CN108998505B - 一种基因多态性位点检测技术及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用错配探针检测基因多态性位点的方法。在基于重组酶聚合酶扩增反应体系中,通过添加一条或两条特异性错配探针,根据探针与模板间的错配对酶切效率的影响,这一特征可通过探针上的荧光信号区分基因多态性位点，在疾病检测等领域具有重要的应用价值。所述错配探针以基因分型位点为1号位点，在探针上游（5’方向）的2‑4号位点人为引入至少一个与待检序列错配的碱基，错配位点能够增加探针在检测基因单核苷酸多态性中的特异性。本发明还提供了用于检测单核苷酸多态性的特异性探针、引物以及基于重组酶聚合酶扩增的检测试剂盒成分。

Description

一种基因多态性位点检测技术及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学领域，通过检测核酸中碱基的多态性位点，进行基因型分析，或者进行遗传病或传染病诊断等应用。

背景技术

SNP(single nucleotide polymorphism)是基因组中单个核苷酸碱基的突变、颠换、插入和缺失等引起的单核苷酸多态性。SNP被广泛地应用于分子遗传学、法医学和疾病诊断等众多领域。人类基因组计划的实施，使我们发现人类基因组中存在大量的SNP位点，占比超过人类基因组DNA碱基数的1％，平均约1000bp会出现一个SNP[1]，其中一些SNP会导致遗传疾病，包括癌症，糖尿病，镰刀型贫血症，帕金森病，阿尔茨海默症，自身免疫性疾病等等。引起传染病的病原，如病毒，细菌，寄生虫等病原体也存在大量的SNP位点，针对它们的SNP 检测可以进行传染病诊断，病原基因型鉴定等。

针对SNP检测越来越得到人们的重视，关于SNP的检测技术也得到了快速发展。传统的 SNP检测方法大多需要进行凝胶电泳，以判断检测结果，它们主要有：变性梯度凝胶电泳 (DGGE)，单链构象多态性(SSCP)，限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。这些方法由于自身局限性操作均非常繁杂。Suzuki等在1991年提出了一种基于PCR检测SNP位点的方法——等位基因特异性PCR(AS-PCR)[2].该方法的原理是基于PCR反应中DNA聚合酶对于引物 3’末端的单个碱基错配无法修复延伸，导致扩增无法进行，一般情况下只有当引物3’端最后一个碱基与模板链互补时，扩增反应才能进行。在实际应用当中，有时即使3’最末端的碱基与DNA模板发生错配，扩增反应仍然可以进行[3]。后来，为了解决这一问题，Hayashi等人在2004年提出，人为再将3’末端倒数第二或第三个碱基替换成与模板链错配的碱基能够解决这一问题，这样显著的提高了引物检测SNP位点的特异性[4]。目前，基于AS-PCR已经延伸出多种改良方法，如四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplificationrefractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)[5]、片段长度差异等位基因特异PCR(fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)[6]、多等位基因特异扩增(PCR amplification of multiple specific alleles,PMASA)[7]等。这些方法也已经应用到了生命科学的各个领域。AS-PCR 较前面提到的方法更简便、快速、可以对SNP分型、费用较低等优点。但是，该方法在设计时需要优化反应条件，对扩增条件要求比较严格。为了使检测更加便捷，通常在反应中添加 DNA双链嵌入染料或特异性荧光探针，并采用实时荧光定量PCR仪实时监测扩增反应。而实时荧光定量PCR仪因为其精密的控温元件和光学元件，价格昂贵，无法普及至基层医院或非实验室环境应用，这些因素都制约着AS-PCR的进一步广泛应用。

随着分子生物学技术的发展出现了多种高通量、自动化的SNP检测方法，主要有直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等，与基于凝胶电泳的SNP检测方法相比，该类方法能实现SNP高通量、自动化检测，但对设备和技术要求高，成本很高，一般的医院和实验室都不具备这些技术。近些年来出现了等温核酸扩增技术，基于这些技术建立的SNP检测方法，无需昂贵的仪器设备，可以在不发达地区实现SNP快速检测，这些特点使得基于等温核酸扩增的SNP检测技术具有广阔的应用前景。

LAMP技术是日本荣研公司在2000年发明的等温扩增技术，需要4-6条引物参与进行反应，在温度为60-65℃恒温条件下，进行15-60min就可以扩增出初始模板量10⁹-10¹⁰倍的拷贝[8]。利用LAMP进行SNP检测时，需要借助特异性的识别引物，原理与AS-PCR相似：引物 3’末端最后一个碱基如果与模板链的碱基错配，则无法发生扩增反应，再将引物3’末端倒数第三个或第二个碱基人为替换成错配碱基能够显著提高该方法的特异性。在设计引物时在上下游引物的其中一条引物3’端最后一个碱基设为SNP位点，而SNP位点前1个或者2个碱基人为地替换成错配碱基。如果这个SNP位点与野生型模板链对应的位点配对时，在DNA聚合酶作用下开始目的基因序列的循环扩增反应；相反，当模板的等位基因为突变型时，循环扩增就无法进行。扩增出的产物可以用Sybr Green I、HNB等核酸染料进行染色，发出荧光以便观察结果。另外，由于扩增反应过程中产生大量的焦磷酸根，与LAMP反应体系中的镁离子反应形成了肉眼可见的焦磷酸酶白色沉淀，这样也可以进行结果判断。目前基于LAMP的SNP 检测已经应用到了多个领域，比如：植物育种、疾病易感性和个性化用药、耐药性病原检测等。尽管用LAMP扩增技术检测SNP的方法具有LAMP所拥有的许多优点，但是该方法有一些缺点仍然限制着它的应用，比如：该方法引物设计复杂，一般需要6条引物进行反应；LAMP 扩增反应温度限定在60-65℃的恒温条件下，对温度变化比较敏感，温度稍发生变化，就有可能导致反应结果不准确，需要比较精密的温度控制仪器辅助；LAMP容易产生假阳性结果，反应结果判定一般需要借助荧光检测仪，或者浊度仪进行判定，容易产生误判,尤其对于单碱基差异性检测,其引物结合的能量限定范围要求更加苛刻,对于反应条件和结果判断要求更加严格,这对于基层和现场应用提出了严峻的挑战。以上缺点大大限制LAMP检测SNP的应用。

SmartAmp全称smart amplification process，是Mitani等在2007年首先发明的一种新的 DNA等温扩增技术[9]。扩增反应需要设计5条不对称的引物，在Aac DNA聚合酶的作用下进行自循环链置换反应，整个扩增反应可在60℃的恒温条件下进行30-40min即可完成。在反应过程中一条引物上结合有一种杂交敏感的荧光引物，当该引物与目的片段互补退火杂交时，就会激发出荧光，并可通过实时荧光定量检测仪捕捉荧光信号，随着扩增反应的进行，荧光信号呈指数式增强，当荧光信号超过检测最低阈值时即可确定目标序列的存在。该项技术具有独特的识别引物错配的机制，反应体系中加入了错配结合蛋白Taq MutS，当目的片段与任何一条引物有错配时，Taq MutS就会阻止后续的扩增反应。所以，如果引物出现了单个碱基的错配，Taq MutS即结合到错配区域，使扩增反应无法进行，利用这一特点使得SmartAmp 成为检测SNP位点的有力工具。SmartAmp技术所用的Aac DNA聚合酶对样品中的抑制剂有很强的抵抗力，所以在进行扩增反应时样品可以无需进行核酸纯化，只需要进行简单的热处理使DNA释放即可，或者在反应体系中加入细胞裂解液直接在60℃条件下进行反应。目前为止，SmartAmp已经被应用到个体化治疗、快速基因筛查、感染性疾病诊断等领域中。SmartAmp 同样有其缺点，该技术可能会受微小变异影响而出现假阴性结果；同时，SmartAmp与LAMP 的扩增反应温度相似，需要在精密的恒温孵育装置内进行；同时需要5引物进行反应，设计复杂；而且Taq MutS只对部分突变类型敏感，无法用于所有SNP类型检测等。

RPA全称重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification)，是由Piepenburg 等在2006年建立的一种等温核酸扩增方法，主要依赖于三种酶：能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。最佳温度为37℃～42℃。扩增反应所需时间少于 30min[10]。利用基于重组酶聚合酶的扩增技术扩增包含SNP位点的基因片段，然后用针对 SNP位点的限制性内切酶酶切扩增产物，通过凝胶电泳就可以判断SNP位点类型。但是这种方法需要电泳仪，紫外照胶仪才能实现，同样不适于实地检测。

Shin等在2013年建立了固相基于重组酶聚合酶的扩增技术检测人膀胱癌相关HRAS基因的SNP突变位点[11]。该方法首先将下游引物固定到固相载体上，然后将野生型上游引物、模板DNA和基于重组酶聚合酶的扩增技术反应体系所需的其他试剂加到该固相载体上，结果显示能够成功的检测出野生型而无法检测出突变型；在检测突变型时，与检测野生型方法相似，除了将上游引物改成突变型引物，其它成分相同，结果显示只能检测到突变型，而无法检测到野生型。这里的突变型和野生型的上游引物3’端最后一个碱基分别与突变型和野生型的SNP位点互补。

Liu等在2016年基于重组酶聚合酶的扩增技术建立了肺癌中EGFR(Epidermalgrowth factor receptor)SNP突变的检测方法[12]。他们利用基于重组酶聚合酶的扩增技术技术设计了一种等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification，ASA)，再结合肽核酸(allele-specific amplification，PNA)和核酸染料SYBR(SYBR Green I)，形成了ARPS(AS-RPA-PNA-SYBR)检测系统。其中的AS-RPA的原理同样和AS-PCR原理相似。PNA是一种具有多肽骨架的DNA类似物，可以特异性地与DNA或RNA结合，形成稳定的复合体，反应体系中的PNA与非目的片段序列牢固的结合，而且PNA结合区域无法被SYBR染色，这样使得基于重组酶聚合酶的扩增技术反应仅能扩增突变的序列，SYBR也只能结合基于重组酶聚合酶的扩增技术扩增的目的片段并显色，这样就可以通过肉眼观察从而判断结果。

Ng等在2017年利用基于重组酶聚合酶的扩增技术建立了检测结核杆菌耐药基因SNP的方法[13]。由于结核杆菌的耐药基因突变导致了SNP位点的出现，所以通过检测其耐药基因的SNP位点，就可以检测出结核杆菌是否是耐药结核杆菌。其方法原理同样是利用了AS-PCR 相似的原理。首先用一对基于重组酶聚合酶的扩增技术引物，将特定SNP位点的基因片段进行扩增，而后在扩增基因序列的内部设计另一对基于重组酶聚合酶的扩增技术引物，其中一条引物的3’末端倒数第三个碱基人为的替换成与目的片段错配的碱基，并且这条引物的3’末端最后一个碱基与耐药性突变的SNP位点互补配对。用这对引物扩增第一轮产物时，如果该结核杆菌具有耐药性突变，则该扩增反应能够进行，反应体系中加入的SYTO9染料使扩增产物显现荧光，如果该结核杆菌为野生型，则该扩增反应无法进行，通过简易的荧光检测仪器就可以判断结果。但是，这个方法在实际应用时，引物3’端最后一个碱基和倒数第三个碱基即使都与模板链错配，有时扩增反应仍然可以进行，这就导致假阳性的出现；而且，该方法需要进行两轮的扩增反应，增加了操作的繁杂程度。

Martorell等在2017年基于重组酶聚合酶的扩增技术和Blocked PCR开发出了Blocked RPA，用于PIK3CA基因SNP位点的检测[14]。其原理类似于Blocked PCR，反应体系中加入了针对野生型blocker寡核苷酸链，blocker位点位于链的中间并且对应模板链的SNP位点，该blocker 的3’端还修饰了化学基团，上游引物位于blocker临近的上游，当检测的模板链为野生型时， blocker与模板链形成紧密结合，由于化学基团blocker阻滞了引物3’端，导致DNA聚合酶无法扩增引物，结果为阴性；当模板DNA为突变型时，该blocker无法与模板链形成稳定的结构，引物得以延伸结果为阳性。

2017年，美国布罗德研究所张峰教授团队开发出一种被称为SHERLOCK(SpecificHigh-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)的诊断平台[15]。它是利用基于重组酶聚合酶的扩增技术首先将目的基因扩增，而后用第二个扩增步骤将DNA转化为RNA，转化后的RNA 会被Cas13a识别，并切割RNA报告分子，从而释放可检测到的荧光信号。2018年4月同是布罗德研究所的Sabeti团队基于SHERLOCK结合HUDSON(Heating UnextractedDiagnostic Samples to Obliterate Nucleases,即对未提取的诊断样品进行加热来消除核酸酶)建立了可以直接检测唾液或血液等体液样品中病原的方法[16]。首先对临床样品进行快速的化学和热处理，这些经过处理的临床样品随后通过SHERLOCK诊断平台进行检测，最终的检测结果(阳性或阴性)能够在试纸条上很容易地观察到。通过该方法他们能够直接在患者的唾液和血清样品中检测到登革热病毒。这种平台还能够检测之前添加到健康血液和尿液样品中的寨卡病毒颗粒。Sabeti团队进一步证实了SHERLOCK能够特异并敏感的检测SNP位点，他们将Cas13a 的crRNA序列中SNP位点旁边的一个碱基替换成与模板链错配的碱基，这样当crRNA序列中 SNP位点的碱基配对时，则下游的反应能够进行，反之则否。在实际检测中，他们成功的对 ZIKV临床样品的3个SNP位点进行了检测。该方法在检测DNA序列中的SNP位点时，需要将 DNA转录为RNA才能进行检测，总时间需要两个小时以上。

因此，本领域亟待开发一种准确性高、操作简便的检测方法。

参考文献

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发明内容

目前基于重组酶聚合酶扩增技术检测SNP的方式均为通过引物错配时扩增能力的差异，对不同的基因型进行扩增或富集,并根据荧光染料的发光强度和时间进行区分[17]。由于扩增引物本身的非特异性扩增问题，重组酶聚合酶扩增技术尤其对于引物和探针的错配容忍程度较高[18,19]，容易出现非特异性而表现为假阳性，且根据时间对比时对实验条件要求非常严苛，从而对操作人员提出很大挑战。对于引物的错配容忍度主要依赖于重组酶、单链结合蛋白及聚合酶的酶促结果产生的；而对于错配探针的容忍度主要是依赖于体系中脱嘌呤 (apurinic)或脱嘧啶(apyrimidinic)核酸内切酶对于杂合双链的切割能力产生，亦称为 AP核酸内切酶(AP endonucleases)，如具有脱嘌呤、脱嘧啶核酸内切酶功能的大肠杆菌核酸外切酶III或核酸内切酶IV。该类酶在常见的DNA脱碱基突变的修复过程中发挥着重要作用 (20，21)。它们裂解AP位点旁的磷酸二酯键，裂解DNA中AP位点的5′-端和3′-端磷酸二酯键，切除AP位点的磷酸糖(sugar phophate)部分，为DNA修复作准备。发明人通过对大肠杆菌核酸外切酶III或核酸内切酶IV分别对于不同位置的错配杂交双链DNA的切除活性的影响进行研究，并用FAM荧光信号进行检测。如实施案例6:通过荧光信号值的高低判断距离AP位点的突变造成的切割效率降低。实验证明，位于靠近探针5‘-端位置的错配能够严重影响AP核酸内切酶活性，尤其对于A/G错配类型，而甚至在探针的脱碱基位点(THF)的5’-端只有一个的错配，荧光信号的变化值相对于完全匹配的荧光信号变化值相差超过5倍差异。如图6-(d)：曲线1-7对应探针pb1-pb7的扩增曲线图所示。

根据这一发现，为了进一步对不同基因型进行区分，本发明结合等位基因特异性扩增与荧光探针技术，对扩增产物进行分析，并对等位基因特异性探针人为引入突变，使探针能够更特异性的区分不同的基因分型。

在等位基因特异性探针设计的过程中，获得的探针可以通过SNP位点并通过额外引入人为突变碱基以增加检测结果的特异性，在特异性分型探针的THF位点附近引入单个或多个人为错配碱基能提高扩增特异性，且不同的错配碱基组合错配延伸能力不同。类似于AS-PCR中的扩增特性，其中引物与模板的错配碱基组合为A/A、A/G、C/C、T/T时在错配延伸率要弱于其它的错配碱基组合。对探针能够更特异的区分非特异性扩增产物，本发明通过案例对其进一步的说明。

本发明的等位基因特异性探针和引物对的设计方法，包括以下步骤：

1)针对包含待测等位基因突变区域的靶序列设计两条用于分型的等位基因特异性探针；

进一步的，所述两条等位基因特异性分型探针设计差异：a.分型的碱基不同；b.人为引入的错配碱基位点或/和错配碱基的种类不同或相同；c.荧光基团不同；其它属性相同；

其它属性包括：探针的长度，其它位置碱基序列，淬灭基团，3’末端的封闭基团

进一步的，所述两条等位基因特异性荧光探针长度为40-52个碱基，其特征在于：

等位基因特异性荧光探针上设计有脱碱基修饰位点四氢呋喃(THF)，该修饰位点设计在靠近等位基因分型位点的下一个碱基(3’方向第一个碱基)。

所述THF位点的左侧5个碱基内和右侧5个碱基内各有一个碱基T作为荧光基团和淬灭基团的修饰位点，如只有一侧有碱基T或两侧都没有T时，另一侧或两侧可以人为引入错配碱基T；优选地，两个T之间距离小于或等于8个碱基；更优选地，两个T之间距离小于或等于6个碱基；更优选地，两个T之间距离小于或等于5个碱基。所述荧光基团包括但不限于：FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，等等，所述荧光淬灭基团包括但不限于：BHQ1、 BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra、Eclipse,等等。上述荧光基团和荧光淬灭基团是本领域已知的。

优选地，所述脱碱基修饰位点(THF)距离探针5’末端≥25个碱基，距离探针3’末端≥14个碱基。

进一步的，所述探针的3’末端设计有封闭基团，如C3-spacer,biotin-TEG或phosphate；用以阻止探针延伸。进一步的，以等位基因特异性荧光探针的基因分型位点为1号位点，在探针上游(5’方向)的2-4号位点人为引入至少一个与待检序列错配的碱基，优选在探针上游的2号和/或3号位点引入人为错配。

所述错配碱基是根据不同碱基之间的错配容忍程度不同，具体进行实验数据分析和统计优选最佳的错配碱基对。

进一步的，如果设计的等位基因特异性探针的荧光基团修饰碱基T为人为引入的错配碱基，且位于分型等位基因位点往5’方向第2个碱基，则不需要再设计额外的人为错配碱基；如果设计的人为错配荧光基团修饰碱基位于分型等位基因位点往5’方向第3个碱基，则可以对分型等位基因位点往5’方向第2个碱基进行继续引入或不再引入人为错配碱基，优选地，引入错配类型为A/A、A/G、C/C、T/T错配。

2)针对设计好的等位基因特异性荧光探针，在其两侧设计一对或两对引物，优选一对引物。且与探针方向相反的引物不能与探针序列有重叠，以避免引物与探针直接扩增。

进一步的，设计在等位基因特异性荧光探针5’端和3’端两侧的引物对，引物长度可以 20-40个碱基；优选地，其引物长度为30-35个碱基；

进一步的，为避免引物与探针直接结合扩增，等位基因特异性荧光探针5’端方向的引物的3’末端距离THF位点≥5个碱基的距离。

为进一步提高等位基因分型的灵敏度，可在设计好一对引物外侧再设计一对外引物用于待测模板预扩增，再对预扩增产物进行等位基因特异性双探针恒温荧光扩增。类似PCR扩增反应中的巢式PCR或嵌套式PCR。

扩增片段可以在70-1000bp之间，优选地，扩增片段在80-500bp之间，更优选地，所述预扩增产物的片段大小在100-200bp之间。

本发明还提供了一种等位基因特异性双探针恒温荧光检测方法，包括以下步骤：

1)针对包含待测等位基因突变区域的靶序列设计两条用于分型的等位基因特异性探针；

2)针对设计好的等位基因特异性荧光探针，在其两侧设计一对或两对引物，优选一对引物；

3)将待测样品通过细胞裂解液制备模板或通过基因组抽提试剂抽提基因组；

4)使用步骤1)和2)设计的等位基因特异性双探针和引物对进行基于重组酶反应体系的恒温荧光扩增；

5)分析步骤4)的荧光扩增曲线确定待测样品的基因型。

进一步的，重组酶扩增反应体系构建如下(采用大肠杆菌重组酶)：

或者构建体系如下(采用噬菌体重组酶):

反应条件如下：25ul，扩增温度：37℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道：FAM/HEX。检测用仪器(ABI7500,FTC-3000)。

本发明还提供了一种等位基因分型检测试剂盒，包括下列组分：重组酶，聚合酶，单链 DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子；所述重组酶选自噬菌体UvsX蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合；所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合；所述单链DNA结合蛋白选自大肠杆菌SSB蛋白，GP32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶III，核酸内切酶IV；所述重组加载蛋白选自噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO或大肠杆菌RecR的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合，其中所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000，PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000；所述能量系统选自ATP或ATP，磷酸肌酸，肌酸激酶的组合；盐离子选自Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。试剂盒还包含以上所述等位基因分型探针和引物对。

另外，本发明还提供了使用一条或两条错配探针进行等位基因单核苷酸多态性检测的方法。两条探针中，其中一条探针与待检的野生型基因部分互补，另一条探针与待检的含有单核苷酸突变的基因部分互补，两条探针分别连有不同波长的荧光基团，探针长度为40-52碱基，每条探针包含一个脱碱基修饰位点四氢呋喃(THF)，该修饰位点位于荧光基团和淬灭基团之间且与等位基因分型位点相邻，以等位基因分型位点为1号位点，在探针上游(5’方向) 的第2-4号位点人为引入至少一个与待检序列错配的碱基，优选在探针上游的2号和/或3号位点引入人为错配。在一种检测方法中，将两条错配探针同时加入反应体系中,通过不同荧光通道的检测仪器,在同一管反应中,同时检测模板中的基因分型。在另一种检测方法中，在反应体系中只加入其中的某一条探针,通过对于此探针的荧光信号值的变化,以区分反应中所加入模板的基因分型。

在反应中，当模板的基因分型位点与探针碱基序列一致时，探针将与所扩增的产物中对应的互补链形成双链，核酸内切酶(AP endonucleases)，如大肠杆菌核酸外切酶III或核酸内切酶IV会切断探针上的THF磷酸二酯键，从而消除荧光淬灭基团的淬灭作用，而发出探针上所标记的荧光。随着扩增的模板量的增加，荧光信号也得以积累。而当模板的基因分型位点与探针碱基序列不一致时，由于在THF紧邻碱基的错配，导致无法形成AP核酸内切酶所作用的双链底物，因此酶切效率极大降低，如实施案例6所示。因此其探针上的荧光基团保持被淬灭状态，从而不发出荧光。

本发明的有益效果：本发明提供的错配探针检测方法能够较好地区分等位基因突变位点，同时反应可以借助恒温荧光检测，不需要昂贵的荧光定量PCR仪等昂贵设备，在疾病检测等领域具有重要的应用价值。本发明还提供了用于区分等位基因单核苷酸多态性的特异性探针，所述探针在THF位点上游第2-4个碱基的位置包含至少一个与靶序列错配的位点，错配位点能够增加探针在检测等位基因单核苷酸多态性中的特异性。

附图说明

图1人亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因rs1801131位点等位基因特异性双探针恒温荧光检测结果。

图2为人亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因rs1801133位点等位基因特异性双探针恒温荧光检测结果。

图3乙醛脱氢酶2(ALDH2)rs671位点的基因多态性等位基因特异性双探针恒温荧光检测结果。图4中国结合杆菌利福平耐药株rpoB基因531位点碱基突变的等位基因特异性双探针恒温荧光检测结果。

图5新生儿常见的耳聋基因(GJB2)相关位点碱基突变的等位基因特异性双探针恒温荧光检测结果。

图6特异性探针在THF附近不同位点引入人为错配碱基后对扩增效率的影响实验结果。

图7对比等位基因特异性探针在引入人为错配碱基后扩增特异性实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。以下实施例仅仅用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

实施例1：人亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因rs1801131位点等位基因特异性双探针恒温荧光检测：

MTHFR是参与叶酸循环代谢的一个重要酶，与DNA的合成甲基化等相关，叶酸是一种B 族维生素，是细胞分裂合成DNA时不可缺少的成分。MTHFR基因检测可指导孕妇合理补充叶酸，预测唇腭裂、唐氏综合症、神经管缺陷等新生儿出生缺陷，适用于正常夫妇生育前预防性检测。

MTHFR包含两个SNP位点：(1)A1298C rs1801131；(2)C677T rs1801133。本案例检测其中的rs1801131的基因分型：rs1801131是位于第一号染色体MTHFR基因的第八个外显子上第1298核苷酸上的一个A/C多态性位点，引起MTHFR基因编码的蛋白质第429个氨基酸由Glu变为Ala。在世界人群中的该多态的频率分布：A占77％，C占23％。中国人群中的分布A占81％，C为19％。研究发现，rs1801131位点的多态性是影响该酶的活性的一个重要因素。携带MTHFR 1298C等位基因的酶活性为野生型A的68％左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病和风险的增加。

1.1人MTHFR基因位点rs1801131的等位基因检测：

搜索并下载rs1801131位点所在基因序列，利用引物设计软件分析并设计等位基因特异性双探针及其引物。rs131-pb1,pb2为等位基因特异性分型探针，分型碱基用黑体斜字表示

对应的模板的SNP位点

分型探针rs131-pb1,pb2的THF碱基位点的5’方向第2个碱基分别引入与靶序列错配的碱基A和错配碱基G，并用下划线表示。

分型探针和扩增引物序列如下：

rs131-f1:5'AGGGGATGAACCAGGGTCCCCACTCCAGCATC 3'(SEQ ID No 1)

rs131-r1:5'ACCTGAAGAGCAAGTCCCCCAAGGAGGAGCTG 3'(SEQ ID No 2)

rs131-pb1:

rs131-pb2:

1.2样本采集

使用一次性口腔拭子，对被检测者进行口腔黏膜细胞采样。具体操作：手持口腔拭子伸进口腔一侧，在内壁黏膜旋转10-15圈，然后再上下移动刮拭5-10次，力度适中，以紧贴口腔内壁黏膜为宜，确保采样拭头各处都能蘸取口腔黏膜脱落细胞；按照同样方法，在口腔内壁另一侧进行采集。

1.3模板制备

使用口腔基因组抽提试剂盒对口腔拭子采集的口腔细胞进行基因组抽提作为检测模板，加入到等位基因特异性双探针恒温反应体系。

配置等位基因特异性双探针恒温反应体系，反应体系如下：

每个待测模板在一管反应体系中进行双探针扩增，利用双通道荧光仪进行荧光曲线分析。

1.4反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：37℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道： FAM/HEX。检测用仪器(ABI7500,FTC-3000)。

1.5检测结果如图1所示。

1.6结果分析

系列1/系列5为一组反应：系列1为FAM通道的荧光扩增曲线，系列5为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为FAM标记探针对应的A型纯合；

系列2/系列6为一组反应：系列6为FAM通道的荧光扩增曲线，系列2为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为HEX标记探针对应的C型纯合；

系列3/系列4为一组反应：系列3为FAM通道的荧光扩增曲线，系列4为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为A/C型杂合；

将上述三组检测模板抽提基因组并进行测序，测序结果显示与等位基因特异性双探针恒温荧光扩增曲线结果一致。

实施例2：人亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因rs1801133位点等位基因检测：

rs1801133是位于第一号染色体MTHFR基因第五个外显子上的677位mRNA上的一个C/T 多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第222个氨基酸由Ala(A)变为Vla(V)。在世界人群中的该多态频率分布，A占78％，T占22％，中国人群中的分布A占67％，C为33％。研究发现，MTHFR677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677C基因型时其MTHFR活性为100％，携带CT基因型的活性则为CC的71％，基因型 TT型的只有34％。

2.1人MTHFR基因位点rs1801133的等位基因检测：

搜索并下载rs1801133位点所在基因序列，利用引物设计软件分析并设计等位基因特异性双探针及其引物。rs133-pb1,pb2为等位基因特异性分型探针，分型碱基用黑体斜字表示

对应的模板的SNP位点

分型探针rs133-pb1的等位基因碱基位点的5’方向第2个碱基引入与靶序列错配的碱基G,分型探针rs133-pb2的等位基因碱基位点的5’方向第1个碱基引入与靶序列错配的碱基T，并用下划线表示。此案例针对口腔细胞裂解模板在扩增引物外侧设计了一对预扩增引物。

分型探针、扩增引物及预扩增引物序列如下：

rs133-f1:5'TATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAG 3'(SEQ ID No 5)

rs133-r1:5'TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGAT 3'(SEQ ID No 6)

rs133-ouf2:5'CCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAG 3'(预扩增引物f)(SEQ IDNo 7)

rs133-our2:5'TGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAG 3'(预扩增引物r)(SEQ IDNo 8)

rs133-pb1:

rs133-pb2:

2.2样本采集

使用一次性口腔拭子，对被检测者进行口腔黏膜细胞采样。具体操作：手持口腔拭子伸进口腔一侧，在内壁黏膜旋转10-15圈，然后再上下移动刮拭5-10次，力度适中，以紧贴口腔内壁黏膜为宜，确保采样拭头各处都能蘸取口腔黏膜脱落细胞；按照同样方法，在口腔内壁另一侧进行采集。

2.3模板制备：

使用口腔基因组抽提试剂盒制备模板，直接通过滤纸将模板吸附并释放入重组酶恒温反应体系，进行模板的预扩增处理。

配置重组酶恒温反应体系，反应体系如下：

模板滤纸条直接吸附蘸入反应体系

预扩增条件

反应体系：25ul，反应温度：30℃，反应时间：40min。

预扩增产物直接用作等位基因特异性双探针恒温检测的模板。

2.4构建等位基因特异性双探针恒温反应体系

注：相比于重组酶恒温预扩增反应体系，等位基因特异性双探针恒温反应体系增加了特异性分型探针和核酸外切酶。

配置等位基因特异性双探针恒温反应体系，反应体系如下：

2.5反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：42℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道：FAM/HEX。检测用仪器(ABI7500，FTC-3000)。

2.6检测结果如图2所示。

2.7结果分析

系列1/系列5为一组反应：系列1为FAM通道的荧光扩增曲线，系列5为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为FAM标记探针对应的C型纯合；

系列2/系列6为一组反应：系列6为FAM通道的荧光扩增曲线，系列2为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为HEX标记探针对应的T型纯合；

系列3/系列4为一组反应：系列3为FAM通道的荧光扩增曲线，系列4为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为T/C型杂合；

将上述三组检测模板抽提基因组并进行测序，测序结果显示与等位基因特异性双探针恒温荧光扩增曲线结果一致。

实施例3：乙醛脱氢酶2(ALDH2)rs671位点的基因多态性检测：

乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是酒精代谢的关键酶,在酒精代谢产生的致癌物乙醛的催化过程中起着重要的作用,其基因多态性(尤其是rs671位点)与饮酒人群肿瘤的发生密切相关。

在人群中ALDH2酶的基因型以3种形式出现，具有正常催化乙醛活性的野生纯合子型G/G，催化活性下降的突变杂合子型G/A(只有ALDH2蛋白正常水平的6.25％)，失去催化活性的突变纯合子型A/A。

3.1人ALDH2基因rs671位点的恒温荧光检测的探针和引物设计：

NCBI上搜索并下载rs671位点所在基因序列，利用引物设计软件分析并设计等位基因特异性双探针及其引物。rs671-pb1,pb2为等位基因特异性分型探针，分型碱基用黑体斜字表示

对应的模板的SNP位点

分型探针rs671-pb1,pb2的等位基因碱基位点的5’方向第1个碱基引入与靶序列错配的碱基A，并用下划线表示。

分型探针和扩增引物序列如下：

rs671-f1:5'AGCCACCAGCAGACCCTCAAGCCCCAACAG 3'(SEQ ID No 11)

rs671-r1:5'CCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCG 3'(SEQ ID No 12)

rs671-pb1:

rs671-pb2:

3.2样本采集

使用一次性口腔拭子，对被检测者进行口腔黏膜细胞采样。具体操作：手持口腔拭子伸进口腔一侧，在内壁黏膜旋转10-15圈，然后再上下移动刮拭5-10次，力度适中，以紧贴口腔内壁黏膜为宜，确保采样拭头各处都能蘸取口腔黏膜脱落细胞；按照同样方法，在口腔内壁另一侧进行采集。

3.3模板制备：

使用口腔基因组抽提试剂盒对口腔拭子采集的口腔细胞进行基因组抽提作为检测模板，加入到等位基因特异性双探针恒温反应体系，

此案例将等位基因特异性分型探针分别配置在独立的两管反应体系中，一个模板同时进行两组反应，配置的两组重组酶恒温荧光反应体系(A组，B组)如下：

A组.(rs671-pb1)

模板滤纸条直接吸附蘸入反应体系

B组.(rs671-pb2)

模板滤纸条直接吸附蘸入反应体系

3.5反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：40℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道：FAM/HEX。检测用仪器(ABI7500,FTC-3000)。

3.6检测结果如图3所示。

3.7结果分析

系列1/系列5为一组反应：系列1为FAM通道(A组)的荧光扩增曲线，系列5为HEX 通道(B组)的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为FAM标记探针对应的A型纯合；

系列2/系列6为一组反应：系列6为FAM通道(A组)的荧光扩增曲线，系列2为HEX 通道(B组)的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为HEX标记探针对应的G型纯合；

系列3/系列4为一组反应：系列3为FAM通道(A组)的荧光扩增曲线，系列4为HEX 通道(B组)的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为A/G型杂合；

将上述三组检测模板抽提基因组并进行测序，测序结果显示与等位基因特异性双探针恒温荧光扩增曲线结果一致。

实施例4：中国结合杆菌利福平耐药株rpoB基因531位点碱基突变的检测：

利福平(RFP)作为目前结核病短程化疗的关键药物，其主要作用机制为与结合杆菌(MTB) RNA聚合酶β亚单位结合而干扰转录和RNA延伸。MTB对RFP产生耐药主要因其编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因突变所致。研究者发现95％左右的结合杆菌利福平耐药株中存在rpoB 基因突变，且多发生在rpoB507-533位27个氨基酸密码子(81bp)组成的区域，其中531位点的发生率最高，碱基突变以TCG/TTG突变为主。

4.1设计检测rpoB 531位点碱基野生型与突变型的探针和引物设计：

NCBI上搜索并下载rpoB基因序列，并在531位点设计等位基因特异性双探针及其引物。 rp531-pb1,pb2为等位基因特异性分型探针。野生型碱基用黑体斜字

表示,突变型碱基用黑体斜字

特异性探针rp531-pb1,pb2的分型碱基位点的5’方向第1个和第2个碱基分别引入与靶序列错配的碱基G和错配碱基C，并用下划线表示。

分型探针和扩增引物序列如下：

rp531-f1:5'ATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAG 3'(SEQ ID No 15)

rp531-r1:5'CGTAGTGCGACGGGTGCACGTCGCGGACCTCC 3'(SEQ ID No 16)

rp531-pb1:

rp531-pb2:

4.2DNA样本获取

向合作机构取得若干株不同分型的MTB的已纯化基因组DNA。

4.3模板制备：

使用特定基因组抽提试剂盒对待测样品抽提基因组用作检测模板，加入到等位基因特异性双探针恒温反应体系，

配置等位基因特异性双探针恒温反应体系，反应体系如下：

每个待测模板在一管反应体系中进行双探针扩增，利用双通道荧光仪进行荧光曲线分析。

4.5反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：37℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道：FAM/HEX。检测用仪器(ABI7500,FTC-3000)。

4.6检测结果如图4所示。

4.7结果分析

系列1/系列3为一组反应：系列1为FAM通道的荧光扩增曲线，系列3为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为FAM标记探针对应的碱基C，既为野生型；

系列2/系列4为一组反应：系列4为FAM通道的荧光扩增曲线，系列2为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为HEX标记探针对应的突变碱基T，则为突变型；

将上述二组模板抽提基因组并进行测序，测序结果显示与等位基因特异性双探针恒温荧光扩增曲线结果一致。

实施例5：新生儿常见的耳聋基因(GJB2)相关位点碱基突变的检测：

听力障碍是可筛查性疾病，有60％的耳聋是由遗传缺陷引起的。由于进行新生儿听力筛查只能发现己存在听力障碍的患儿，对于听力正常的遗传因素导致的迟发型耳聋患儿和药物致聋敏感基因携带者则有漏诊的危险。针对这种现状，本实施例通过错配探针检测方法新生儿常见的耳聋基因(GJB2)235delC基因位点进行检测，为进一步诊断提供初步信息。

5.1设计检测GJB2 235delC位点碱基缺失的的探针和引物设计：

NCBI上搜索并下载GJB2基因序列，并在235位点设计基因特异性双探针及其引物。G235-pb1,pb2为等位基因特异性分型探针。Pb2为碱基C缺失型特异性探针，荧光修饰位点为人为错配碱基t,并用下划线表示。

特异性探针和扩增引物序列如下：

G235-f1:5'TTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAG 3'(SEQ ID No 19)

G235-r1:5'TGTCTCCGGTAGGCCACGTGCATGGCCACTAG 3'(SEQ ID No 20)

G235-pb1:5'TACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATG(FAM-dt)GC(THF)C(BHQ1-dt)GCAGCTGATCTTCG(C3-SPACER)3'(SEQ ID No 21)

G235-pb2:5'TACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATG(HEX-dt)G(THF)C(BHQ1-dt)GCAGCTGATCTTCG(C3-SPACER)3'(SEQ ID No 22)

5.2样本采集

使用一次性口腔拭子进行口腔黏膜细胞采样。具体操作：手持口腔拭子伸进口腔一侧，在内壁黏膜旋转10-15圈，然后再上下移动刮拭5-10次，力度适中，以紧贴口腔内壁黏膜为宜，确保采样拭头各处都能蘸取口腔黏膜脱落细胞；按照同样方法，在口腔内壁另一侧进行采集。

5.3模板制备：

使用口腔基因组抽提试剂盒对口腔拭子采集的口腔细胞进行基因组抽提作为检测模板，加入到等位基因特异性双探针恒温反应体系，

配置等位基因特异性双探针恒温反应体系，反应体系如下：

每个待测模板在一管反应体系中进行双探针扩增，利用双通道荧光仪进行荧光曲线分析。

5.5反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：38℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道：FAM/HEX。检测用仪器(ABI7500,FTC-3000)。

5.6检测结果如图5所示。

5.7结果分析

系列1/系列3为一组反应：系列1为FAM通道的荧光扩增曲线，系列3为HEX通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为正常基因型；

系列2/系列4为一组反应：系列2为HEX通道的荧光扩增曲线，系列4为FAM通道的荧光扩增曲线，根据荧光曲线判断待测模板为235delC缺失型；

将上述二组检测模板抽提基因组并进行测序，测序结果显示与等位基因特异性双探针恒温荧光扩增曲线结果一致。

实施例6：特异性探针在THF附近不同位点引入人为错配碱基后对扩增效率的影响：

在设计等位基因特异性探针时，通过额外引物人为突变碱基可以增加检测结果的特异性，在引物不同的错配碱基、错配个数及不同的错配碱基位点时均对扩增效率产生影响，对本发明方法中的探针设计起到指导意义。

6.1模板和特异性探针设计：

针对rs1801131基因位点附近的序列人工合成一段序列，与探针配对的部分碱基序列如下,其中小写字母c处为对应探针上THF位点：

5’TGACAGAGGGCAAGTGcCAACCACATGCCCAGGAGGCCATTCCTGTAA 3’(SEQ ID No 23)

以人工合成的序列为模板，基于与模板的不同碱基错配组合设计了多组特异性探针，其中错配碱基用小写黑体字母表示。

特异性探针序列如下：

Pb1:5'TTACAGGAATGGCCTCCTGGGCATGTGG(FAM-dt)TG(THF)CAC(BHQ1-dt)TGCCCTCTGTCA (C3-SPACER)3'(SEQ ID No 24)

Pb2:

Pb3:

Pb4:

Pb5:

Pb6:

Pb7:

Pb8:

Pb9:

Pb10:

Pb11:

Pb12:

Pb13:

Pb14:5'TTACAGGAATGGCCTCCTGGGCATGTGG(FAM-dt)T(THF)CAC(BHQ1-dt)TGCCCTCTGTCA (C3-SPACER)3'(SEQ ID No 37)

Pb15:

Pb16:

Pb17:

Pb18:

Pb19:

6.2基于核酸外切酶III和核酸内切酶IV配置两组重组酶恒温反应体系A和B，

反应体系如下：

体系A：

体系B：

其中核酸外切酶III/核酸内切酶IV、醋酸镁加在反应管盖上，上机测试时离心混匀。

6.3反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：37℃，反应时间：20min，每30s读取一次荧光，荧光通道： FAM。检测用仪器(恒温荧光检测仪GS8)。

6.4.1实验结果(A体系)如图6a-c所示。

图6a：曲线系列1-7依次对应探针pb1,pb2,pb3,pb4,pb5,pb6,pb7的扩增曲线图

图6b：曲线系列1-7依次对应探针pb8,pb9,pb10,pb11,pb12,pb13,pb14的扩增曲线图

图6c：曲线系列1-7分别对应探针pb3,pb15,pb16,pb5,pb17,pb18,p19的扩增曲线图

6.4.2实验结果(B体系)如图6d-f所示。

图6d：曲线系列1-7依次对应探针pb1,pb2,pb3,pb4,pb5,pb6,pb7的扩增曲线图

图6e：曲线系列1-7依次对应探针pb8,pb9,pb10,pb11,pb12,pb13,pb14的扩增曲线图

图6f：曲线系列1-7分别对应探针pb3,pb15,pb16,pb5,pb17,pb18,p19的扩增曲线图

基于上述实验数据分析，当突变碱基位于THF位点5’方向附近，且探针与模板的错配碱基组合为G/A、A/A、A/G、C/C、T/T时错配延伸率要低于其它的错配碱基组合，能够使探针更特异的区分非特异性扩增产物。

实施例7:对比等位基因特异性探针在引入人为错配碱基后扩增特异性实验

经过实验验证,仅通过SNP位点的特异性碱基进行基因分型时,特异性不高,在特异性探针SNP位点5’端方向引入与模板人为错配碱基后,能够使探针更特异的区分非特异性扩增产物。

7.1在实施例1的基础上设计一条与A基因型完全互补的探针rs131-pb对比本发明中的特异性探针rs131-pb1扩增特异性。分型碱基用黑体斜字

对应的模板的SNP位点

下划线标记的碱基为人为引入的错配碱基。

分型探针和扩增引物序列如下：

rs131-f1:5'AGGGGATGAACCAGGGTCCCCACTCCAGCATC 3'(SEQ ID No 1)

rs131-r1:5'ACCTGAAGAGCAAGTCCCCCAAGGAGGAGCTG 3'(SEQ ID No 2)

rs131-pb1:

rs131-pb:

7.2实验设计

分别使用针对模板为A型的检测探针，其中基因特异性探针rs131-pb1在2号位置引入了A/A错配类型，探针rs131-pb为与模板完全匹配，未引入人为错配位点；利用两条探针分别针对两种纯合基因组模板A纯合型和C纯合型进行扩增,比较两条探针对于不同基因型扩增的荧光信号差异.

7.3体系配置

配置等位基因特异性双探针恒温反应体系，反应体系如下：

7.4反应条件

反应体系：25ul，扩增温度：37℃，反应时间：30min，每30s读取一次荧光，荧光通道：FAM。检测用仪器(ABI7500,FTC-3000)。在体系中,分别添加不同的探针类型。

7.5检测结果如图7所示。

图形说明：

系列1/系列2对应rs131-pb1反应体系的扩增曲线图,系列3/系列4对应rs131-pb反应体系的扩增曲线图,且系列1/系列3的扩增模板为A纯合型基因,系列2/系列4的扩增模板为C纯合型基因。

7.6结果分析

30min反应结束时，系列1的荧光值ΔG为2828.63，系列2的荧光值ΔG为270.18，系列1与系列2荧光值ΔG的比值为：10.46；系列3的荧光值ΔG为4176.25，系列4的荧光值ΔG为1899.78，系列3与系列4荧光值ΔG的比值为：2.19，引入了错配碱基的分型探针特异性要优于未引入人为突变的探针。

序列表

<110> 苏州先达基因科技有限公司

<120> 一种基因多态性位点检测技术及其试剂盒

<130> 2018003

<160> 0

<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (17)

1.用于单核苷酸多态性检测的基因分型探针，探针长度为40-52bp，其上连接有荧光基团、荧光淬灭基团，该探针包含一个脱碱基修饰位点四氢呋喃THF，该修饰位点位于荧光基团和荧光淬灭基团之间且该修饰位点位于基因分型位点下游方向即3’方向的第一个碱基上，其中以基因分型位点为1号位点，在探针上游方向即5’方向的2-4号位点人为引入至少一个与待检序列错配的碱基，在THF位点两侧5个碱基以内上游和下游各有一个T；如果只有一侧有T或两侧都没有T，则人为引入错配碱基T，两个T碱基上分别标有荧光基团和荧光淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra或Eclipse；脱碱基修饰位点THF距离探针5’末端≥25个碱基，距离探针3’末端≥14个碱基；探针3’端连接有封闭基团，所述封闭基团选自C3-spacer,biotin-TEG或phosphate。

2.权利要求1所述的基因分型探针，其特征在于在探针上游5’方向的2号和/或3号位点引入人为错配,即分型位点上游紧邻的第一个或第二个碱基位置。

3.权利要求1-2任一项所述的基因分型探针，其特征在于获得该探针检测的模板的引物对中，引物长度为30-35bp，与分型探针结合于同一条模板链的引物的3’末端距离探针THF位点≥5个碱基的距离。

4.一种非诊断目的基因分型检测方法，包括以下步骤：

（1）获得权利要求1-2任一项所述的基因分型探针；

（2）获得权利要求3中的引物对；

（3）获得待检测基因模板或细胞裂解液；

（4）使用上述探针、引物对、模板进行基于重组酶的恒温扩增；

（5）分析数据。

5.权利要求4所述的非诊断目的基因分型检测方法，其特征在于所述基于重组酶的恒温扩增为重组酶聚合酶扩增法。

6.权利要求5所述的非诊断目的基因分型检测方法，其特征在于所述重组酶恒温扩增反应体系包括下列组分：权利要求1-2任一项所述基因分型探针、权利要求3中的引物对和待检测模板。

7.权利要求6所述的非诊断目的的基因分型检测方法，其特征在于反应体系还包括重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。

8.权利要求7所述的非诊断目的的基因分型检测方法，其特征在于所述重组酶选自噬菌体UvsX 蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合;所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶的任一种或一种以上的组合；所述单链DNA结合蛋白选自大肠杆菌SSB蛋白，GP32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶III，核酸内切酶IV；所述重组加载蛋白选自噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO 或大肠杆菌RecR的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合；所述能量系统选自ATP或ATP，磷酸肌酸，肌酸激酶的组合；盐离子选自Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。

9.权利要求8所述的非诊断目的的基因分型检测方法，其特征在于所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000， PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000。

10.权利要求4-9任一项所述的非诊断目的基因分型检测方法，其特征在于反应温度为30-45℃，反应时间为20-40分钟。

11.一种基因分型检测试剂盒，其特征在于包括下列组分：权利要求1-2任一项所述基因分型探针、权利要求3中的引物对和待检测模板。

12.权利要求11所述的基因分型检测试剂盒，其特征在于试剂盒还包括重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。

13.权利要求12所述的基因分型检测试剂盒，其特征在于所述重组酶选自噬菌体UvsX蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合；所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶的任一种或一种以上的组合；所述单链DNA结合蛋白选自大肠杆菌SSB蛋白，GP32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶III，核酸内切酶IV；所述重组加载蛋白选自噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO 或大肠杆菌RecR的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合；所述能量系统选自ATP或ATP，磷酸肌酸，肌酸激酶的组合；盐离子选自Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。

14.权利要求13所述的基因分型检测试剂盒，其特征在于所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000， PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000。

15.权利要求1-2任一项所述基因分型探针和权利要求3中的引物对在非诊断目的基因分型检测中的应用。

16.一种利用双探针非诊断目的检测单核苷酸多态性的方法，其中一条探针与待检的野生型基因部分互补，另一条探针与待检的含有单核苷酸突变的基因部分互补，两条探针分别连有不同波长的荧光基团和荧光淬灭基团，探针长度为46-52bp，每条探针包含一个脱碱基修饰位点四氢呋喃，该修饰位点位于荧光基团和淬灭基团之间且该修饰位点位于基因分型位点下游方向即3’方向的第一个碱基上，以基因分型位点为1号位点，在探针上游方向即5’方向的2-4号位点人为引入至少一个与待检序列错配的碱基，在THF位点两侧5个碱基以内上游和下游各有一个T；如果只有一侧有T或两侧都没有T，则人为引入错配碱基T，两个T碱基上分别标有荧光基团和荧光淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、TaxasRed或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra或Eclipse；脱碱基修饰位点THF距离探针5’末端≥25个碱基，距离探针3’末端≥14个碱基；探针3’端连接有封闭基团，所述封闭基团选自C3-spacer,biotin-TEG或phosphate。

17.权利要求16所述的检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于探针上游5’方向的2号和/或3号位点引入人为错配,即分型位点上游紧邻的第一个或第二个碱基位置。

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