CN108060213A

CN108060213A - 基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点用探针和试剂盒

Info

Publication number: CN108060213A
Application number: CN201810054152.8A
Authority: CN
Inventors: 马学军; 段素霞; 王佶; 张益�; 申辛欣; 何小周
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108060213B

Abstract

本发明提供了一种基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒，属于SNP位点检测技术领域。所述基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针，所述探针在重组酶介导的等温扩增法用探针的基础上，将四氢呋喃替换SNP位点的后一位碱基或SNP位点互补位点的后一位碱基，外切酶III酶解到四氢呋喃位点切割结束，切掉的荧光基团修饰的碱基在体系中产生荧光信号，余下的探针部分充当下游引物的作用。所述探针简化检测过程中必须下游引物组分，降低了探针与引物发生非特异性扩增。本发明提供了检测SNP位点的试剂盒，包括上游引物和所述的探针。所述试剂盒能够用于检测多种SNP位点。

Description

基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒

技术领域

本发明属于SNP位点检测技术领域，具体涉及基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，占所有已知多态性的90％以上。SNP位点是在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。随着人类基因组计划和HapMap计划的完成，使得单核苷酸多态性(SNP)成为了第三代遗传标志。人体的许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，及时了解个体的SNP差异可以指导临床对病人采取合适的用药与治疗。此外，随着SNP位点研究的越来越广泛，SNP位点在植物中广泛存在，并且作为分子标记与某些育种相关的抗性基因紧密连锁，通过检测SNP位点快速准确得到育种抗性品种的基因型，提供为育种工作提供便利。

目前，有许多方法被用来SNP的分型，如Taqman-MGB，直接测序，限制性片段长度多态性分析法，四引物扩增受阻突变体系PCR等。但是这些方法基本上全部依赖于PCR，费时，费力，而且需要复杂的仪器设备。

近来，等温扩增技术以其不需要温度循环仪器特别适合床旁检验(POCT)的特点吸引了国内外专家的关注。其中环介导等温扩增技术(LAMP)常被用于SNP的检测，但是由于其引物设计复杂，反应温度高达60℃的特点而限制了其应用。同时，也有利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)来检测肿瘤基因点突变的研究报道，但是通常需要借助肽核酸，内参等方法，反应复杂，而且灵敏度和特异度也不高。重组酶介导的等温扩增法(Recombinase aided amplification，RAA)是一种新型的等温扩增方法，RAA使用从细菌或真菌中获得的重组酶，在39℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物同样以指数级增长。通常在30min内可以完成检测。同样它也可以通过添加带有荧光标记的探针来检测产物的实时扩增。尽管RAA检测方法具有较高的灵敏度和特异度，但是传统的RAA检测方法依赖于设计一对扩增引物和一条探针，而且避免引物产生非特异性扩增及引物与探针的非特异性结合，这对引物和探针的要求较高，同时目前也尚无利用该方法做SNP位点研究的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒，所述探针既可以作为探针产生荧光信号使用，又可以作为引物使用，简化RAA检测方法所需引物组分。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针，所述探针的长度为46～52nt，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃替代，探针的5’端距四氢呋喃位点至少间隔30个碱基，3’端距四氢呋喃位点至少间隔15个碱基；所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点的3’端T碱基上，猝灭基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的T碱基与猝灭基团修饰的T碱基间隔2～5个碱基。

优选的，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点的下一位T碱基上。

优选的，所述猝灭基团修饰SNP位点的上一位T碱基上或修饰SNP位点互补碱基的上一位T碱基上。

优选的，所述荧光基团包括6-羧基荧光素或六氯-6-甲基荧光素；所述淬灭基团包括黑洞猝灭基团。

优选的，探针的3’末端碱基由磷酸盐阻滞剂修饰。

优选的，所述SNP位点为A或C；所述SNP位点互补碱基为T或G。

优选的，当检测SNP位点为MTHFRA1298C侧翼序列时，所述探针包括两条，分别具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，包括10～1000μmol/L的上游引物和10～1000μmol/L的权利要求1～7任意一项所述的探针。

优选的，所述上游引物具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

优选的，所述试剂盒还包括酶混合物、反应缓冲液、280mmol/L醋酸镁；所述酶混合物包括800ng/μL的单链结合蛋白，60ng/μL的噬菌体UvsX蛋白，50ng/μLDNA聚合酶和40ng/μL外切酶III。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针，所述探针在重组酶介导的等温扩增法用探针的基础上，将SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃替代，外切酶III从探针的3’端进行切割，到四氢呋喃位点切割中断，切掉的荧光基团修饰的碱基在体系中产生荧光信号，发挥探针的作用；余下的探针部分充当下游引物，当SNP位点或SNP位点互补碱基的探针与样品中SNP位点发生正确配对时，余下的探针作为下游引物进行扩增延伸，而不正确配对的碱基无法正常扩增。所述探针既可以作为探针产生荧光信号使用，又可以作为引物使用，减省了检测过程中必需下游引物组分，同时避免了探针与引物发生非特异性扩增。

同时本发明提供的探针打破了传统RAA检测方法中在上游引物的3’末端与SNP位点配对的设计思路，实现SNP位点特异性的检测，同时能够准确、快速得到样品的基因型。

进一步的，本发明提供的探针分别具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。所述探针能够准确检测MTHFR基因的SNP位点，同时判断MTHFRA1298C位点分型情况。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，包括10～1000μmol/L的上游引物和2条10～1000μmol/L的所述探针。所述探针配合上游引物对SNP位点进行检测，在模板拷贝数位于5×10³～1×10⁵时具有较高特异性。

附图说明

图1为本发明中PRAA探针设计原则示意图；

图2为实施例2中分别采用PRAA方法和直接测序法判读标本的基因型；其中图2-1为不同基因型样品在A反应中扩增情况；图2-2为不同基因型样品在C反应中扩增情况；图2-3为Sanger测序法对3个基因型样品的分型情况；

图3为实施例3中重组质粒在PRAA检测的准确度评估，其中图3-1为不同浓度的AA型质粒在A反应中的扩增情况；图3-2为不同浓度的CC型质粒在C反应中的扩增情况；图3-3为不同浓度的CC型质粒在A反应中的扩增情况；图3-4为不同浓度的AA型质粒在C反应中的扩增情况。

具体实施方式

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针，所述探针的长度为46～52nt，其中SNP位点或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃替代，探针的5’端距四氢呋喃位点至少间隔30个碱基，3’端距四氢呋喃位点至少间隔15个碱基；所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点的3’端T碱基上，所述猝灭基团修饰在SNP位点或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的碱基与猝灭基团修饰的碱基间隔2～5个碱基。

在本发明中，所述探针的设计思路见图1所示。在本发明中，所述探针的核苷酸序列是5’端向3’端方向排列。所述荧光基团修饰优选在四氢呋喃位点的下一位T碱基上。所述猝灭基团优选修饰SNP位点的上一位T碱基上或修饰SNP位点互补碱基的上一位T碱基上。

在本发明中，所述荧光基团优选包括FAM(6-羧基荧光素)或HEX(六氯-6-甲基荧光素)；所述淬灭基团包括BHQ(黑洞猝灭基团)。

在本发明中，探针的3’末端碱基优选由磷酸盐阻滞剂修饰。所述磷酸盐阻滞剂修饰的作用是防止聚合酶可能引导的扩增。

在本发明中，所述探针中荧光基团和淬灭基团修饰的碱基必须为T碱基上，依照模板正负链中SNP位点前后A和T碱基的分布情况，所述探针优选包括正向探针和反向探针。所述正向探针与模板的负链结合。所述正向探针中设计包含SNP位点。所述反向探针与模板的正链结合。所述反向探针中设计包含SNP位点互补位点。所述模板中SNP位点或SNP互补位点的前后存在A碱基就可以满足探针的构建。

在本发明中，当检测基因为MTHFRA1298C侧翼序列时，所述SNP位点表现为A/C多态性时，所述SNP位点互补碱基对应为T/G，且在SNP位点前后存在A碱基，满足反向探针的构建。检测MTHFRA1298C基因SNP位点用反向探针优选为具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。模板MTHFRA1298C侧翼序列具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。所述探针和上游引物的序列具体如下表1所示：

a.A,C反应所用的正向引物；b.反应的特异性探针；c.C反应的特异性探针；

d.探针的修饰:FAM(6-羧基荧光素)代表荧光基团；THF(四氢呋喃)；BHQ(黑洞猝灭基团)代表淬灭基团；

以检测MTHFRA1298C侧翼序列(SEQ ID No.4)为例，说明探针的反应原理。当样品中基因型为AA时，即发生A反应，分别向两个扩增反应体系中添加两个探针，添加A1298C-A-P的探针中SNP位点互补碱基为T，能够与模板中的A碱基互补配对，外切酶III切割到THF位点中断，余下的探针的3’端能够与模板严格互补配对，因此余下的探针作为下游引物进行延伸扩展，产生扩增曲线；而另一个体系中添加的A1298C-C-P探针，SNP位点互补碱基为G，不能与模板中SNP位点的A碱基严格互补配对，导致无法正常扩增，不能产生扩增曲线。当样品中基因型为CC时，发生C反应，添加A1298C-A-P的探针的体系无法正常扩增，而添加的A1298C-C-P探针的体系能够正常扩增，产生扩增曲线。当样品的基因型为AC时，两个体系中分别发生A反应和C反应，产生两个扩增曲线。因此，根据扩增曲线的有无及使用的探针种类判断基因型。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，包括10～1000μmol/L的上游引物和10～1000μmol/L的所述探针。

在本发明中，所述上游引物与所述探针以不同正负链的模板设计得到，即当所述探针以负链作为模板设计时，所述上游引物以正链为模板设计得到。本发明对所述设计引物的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物设计方法即可。本发明对所述上游引物的合成没有特殊限制，委托本领域所熟知的引物合成公司即可。在本发明实施例中，所述探针委托上海生工生物工程股份有限公司合成。所述上游引物的浓度优选为50～500μmol/L，更优选为100μmol/L。当检测MTHFRA1298C侧翼序列的SNP位点时，所述上游引物优选具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述试剂盒包括所述探针。所述探针的浓度独立优选为50～500μmol/L，更优选为100μmol/L。所述探针为两条，优选独立分装。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括酶混合物、反应缓冲液和280mmol/L醋酸镁；所述酶混合物包括800ng/μL的单链结合蛋白，60ng/μL的噬菌体UvsX蛋白，50ng/μLDNA聚合酶和40ng/μL外切酶III。本发明对所述酶混合物、反应缓冲液和醋酸镁的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶混合物、反应缓冲液和醋酸镁的来源即可。在本发明实施例中，所述酶混合物、反应缓冲液和醋酸镁分别购自江苏奇天基因公司生产的RAAExo kit试剂盒。

所述试剂盒的检测原理是在传统的RAA检测方法的基础上进行了改进，利用未水解的部分探针作为下游引物扩增，得到一种新的检测方法，即探针导向的重组酶介导的等温扩增法(PRAA)。

在本发明中，所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)将酶混合物、反应缓存液、无核酶水、醋酸镁、模板DNA和上游向引物进行混合，将得到的混合液均分成3份，分别向2份混合液中各加入一种探针，向另一份混合液中加入无核酶水作为对照；

2)将3份混合液进行等温扩增，得到扩增情况。

在本发明中，所述酶混合物的质量和反应缓存液、无核酶水、醋酸镁、模板DNA和正向引物的体积比优选为142.5μg：75μL：51μL：7.5μL：6μL：6.3μL。所述模板DNA的浓度优选为10～75ng/μL。所述正向引物的浓度优选为10μmol/L。所述醋酸镁的浓度优选为280mmol/L。

所述等温扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的等温扩增用仪器即可。在本发明实施例中，所述等温扩增用仪器为江苏奇天公司生产的QT-RAA-F7200荧光检测仪。所述等温扩增的温度优选为39℃。所述等温扩增的时间优选为35min。

在本发明中，本发明提供的试剂盒检测与疾病不相关的SNP位点。

在本发明中，所述疾病不相关的SNP位点包括辣椒素合成酶CS A267T，T618A，G679C。

下面结合实施例对本发明提供的基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

通过美国国立生物技术信息中心(National center for BiotechnologyInformation，NCBI)的dbSNP数据库获得MTHFRA1298C SNP位点的侧翼序列，使用Oligo7.37软件，根据RAA方法的设计原则设计适用于该方法的一条引物和两条探针。同时，除了RAA的设计原则外我们要求该SNP位点要刚好位于探针THF位点的前一位，如图1所示。所有引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，高效液相色谱法纯化。PRAA引物和探针如表1所示。

表1 PRAA引物与探针

a.A,C反应所用的正向引物

b.A反应的特异性探针

c.C反应的特异性探针

d.探针的修饰:FAM,6-Carboxyfluorescein(6-羧基荧光素)；THF，tetrahydrofuran(四氢呋喃)；BHQ，blackhole quencher(荧光猝灭集团)；C3-spacer，3′phosphateblocker(磷酸盐阻滞剂)。

实施例2

1、临床标本的收集

于2016年至2017年收集河北省儿童心脏外科住院的CHD儿童150名，其中男72名，女78名，年龄1月～14岁。采用天根生化科技(北京)有限公司生产的天根生化血液基因组DNA提取试剂盒提取标本的全血DNA，采用150μL的无核酶水溶解基因组DNA,并放入-20℃保存待用。所得标本的DNA浓度范围为10–75ng/μL。本研究经河北省儿童医院医学伦理委员会批准，患儿父母均签署了知情同意书。

2、对150例临床标本进行PRAA检测

采用江苏奇天基因公司生产的RAAExo kit试剂盒。A、C反应均在一个0.2ml的反应管中进行，该管包括了预先进行冻干的酶混合物(SSB,UvsX,DNA polymerase,ExonucleaseIII),然后加入25μL反应缓存液，17ul无核酶水，2.1μL正向引物(10μM)，1.4μL相应特异性反向探针(10μM)，2μL模板(10–75ng/μL)，2.5μL醋酸镁(280mM)。配液完成后转入到江苏奇天公司生产的QT-RAA-F7200荧光检测仪上进行检测，39℃条件下反应35min。每次反应均由无核酶水作为阴性对照。

3、PRAA的结果及分析

A和C反应的阳性荧光阈值均定为了500(mv)，反应时间为35min。这样，当一个标本其A和C反应均为阳性时，则它相应的基因型为AC型，反之如果仅有一个管为阳性，那么则为相应的纯合子(AA或CC型)。

对比例1

对150例临床标本进行直接测序

采用TaKaLa Ex TaqHot StartVersion(大连宝生物工程有限公司)的PCR试剂盒，配置25μl的PCR反应体系，其中包含无核酶水16.375μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，dNTP 2μl，Taq酶0.125μl，相应的上下游引物各1μl(10μmol/L)，模板2μl(50-150ng/μl)。PCR反应条件：95℃预变性3min；进入循环：95℃变性30s，60℃45s，50个循环；最后4℃保存。对全部样本PCR后进行Sanger测序(上海生工生物工程股份有限公司)。

PRAA和直接测序法的结果比较如下：

结果见图2。由图2可知，除了两例样本由于核酸浓度太低(<10ng/μL)导致A、C管检测均失败外，其余148例临床标本经PRAA检测后所得结果与Sanger测序法100％相符，特异性强，无SNP位点发生通读与误判。PRAA判读3个拥有不同基因型的标本结果如图2-1，图2-2所示。Sanger测序法判读该3个标本的分型情况如图2-3所示。

实施例3

为了进一步探究样本浓度对PRAA方法特异性的影响，我们构建了两个分别携带有该位点AA型和CC型纯合子的质粒，分别对其进行了一系列的稀释，包括了10⁷,10⁶,10⁵,5*10⁴,10⁴,5*10³,10³,5*10²,10²拷贝/反应，然后分别用PRAA方法(A和C反应)进行了检测。

利用AA型质粒来探索A反应的灵敏度和C反应的特异度，利用CC型质粒来探索A反应的特异度和C反应的灵敏度。对于质粒来说，我们发现A，C反应所能检测到的模板下限均在5*10³拷贝每反应，(图3-1和图3-1)。当错配的模板量达到105个拷贝每反应时会出现非特异的扩增(图3-3和图3-4)。提示PRAA方法可能在模板拷贝数位于5×10³～10⁵时具有较高特异性。但是我们在实际检测临床标本时并未观察到非特异的交叉反应，这可能是由于样本的模板数量刚好位于这一区间，也可能是由于质粒和临床样本间的差异。该问题需要在未来进行更深入的研究和探讨。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针和试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(46)

<223> n(30)=THF

<400> 1

gtaaagaacg aagacttcaa agacactttn ttcactggtc agctcc 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(46)

<223> n(30)=THF

<400> 2

gtaaagaacg aagacttcaa agacacttgn ttcactggtc agctcc 46

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgggagcgg gagggcagaa gaagtttgca t 31

<210> 4

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1001)

<223> n(501)=T/G

<400> 4

tccggctccc tctagccaat cccttgtctc aattctctgt ccccatcctc acccaggcgt 60

cccctaccct gggctctcag cgcccacccc aagcgccgag aggaagatgt acgtcccatc 120

ttctgggcct ccagaccaaa gagttacatc taccgtaccc aggagtggga cgagttccct 180

aacggccgct ggtgagggcc tgcagacctt ccttgcaaat acatctttgt tcttgggagc 240

gggagggcag aagaagtttg catgcttgtg gttgacctgg gaggagtcag gggcagaatt 300

tacaggaatg gcctcctggg catgtggtgg cactgccctc tgtcaggagt gtgccctgac 360

ctctgggcac ccctctgcca ggggcaattc ctcttcccct gcctttgggg agctgaagga 420

ctactacctc ttctacctga agagcaagtc ccccaaggag gagctgctga agatgtgggg 480

ggaggagctg accagtgaag naagtgtctt tgaagtcttc gttctttacc tctcgggaga 540

accaaaccgg aatggtcaca aagtgagtga tgctggagtg gggaccctgg ttcatcccct 600

gcccctggcc tgaccccagc tgcaggccag gctgcggggc tgtgacttcc ccatcctgtg 660

ccctcccctc catgctgtgg acatggcaaa gggagaaggg taagttggga gacctccacc 720

tggaagggct tagggaggca aagacaggct gggtctttgt tgggggccgt gagagggact 780

cagggtgcca aacctgatgg tcgccccagc cagctcaccg tctctcccag gtgacttgcc 840

tgccctggaa cgatgagccc ctggcggctg agaccagcct gctgaaggag gagctgctgc 900

gggtgaaccg ccagggcatc ctcaccatca actcacagcc caacatcaac gggaagccgt 960

cctccgaccc catcgtgggc tggggcccca gcgggggcta t 1001

Claims

1.一种基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点用探针，所述探针的长度为46～52nt，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃替代，探针的5’端距四氢呋喃位点至少间隔30个碱基，3’端距四氢呋喃位点至少间隔15个碱基；所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点3’端的T碱基上，所述猝灭基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的T碱基与猝灭基团修饰的T碱基间隔2～5个碱基。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点的下一位T碱基上。

3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述猝灭基团修饰SNP位点的上一位T碱基上或SNP位点互补碱基的上一位T碱基上。

4.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光基团包括6-羧基荧光素或六氯-6-甲基荧光素；所述淬灭基团包括黑洞猝灭基团。

5.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，探针的3’末端碱基由磷酸盐阻滞剂修饰。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的探针，其特征在于，所述SNP位点为A或C；所述SNP位点互补碱基为T或G。

7.根据权利要求1～5任意一项所述的探针，其特征在于，当检测SNP位点为MTHFRA1298C侧翼序列时，所述探针包括两条，分别具有如序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列和具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

8.一种基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，包括10～1000μmol/L的上游引物和10～1000μmol/L的权利要求1～7任意一项所述的探针。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合物、反应缓存液、280mmol/L醋酸镁；所述酶混合物包括800ng/μL单链结合蛋白，60ng/μL噬菌体UvsX蛋白，50ng/μL DNA聚合酶和40ng/μL外切酶III。