CN110283943A - 一种h5亚型禽流感病毒的等温扩增检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒RT‑RAA检测方法，其中使用的引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2，探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于现场快速检测，与PCR法相比，RT‑RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。

Description

一种H5亚型禽流感病毒的等温扩增检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒的等温扩增检测方法，即一种禽流感病毒逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcriptionrecombinase-aided amplification，RT-RAA)检测方法，包括鉴定H5亚型禽流感病毒的引物对和探针。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。

Perroncito于1878年在意大利首次报道了H5亚型高致病性禽流感。H5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。H5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性H5N1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染H5N1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染H5N1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染H5N1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。近年来，我国主要流行是第7分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支等，但随着H5亚型禽流感病毒变异速率加快，以往的检测方法可能不能满足实际检测需求，因此需要能够检测所有流行毒株的检测方法，而能够覆盖所有流行毒株的恒温快速检测方法更是满足了现场检测需求，可以为H5亚型禽流感的预防监测提供助力。

发明内容

本发明的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒RT-RAA检测方法，以实现对禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定禽流感病毒HA基因的引物对H5 forward、H5reverse和探针组H5

probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物H5 forward：

5′-CAGTTTGAGGCYGTTGGAAGGGAATTTAAYAA-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H5reverse：

5′-CTTGTCRTAAAGGTTCTTGACATTTGAGTCAT-3′(SEQ ID NO:2)

探针H5probe：

5′-CTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTTGGTTCTCATGGAAAAT-3′(SEQ ID NO:3)

其中探针自5′端起第30位碱基T标记FAM发光基团，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第31位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

本发明所提供的引物对和探针组在制备检测H5亚型禽流感病毒的制品中的应用；

所述的制品，优选为逆转录重组酶介导等温扩增试剂盒，其中包含有逆转录重组酶介导等温扩增的试剂。

本发明再一个方面提供检测临床样品中H5亚型禽流感病毒的RT-RAA检测方法，包括如下的步骤：

1)配制RT-RAA反应体系：

其中包含有逆转录重组酶介导等温扩增所使用的试剂组分，以及上述的引物对和探针组，以及待检测样品的核苷酸；

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为在39℃下恒温扩增20min；

3)结果判定

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，待检测样品的无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于现场快速检测，与PCR法相比，RT-RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。

附图说明

图1：H5亚型禽流感病毒的RT-RAA优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度的检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcription recombinase-aidedamplification，RT-RAA)是一种在恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现现成快速检测等特点。该方法使用的引物和探针长度高于普通引物和探针，一般引物长度一般为30-35bp，探针长度一般为46-52bp，不仅在保守区域的选择方面需要提高要求，还需要考虑到引物之间形成二级结构、引物二聚体等生物干扰，因此引物和探针的筛选过程中显得尤为重要。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：H5亚型禽流感病毒检测引物及探针设计与筛选

申请人选择H5亚型禽流感病毒特异性HA基因作为目的基因进行引物探针设计，通过NCBI查找到2636条公开的包含H5亚型禽流感病毒所有当前流行分支的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1166-1420的碱基(参考序列GenBank登录号：CY030889)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。

设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物和探针，上游引物所在区域对应的参考序列第1230位碱基，在2636条序列中对应该位置的碱基有C和T两种，因此引物序列中设计成简并碱基Y，第1248位碱基，在2636条序列中对应该位置的碱基有C和T两种，因此引物序列中设计成简并碱基Y；下游引物所在区域对应的参考序列第1392位碱基，在2636条序列中对应该位置的碱基有T和C两种，下游引物取参考序列的反向互补序列，对应A和G，因此引物序列中设计成简并碱基R。

引物序列如下：

上游引物H5-F1：

5′-CAGTTTGAGGCYGTTGGAAGGGAATTTAA-3′(29bp)

上游引物H5-F2：

5′-CAGTTTGAGGCYGTTGGAAGGGAATTTAAYAA-3′(32bp)

下游引物H5-R1：

5′-CTTGTCRTAAAGGTTCTTGACATTTGAGTCAT-3′(32bp)

下游引物H5-R2：

5′-CTTGTCRTAAAGGTTCTTGACATTTGAGTCATGG-3′(34bp)

设计1条探针与引物进行组合筛选筛选。探针的5′端第30位T碱基标记FAM发光基团，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第31位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰；修饰后探针序列如下：

H5-P：5′-CTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACT/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/GGTTCTCATGGAAAAT[C3-spacer]-3′(47bp)

2对引物和1条探针两两配对形成4个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：H5-F1、H5-R1和H5-P

组合2：H5-F1、H5-R2和H5-P

组合3：H5-F2、H5-R1和H5-P

组合4：H5-F2、H5-R2和H5-P

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL H5 forward和H5 reverse各2.1μL，10pmol/μL H5 probe 0.6μL，RNase Free dH₂O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元(包含重组酶、逆转录酶和聚合酶的冻干粉)，待检测的样品RNA模板2μL。

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min。

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，H5组合3的扩增效率优于其他3个组合，因此将H5组合3引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物H5 forward：

5′-CAGTTTGAGGCYGTTGGAAGGGAATTTAAYAA-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H5reverse：

5′-CTTGTCRTAAAGGTTCTTGACATTTGAGTCAT-3′(SEQ ID NO:2)

探针H5probe：

5′-CTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACT/i6FAMdT/THF//iBHQ1dT/GGTTCTCATGGAAAAT[C3-spacer]-3′(SEQ ID NO:3)；

其中探针的5′端第30位T碱基标记FAM发光基团，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第31位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

选择一株H5亚型禽流感病毒的RNA作为模板，设置7组不同浓度的RNA，进行RT-RAA最适条件下的核酸扩增。

参照RNA提取试剂盒说明书提取H5亚型流感病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度，按照比例稀释至1ng/μL，再以10倍梯度稀释成10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^{- 4}ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。

结果如图2所示，本发明设计的引物和探针组合在H5亚型禽流感病毒RNA浓度为1ng/μL，10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，时出现荧光扩增曲线，检测灵敏度为RNA最低浓度10^-4ng/μL，能够保证检测灵敏度。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，H5亚型禽流感病毒RNA模板为2μL，其他亚型流感病毒(H1N2亚型禽流感病毒，H3N2亚型禽流感病毒，H4N2亚型禽流感病毒，H6N2亚型禽流感病毒，H7N9亚型禽流感病毒，H9N2亚型禽流感病毒，H10N7亚型禽流感病毒，H11N2亚型禽流感病毒)、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒RNA模板分别为2μL。检测反应条件为：39℃恒温扩增20min。结果如图3所示，4株H5亚型禽流感病毒RNA模板对应的试验组均出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，本发明设计的引物和探针组合可以实现对H5亚型流感病毒病毒的特异性检测，不与其他亚型流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

1.样品采集：

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份。采用PBS液(pH5.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 19438.2-2004H5亚型禽流感荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒。

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为14号样品临床样品有荧光信号，形成扩增曲线，判定为H5阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为14号样品临床样品有有荧光信号，形成扩增曲线，判定为H5阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现荧光信号，结果准确可信。

综上所述，这30份临床样品中，14号样品可以判定为H5阳性，其余样品均为阴性。对14号样品进行特异性HA基因扩增并测序分析，发现该样品中H5亚型禽流感病毒属于2.3.4.4分支，为当前我国H5亚型禽流感病毒的主要流行分支。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定H5亚型禽流感病毒，对我国当前流行的第7分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支等H5亚型禽流感病毒均可以检测，满足了当前对于H5亚型禽流感病毒检测的需求。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种H5亚型禽流感病毒的等温扩增检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtttgagg cygttggaag ggaatttaay aa 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttgtcrtaa aggttcttga catttgagtc at 32

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt tggttctcat ggaaaat 47

Claims (6)

1.一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2，探针的序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针自5′端起第30位碱基T标记FAM发光基团，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃，第31位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备检测H5亚型禽流感病毒的制品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为逆转录重组酶介导等温扩增试剂盒。

5.一种逆转录重组酶介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有逆转录重组酶介导等温扩增的试剂，和权利要求1或2所述的引物对和探针组。

6.一种非疾病诊断治疗目的的检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制RT-RAA反应体系：

其中包含有逆转录重组酶介导等温扩增所使用的试剂组分，以及权利要求1或2所述的引物对和探针组、待检测样品的核苷酸；

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为在39℃下恒温扩增20min；

3)结果判定

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，待检测样品的无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。