca atcatgagaa gtgaattaga gtaatggtaa ctgtgacacc aa 52

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

atcagatcac aggcaaattg aatcgtct 28

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ttcagcatta tacgaccata cctcagtca 29

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tcagtgaaat agaacaacaa attgggaatg tcattaactg gacacgaga 49

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

atgtgccttc tagatctagt agaggactat t 31

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

tcattttgtc gactatatta ttcactttgg atgtt 35

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ttccagcatt caaatgacca aggggttggt atggcagcag ataga 45

Claims

1.重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针；

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括具有SEQ ID NO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有ROX发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。

3.一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μM。

5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，重组酶聚合酶扩增反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增15-25min。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，扩增反应体系中还包括浓度为3-5U/μL的逆转录酶，2-6U/μL的重组酶，2-6U/μL的聚合酶，12-16mmol/L的醋酸镁，1-10⁵拷贝/μL的RNA模板。

7.重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。