CN101392299A - 一种马流感检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种马流感检测试剂盒和检测方法，属于检验检疫领域。一组检测H3N8亚型马流感病毒的核苷酸序列，为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本发明的优点是：1)快速：将传统检测方法的21天检测时间缩短为4个小时；2)灵敏：对以10倍梯度稀释的H3N8亚型马流感病毒进行检测，结果表明单重方法稀释到10^－7倍均检出为阳性；双重方法稀释到10^－5倍检出为阳性。3)特异：建立的H3N8亚型马流感病毒单重和双重荧光RT－PCR检测方法在检测马动脉炎病毒，其他亚型的流感病毒，结果为阴性，未发现交叉反应；4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；5)不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

Description

一种马流感检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及一种马流感检测试剂盒和检测方法，尤指采用快速的单重和双重荧光RT-PCR检测方法检测H3N8亚型马流感病毒的核苷酸序列、检测试剂盒和方法，不仅适用于对动物组织样本中H3N8亚型马流感病毒的准确检测，还可适用于动物活体样本(主要为鼻拭子)的检测，可用于国内马科动物H3N8亚型马流感病毒的筛查，出入境马匹检疫等，属于检验检疫领域。

背景技术

马流行性感冒(简称马流感)的病原为马流行性感冒病毒(Equine influenza，EI)可引起马的急性上呼吸道感染，特征性临床症状为发烧、呼吸困难，厌食和持续性咳嗽；并可导致母马流产；病理学表现为急性支气管炎、细支气管炎、间质性肺炎，继发感染可表现支气管肺炎。根据HA和NA的不同，存在2个亚型的马流感病毒可感染马，即H7N7亚型(马甲1型)和H3N8(马甲2型)，但近20多年以来，世界范围内没有再分离到马甲1型病毒。马甲1型原型毒株为A/Equine/Prague/1/56(H7N7)，为1956年从捷克斯洛伐克的马体中分离；马甲2型原型毒株为A/Equine/Miami/1/63(H3N8)，最早分自美国迈阿密州。

自然条件下，只有马属动物对马流感病毒具有易感性，一般来讲，没有年龄、性别和品种的差别。本病传染方式包括呼吸道(吸入含有病毒的飞沫)、消化道(病毒污染的饲料和饮水)与本交(康复公马的精液长期带毒)，其中经呼吸道传染是本病主要的传染方式。本病传播极为迅速，呈暴发性流行，病毒传入易感马群，易感马7天左右都可以感染发病。本病一年四季均可发生，我国北方地区春夏之交多发，有些地区则多发生于冬末春初，而另外一些地区流行和发生于夏季。病马主要表现发热、咳嗽和流浆液性鼻液。马流感主要有H7N7(马1)和H3N8(马2)两个亚型，马1于1956年在捷克首都布拉格马群中暴发，马2于1963年在美国迈阿密马群中暴发，马2型在多个国家暴发和流行。

建国后，我国共有4次马流感的大流行。第一次发生于1974年6月，新疆伊犁、博尔塔拉和塔城等地区暴发和蔓延到青海、内蒙古、河北、福建等17个省、市和自治区，此次疫情为马1型，这次疫情分离的毒株以A/马/京防74-1为代表，该毒株与1956年国外首次发现并分离的代表株A/马/1/布拉格/1/56(马甲1型)抗原性相似，多年来未见国内外该亚型流感发病的报道；第二次疫情发生于1989年和1990年，发病率为81％，个别马群的死亡率为20％，某县病马的死亡率高达35％。此次疫情中分离出的毒株为H3N8亚型的马流感毒株(A/马/吉林/1/89)，该毒株的6个片段的基因与禽流感病毒有密切关系，文献报道禽源流感病毒在马群中传播至少5年，发展趋势难以预测(Binns等，1995)；第三次大流行暴发于1993年，我国西北、华北和西南地区突然暴发了马流感，从发病马体内分离出H3N8亚型马流感病毒(A/马/青海/1/94)。北京市10个区县的18个乡也发生92个疫点，发病马7630匹，死亡28匹。1994年，北京市又有6个区县的8个乡发生30个疫点，发病马1510匹，死亡160匹(祝俊杰、曹平，2005)。时隔13年，在马匹的数量急剧减少的情况下，蒙古和我国再次暴发了H3N8亚型马流感(马2)。2007年11月中旬，华北某地区突然暴发H3N8亚型马流感。历史上，马流感对比赛马的影响主要有(1)1992年年底，香港赛马尽管用疫苗进行了免疫接种，但是仍暴发了H3N8亚型马流感，对赛马业造成巨大的经济损失(Powell等，1992；Lai等，1992)；(2)1986年，南非由于暴发马流感，赛马会被取消2个多月(Kawaoka等，1989)。由于国际间马匹的流动，容易将马流感病毒引入到易感马群而暴发马流感，国际兽疫局(OfficeInternational des Epizootis，OIE)建议，没有马流感的国家在引入马匹时，应要求对马流感流行地区的马进行疫苗免疫，并且在运输前2～8周进行追加免疫一次(Oxburgh等，1998)。鉴于目前世界范围内发生的马流感均为H3N8亚型(马甲2型)病毒引起，因此开展H3N8亚型(马甲2型)马流感病毒快速检测技术研究。

对于马流感病原检测，目前常用方法为病毒分离鉴定、抗原捕获检测和分子生物学检测方法。病毒分离鉴定周期长且存在生物安全问题，抗原捕获检测方法的灵敏度较差。尽管普通聚合酶链式反应的RT-PCR方法可以检测病毒核酸，且样本来源广泛，适用性好。但是这种方法操作相对繁琐而且容易污染。而且测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA的拷贝数。由于PCR的终产物的量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA的拷贝数，无法做到准确定量。

Taqman荧光实时定量检测病原的技术具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，是国际上公认的快速准确技术之一。可检测到很微量的病毒核酸。我们已经将其应用到了禽流感病毒、新城疫病毒、猪链球菌以及口蹄疫病毒亚洲1型的检测领域，取得了很好的技术效果。

TaqMan技术的要点是在普通PCR原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示)，3’端标记的荧光素，在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收。

PCR进行一个循环，合成了N条新链的同时，就水解了N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线—称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“S”型；而当标本中不含病原体，则PCR过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。

PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线(Threshold)；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越高，Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。

本发明首次将单重和双重荧光RT-PCR技术应用于H3N8亚型马流感病毒检测领域，提供了针对H3N8亚型马流感病毒的特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测H3N8亚型马流感病毒的核苷酸序列，包括引物序列和探针序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供快速、准确、使用方便的检测H3N8亚型马流感病毒的单重和双重检测试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种快速、准确、可定量检测H3N8亚型马流感病毒的单重和双重检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％—60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

1组检测H3N8亚型马流感病毒的核苷酸序列，如下：

1)5’-AAC CRG TGG CAA CAA CAC AG-3’(SEQ ID NO：1)

2)5’-TCA GTA GCA TTT GTC ACC TCA AT-3’(SEQ ID NO：2)

3)5’-[FAM]CTG GGA CAC CAT GCA GTA GCA AAT GG[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)

4)5’-CAG CTC CAT TGT GAT GTG TG-3’(SEQ ID NO：4)

5)5’-TCG TAA AYT ACA TCT TRT CGA TGT C-3’(SEQ ID NO：5)

6)5’-[VIC或HEX]AAG RAT AGC TCC ATC GTG CCA TGA CC[TAMRA]-3’(SEQID NO：6)

其中序列1)和2)分别为HA检测的正义引物和反义引物，序列3)为HA检测荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6—羧基荧光素)，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；序列4)和5)分别为NA检测的正义引物和反义引物，序列6)为NA检测荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团VIC或HEX(六氯-6-甲基荧光素)，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了H3N8亚型马流感病毒单重和双重检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。

检测H3N8亚型马流感病毒单重和双重检测试剂盒，由以下组分组成：

1)裂解液：购自INVITROGEN公司，按5ml/管进行分装，6管/盒。

2)RT-PCR反应液，表1为HA或NA单重反应液配方；表2为检测HA和NA的双重反应液配方。

表1 HA或NA单重反应液配方

 

组分	终浓度
		10×PCR缓冲液	0.5×PCR缓冲液
25mM MgCl2	3.0mM
		2.0mM dNTP	0.2mM dNTP
正义引物	0.2μmol/L
		反义引物	0.2μmol/L
探针	0.1μmol/L

表2 检测HA和NA的双重反应液配方

 

组分	终浓度
		10×PCR缓冲液	0.5×PCR缓冲液
25mM MgCl2	3.0mM
		2.0mM dNTP	0.2mM dNTP
HA正义引物	0.2μmol/L
		HA反义引物	0.2μmol/L
HA探针	0.1μmol/L
		NA正义引物	0.2μmol/L
NA正义引物	0.2μmol/L
		NA探针	0.1μmol/L

10×PCR缓冲液、25mM MgCl₂、2.0mM dNTP均购于Promega公司；引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10×PCR缓冲液的组成为：500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH9.025℃)、1.0％ Triton X-100。

3)RT-PCR酶颗粒，购自AMERCIA公司，12管/盒。

4)Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司。

5)DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1％，37℃搅拌处理12hr，151bf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

6)阴性对照：马流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时。

7)阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增产物，获得高纯度的含有H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因编码区序列基因，长度分别为1762bp和1413bp，与PGEM-T easy载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为PGEM-RAB。以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备H3N8亚型马流感病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

1762bp HA目的片段基因序列如下：

1    AGCAAAAGCA GGGGATATTT CTGATGAAGA CAACCATTAT TTTTATTTTT ATACTACTGA

61   CCCATTGGGC CTACAGTCAA AACCCAATCA GTAACAACAA CACAGCCACA TTGTGTCTGG

121  GACACCATGC AGTAGCAAAT GGAACATTAG TAAAAACAAT AAGTGATGAT CAAATTGAGG

181  TGACAAATGC TACAGAATTA GTTCAGAGCA TTTCAATGGG GAAAATATGC AACAACTCAT

241  ATAGAATTCT AGATGGAAGA AATTGCACAT TAATAGATGC AATGCTAGGA GACCCCCACT

301  GTGACGTCTT TCAGTATGAG AATTGGGACC TCTTTATAGA AAGAAGCAGC GCTTTCAGCA

361  ATTGCTACCC ATATGACATC CCTGACTATG CATCGCTCCG ATCAATTGTA GCATCCTCAG

421  GAACATTGGA ATTCACAGCA GAGGGATTCA CATGGACAGG TGTCACTCAA AACGGAAGAA

481  GTGGAGCCTG CAAAAGGGGA TCAGCCGATA GTTTCTTTAG CCGACTGAAT TGGCTAACAA

541  AATCTGGAAA CTCTTATCCC ACATTGAATG TGACAATGCC TAACAATAAA AATTTCGACA

601  AGCTATACAT CTGGGGGATT CATCACCCGA GTTCAAATCA AGAGCAGACA AAATTGTATA

661  TCCAAGAATC AGGACGAGTA ACAGTCTCAA CAAAAAGAAG TCAACAAACA ATAATCCCTA

721  ACATCGGATC TAGACCGTGG GTCAGAGGTC AATCAGGCAG GATAAGCATA TACTGGACCA

781  TTGTAAAACC TGGAGATATC CTAATGATAA ACAGTAATGG CAACTTAGTT GCACCGCGGG

841  GATATTTTAA ATTGAAAACA GGGAAAAGCT CTGTAATGAG ATCAGATGTA CCCATAGACA

901  TTTGTGTGTC TGAATGTATT ACACCAAATG GAAGCATCTC CAACGACAAG CCATTCCAAA

961  ATGTAAACAA AGTTACATAT GGAAAATGCC CCAAATATAT CAGGCAAAAC ACTTTAAAGT

1021 TAGCCACTGG AATGAGAAAT GTACCAGAAA AGCAAATCAG AGGAATCTTT GGAGCAATAG

1081 CGGGATTCAT CGAAAACGGC TGGGAAGGAA TGGTTGATGG GTGGTATGGG TTCCGATACC

1141 AAAACTCTGA AGGAACAGGA CAAGCTGCAG ATCTAAAGAG CACTCAAACA GCCATCGACC

1201 AGATTAATGA AAAGTTAAAC AGAGTGATTG AAAGAACCAA TGAGAAATTC CATCAGATAG

1261 AGAAGGAATT CTCAGAAGTA GAAGGAAGAA TTCAGGACTT GGAGAAATAT GTGGAAGACA

1321  CCAAAATAGA CCTATGGTCC TACAATGCAG AATTGCTGGT GGCTCTAGAA AATCAACATA

1381  CAATTGACTT AACAGATGCA GAAATGAATA AATTATTCGA GAAGACTAGA CGCCAGTTAA

1441  GAGAAAACGC AGAAGACATG GGAGGTGGAT GTTTCAAGAT TTACCACAAA TGTGATAATG

1501  CATGCATTGG ATCAATAAGA AATGGGACAT ATGACCATTA CATATACAGA GATGAAGCAT

1561  TAAACAACCG ATTTCAAATC AAAGGTGTTG AGTTGAAATC AGGCTACAAA GATTGGATAC

1621  TGTGGATTTC ATTCGCCATA TCATGCTTCT TAATTTGCGT TGTTCTATTG GGTTTTATTA

1681  TGTGGGCTTG CCAAAAAGGC AACATCAGAT GCAACATTTG CATTTGAGTA AACTGATAGT

1741  TAAAAACACC CTTGTTTCTA CT

1413 bp NA目的片段基因序列如下：

1    TATACATTGG ATCTGCATCA TTGGGGATAT TAATCATTAA CGTCATTCTC CATGTAGTCA

61   GCATTATAGT AACAGTACTG GTCCTCAATA ACAATGAAAC AGGTCTGAAC TGCAAAGGGA

121  CGATCATAAG AGAGTACAAT GAAACAGTAA GAGTAGAAAA AATTACTCAA TGGCATAATA

181  CCAGTGCAAT TAAGTACATA GAGAGACCTC CAAATGAATA CTACATGAAC AACACCGAAC

241  CACTTTGTGA GGCCCAAGGC TTTGCACCAT TTTCCAAAGA TAATGGAATA CGAATTGGGT

301  CGAGAGGCCA TGTTTTTGTG ATAAGAGAAC CTTTTGTATC ATGTTCGCCC TCAGAATGTA

361  GAACCTTTTT CCTCACACAG GGCTCATTAC TCAATGACAA ACATTCTAAC GGCACAGTAA

421  AGGATCGAAG TCCATATAGG ACTTTGATGA GTGTCAAAAT AGGGCAATCA CCTAATGTGT

481  ATCAAGCTAG GTTTGAATCG GTGGCATGGT CAGCAACAGC ATGCCATGAT GGAAAAAAAT

541  GGATGACAAT TGGAGTCACA GGGCCCGACA ATCAAGCAAT TGCAGTAGTG AACTATGGGG

601  GTATTCCGGT TGATATTATT AATTCATGGG AAGGGGACAT CTTAAGAACC CAAGAATCAT

661  CATGCACCTG CATTAAAGGA AACTGTTATT GGGTAATGAC TGATGGACCG GCAAATAGGC

721  AAGCTAAATA TAGGATATTC AAAGCAAAAG ATGGAAGAGT AATTGGACAG ACTGATATAA

781  GTTTCAATGG GGGACACATA GAGGAGTGTT CTTGTTACCC CAACGAAGGG AAGGTGGAAT

841  GCATATGCAG GGACAATTGG ACTGGAACAA ATAGACCAAT TCTGGTAATA TCTTCTGATC

901  TATCGTACAC AGTTGGATAT TTGTGTGCTG GCATTCCCAC TGACACTCCT AGGGGAGAGG

961  ATAGTCAATT CACAGGCTCA TGTACAAGTC CTTTGGGAAA TAAAGGATAC GGTGTAAAAG

1021 GTTTCGGGTT TCGACAAGGA ACTGACGTAT GGGCCGGAAG GACAATTAGT AGGACTTCGA

1081 GATCAGGATT CGAAATAATA AAAATCAGGA ATGGTTGGAC ACAGAACAGT AAAGACCAAA

1141 TCAGGAGGCA AGTGATTATC GATGACCCAA ATTGGTCAGG ATATAGCGGT TCTTTCACAT

1201 TGCCGGTTGA ACTAACAAAA AAGGGATGTT TGGTCCCCTG TTTCTGGGTT GAAATGATTA

1261  GAGGTAAACC TGAAGAAACA ACAATATGGA CCTCTAGCAG CTCCATTGTG ATGTGTGGAG

1321  TAGATCATAA AATTGCCAGT TGGTCATGGC ACGATGGAGC TATTCTTCCC TTTGACATCG

1381  ATAAGATGTA GTTTACGAAA AAAACTCCTT GTA

对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之间，即视为合格引物。从1∶104稀释的H3N8亚型马流感病毒鸡胚培养物中提取的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较高。

将筛选好的引物浓度从0.1μM至0.8μM以0.1μM为间距递增，探针浓度从0.025μM至0.2μM以0.025μM递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：不同浓度的引物、探针对于该阳性模板，CT值基本稳定在18.55左右，但引物浓度为0.2μM，探针浓度为0.1μM时荧光增幅相对较高，所以选定引物浓度为0.2μM，探针浓度为0.1μM作为H3N8亚型马流感病毒单重和双重荧光RT-PCR检测方法的引物和探针浓度。

我们针对Roche Light Cycler以及ABI 7900HT荧光PCR检测仪，在42℃/30min，92℃/3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数。最终确定采用扩增效果较好，耗时较短的方案为PCR反应参数：92℃/10sec，60℃/30sec 40个循环，每个循环结束时收集荧光。

研究表明，Mg2+浓度对荧光PCR扩增结果的影响较大，故应用筛选好的引物探针，将Mg2+的浓度从1.5mM至6.0mM以0.5mM为间距递增，对不同Mg2+浓度条件下的扩增进行了比较，结果表明Mg2+浓度对荧光增量和检测的灵敏度相关，提高其使用浓度，可提高检测探针的荧光增量，但随着Mg2+浓度的提高，特别是超过5mM时，在检测某些样品时，可发现曲线上漂的现象。对于H3N8亚型马流感病毒单重和双重检测方法，优化后的Mg2+浓度为3.0mM。

我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性。Taq酶用量(以单位U计)的优化实验模板采用H3N8亚型马流感病毒鸡胚培养物(1:10⁴稀释)提取RNA反转录后进行扩增。从多次重复试验结果中选定1.25U Taq酶作为使用的Taq酶量。

1)样品处理：对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融2次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

2)RNA的提取：在样本处理区进行。

取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(一份样本换用一个吸头)；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。

12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(—20℃预冷)，作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600ul 75％乙醇(—20℃预冷)，颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。

加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。

3)RT-PCR扩增：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15ul RT-PCR反应液和0.25ul Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15ul，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：

——第一阶段，预变性42℃/30min，92℃/3min；

——第二阶段，92℃/10s，60℃/30sec 40个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。

4)结果的判定：结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H3N8亚型马流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在H3N8亚型马流感病毒。

检测H3N8亚型马流感病毒的单重和双重方法，包括如下步骤：

1)提取样品RNA；

2)对提取的样品RNA进行RT-PCR扩增：

HA检测引物序列为1)5’-AAC CRG TGG CAA CAA CAC AG-3’(SEQ ID NO：1)

2)5’-TCA GTA GCA TTT GTC ACC TCA AT-3’(SEQ ID NO：2)

HA检测荧光探针为3)5’-[FAM]CTG GGA CAC CAT GCA GTA GCA AAT GG[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：3)

NA检测引物序列为4)5’-CAG CTC CAT TGT GAT GTG TG-3’(SEQ ID NO：4)

5)5’-TCG TAA AYT ACA TCT TRT CGA TGT C-3’(SEQ ID NO：5)

NA检测荧光探针为6)5’-[VIC或HEX]AAG RAT AGC TCC ATC GTG CCA TGA CC[TAMRA]-3’(SEQ ID NO：6)

扩增条件为42℃/30min，92℃/3min；92℃/10sec，60℃/30sec40个循环，每个循环结束时收集荧光。

3)测定RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在H3N8亚型马流感病毒；阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H3N8亚型马流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在H3N8亚型马流感病毒。

本发明的优点是：本发明选择H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因编码区作为靶区域，设计引物和探针建立并优化了H3N8亚型马流感病毒单重和双重荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果：1)快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果，将传统检测方法的21天检测时间缩短为4个小时。

2)灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍；用所建立的方法对以10倍梯度稀释的H3N8亚型马流感病毒A/equine/xibei/1/2007株鸡胚培养尿囊液进行检测，结果表明稀释到10^-7倍单重方法仍为阳性；稀释到10^-5倍双重方法为阳性。

3)特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的马动脉炎病毒以及其他动物流感病毒病原，结果为阴性，未发现交叉反应。

4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；

5)不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为H3N8亚型马流感病毒H3和N8单重检测方法的检测极限测定结果：(a)为H3检测结果，(b)为N8检测结果。

图2为H3N8亚型马流感病毒双重检测方法检测极限测定结果：a)为对稀释病毒的检测结果；(b)为对稀释RNA的检测结果。

图3为采用单重方法对病毒RNA进行相对定量的结果。

图4为双重方法与单重方法对不同浓度RNA的检测结果。

图5为H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果：(a)为H3特异性试验结果；(b)为N8特异性试验结果。

图6为双重方法的特异性试验结果。

图7采用荧光RT-PCR对临床样品的检测结果。

具体实施方式

实施例1：试剂盒的配制和使用

1.试剂盒的配制组成，见表3。

表3 试剂盒配制组成

 

组成(48tests/盒)	数量
		裂解液	5.0mL×6管
H3和N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR单重反应液	各750μL×1管
		H3 N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR双重反应液	750μL×1管
Taq酶(5U/μL)	45μL×1管
		RT-PCR酶颗粒	1粒×36管
DEPC水	1mL×3管
		阴性对照	1mL×3管
阳性对照	1mL×3管

2.试剂盒的使用方法

2.1RNA提取：

取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(一份样本换用一个吸头)；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。

12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(—20℃预冷)，作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600ul75％乙醇(—20℃预冷)，颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。

加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。

2.2扩增试剂准备与配制

从试剂盒中取出单重和双重RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15ul RT-PCR反应液和0.25ul Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15ul，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：

——第一阶段，预变性42℃/30min，92℃/3min；

——第二阶段，92℃/10s，60℃/30sec 40个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。

2.3结果判定

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H3N8亚型马流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在H3N8亚型马流感病毒。

实施例2：试剂盒的灵敏度试验及用于病毒RNA的相对定量

1.材料：

方法研究过程中应用到的病毒株为本实验室保存的H3N8亚型马流感病毒A/equine/xibei/1/2007(10^-5EID50/0.1ml)。

2.方法

1)将H3N8亚型马流感病毒A/equine/xibei/1/2007鸡胚培养的尿囊液作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，分别进行H3和N8单重和双重H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR检测，同时将各个稀释度的病毒接种SPF鸡胚，比较两种方法的灵敏度。

2)病毒RNA的相对定量：

为实现对临床样品中病毒RNA量的相对定量，我们进一步对连续10倍稀释的病毒RNA样品进行检测，对Ct值和样品中病毒RNA的量进行线性回归，计算相关系数。

3.结果

1)见图1—图3所示，将H3N8亚型马流感病毒A/equine/xibei/1/2007鸡胚培养的尿囊液作10倍系列稀释，运用优化后的条件分别用两种检测方法进行检测，试验结果显示，单重检测方法的检测极限可达10^-7，双重检测方法可达10^-5。图1，图2分别为H3N8亚型马流感病毒单重和双重荧光RT-PCR检测方法的灵敏度检测结果。而采用SPF鸡胚分离培养鉴定，灵敏度仅能达到10^-5，与双重荧光RT-PCR检测方法的灵敏度一致，但低于单重荧光RT-PCR检测方法。

2)病毒RNA的相对定量：为实现对临床样品中病毒RNA量的相对定量，我们进一步对连续10倍稀释的病毒RNA样品进行检测，对Ct值和样品中病毒RNA的量进行线性回归，计算相关系数。结果显示，病毒RNA的量与试验测得的Ct值呈线性相关，R2＝0.9990(ABI7900)和0.995(ROCHE1.1)，表明建立的方法可用于病毒RNA量的相对确定，如图3所示。对于各个稀释度的RNA，采用单重和双重方法，所得Ct值基本一致，如图4所示，表明RNA浓度在10^-1—10^-5稀释度范围内，单重和双重检测方法检测效率相近。

实施例3：试剂盒的特异性试验

1.材料

表4方法研究过程中应用到的病毒株

2.方法

用所建立的单重和双重荧光RT-PCR方法对多种流感病毒(包括H1，禽源H3，H5，H9亚型病毒)以及马动脉炎病毒、马甲1型流感病毒进行检测，以验证方法的特异性。

3.结果

如图5和图6所示，结果表明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性良好。

实施例4：H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR试剂盒的批间、批内可重复性试验

为对该试剂盒批间、批内重复性进行综合考核，我们选择三批合格试剂进行了批间、批内可重复性试验。

1.实验材料

试剂：H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR试剂盒3批，批号：200612001、200612002、200612003

检测仪器：全自动荧光PCR检测仪ABI公司产品，型号，7900。

检测样本：将将H3N8亚型马流感病毒A/equine/xibei/1/2007鸡胚培养的尿囊液作10^-3、10^-4、10^-5倍稀释后，分别命名为D1、D2、D3，连续三次分别用H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR试剂盒进行批间、批内重复性试验。

2.实验内容：每批试剂均对A/equine/xibei/1/2007鸡胚培养的尿囊液的3个稀释度进行3次荧光RT-PCR检测，每次每一样本检测10份复管，然后根据以上数据计算试剂盒的批内、批间误差。

检测结果要求：同一样本的批内、批间CV值≤10％

3.实验结果

根据表5结果可见200712001、200712002、200712003三个批号的“H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒”对每一样木各10份复管的重复性检测，同一批号、同一次检测结果的CV值均小于5％，说明该试剂盒同批试剂同时检测具有很好的重复性。

表5三批试剂盒批内、批间重复性试验数据

根据表6结果可见200712001、200712002、200712003三个批号的“H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒”对三份样本的重复性检测，同一批号、各自三次检测结果之间的CV值均小于5％，说明该试剂盒同批试剂、不同时间的检测结果也具有很好的重复性。

表6三批试剂盒各自批内重复性试验数据

根据表7结果可见200712001、200712002、200712003三个批号的“H3N8亚型马流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒”对三份样本的重复性检测，三批号试剂、各自三次检测结果之间的CV值均小于5％，说明该试剂盒不同批次试剂、不同时间的检测结果也具有很好的重复性。

表7三批试剂盒批间重复性试验数据

根据以上试验数据及统计分析，该试剂盒批内、批间重复性结果的CV值均小于5％，说明具有很好的批内、批间重复性。

实施例6：对临床样品检测的实验报告

1.材料

北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供的40份马驴鼻拭子样品。

2.方法

对于这40份临床样品，分成2份，1份采用荧光RT-PCR检测方法进行检测，另一份采用鸡胚病毒分离鉴定进行检测，比较两种方法的检测结果。

3.结果

检测结果见表8、图7。

表8临床样品的检测结果

在本研究中，我们将建立的方法用于临床样品的检测，样品均为北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供的40份临床样品，结果显示与鸡胚病毒分离鉴定试验结果完全一致。

序列表

<110> 中华人民共和国北京出入境检验检疫局

<120> 一种马流感检测试剂盒和检测方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

<210> 7

<211> 1762

<212> DNA

<213> 人工合成HA片段

<400> 7

<210> 8

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工合成NA片段

<400> 8

Claims (7)

1.一组检测H3N8亚型马流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：为序列表SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为HA检测引物序列；SEQ ID NO：3为HA检测荧光探针；SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为NA检测引物序列；SEQ ID NO：6为NA检测荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测H3N8亚型马流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：序列SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；SEQ ID NO：6的5’端标记报告荧光基团VIC或HEX，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

3.一种检测H3N8亚型马流感病毒的试剂盒，48tests/盒，由以下组分组成：

1)裂解液：5ml/管，6管/盒；

2)H3或N8单重荧光RT-PCR反应液，分别为750μL×1管，均包括：10×PCR缓冲液、25mM MgCL₂、2.0mM dNTP、引物1、引物2和探针；

3)H3N8双重荧光RT-PCR反应液，为750μL×1管，包括：10×PCR缓冲液、25mM MgCL₂、2.0mM dNTP、检测H3和N8的特异性引物和探针；

4)RT-PCR酶颗粒，1粒×36管；

5)Taq DNA聚合酶5U/μL，45μL×1管；

6)DEPC水，1mL×3管；

7)阴性对照：1mL×3管，马流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时；

8)阳性对照：1mL×3管，为体外转录的非感染性RNA片段。

4.根据权利要求3所述的一种检测H3N8亚型马流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述8)阳性对照的制法为：回收H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增产物，获得高纯度的含有H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因编码区序列基因，长度分别为1762bp和1413bp，与PGEM-T easy载体进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为PGEM-RAB。以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备H3N8亚型马流感病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液；其中HA目的片段基因序列为序列表SEQ ID NO：7，NA目的片段基因序列为序列表SEQ ID NO：8。

5.根据权利要求3所述的H3N8亚型马流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述检测HA基因引物序列为序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；HA检测荧光探针为序列表SEQ ID NO：3，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

6.根据权利要求3所述的检测H3N8亚型马流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述检测NA基因引物序列为序列表SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；NA检测荧光探针为序列表SEQ ID NO：6，其5’端标记报告荧光基团VIC或HEX，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

7.检测H3N8亚型马流感病毒的方法，包括如下步骤：

1)提取样品RNA；

2)对提取的样品RNA进行单重或双重RT-PCR扩增：

检测HA引物序列为序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

荧光探针为序列表SEQ ID NO：3；

检测NA引物序列为序列表SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；

荧光探针为序列表SEQ ID NO：6；

扩增条件为扩增条件为42℃/30min，92℃/3min；92℃/10sec，60℃/30sec 40个循环，每个循环结束时收集荧光；

3)测定RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在H3N8亚型马流感病毒；阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H3N8亚型马流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在H3N8亚型马流感病毒。

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