CN109628643A - 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法，通过比对了近年来分离到的H5亚型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5亚型禽流感病毒实时荧光定量RT‑PCR核酸快速检测方法。本发明所提供的H5亚型禽流感病毒实时荧光RT‑PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节，只需一台荧光PCR仪即可在密闭反应管中完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求。

Description

一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法。

背景技术

1996年，我国首次从广东的鹅体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒。从2003年末开始，H5N1亚型禽流感在东南亚多个国家的家禽中暴发，包括越南、泰国、韩国、日本、柬埔寨和印度尼西亚。2004年至2015年，我国的多个省份暴发了疫情，超过2千万只禽类被扑杀，给养禽业造成了巨大的经济损失。2005年底开始，我国针对H5亚型禽流感病毒实行大规模强制免疫政策，疫情开始得到了有效控制。实践证明，在禽流感防控方面，疫苗免疫发挥了巨大的作用。

但是，不可否认，它也带来了一系列的问题，如免疫加快了病毒变异，使得疫苗必须加快更新换代。随着病毒的进化，H5亚型禽流感病毒一直在发生较快的变异；从最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12。病毒变异是由于其血凝素基因(HA)中核苷酸的变异引起的。目前，全球H5亚型禽流感病毒共存在10个分支。我国存在或流行的分支包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支和第7分支共4个分支。我国现在流行的毒株与1996年最初分离的病毒A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1)的HA核苷酸同源性仅为90.6％(Re-11)和91.2％(Re-12)。以Re-11和Re-12疫苗株为代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性仅为88.5％。HA核苷酸的快速变异增加了以核苷酸为靶基因的检测方法的难度，导致以HA基因为靶基因的检测方法的特异性、敏感性下降，造成假阴性的结果。而病毒分离作为禽流感诊断的金标准，耗时较长、需要的硬件较高，不适合临床的快速诊断和应用。

发明内容

本发明提供一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法，通过比对了近年来分离到的H5亚型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR核酸快速检测方法。

本发明首先提供一种用于H5亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQ ID NO.1)，

下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQ ID NO.2)；

探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQ ID NO.3)，

其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；

本发明的引物组和探针用于制备使用实时荧光定量RT-PCR方法检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒；

本发明再一个方面提供一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，包括如下的步骤：

1)配置反应体系：

在聚合酶链式反应管中依次加入含dNTPs、Mg²⁺的2×qRT-PCR反应缓冲液25μl、水7.0μl、浓度为10μmol/L上游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的下游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的探针1.5μl、酶混合物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品10.0μl；

2)反应步骤：

将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；

3)结果检测：

如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

本发明所提供的H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节(易造成环境污染)，只需一台荧光PCR仪即可在密闭反应管中完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求(高致病性禽流感病毒需要在生物安全三级实验室完成)。

附图说明

图1：HA序列比对图，

图2本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法敏感性试验图。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明进行详细的描述。

实施例1：保守序列区域的确定及引物探针的筛选

申请人通过分子生物学方法研究了H5亚型流感病毒的不同NA亚型、不同分支的HA核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的H5毒株HA序列进行比对，确定其保守区域(图1)。序列比对发现，H亚型流感病毒的HA序列在nt106–nt174区域，该区域的序列如下：

ATGGAAAARAACGTYACTGTWACRCATGCYMAAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGARGCTYTG；

nt210–nt242区域，序列为ATTGYAGTGTRGCWGGATGGCTHCTYGGRAAYCC的保守度较高；其中，R＝A或G，Y＝C或T，M＝或C，W＝A或T。

表1：本发明中引物和探针设计使用到的病毒株信息表

按照荧光定量RT-PCR引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于H5亚型禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQ ID NO.1)，

下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQ ID NO.2)；

探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQ ID NO.3)，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；

实施例2：建立检测方法

确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入2×RT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg²⁺)、水7.0μl、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；然后将反应体系密闭，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

用实时荧光定量RT-PCR技术，对H5亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：

第一步(合成引物)：按照本发明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3)，人工合成扩增反应所需要的上下游引物和探针；

第二步(配置反应体系)：在聚合酶链式反应管中依次加入2×qRT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg²⁺)、水7.0μl、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；

第三步(反应)：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。

第四步(结果检测)：如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

实施例3：引物和探针的效果检测

1、采用上述筛选建立的引物探针和方法对H5亚型禽流感病毒进行了敏感性测试，包括如下步骤：

第一步：提取病毒RNA，用微量核酸分析仪测定病毒RNA含量。将RNA作10倍比稀释，取10.0μl稀释后的RNA模板，加入到40.0μl qRT-PCR预混液中；

第二步：采用建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其灵敏度；

结果表明，本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法，可以检测到0.1fg的RNA模板(图2)。

2、对H5亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法进行了特异性测试，包括如下步骤：

第一步：选取本室保存的H1-H16亚型的禽流感病毒，包括H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、H4N4亚型、H5N1亚型、H5N2亚型、H5N3亚型、H5N6亚型、H5N8亚型、H6N8亚型、H7N2亚型、H7N3亚型、H7N9亚型、H8N6亚型、H9N2亚型、H10N8亚型、H11N2亚型、H12N2亚型、H13N1亚型、H14N4亚型、H15N1亚型、H16N1亚型。其中H5亚型禽流感病毒，包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支、第7.2分支共4个分支的病毒株。同时选取其他禽类病毒，包括新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒。提取RNA作为模板；

第二步：采用建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其特异性；

第三步：本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法，可以检测出第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支、第7.2分支共4个分支的H5亚型禽流感病毒，对其他亚型的禽流感病毒及其他禽类病毒均无检出(表2)。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。表2：本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性试验结果表

实施例4：临床样品的应用检测。

对2014～2018年收集临床疑似H5亚型高致病性禽流感发病家禽样品100份，主要包括肺脏、肝脏、脾脏、气管、直肠等组织。取少量组织样品，剪碎后加入5～10倍体积的PBS缓冲液，进行匀浆或震荡破碎。冻融3次后，10000rpm离心5分钟，取上清备用。一部分上清直接提取RNA，用上述H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法进行检测；另一部分上清接种10日龄鸡胚，进行病毒分离，比较两种方法的符合率。

结果显示：对100份临床发病组织样品进行检测，用上述H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法进行检测，有76份为阳性。病毒分离结果也显示为76份为阳性，二者结果一致且为对应关系，符合率100％。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

实施例5：

对近年来实验室分离鉴定的30株H5亚型禽流感病毒(HA核苷酸序列相对于Re-8和Re-6疫苗株变异在10％以上)进行实时荧光定量RT-PCR检测，同时用深圳市匹基生物工程股份有限公司(《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法(GB/T 19438.2-2004)》国家标准起草单位)生产的禽流感(AIV-H5)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒进行检测，以对比两者的检出率。

结果显示：上述H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法可以将30份H5病毒全部检出，检出率100％。而深圳市某生物工程股份有限公司生产的禽流感(AIV-H5)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒有1份检测为阴性，检出率为98％；表明本发明所筛选的引物和探针能有效的对目前的H5亚型禽流感病毒的各种变异株进行检测。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaaara acgtyactgt 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccatccwg cyacactrca at 22

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagacatact ggaraagaca cayaayggga 30

Claims (5)

1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组合探针的序列信息如下：

其中上游引物的序列为SEQ ID NO.1，

下游引物的序列为SEQ ID NO.2；

探针的序列为SEQ ID NO.3。

2.如权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1。

3.权利要求1或2所述的引物组和探针在制备使用实时荧光定量RT-PCR方法检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。

4.一种检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有荧光定量RT-PCR扩增反应的试剂，和权利要求1或2所述的引物组和探针。

5.一种非疾病诊断治疗目的的检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配置反应体系：

在聚合酶链式反应管中依次加入含dNTPs、Mg²⁺的2×qRT-PCR反应缓冲液25μl、水7.0μl、浓度为10μmol/L的上游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的下游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的探针1.5μl、酶混合物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品10.0μl；所述的上游引物、下游引物和探针为权利要求1或2所述的引物组和探针；

2)反应步骤：

将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应；反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；

3)结果检测：

如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。