CN103131798A

CN103131798A - 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103131798A
Application number: CN2013100590998A
Authority: CN
Inventors: 石康; 王琳琳; 朱世新
Original assignee: HUBEI LANGDE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUBEI LANGDE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2013-06-05

Abstract

一种诺如病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其应用，属于基因检测领域。本发明试剂盒中包含有筛选获得的针对I型诺如病毒的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，和/或针对Ⅱ型诺如病毒的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，通过一步法实时荧光RT-PCR可检测出的I型和/或Ⅱ型诺如病毒的最低浓度为1.0×10²copies/mL，这说明本试剂盒的灵敏度和特异性非常高。通过本发明实现了对大便、肛拭子等样品中的诺如病毒的快速早期检测和定量分析。本发明检测周期短、效率高；检测病毒特异性强，准确率高；病毒定性分析的同时还能定量分析；灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

一种诺如病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种I型和/或Ⅱ型诺如病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中包含有筛选获得的针对I型诺如病毒的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，和/或针对Ⅱ型诺如病毒的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，通过一步法实时荧光RT-PCR可检测出的I型和Ⅱ型诺如病毒的最低浓度为1.0×10²copies/mL，这说明本试剂盒的灵敏度和特异性非常高。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NV)是美国学者Kapikian于1972年通过免疫电镜技术，首先在发生于美国俄亥俄州诺瓦克镇暴发腹泻疫情患者粪便中发现的病毒颗粒，所以最早称诺瓦克病毒(Norwalk virus)。此后研究者不断从腹泻病人粪便中检测到此病毒，先称小圆结构病毒(Small round structural virus，SRSV)，后称诺瓦克样病毒(Norwalk-like virus，NLV)，2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒。诺如病毒是引起病毒性腹泻最常见的病原体之一，基因组为7642个核苷酸(nt)组成的单股正链RNA，包括三个主要的开放读码框(ORF)。ORF1的序列与小RNA病毒的2C、3C和3D区序列相似，编码一个1738个氨基酸的非结构蛋白前体。ORF2编码一个530个氨基酸的蛋白(衣壳蛋白)。ORF3可能编码一个功能未知的小肽(2215K)。通过诺如病毒基因组RNA多聚酶和壳体蛋白区域核苷酸和氨基酸序列差异的比较，诺如病毒被分成5个基因群(gene group，G)：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GV。其中GⅠ、GⅡ和GⅣ群诺如病毒感染人类。

诺如病毒是引起儿童和成人非细菌性胃肠炎的主要病原体之一，常年都有诺如病毒感染病例发生，发病高峰为秋冬季，，可通过食物、水源、接触等多种途径传播，因而在一些公共场所，常在医院、餐馆、学校、托儿所、孤儿院、养老院、军队、家庭及其他人群中引起大规模的暴发，人群危害较大。

诺如病毒为单正链RNA病毒，属人杯状病毒科、诺如病毒属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。由于目前不能进行细胞培养和没有动物模型，所以不能进行中和试验，人诺如病毒目前无法进行经典的血清分型。

常用的检测诺如病毒感染的方法主要有四种：

（1）电镜法：电镜检查包括直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，直接电镜法要求每毫升样品中至少有约10⁵～10⁶个病毒颗粒，灵敏度较低，患者早期病毒大量排出时的检出率只有10％～20％。免疫电镜法应用了血清捕捉抗原，使检出率比直接电镜法高10～100倍。方肇寅等曾用20％便样上清液滴膜后，2％PTA(pH6.4)染色，直接电镜观察，在国内首先发现了诺瓦克样病毒。

（2）普通RT-PCR技术：刘翼等针对RNA依赖的RNA聚合酶基因区采用Koopmans引物JV12Y/JV13I，引物JV12Y位于4552～4572bp，引物JV13I位于4858～4878bp，扩增的目的片段长度为327bp，建立了检测诺如病毒RT-PCR技术。

（3）多重RT-PCR技术：孙亚萍等应用针对诺如病毒壳体区域设计的4对引物(GⅠ-SKF/GⅠ-SKR、COG2F/G2-SKR、SLV5317/SLV5749、PreCAP1/82b)扩增杯状病毒、星状病毒壳体区域的N/S端，对于诺如病毒GⅠ、GⅡ、札如病毒、星状病毒得到的扩增产物分别为330、387、434、719bp，分子量差距大，可通过琼脂糖凝胶电泳直接进行鉴定。

(4)ELISA技术：

荧光定量PCR技术（FQ-PCR）是近年来发展起来的一种快速直接的核酸的检测技术。荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上发展起来的实时核算定量检测技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种也称为逆转录实时PCR，这是一种直接快速检测RNA的方法，它与荧光定量PCR技术的不同之处是多加了逆转录酶，同时多加了一个逆转录反应的步骤。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

发明内容

本试剂盒检测的基本原理是利用针对I型诺如病毒的一对特异性寡核苷酸引物和一条特异性寡核苷酸探针，和/或针对Ⅱ型诺如病毒的一对特异性寡核苷酸引物和一条特异性寡核苷酸探针，在逆转录酶、耐热DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）以及Mg²⁺等RT-PCR反应缓冲液，通过荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的扩增，从而实现分别快速、高效、特异、实时定量检测I型和/或Ⅱ型诺如病毒寡核苷酸的目的。

为了高效、特异、灵敏的检测出I型和/或Ⅱ型诺如病毒，本发明在对GeneBank中所有的现有的I型和Ⅱ型诺如病毒基因序列进行生物信息学分析，分别找出了I型和Ⅱ型诺如病毒的特异性保守区，并对这些保守区域设计了多对引物、探针。通过对I型和Ⅱ型诺如病毒标准株的检测，筛选出灵敏度高、特异性好、且分别针对I型和Ⅱ型诺如病毒的一对引物（用于扩增I型或Ⅱ型诺如病毒靶多核苷酸）和一条探针，即：分别能与I型和Ⅱ型诺如病毒双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV I-F、NoV Ⅱ-F，分别能与I型和Ⅱ型诺如病毒双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV I-R、NoV Ⅱ-R、分别能与I型和Ⅱ型诺如病毒靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV I-P、NoVⅡ-P，其中荧光报告基团任选自：FAM、TET、JOE、HEX、VIC；荧光猝灭基团任选自：TAMRA、DABCYL、BHQ。

其中：1)Ⅰ型诺如病毒正向引物NoV Ⅰ-F：CGYTGGATGCGNTTYCATGA（SEQ IDNO：1）；2)Ⅰ型诺如病毒反向引物NoV Ⅰ-R：CTTAGACGCCATCATCATTYAC（SEQ IDNO：2）；3)Ⅰ型诺如病毒寡核苷酸探针NoV Ⅰ-P：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA（SEQID NO：3）；4)Ⅱ型诺如病毒正向引物NoV Ⅱ-F：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG（SEQ ID NO：4）；5)Ⅱ型诺如病毒反向引物NoV Ⅱ-R：TCGACGCCATCTTCATTCACA（SEQ ID NO：5）；6)Ⅱ型诺如病毒的寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P：TGCTTGCACGCTACGATCTA（SEQ ID NO：6），优选的，上述寡核苷酸探针5’端连接有VIC，3’端连接有TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)；上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T，B代表G、T或C。

所以本发明提供了一种用于检测诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-4)中任一个：

1)寡核苷酸正向引物NoV I-F；寡核苷酸反向引物NoV I-R、寡核苷酸探针NoV I-P中任意一种或一种以上的组合；2)寡核苷酸正向引物NoV Ⅱ-F、寡核苷酸反向引物NoVⅡ-R、寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P中任意一种或一种以上的组合；3)1)或2)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本发明还提供了上述寡核苷酸组合物在制备检测诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)的试剂中的应用，其中：所述诺如病毒为I型和/或Ⅱ型诺如病毒，所述试剂为用于实时荧光RT-PCR的试剂。

本发明的目的之一是提供一种诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包含1)～3)中任一个：

1)能与I型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV I-F；能与I型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV I-R、能与I型诺如病毒的靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV I-P中任意一种或一种以上的组合；

2)能与Ⅱ型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV Ⅱ-F、能与Ⅱ型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV Ⅱ-R、能与Ⅱ型诺如病毒的靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P中任意一种或一种以上的组合；

3)1)或2)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

本发明的目的之一是提供一种诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取试剂，RT-PCR扩增反应液，混合酶，阴性质控品，阳性质控品，诺如病毒阳性标准品等。其中，所述混合酶包含Taq DNA聚合酶和逆转录酶（RT酶）。所述RT-PCR扩增反应液包含有：能与I型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV I-F、能与I型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV I-R、能与I型诺如病毒的靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV I-P中任意一种或一种以上的组合；和/或能与Ⅱ型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV Ⅱ-F、能与Ⅱ型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV Ⅱ-R、能与Ⅱ型诺如病毒的靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P中任意一种或一种以上的组合。所述的RT-PCR扩增反应液还包含有dNTPs、PCR buffer和RNA酶抑制剂（RNasin）。

其中：1)正向引物NoV Ⅰ-F：CGYTGGATGCGNTTYCATGA（SEQ ID NO：1）；2)反向引物NoV Ⅰ-R：CTTAGACGCCATCATCATTYAC（SEQ ID NO：2）；3)寡核苷酸探针NoV Ⅰ-P：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA（SEQ ID NO：3）；4)正向引物NoV Ⅱ-F：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG（SEQ ID NO：4）；5)反向引物NoV Ⅱ-R：TCGACGCCATCTTCATTCACA（SEQ ID NO：5）；6)寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P：TGCTTGCACGCTACGATCTA（SEQ ID NO：6），优选的，上述寡核苷酸探针5’端连接有FAM或VIC，3’端连接有TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)；或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T，B代表G、T或C。

本发明所提供的试剂盒还包含：（1）分别装有RNA提取剂、RT-PCR扩增反应液、混合酶、阴性质控品、阳性质控品、诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)阳性标准品的加盖密封的多个试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒中，正向引物浓度为0.5-1umol/L、反向引物的浓度为0.5-1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.25-0.5umol/L；优选为：正向引物浓度为1umol/L、反向引物的浓度为1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.5umol/L。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒中，Taq DNA聚合酶的浓度为1-8U/反应，逆转录酶的浓度为50-400U/反应；优选为：Taq DNA聚合酶的浓度为5U/反应，逆转录酶的浓度为100U/反应。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于RT-PCR扩增反应液中Mg²⁺最佳浓度为2.0mmol/L，RNA酶抑制剂（RNasin）最佳用量为5-40U/反应，优选20U/反应，高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）最佳浓度为0.1-0.25mmol/L，优选为0.2mmol/L。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒的RT-PCR扩增的反应条件为：37℃ 60min，94℃ 5min；PCR反应条件为94℃ 5min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1s，共30个循环。

根据本发明的一个优选实施方法是：使用所述的试剂盒时，检测样本选自大便样品、肛样品、含大便或肛样品的抽提液或培养上清液

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为NoV Ⅰ体外转录RNA、和/或NoV Ⅱ体外转录RNA。其中，建立NoV Ⅰ体外转录RNA的技术路线如下：使用NoV Ⅰ特异性正、反向引物定性扩增病毒核酸，扩增产物纯化后克隆入pGEM-T载体中，阳性克隆经测序确定目的片段是否正确插入并确定插入方向。提取重组质粒pGEM-T-NoV Ⅰ质粒进行酶切反应，割胶回收后得到其模板，用于体外转录。体外转录后消化DNA模板，进行RNA纯化，得到NoV Ⅰ-RNA。NoV Ⅱ体外转录的技术路线同NoV Ⅰ。其中阳性质控品的浓度为10³copies/ml。

根据本发明的另一个优选实施方案，本发明试剂盒中定量参考品为10⁴-10⁷copies/mlNoV Ⅰ和/或NoV Ⅱ体外转录RNA。其中体外转录步骤同上，体外转录后的RNA用紫外分光光度计测定A260进行定量，根据定量结果，用DEPC处理水将体外转录的NoV Ⅰ和/或NoV ⅡRNA分别稀释至10⁴-10⁷copies/ml作为本试剂盒中定量参考品。所有定量参考品与标本中提取的RNA同时进行扩增，荧光定量PCR仪会根据定量参考品绘制出标准曲线，并依此对检测标本中诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)的感染量进行自动测定。

本发明所提供的检测样品中Ⅰ型和/或Ⅱ型诺如病毒的试剂盒可以检测出的NoV的最低浓度为1.0×10²copies/mL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明所提供的检测样品中诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)的试剂盒是针对I型和/或Ⅱ型诺如病毒基因组保守基因片段设计特异引物和探针，可检测出I型和/或Ⅱ型诺如病毒，但不能检测出非诺如病毒病原体，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明所提供的检测样品中I型和/或Ⅱ型诺如病毒的试剂盒可以检测大便、肛拭子等样本中的诺如病毒；可为灵敏、快速、特异早期诊断诺如病毒感染提供可靠的实验证据，并且能够准确定量，所以可对疗效进行有效检测。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：（1）同时检测待检测样本中诺如病毒(I型和/或Ⅱ型)感染型别和感染量，可真实的反映出患者体内病原体类型、拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病，选择治疗方案及监测治疗效果；（2）与ELISA技术相比，具有更高的灵敏性，适用于大便、肛拭子等多种样本的检测；（3）针对病毒特异性保守序列设计引物和探针，具有更高的特异性，避免了与其他如星状病毒、扎入病毒、轮状病毒、肠道腺病毒等腹泻病毒的交叉反应；（4）将PCR的敏感性与探针杂交的特异性相结合，在很大程度上改变了普通PCR的缺陷，降低了反应时间，简化了操作步骤；（5）闭管检测不需要PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；实时的检测技术可以连续的检测PCR反应中荧光信号的变化，避免了普通PCR的“平台期效应”，而且模板的定量不通过终产物，而是有Ct值计算，准确性和灵敏性均有很大的提高。

附图说明

图1是NoV I病毒标准品扩增曲线；

图2是NoV Ⅱ病毒标准品扩增曲线；

图3是NoV I病毒标准品浓度标准曲线；

图4是NoV Ⅱ病毒标准品浓度标准曲线；

图5是4例NoV I阳性标本扩增曲线；

图6是5例NoV Ⅱ阳性标本扩增曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。

实施例1：诺如病毒一步法实时荧光定量RT-PCR试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genebank数据库中已有的诺如病毒核酸序列利用DNAman软件进行序列比对分析，以诺如病毒基因组ORF1-ORF2连接区的保守片段为扩增靶位点，根据引物探针设计的基本原则，利用软件人工设计多对引物和探针。

2、样本的选择：根据国内外相关的文献报道表明，可以选择来自大便样品、肛样品、含大便或肛样品的抽提液或培养上清液，如大便、肛拭子等样品。

3、反应体系的建立与优化

样本的准备：以病毒鉴定为Ⅰ型诺如病毒阳性的10份样品作为NoV-Ⅰ阳性参考品，分别为NoV Ⅰ-1、NoV Ⅰ-2、NoV Ⅰ-3、NoV Ⅰ-4、NoV Ⅰ-5、NoV Ⅰ-6、NoV Ⅰ-7、NoV Ⅰ-8、NoV Ⅰ-9、NoV Ⅰ-10；以病毒鉴定为Ⅱ型诺如病毒阳性的10份样品作为NoV-Ⅱ阳性参考品，分别为NoV-Ⅱ-1、NoV-Ⅱ-2、NoV-Ⅱ-3、NoV-Ⅱ-4、NoV-Ⅱ-5、NoV-Ⅱ-6、NoV-Ⅱ-7、NoV-Ⅱ-8、NoV-Ⅱ-9、NoV-Ⅱ-10；以病毒鉴定为阴性的10份非NoV样本为阴性参考品，分别为4种病毒样品（星状病毒、札如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒）以及6份正常的大便和肛拭子样品。分别提取上述阳性参考品和阴性参考品的RNA，待用。

引物探针的筛选：用上述1中设计的多组引物和探针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品的RNA，经反复多次试验，筛选出特异性好、灵敏度高和重复性好的最佳引物探针组合，如NoV Ⅰ-F、NoV Ⅰ-R及探针NoV Ⅰ-P的组合；引物NoV Ⅱ-F、NoV Ⅱ-R及探针NoV Ⅱ-P的组合；引物NoV Ⅰ-F、NoV Ⅰ-R、NoV Ⅱ-F、NoV Ⅱ-R及探针NoV Ⅰ-P、NoV Ⅱ-P的组合。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的条件下，分别使用0.5umol/L至1umol/L的浓度梯度的引物和0.25umol/L至0.5umol/L的浓度梯度的探针进行PCR反应，经反复多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为1umol/L、探针浓度为0.5umol/L。

Taq DNA聚合酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从1U（酶单位）至8U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为5U/反应。

RT酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从50U(酶单位）至400U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为100U/反应。

RNasin用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位）至40U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为20U/反应。

dNTPs度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.2mmol/L。

反应温度、时间的优化：根据酶的活性和寡核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：37℃ 60min，94℃ 5min；PCR反应条件为94℃ 5min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1s共30个循环。

4、标本检测：以大便、肛拭子等作为待检标本，分别提取标本的RNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明：本发明试剂盒可以灵敏的检测出临床标本中的诺如病毒（NoV Ⅰ型和/或NoV Ⅱ型）。

实施例2：诺如病毒一步法荧光实时定量RT-PCR检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组分成分的试剂盒：RNA提取液、RT-PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品、诺如病毒阳性标准品（定量参考品）、DEPC处理水。

2、标本的采集、运输及保存

2.1适用标本类型：大便、肛拭子等。

2.2标本采集与前处理（注意无菌操作）

2.2.1大便标本采集：粪便的采集应由受过专门培训的人员来施行，标本采集人员采集粪便5g（5ml），置于无菌粪便采样杯中（不添加任何试剂）。

2.2.2肛拭子标本采集：用棉花拭子在生理盐水中浸湿，插入肛门2-3cm处，自肛门周围皱襞处拭取，或在肛门口内轻轻旋转涂擦，然后插入盛有生理盐水的试管内。如做粪便拭子培养，以上操作均需使用无菌器材，并将拭子放入灭菌试管。

2.3标本运输与保存：采集或处理的样本在4℃条件下保存应不超过48h；若需长期保存，须放置-80℃低温冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样本密封后，采用保温箱加冰密封，并尽快运送到实验室。

3、检测步骤

（1）RNA提取

A．取N个（N=1管阴性质控品+待测样本数）灭菌的1.5ml离心管，并作好标记。

B．每个离心管加入600ul Trizol试剂，然后分别加入200ul待测样品上清液或阴性质控品，充分震荡混匀15s，室温静置3～5min；

C．每个离心管加入200ul氯仿，上下震荡混匀10s，12,000rpm离心5min；

D．小心吸取无色上层液体，转移至新灭菌的1.5ml离心管，然后加入10ul RNA提取液，充分吸打混匀，8,000rpm离心1分钟，然后小心弃去所有液体；

E．加入溶液C（确认已经加入无水乙醇）800ul，充分吸打混匀，8000rpm离心1min，尽可能将液体去除干净；

F．将离心管的盖子打开并放入通风橱中风干15min，也可使用加热器于60℃干燥5min，（主要去除无水乙醇），然后加入30ul DEPC处理水，吸打混匀管中沉淀，得到液体，可直接用于检测，也可存于-80℃备用。

（2）RT-PCR反应与结果分析、判定

分别取阴性质控品、阳性质控品、定量参考品、待测标本各3ul，加入PCR反应管中进行RT-PCR扩增反应。RT-PCR扩增反应的条件为：37℃逆转录60min；94℃ 5min；PCR反应条件为94℃ 5min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1s共30个循环。

结果分析：据定量参考品的扩增曲线设置Baseline的Start值、Stop值以及Threshold的Value值，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0～-0.97。最后在Analysis菜单中选择Analyze自动分析结果。

结果判定：诺如病毒（NoV Ⅰ型和/或NoV Ⅱ型）阳性样本扩增曲线呈S型，所有阴性样本无扩增曲线出现，待测标本的NoV Ⅰ型和/或NoV Ⅱ型检测结果有效，否则，结果为无效，需要重新检测，并根据标准品进行阳性样本定量检测，结果如图1-4。

实施例3：诺如病毒一步法荧光实时定量RT-PCR检测试剂盒临床检测使用

用上述方法对另外疑似诺如病毒感染病人粪便标本68份进行检测，荧光定量PCR设置为FAM/VIC双通道检测模式，可同时检测NoV I和NoV II病毒。其中NoV I检测结果阳性4例，NoV I检测的荧光探针为FAM标记，荧光定量PCR选定FAM通道对结果进行分析，扩增曲线见图5，根据这4例阳性结果的C_t值结合扩增曲线，由RocheLightCycler480分析软件自动分析得到这4例NoV I阳性标本的病毒浓度，具体结果见表1。其中NoV II检测结果阳性5例，NoV II检测的荧光探针为VIC标记，荧光定量PCR选定VIC通道对结果进行分析，扩增曲线见图6，根据这5例阳性结果的C_t值结合扩增曲线，由Roche LightCycler480分析软件自动分析得到这5例NoV II阳性标本的病毒浓度，具体结果见表2。

表1 4例NoV I阳性标本病毒浓度

样品编号	Ct值	NoV I病毒浓度（拷贝数/μl）
			样品1	20.67	2.38×10²
样品2	19.25	8.88×10³
			样品3	19.85	2.55×10³
样品4	19.72	2.12×10³

表2 5例NoV II阳性标本病毒浓度

样品编号	Ct值	NoV II病毒浓度（拷贝数/μl）
			样品1	20.91	1.05×10²
样品2	20.72	2.02×10²
			样品3	20.06	1.48×10³
样品4	20.46	4.81×10²
			样品5	19.85	2.53×10³

SEQUENCE LISTING

<110>湖北朗德医疗科技有限公司

<120>一种诺如病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其应用

<130>2013

<160>6

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>诺如病毒Ⅰ型的上游引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>n is a，c，g，ort

<400>1

cgytggatgc gnttycatga 20

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>诺如病毒Ⅰ型的下游引物

<400>2

cttagacgcc atcatcatty ac 22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>诺如病毒Ⅰ型荧光探针序列

<400>3

agatygcgrt cycctgtcca 20

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>诺如病毒Ⅱ型上游引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>n is a，c，g，ort

<400>4

cargarbcna tgttyagrtg gatgag 26

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>诺如病毒Ⅱ型下游引物

<400>5

tcgacgccat cttcattcac a 21

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>诺如病毒Ⅱ型荧光探针序列

<400>6

tgcttgcacgctacgatcta 20

Claims

1.一种诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取试剂，RT-PCR扩增反应液，混合酶，阴性质控品，阳性质控品，I型和/或Ⅱ型诺如病毒阳性标准品。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中，所述混合酶包含Taq DNA聚合酶和逆转录酶。

3.权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述的RT-PCR扩增反应液包含有：

能与I型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV I-F、能与I型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV I-R、能与I型诺如病毒的靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV I-P中任意一种或一种以上的组合；和/或

能与Ⅱ型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物NoV Ⅱ-F、能与Ⅱ型诺如病毒的双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物NoV Ⅱ-R、能与Ⅱ型诺如病毒的靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P中任意一种或一种以上的组合。

4.权利要求3所述的试剂盒，其中：

Ⅰ型诺如病毒正向引物NoV Ⅰ-F：CGYTGGATGCGNTTYCATGA；

Ⅰ型诺如病毒反向引物NoV Ⅰ-R：CTTAGACGCCATCATCATTYAC；

Ⅰ型诺如病毒所使用的寡核苷酸探针NoV Ⅰ-P：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA；

Ⅱ型诺如病毒正向引物NoV Ⅱ-F：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG；

Ⅱ型诺如病毒反向引物NoV Ⅱ-R：TCGACGCCATCTTCATTCACA；

Ⅱ型诺如病毒所使用的寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P：TGCTTGCACGCTACGATCTA；

或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；

上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T，B代表G、T或C。

5.权利要求1-4任一所述的试剂盒，其中所述的RT-PCR扩增反应液还包含有dNTPs、PCRbuffer和RNA酶抑制剂。

6.根据权利要求3-5任一所述的试剂盒，其中，正向引物浓度为0.5-1umol/L、反向引物的浓度为0.5-1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.25-0.5umol/L。

7.根据权利要求3-6任一所述的试剂盒，其中，正向引物浓度为1umol/L、反向引物的浓度为1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.5umol/L。

8.根据权利要求2-7任一所述的试剂盒，其中，Taq DNA聚合酶的浓度为1-8U/反应，逆转录酶的浓度为50-400U/反应。

9.根据权利要求2-8任一所述的试剂盒，其中，Taq DNA聚合酶的浓度为5U/反应，逆转录酶的浓度为100U/反应。

10.根据权利要求5-9任一所述的试剂盒，其中，RT-PCR扩增反应液中的RNA酶抑制剂的浓度为5-40U/反应，dNTPs的浓度为0.1-0.25mmol/L/反应。

11.根据权利要求5-10任一所述的试剂盒，其中，RT-PCR扩增反应液中的RNA酶抑制剂的浓度为20U/反应，dNTPs的浓度为0.2mmol/L/反应。

12.根据权利要求1-11任一所述的试剂盒，其中，RT-PCR扩增的反应条件为：37℃60min，94℃ 5min；PCR反应条件为94℃ 5min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1s，共30个循环。

13.根据权利要求1-12任一所述的试剂盒，其特征还在于：检测样本选自大便样品、肛样品、含大便或肛样品的抽提液或培养上清液。

14.一种用于检测诺如病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-7)中任一个：

1)Ⅰ型诺如病毒正向引物NoV Ⅰ-F：CGYTGGATGCGNTTYCATGA；

2)Ⅰ型诺如病毒反向引物NoV Ⅰ-R：CTTAGACGCCATCATCATTYAC；

3)Ⅰ型诺如病毒寡核苷酸探针NoV Ⅰ-P：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA；

4)Ⅱ型诺如病毒正向引物NoV Ⅱ-F：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG；

5)Ⅱ型诺如病毒反向引物NoV Ⅱ-R：TCGACGCCATCTTCATTCACA；

6)Ⅱ型诺如病毒寡核苷酸探针NoV Ⅱ-P：TGCTTGCACGCTACGATCTA；

7)1)～6)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；

15.权利要求14所述的寡核苷酸组合物在制备检测诺如病毒的试剂中的应用。

16.权利要求15所述应用，其中所述诺如病毒为I型和/或Ⅱ型诺如病毒。

17.权利要求15或16所述应用，其中所述试剂为用于实时荧光RT-PCR的试剂。