CN113930545A - 一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明的一种诺如病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法，包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液，诺如病毒反应液为预分装至八连管中的冻干粉。其中，诺如病毒反应液中含有多条不同荧光标记的探针、引物、酶混合物、增强剂、冻干保护剂、10xbuffer、核苷酸混合物等，可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病毒。通过内源性内参对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对诺如病毒在核酸水平上的检测。

Description

一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及诺如病毒核酸检测技术领域，尤指一种诺如病毒核酸检测试剂 盒及其使用方法。
背景技术
诺如病毒(Norovirus，NV)是引起肠道急性病症的RNA病毒，根据RNA 多聚酶区核苷酸序列的相似性，将NV分为5个基因型(GI～GV)，其中只有 GI、GⅡ和GIV可以感染人。诺如病毒已被很多国家认为是导致成人和儿童病 毒性腹泻及肠胃炎的首要病原体，以手-粪-口为主，其次是直接接触传染，我 国流行的人类诺如病毒主要以基因组Ⅱ为主。感染临床表现为急性胃肠炎和渗 透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重 出现脱水症状。诺如病毒多在寒冷的冬季发病，所以又被称为冬季呕吐症。因 为其不能在细胞或组织中培养，对诊断工作带来了一定的困难。
经过检索，中国发明专利：腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应 用(申请号为201710503230.3，申请日为2017.06.27)，该申请案公开了一种 腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用。检测体系共有22对引物，其 中包括19对腹泻病原体、2对人基因组内参和1对系统质控内参引物。腹泻病 原体分别针对空肠弯曲菌、志贺菌、艰难梭菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、 肠产毒性大肠埃希菌、大肠埃希菌O157、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、人星状 病毒、诺如病毒II、人肠道腺病毒、轮状病毒等。可在同一反应体系内直接对 粪便样本进行多种腹泻病原体的同步检测和分析，弥补了常规检测方法通量低、 耗时长和检出率低等缺点，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学 诊断，为个体化用药和精准医疗提供重要参考。但是该申请案针对多种引起腹 泻的病原体(包括细菌和病毒)进行检测，所用方法为毛细管电泳，通过引物 设计，不同的病原体可扩增不同长度的DNA片段，将扩增产物从PCR仪取出 后转移至毛细管电泳分析仪中分析扩增片段长度，不同长度DNA片段电泳速 度不同，从而区分不同的病原体。该申请案的不足之处：1.引物设计复杂，引 物合成成本较高。2.检测过程耗时较长，需先提取核酸，再PCR扩增，再毛 细管电泳分析片段长度进而分析可能感染的病原体。3.如若引物设计不够合理， 不同目的基因扩增片段长度相差过小，则会因为电泳中的漂移问题，无法有效 判断扩增片段的大小，进而带来检测误差。4.该方法仅包含诺如GⅡ型扩增引物， 因此无法检测其他型别的诺如病毒。而目前不管是从临床个性化诊治还是国家 疾控传染病监测需要，均需监测并区分常见患者所感染的诺如病毒型别。
发明内容
本发明提供一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法，将针对检测诺如 GⅠ型和GⅡ型病毒检测并对其分型鉴定的效率慢、容易产生误差以及成本高的 的技术问题。
本发明提供的技术方案如下：一种诺如病毒核酸检测试剂盒，包括诺如病 毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
优选地，所述诺如病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、 增强剂、冻干保护剂、诺如病毒GⅠ上游引物、诺如病毒GⅠ下游引物、诺如病 毒GⅠ探针P1、诺如病毒GⅠ探针P2、诺如病毒GⅡ上游引物、诺如病毒GⅡ下 游引物、诺如病毒GⅡ探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内 参β-actin探针。
优选地，所述检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，所述检测靶标位 于诺如病毒GII型的ORF基因。
优选地，所述阳性对照液为诺如病毒病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒 的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
优选地，所述诺如病毒GⅠ型上游引物的序列为GCTAGTGGCGCTGGTCA；
所述诺如病毒GⅠ型下游引物的序列为ATTAACTTGTCCAGCAGTCGC；
所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列为：
AATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGACA；
和/或；
所述所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列为：
TATGAGGAGGTGGCCATTG；
所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列为CCGGATCTTGGCCTCCT；
所述诺如病毒GⅡ型探针的序列为：
CAGGGCGACCGAGGAAGACTTCTGTGAAG。
优选地，所述诺如病毒GⅠ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修 饰碱；
所述诺如病毒GⅠ型下游引物序列中的第15位碱基C为锁核酸修饰碱基；
所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列中的第7为碱基T为修饰荧光基团，第18 位碱基G修饰淬灭基团，第28位A碱基为磷酸化碱基；
所述诺如病毒GⅠ探针P2的序列中的5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭 基团；
和/或；
所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列中的第11位碱基T为锁核酸修饰碱 基；
所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列中的第7位碱基C为锁核酸修饰碱基；
所述诺如病毒GⅡ型探针序列中的5’端修饰荧光基团，第15位碱基A修饰 淬灭基团，第29位碱基G修饰淬灭基团。
优选地，所述诺如病毒GⅠ探针P1中所述T碱基修饰的荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种；
所述诺如病毒GⅠ探针P1中G碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、 BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种；
所述诺如病毒GⅠ探针P2中5’端修饰的荧光基团与T碱基修饰的荧光基团 相同；所述诺如病毒GⅠ探针P2中3’端修饰的淬灭基团与G碱基修饰的荧光 淬灭基团相同。
优选地，所述诺如病毒GⅡ型探针的5’端修饰荧光基团可与GⅠ探针P1的 荧光基团相同时，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII通用型检测试剂盒；
所述诺如病毒GⅡ型探针的5’端修饰荧光基团与GⅠ探针P1的荧光基团不 同，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII分型检测试剂盒。
优选地，所述内参上游引物的序列为CTGGCACCACACCTTCTACAA；
所述内参下游引物的序列为AAACATGATCTGGGTCATCTTCT；
所述内参探针的序列为CCGTGCTGCTGACCGAGGCCC，其中，第6位 碱基C修饰荧光基团，15位碱基G修饰为淬灭基团，第21位碱基C为磷酸化 碱基。
优选地，所述诺如病毒反应液中的所包含的酶混合物包括如下组分：
UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/ μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL； 和/或；
所述诺如病毒反应液中的所包含的增强剂组合包括如下组分，MnCl2 1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨 0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L。
和/或；
所述诺如病毒反应液中的所包含的冻干保护剂包括如下组分，BSA 0.6-1.0g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；
和/或；
所述诺如病毒反应液中所包含的10xBuffer如下，Tris-HCl10-50mM，KCl 100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
和/或；
所述诺如病毒反应液中所包含的核苷酸混合液如下，dATP，dGTP，dUTP 和dCTP分别为0.1-0.5mM。
本发明还公开了一种诺如病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，使 用上述所述所述的试剂盒，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振 荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有诺如病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样 本、阳性对照和阴性对照核酸各25μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S300得到的PCR反应管放置在荧光 定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、判断样本检测结果。
具体判断方式如下：
Figure BDA0003294214200000051
优选地，所述步骤S300中的诺如病毒反应液预分装冻干八连管包含了荧 光PCR扩增所需的全部组分。
优选地，所述步骤S300中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环 参数如下：
Figure BDA0003294214200000061
与现有技术相比，本发明提供的一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方 法具有以下有益效果：
1、本发明的试剂盒包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。组 分简单，试剂盒仅含有3部分；使用方便，反应程序快速简单，仅需30min即 可完成扩增，加上提取10min，从获得样本到得到检测结果，40min内即可完 成全部检测。
2、本发明的引物探针中含有多条不同修饰方式、不同荧光标记的探针、 引物，引物中个别碱基通过锁核酸的修饰，即将核糖的2′-O位和4′-C位通 过特定的的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形, 这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性，降低 与互补碱基的结合自由能，从而稳定互补结构。通过该技术，人为调整引物探 针结合自由能分布使得结合自由能呈正弦分布，不仅提高引物与模板结合的稳 定性，同时大大提高了特异性。本发明中的探针有多种修饰方式，多种修饰的 目的在于尽可能降低探针自身的本底信号值，提高检测的灵敏度。
3、本发明可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病毒GI型和GII型。 根据GI型的探针与GII型的探针标记是否一致可将本试剂盒设置为通用型检 测试剂或分型检测试剂，在实际制备试剂盒的时候可以根据具体的需要进行探 针标记的选择，方便快捷。
4、本发明的诺如病毒反应液中的酶混合液含有逆转录酶，Tth DNA聚合 酶，VentDNA聚合酶，Taq酶，Vent酶扩增效率明显高于Taq酶，有利于在扩 增初始阶段快速累积PCR产物，并在此基础上有Taq酶进一步发挥Taqman探 针切割作用，给出扩增信号，从而提高反应灵敏度，Tth DNA聚合酶兼有逆转 录酶和DNA聚合酶的活性，且热稳定性好，Tth酶因高温变性而失活，且本反 应体系含有Mn2+离子，Tth酶在延伸过程中可继续进行逆转录，从而在扩增过 程中适当引入逆转录，充分利用RNA模板，从而提高逆转录和扩增效率。经 过大量配比及浓度优化后，试剂检测诺如病毒的灵敏度得到显著提升。
5、本发明的诺如病毒反应液中的增强剂含有MnCl2 1.0-3.0g/L，SSB单链 结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠 0.06-0.1g/L，，其中，MnCl2和氯化四甲氨有助于提高扩增效率，SSB单链结 合蛋白有助于稳定单链结构，焦磷酸酶有助于消除PCR过程生成的焦磷酸，从 而提高PCR的持续性。经过大量配比及浓度优化后得到本发明所述的试剂盒， 试剂检测诺如病毒的信号值及灵敏度得到显著提升。
6、本发明的诺如病毒反应液中含有冻干保护剂，其成为含有BSA 0.8g/L， 明胶1％，山梨醇糖1％，精氨酸1.0g/L，葡聚糖1.0g/L，海藻糖1.0g/L，其中， BSA和明胶有助于提高酶热稳定性和冻融稳定性，增强PCR的持续性，精氨 酸，山梨糖醇，葡聚糖和海藻糖有助于提高酶的冻融稳定性和构象。且相对于 其他PCR试剂，热稳定性显著提高。
7、本发明的诺如病毒反应液预分装且冻干入八连管，开封后可直接加入 提取好的核酸进行上机检测。省事，省时，省力，由于加入核酸体积量大，故 灵敏度高。
8、本发明试剂盒为内源性内参，可对样本采集、核酸提取、扩增和检测 整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基 团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告 基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶 (5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号， 从而实现对诺如病毒在核酸水平上的检测。
9、本发明通过酶混合物和增强剂组合，使得试剂盒灵敏度显著提高，各 靶标灵敏度均可达50copies/mL，且检测时间大大缩短，整个检测过程仅需30 分钟；通过冻干保护剂，使得试剂盒热稳定性显著增加，可于37℃稳定储存1 个月，从而减少对低温运输和储存的依赖。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种诺如病毒 核酸检测试剂盒及其使用方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以 进一步说明。
图1为本发明作为GI型和GII型分型试剂的检测效果图；
图2为通用型试剂盒检测74例检测限浓度(50copies/mL)样本的检测效 果图；
图3为通用型试剂盒检测2例GI型不同浓度样本，每个样本重复检测10 次的精密度效果图；
图4为通用型试剂盒检测2例GII型不同浓度样本，每个样本重复检测10 次的精密度效果图；
图5为不同浓度UNG酶检测含GI型dUTP产物的对比效果图；
图6为不同浓度UNG酶检测含GII型dUTP产物的对比效果图；
图7为不同酶体系对GI型样本扩增效率影响的对比效果图；
图8为不同酶体系对GII型样本扩增效率影响的对比效果图；
图9为GⅠ不同引物探针修饰方法体系对扩增效率影响的对比效果图；
图10为GⅡ不同引物探针修饰方法体系对扩增效率影响的对比效果图；
图11为诺如病毒反应液中是否含有增强剂对GI型样本扩增效率影响的对 比效果图；
图12为诺如病毒反应液中是否含有增强剂对GII型样本扩增效率影响的对 比效果图；
图13为预分装在八连管中的冻干诺如病毒反应液37℃放置30天检测GI 型效果图。
图14为预分装在八连管中的冻干诺如病毒反应液37℃放置30天检测GII
具体实施方式
本发明提供一种诺如病毒核酸检测试剂盒，包括诺如病毒反应液、阳性对 照液和阴性对照液。
其中，所述诺如病毒反应液包括诺如病毒GⅠ上游引物、诺如病毒GⅠ下游 引物、诺如病毒GⅠ探针P1、诺如病毒GⅠ探针P2、诺如病毒GⅡ上游引物、诺 如病毒GⅡ下游引物、诺如病毒GⅡ探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下 游引物和内参β-actin探针。
其中，诺如病毒反应液还包括酶混合物、核苷酸混合物，Buffer、增强剂、 冻干保护剂和DEPC水。
具体的，诺如病毒反应液中的所包含的酶混合物包括如下组分：UNG酶 1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶 2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；。
增强剂包括如下组分：MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L， 焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L。
冻干保护剂包括如下组分：BSA 0.8g/L，明胶1％，山梨醇糖1％，精氨酸 1.0g/L，葡聚糖1.0g/L，海藻糖1.0g/L；
10xBuffer如下，Tris-HCl10-50mM，KCl 100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
核苷酸混合液如下，dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
具体实施时，诺如病毒反应液的具体配方具体如表1所示：
Figure BDA0003294214200000101
Figure BDA0003294214200000111
表1
其中，阳性对照液包括诺如病毒病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒和TEBuffer，阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
其中，检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，检测靶标位于诺如病毒 GII型的ORF基因；
检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，诺如病毒GⅠ型上游引物的序列 为GCTAGTGGCGCTGGTCA，其中，列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱； 诺如病毒GⅠ型下游引物的序列为ATTAACTTGTCCAGCAGTCGC，其中，序 列中的第15位碱基C为锁核酸修饰碱基；诺如病毒GⅠ探针P1的序列为 AATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGACA，其中，序列中的第7为碱基T为修饰荧光基团，第18位碱基G修饰淬灭基团，第28位A碱基为磷酸化碱基； 诺如病毒GⅠ探针P1的T碱基标记的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、 ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种，并且G碱基修饰一种荧光淬 灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。 诺如病毒GⅠ探针P2的序列为AATGGATCCTGTAGCGGGTCCCTCGACA，5’ 端修饰荧光基团，与GⅠ探针P1修饰荧光基团相同。3’端修饰淬灭基团，与 GⅠ探针P1的淬灭基团相同。
检测靶标位于诺如病毒GII型的ORF基因，诺如病毒GⅡ型上游引物的序 列为TATGAGGAGGTGGCCATTG，其中，序列中的第11位碱基T为锁核酸 修饰碱基；诺如病毒GⅡ型下游引物的序列为CCGGATCTTGGCCTCCT，其中， 序列中的第7位碱基C为锁核酸修饰碱基；诺如病毒GⅡ型探针的序列为 CAGGGCGACCGAGGAAGACTTCTGTGAAG，其中，5’端修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第29位碱基G修饰淬灭基团，该探针为双淬灭探 针。
内参上游引物的序列为CTGGCACCACACCTTCTACAA，内参下游引物的 序列为AAACATGATCTGGGTCATCTTCT，内参探针的序列为 CCGTGCTGCTGACCGAGGCCC，其中，第6位碱基C修饰荧光基团，第15 位碱基G修饰为淬灭基团，第21位碱基C为磷酸化碱基，值得注意的是，内 参探针的修饰荧光基团与诺如病毒GⅠ探针P1和诺如病毒GII探针不同。
内参引物的TM值在55-60℃之间，GC含量在30-80％，两条引物的TM 值差异小于5℃；扩增长度50-150bp之间；引物3’末端自身错配小于3bp；引 物在非靶标序列中，无特异结合位点，或特异结合区域大于1000bp。探针的 TM值在60-70℃之间，GC含量在30-80％；探针的5’端第一个碱基不能为G； 探针无大于3bp的发夹结构。
本实施例修饰的的内参是对样本本身内参的检测，在样本中含有天然的人 脱落细胞，因此含有大量的内参基因，由于内参基因独立于诺如病毒，因此无 论样本中是否含有诺如病毒，其内参均为阳性。本实施例修饰的内参会参与样 本采集到RT-PCR的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程 和扩增过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现，而现有的呼吸道病毒检测 试剂中的内参为外源的含有内参基因片段的慢病毒，不参与提取，只参与扩增， 这样只能指示扩增的结果是否正常，完全不能避免样品采集，保存运输和核酸 提取过程有误而导致的阴性结果的出现。
本发明还提供一种诺如病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，包括 如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振 荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有诺如病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样 本、阳性对照和阴性对照核酸各25μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S300得到的PCR反应管放置在荧光 定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、判断样本检测结果。
具体判断步骤如下表：
Figure BDA0003294214200000131
其中步骤S300中的诺如病毒反应液为预分装冻干粉。
步骤S400中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
Figure BDA0003294214200000132
采用实时荧光PCR技术，实时荧光PCR技术在同一反应体系中加入一条 或多条不同荧光标记的探针和引物(具体的，针对诺如病毒的探针标记FAM， 针对内参基因的探针标记ROX)，可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病 毒以及通过内参对样本整个过程进行监控，避免假阴性结果的误判。探针为包 括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠 近报告基团而极大地抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针 被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧 光信号，从而实现对诺如病毒在核酸水平上的检测。
PCR反应过程中，若待检样本包含诺如病毒，则标记FAM的探针产生荧 光信号。另外，每个反应中含有内参基因，则标记的ROX的探针应产生荧光 信号，用于检测仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素等。
实施例2
诺如病毒的分型效果验证：若将诺如病毒GI型(FAM荧光基团标记，BHQ1 淬灭基团标记)与GII型(VIC荧光基团标记，BHQ1淬灭基团标记)探针设 置通道不同，试剂盒可开发为为诺如病毒GI型和GII型分型检测试剂，针对 10号样本(源自上海疾控中心的GI型感染的灭活临床样本，编号10)和11 号样本(源自上海疾控中心的GII型感染的灭活临床样本，编号11)进行检测， 针对GI型和GII型扩增曲线在不同荧光通道上分别对应显示，说明通过对应 与标记探针的荧光通道，可有效区分出GI型和GII型，结果如图1。
实施例3
临床样本的检测限和精密度验证：将诺如病毒GI型与GII型探针设置通 道相同，试剂盒设置为诺如病毒GI型和GII型通用型检测试剂，针对74例临 床样本(源自上海疾控中心的GI型和/或GII型灭活临床样本，编号1-74，表 2)，并稀释至50copies/mL(检测限浓度)后进行检测。由表2检测结果可知， 本发明试剂盒可有效检出检测限浓度的诺如病毒GI型和GII型样本，检出率 为100％，说明其针对临床样本的检测限可达50copies/mL，其检测限结果如图 2所示。将10-20号样本分别稀释至100copies/mL(低浓度)和105copies/mL(高浓度)，其扩增曲线无异常，Ct值的CV分别为0.8％和0.6％，均小于5％， 说明其精密度合格，其检测结果如图3所示。
序号 检测结果 分型结果 序号 检测结果 分型结果
1 阳性 NVGⅡ型 38 阳性 NVGⅠ型
2 阳性 NVGⅡ型 39 阳性 NVGⅡ型
3 阳性 NVGⅡ型 40 阳性 NVGⅡ型
4 阳性 NVGⅠ型 41 阳性 NVGⅡ型
5 阳性 NVGⅠ&Ⅱ型 42 阳性 NVGⅠ&Ⅱ型
6 阳性 NVGⅡ型 43 阳性 NVGⅡ型
7 阳性 NVGⅠ型 44 阳性 NVGⅡ型
8 阳性 NVGⅡ型 45 阳性 NVGⅡ型
9 阳性 NVGⅡ型 46 阳性 NVGⅡ型
10 阳性 NVGⅠ型 47 阳性 NVGⅡ型
11 阳性 NVGⅡ型 48 阳性 NVGⅡ型
12 阳性 NVGⅠ型 49 阳性 NVGⅡ型
13 阳性 NVGⅡ型 50 阳性 NVGⅡ型
14 阳性 NVGⅡ型 51 阳性 NVGⅠ型
15 阳性 NVGⅡ型 52 阳性 NVGⅡ型
16 阳性 NVGⅡ型 53 阳性 NVGⅡ型
17 阳性 NVGⅡ型 54 阳性 NVGⅡ型
18 阳性 NVGⅠ型 55 阳性 NVGⅡ型
19 阳性 NVGⅡ型 56 阳性 NVGⅡ型
20 阳性 NVGⅡ型 57 阳性 NVGⅡ型
21 阳性 NVGⅠ型 58 阳性 NVGⅠ&Ⅱ型
22 阳性 NVGⅡ型 59 阳性 NVGⅡ型
23 阳性 NVGⅡ型 60 阳性 NVGⅡ型
24 阳性 NVGⅡ型 61 阳性 NVGⅡ型
25 阳性 NVGⅡ型 62 阳性 NVGⅡ型
26 阳性 NVGⅠ&Ⅱ型 63 阳性 NVGⅡ型
27 阳性 NVGⅠ型 64 阳性 NVGⅠ型
28 阳性 NVGⅡ型 65 阳性 NVGⅡ型
29 阳性 NVGⅠ型 66 阳性 NVGⅡ型
30 阳性 NVGⅡ型 67 阳性 NVGⅡ型
31 阳性 NVGⅡ型 68 阳性 NVGⅡ型
32 阳性 NVGⅡ型 69 阳性 NVGⅠ&Ⅱ型
33 阳性 NVGⅡ型 70 阳性 NVGⅡ型
34 阳性 NVGⅡ型 71 阳性 NVGⅡ型
35 阳性 NVGⅡ型 72 阳性 NVGⅠ型
36 阳性 NVGⅠ型 73 阳性 NVGⅡ型
37 阳性 NVGⅡ型 74 阳性 NVGⅡ型
表2
实施例4
特异性验证(交叉反应)：本发明检测其他病原体的特异性检测效果如下 表3。检测其他常见病原体均为阴性。
Figure BDA0003294214200000151
Figure BDA0003294214200000161
表3
特异性验证(抗干扰)：试剂盒检测对照组和分别加入不同干扰物质进行 检测，对于诺如病毒GI型样本，加入干扰物质与对照组(不加干扰物质)的 对比检测结果见下表4。结果表明，诺如病毒GI型样本中含有下表中的干扰物 质时，对试剂盒检测无干扰，表明试剂盒抗干扰能力较强。
Figure BDA0003294214200000162
Figure BDA0003294214200000171
表4：诺如病毒GI型干扰物质研究实验数据
特异性验证(抗干扰)：试剂盒检测对照组和加入不同干扰物质，对于诺 如病毒GII型样本，与对照组不加干扰物质的对比检测结果见下表5。结果表 明，诺如病毒GII型样本中含有下表中的干扰浓度，对试剂盒检测无干扰。
Figure BDA0003294214200000172
表5诺如病毒GII型干扰物质研究实验数据
实施例5
UNG酶防污染效果验证：在检测体系中加入不同浓度的UNG酶：浓度1 (4.0U/μL)、浓度2(6.0U//μL)、浓度3(最佳浓度)(5.0U/μL)，以1× 104copies/mL的含dU的产物为模板进行扩增，结果显示，浓度3UNG酶无扩 增曲线，表明5U/μL的UNG酶能够消除不高于1×104copies/mL的产物的污染， 起到防污染的效果，检测结果见图4。
实施例6
酶混合物对扩增效率的影响的验证：设置4种不同的DNA聚合酶组合方 式，分别为体系中加入Taq酶+Tth酶(组合1)、Taq酶+Vent酶+Tth酶(组 合2)、Taq酶+Vent酶(组合3)、仅含Taq酶(组合4)4种组合，对比检测 诺如阳性样本，对比检测结果如下图5所示。从图5中可知，体系中同时加入 Taq酶、Vent酶和Tth酶时，反应体系扩增效果最佳。
实施例7
引物探针修饰对扩增效率的影响的验证：本实施例中设置3种不同引物探 针的修饰方法组合，进行对比评价，以诺如病毒GI和GII型引物探针的修饰 组合为例进行案例实施，修饰组合方法见下表6和表7。
Figure BDA0003294214200000181
表6
3种修饰组合对比来看，修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于 其他修饰方法，以诺如病毒GI型引物探针的不同修饰方式下的检测结果见图6。
由图6可知，本申请的修饰方法极大改善了体系扩增的效率问题，提升检 测灵敏度和信号值。
Figure BDA0003294214200000191
表7
3种修饰组对比来看，修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于其 他修饰方法，以诺如病毒GII型引物探针的不同修饰方式下的检测结果见图7。
由图7可知，本申请的修饰方法极大改善了体系扩增的效率问题，提升检 测灵敏度和信号值。
实施例8
增强剂对扩增效率的影响的验证：本实施例中含有增强剂，具有增强诺如 病毒反应液稳定性的效果，同时也可显著提高灵敏度及信号值。具体的如图8 所示，实施方案中去除增强剂和加入增强剂的对比效果图，可明显看到无论高 浓度样本还是低浓度样本，增强剂均有显著提升效果。
实施例9
预分装冻干工艺对试剂盒稳定性的影响的验证：本实施例中诺如病毒反应 液为预分装在冻干八连管中的冻干粉，具有操作简便，上样量大的效果，稳定 性更强，置于37℃条件下可稳定保存30天。具体如图9所示，分别对高浓度 样本和低浓度样本进行检测，实施方案中将预分装在冻干八连管中的冻干粉置 于37℃条件下储存30天，与正常冻存于-20℃条件保存的冻干粉的检测效果对 比。
预分装在八连管中的冻干诺如病毒反应液分别在37℃和-20℃下保存30 天，对比检测3例临床样本的检测效果对比，从下表8的结果中可以看出，检 测冻干粉在37℃条件下放置30天与第0天无差异，与-20℃条件下放置30天 也无差异。表明预分装在八连管中的冻干诺如病毒反应液37℃条件下储存的稳 定性良好。
Figure BDA0003294214200000201
表8
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明 的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离 本发明原理的前提下，还可以做出若干和润饰，这些改进和润饰也应视为本发 明的保护范围。

Claims (13)

1.一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
2.根据权利要求1所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述诺如病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、诺如病毒GⅠ上游引物、诺如病毒GⅠ下游引物、诺如病毒GⅠ探针P1、诺如病毒GⅠ探针P2、诺如病毒GⅡ上游引物、诺如病毒GⅡ下游引物、诺如病毒GⅡ探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针。
3.根据权利要求2所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，所述检测靶标位于诺如病毒GII型的ORF基因。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为诺如病毒病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
5.根据权利要求4所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述诺如病毒GⅠ型上游引物的序列为GCTAGTGGCGCTGGTCA；
所述诺如病毒GⅠ型下游引物的序列为ATTAACTTGTCCAGCAGTCGC；
所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列为：
AATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGACA；
和/或；
所述所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列为：
TATGAGGAGGTGGCCATTG；
所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列为CCGGATCTTGGCCTCCT；
所述诺如病毒GⅡ型探针的序列为：
CAGGGCGACCGAGGAAGACTTCTGTGAAG。
6.根据权利要求5所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述诺如病毒GⅠ型上游引物序列中的第10位碱基G为锁核酸修饰碱；
所述诺如病毒GⅠ型下游引物序列中的第15位碱基C为锁核酸修饰碱基；
所述诺如病毒GⅠ探针P1的序列中的第7为碱基T为修饰荧光基团，第18位碱基G修饰淬灭基团，第28位A碱基为磷酸化碱基；
所述诺如病毒GⅠ探针P2的序列中的5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团；
和/或；
所述诺如病毒GⅡ型上游引物的序列中的第11位碱基T为锁核酸修饰碱基；
所述诺如病毒GⅡ型下游引物的序列中的第7位碱基C为锁核酸修饰碱基；
所述诺如病毒GⅡ型探针序列中的5’端修饰荧光基团，第15位碱基A修饰淬灭基团，第29位碱基G修饰淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述诺如病毒GⅠ探针P1中所述T碱基修饰的荧光基团为FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、CY3、HEX中的一种；
所述诺如病毒GⅠ探针P1中G碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种；
所述诺如病毒GⅠ探针P2中5’端修饰的荧光基团与T碱基修饰的荧光基团相同；所述诺如病毒GⅠ探针P2中3’端修饰的淬灭基团与G碱基修饰的荧光淬灭基团相同。
8.根据权利要求7所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述诺如病毒GⅡ型探针的5’端修饰荧光基团可与GⅠ探针P1的荧光基团相同时，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII通用型检测试剂盒；
所述诺如病毒GⅡ型探针的5’端修饰荧光基团与GⅠ探针P1的荧光基团不同，所述试剂盒作为诺如病毒GI和GII分型检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述内参上游引物的序列为CTGGCACCACACCTTCTACAA；
所述内参下游引物的序列为AAACATGATCTGGGTCATCTTCT；
所述内参探针的序列为CCGTGCTGCTGACCGAGGCCC，其中，第6位碱基C修饰荧光基团，第15位碱基G修饰为淬灭基团，第21位碱基C为磷酸化碱基。
10.根据权利要求2所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述诺如病毒反应液中的所包含的酶混合物包括如下组分：UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；；
和/或；
所述诺如病毒反应液中的所包含的增强剂组合包括如下组分，MnCl21.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L；
和/或；
所述诺如病毒反应液中的所包含的冻干保护剂包括如下组分，BSA 0.6-1。0g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；
和/或；
所述诺如病毒反应液中所包含的10xBuffer如下，Tris-HCl10-50mM，KCl100-1000mM，Mg2SO420-80mM；
和/或；
所述诺如病毒反应液中所包含的核苷酸混合液如下，dATP，dGTP，dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。
11.一种诺如病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于：使用权利要求1-11任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：
S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
S300、加样：取出装有诺如病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各25μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S300得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
S500、根据下述判定标准判断样本检测结果。
12.根据权利要求11所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于：所述步骤S300中的诺如病毒反应液预分装冻干八连管包含了荧光PCR扩增所需的全部组分。
13.根据权利要求12所述的一种诺如病毒核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于：所述步骤S300中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
Figure FDA0003294214190000041
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Address before: 201415 rooms 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307 and 1309, building 3, 1588, Huhang Road, Fengxian District, Shanghai

Applicant before: SHANGHAI BOJIE MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

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