KR102543156B1 - 높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물 - Google Patents

높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 매우 낮은 농도의 표적핵산(target nucleic acid)을 높은 특이도로 증폭할 수 있는 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적핵산이 존재할 경우, 표적핵산과 결합한 길잡이 프로브와 상기 길잡이 프로브에 결합하여 표적핵산을 증폭할 수 있는 부분 프라이머를 통해 높은 특이도로 표적핵산의 증폭산물(amplicon)을 생성하는 방법 및 상기 방법 구현을 위한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 표적핵산 증폭방법은 길잡이 프로브를 이용하여 샘플 내 존재하는 혼성화 가능한 모든 핵산에 결합하면서 부분 프라이머의 표적핵산 검출부위 결합을 돕기 때문에 매우 낮은 농도로 존재하는 표적핵산도 증폭이 가능하며, 또한 부분 프라이머의 서열 특이성에 의해 표적핵산 이외의 핵산은 증폭 속도에서 차이가 발생하여 표적핵산을 높은 특이도로 검출할 수 있는 장점이 있으므로, 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암 진단, 유전관련 진단, 유전형질 진단, 감염균의 진단, 약제내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종판별 등에 유용하다.

Description

높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물{Method and Kits for Amplifying Target Nucleic Acid with High Specificity}
본 발명은 매우 낮은 농도의 표적핵산(target nucleic acid)을 높은 특이도로 증폭할 수 있는 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적핵산이 존재할 경우, 표적핵산과 결합한 길잡이 프로브(guide probe)와 상기 길잡이 프로브에 결합하여 표적핵산을 증폭할 수 있는 부분 프라이머(partial primer)를 통해 높은 특이도로 표적핵산의 증폭산물(amplicon)을 생성하는 방법 및 상기 방법 구현을 위한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)용 조성물에 관한 것이다.
지구상 모든 생명체가 가진 유전정보는 각 개체가 지닌 고유한 속성의 근원이 되며 이는 핵산(DNA 또는 RNA) 이라는 물질에 아데닌(A; adenine), 구아닌(G; guanine), 시토신(C; cytosine), 티민(T; thymine), 우라실(U; uracil)의 염기가 배열된 순서로 기록된다. 따라서 이러한 염기의 순서(염기서열)를 밝히거나 확인하는 일은 생명체의 속성을 확인하고 내재된 대사 기작을 이해하기 위한 과정이 될 수 있다.
최근 생명체의 특정 염기서열을 검출 또는 확인하는 방법을 통해 생명체의 존재 여부 또는 그 속성을 확인하는 분자진단(molecular diagnostics)법이 널리 활용되고 있다. 의학적으로 활용되는 분자진단의 대표적인 예로 인간의 암 발생과 관계된 유전자 돌연변이(mutation)를 검출하거나 인간에게 발생할 수 있는 감염 질환의 원인 병원체를 검출하는 것이 있고, 그 외 식품에 존재하는 유해 미생물을 검출하는 검사 역시 분자진단에 속한다.
특정 염기서열을 특이적으로 확인하기 위한 분자진단의 여러 기법 중 대다수가 핵산 중합효소(DNA polymerase)를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용한다. 상기 중합효소연쇄반응은 특정 염기서열 부위를 포함하는 표적핵산(target nucleic acid)에 특이적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 1쌍의 프라이머(primer) 및 상기 프라이머를 시발체로 하여 표적핵산을 주형으로 중합효소연쇄반응을 일으킬 수 있는 내열성(thermo-stable) 핵산 중합효소를 포함한 조성물, 그리고 상기 조성물에 정해진 온도를 단계적이고 반복적으로 부여할 수 있는 장치(thermal cycler)를 통해 이루어진다. 또한 상기 중합효소연쇄반응을 통한 분자진단은 대량으로 형성된(증폭된) 표적핵산 내 특정 염기서열을 실시간으로 검출하기 위해 핵산 결합 염료(nucleic acids-binding dye) 또는 프로브(probe)를 활용하는데, 이러한 것들을 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)이라 부른다(Higuchi, R. et al., Biotechnology 1992. 10:413-417, Higuchi, R. et al., Biotechnology 1993. 11:1026-1030).
상기 분자진단에서, 인간의 암 발생과 관계된 유전자 돌연변이를 검출하는 것은 높은 민감도(sensitivity)와 높은 특이도(specificity)를 요구한다. 검출하고자 하는 돌연변이가 체성돌연변이(somatic mutation)에 속하므로 돌연변이가 일어나지 않은(wild-type) 정상 DNA와 섞여 매우 미량 존재하며, 정상 유전자와 염기서열 차이가 크지 않은 점돌연변이(point mutation) 혹은 염기서열 변이가 복잡하게 나타나는 삽입/삭제 돌연변이(insertion/deletion), 유전자 융합 돌연변이(gene fusion) 등에서 목표 변이를 정확히 인식하지 못하면 위양성(false-positive)을 발생시킬 수 있기 때문이다.
즉, 종양 특이적인 돌연변이 검출검사에서 중요하게 요구되는 사항은 (1) 정상 DNA 속에서 낮은 비율로 존재하는 돌연변이 DNA를 검출할 수 있는 민감도 (sensitivity)와 (2) 정상 DNA를 돌연변이 DNA로 잘못 판정하는 위양성(false-positive) 비율을 최대한 낮출 수 있는 특이도 (specificity)를 갖추는 것이다.
종양 특이적인 돌연변이를 검출하는 다양한 검사법들이 개발 및 이용되고 있으며, 대표적인 방법으로 직접 염기서열분석법 (direct sequencing), 대립유전자특이증폭법 (allele-specific PCR; AS-PCR), 제한효소절편길이다형성법 (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), TaqMan 프로브 법, ARMS (amplification refractory mutation system) PCR 등이 있다. 그러나 이 방법들은 민감도와 특이도에 있어서 만족할 만한 결과를 보여주지 못하였다. 직접 염기서열분석법은 가장 특이도가 높아 위양성의 비율이 낮지만, 20~30% 이상의 돌연변이 DNA가 존재할 때만 검출이 가능한 단점이 있다. 반면 AS-PCR이나 RFLP, TaqMan 프로브 법 등은 민감도는 높으나 특이도가 낮아 위양성의 문제점을 항상 가지고 있다.
최근에는 PNA (peptide nucleic acid) 매개 PCR 클램핑법(Sun, X., et al., 2002. Nat Biotechnol, 20: 186-189), LNA (locked nucleic acid) 매개 PCR 클램핑법(Dominguez, P. L., et al., 2005. Oncogene, 24: 6830-6834), COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR)(Li, J., et al., 2008. Nat. Med, 14: 579-584) 등의 민감도와 특이도가 크게 개선된 방법이 개발되는 등, 높은 특이도의 염기서열 분석 능력이 점차 강조되고 있는 실정이다.
ARMS-PCR 방법은 AS-PCR의 단점인 특이도를 향상할 수 있는 방안으로 개발된 방법으로 AS-PCR과 동일하게 프라이머가 주형의 서열과 완벽한 상보서열로 구성되어야만 PCR이 시행된다는 원리에 기초하는데(Newton, C. R., et al., 1989. Nucl Acids Res, 17; 2503-2516), 특이도가 뛰어난 최적의 프라이머를 결정하기 위해서는 실험적 시행착오를 거쳐야 하는 단점이 있다(Drenkard, E., et al., 2000. Plant Physiol. 124: 1483-1492).
이에, 본 발명자들은 매우 낮은 농도로 존재하는 표적핵산 증폭의 특이도(specificity)를 획기적으로 증가시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization) 할 수 있는 길잡이 프로브(Guide probe), 상기 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer) 및 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer)를 이용하여 증폭산물을 생성하는 방법으로 PCR을 수행할 경우, 매우 낮은 농도의 표적핵산을 높은 특이도로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 매우 낮은 농도의 표적핵산을 높은 특이도로 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 매우 낮은 농도의 표적핵산을 높은 특이도로 증폭할 수 있는 표적핵산 증폭용 중합효소연쇄반응(PCR) 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) i) 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization)할 수 있는 길잡이 프로브(Guide probe); ii) 상기 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer); 및 iii) 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer); 를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 증폭산물의 존재 여부를 판별하는 단계를 포함하는 표적핵산 증폭방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization)할 수 있는 길잡이 프로브(Guide probe); ii) 상기 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer); 및 iii) 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer)를 포함하는 표적핵산 증폭용 PCR 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 표적핵산 증폭방법은 길잡이 프로브를 이용하여 샘플 내 존재하는 혼성화 가능한 모든 핵산에 결합하면서 부분 프라이머의 표적핵산 검출부위 결합을 돕기 때문에 매우 낮은 농도로 존재하는 표적핵산도 증폭이 가능하며, 또한 부분 프라이머의 서열 특이성에 의해 표적핵산 이외의 핵산은 증폭 속도에서 차이가 발생하여 표적핵산을 높은 특이도로 검출할 수 있는 장점이 있으므로, 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암 진단, 유전 관련 진단, 유전형질 진단, 감염균의 진단, 약제내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종판별 등에 유용하다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 필요한 구성물인 길잡이 프로브(guide probe), 부분 프라이머(partial primer), 특이 프라이머(specific primer) 및 구성물 간 혼성화 관계를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명을 통해 표적핵산과 비표적핵산의 염기서열 차이에 따른 증폭 효율 차이를 극대화하는 원리를 도시한 것으로, (a)는 본 발명의 부분 프라이머가 표적핵산과 혼성화하는 부분의 길이가 짧아 염기서열 불일치(mismatch)에 의한 혼성화 효율 차이가 크고, 이를 통해 정상 DNA와 돌연변이 DNA 간 증폭 효율 차이를 극대화할 수 있음을 나타내며, (b)는 통상의 프라이머가 표적핵산과 혼성화되는 부분의 길이가 길어 염기서열 불일치에 의한 혼성화 효율 차이가 작고, 이로 인해 정상 DNA와 돌연변이 DNA 간의 구별이 어려움을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명을 통해 표적핵산과 비표적핵산의 염기서열 차이에 따른 증폭 효율 차이를 이끌어내는 과정을 도시한 것으로, (a)는 표적핵산 존재 시 상기 표적핵산의 특정 부위와 혼성화되는 길잡이 프로브의 도움으로 상기 길잡이 프로브의 일부와 혼성화되는 부분 프라이머가 표적핵산의 목표 증폭 부위에 근접하게 되면, 부분 프라이머의 3‘ 말단 부위 일부가 상기 표적핵산 목표 증폭 부위의 염기서열과 상보적이어서 혼성화 및 신장 증폭이 일어나는 것을 나타내고, 이때 길잡이 프로브와 표적핵산 및 길잡이 프로브와 부분 프라이머의 결합은 Tm이 높으므로 먼저 혼성화하게 되고, 부분 프라이머와 표적핵산의 결합은 상보적인 서열 길이가 짧아 Tm이 낮으므로 나중에 혼성화하게 되며, (b)는 상기 표적핵산과 일부 염기서열이 다른 비표적핵산 존재 시 상기 길잡이 프로브가 상기 비표적핵산의 특정 부위와 혼성화되어 상기 길잡이 프로브의 일부와 혼성화되는 부분 프라이머가 비표적핵산에 근접하게 되더라도 상기 부분 프라이머의 3’ 말단 부위 일부와 상기 비표적핵산의 염기서열 간 상보성이 낮아 혼성화 및 신장 증폭이 억제되는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일구현예에 따라 특정 돌연변이를 야생형과 구분하여 검출하는 방법을 나타낸 개념도이다.
도 5는 본 발명의 일구현예에 따라 높은 특이도로 인간 유전체 내 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이(mutation)를 검출한 결과를 도시한 것으로, 3‘ 말단 일부가 V600E 돌연변이의 유전형(genotype)과 혼성화되도록 제작된 부분 프라이머를 이용할 경우, V600E 돌연변이 존재 시 높은 증폭 효율을 나타내어 비교적 낮은 Ct 값이 산출되는 반면, 야생형(wild-type) 및 비표적 돌연변이들(V600A, V600D, V600G, V600K, V600M, V600R, K601E)이 존재하는 경우에는 낮은 증폭 효율이 나타나 비교적 높은 Ct 값이 산출되어, 결과적으로 Ct 값 비교를 통해 V600E 돌연변이 존재 여부를 판단할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일구현예에 따라 고민감도로 인간 유전체 내 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이를 검출한 결과를 도시한 것으로, 3‘ 말단 일부가 G12C 돌연변이의 유전형과 혼성화되도록 제작된 부분 프라이머를 이용할 경우, 극소량(1% 및 0.5%)의 G12C 돌연변이 존재 시 높은 증폭 효율이 나타나 비교적 낮은 Ct 값이 산출되는 반면, 야생형만 존재하는 경우에는 증폭 곡선이 형성되지 않아, 결과적으로 Ct 값 비교를 통해 G12C 돌연변이 존재 여부를 판단할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일구현예에 따라 인간 유전체 내 MET 유전자의 D1002N, D1002G, Y1003F, Y1003N, Y1003*(1), Y1003*(2) 돌연변이를 단일 반응액 내에서 검출한 결과를 도시한 것으로, 3‘ 말단 일부가 D1002N, D1002G, Y1003F, Y1003N, Y1003*(1), Y1003*(2) 돌연변이 유전형과 혼성화되도록 6종의 부분 프라이머를 각기 제작하고 혼합하여 사용할 경우, 표적 돌연변이 존재 시 높은 증폭 효율이 나타나 비교적 낮은 Ct 값이 산출되는 반면, 야생형만 존재하는 경우에는 낮은 증폭 효율이 나타나 비교적 높은 Ct 값이 산출되어, 결과적으로 Ct 값 비교를 통해 표적 돌연변이 존재 여부를 판단할 수 있다.
도 8은 본 발명의 길잡이 프로브에 포함될 수 있는 링커의 예시이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 인간 유전체 내 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이를 검출할 수 있는 검출한계를 측정한 결과로, 표적 돌연변이 핵산이 반응 당 약 0.5%(20 copy)만 존재하더라도 검출할 수 있는 수준의 매우 높은 민감도와 더불어 특이도 역시 뛰어난 것을 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 매우 낮은 농도의 표적핵산을 길잡이 프로브와 부분 프라이머를 이용하여 검출할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인간 BRAF 유전자의 exon 15, codon 600에 위치하는 GTG>GAG 염기서열 변이인 V600E 돌연변이를 특이적으로 증폭하고 검출하기 위하여, BRAF 유전자의 codon 600 인근 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길잡이 프로브, V600E 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자의 codon 600 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머, 상기 부분 프라이머와 쌍(pair)을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있도록 BRAF 유전자의 exon 15 염기서열 일부와 혼성화할 수 있는 특이 프라이머를 설계하였으며, 이때 상기 길잡이 프로브의 C 말단 일부 염기서열과 상기 부분 프라이머의 5’ 말단 일부 염기서열이 혼성화될 수 있도록 하였다.
야생형 핵산 및 V600 위치에 존재하는 다양한 돌연변이들의 존재 하에서 상기 V600E를 검출할 수 있는지 상기 길잡이 프로브, 부분 프라이머 및 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 모든 표적핵산 주입 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되었으나, 다른 조건들 대비 V600E 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 더 빠르게 나타나 더 낮은 Ct 값이 산출되는 것을 확인하였다(도 5).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) i) 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization)할 수 있는 길잡이 프로브(guide probe); ii) 상기 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer); 및 iii) 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer); 를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 증폭산물의 존재 여부를 판별하는 단계를 포함하는 표적핵산 증폭방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “표적핵산(target nucleic acid)”은 증폭(amplification) 혹은 검출하고자 하는 관심 염기서열을 포함하는 모든 종류의 핵산을 의미한다. 상기 표적핵산은 여러 종(species), 아종(subspecies), 또는 변종(variant) 유래의 유전자 염기서열 또는 동일 종 내 유전자 돌연변이를 포함하고, 이는 genomic DNA와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 표적핵산은 중합효소연쇄반응을 위한 조건 하에서 길잡이 프로브, 부분 프라이머(3‘ 말단 일부), 특이 프라이머와 혼성화될 수 있다.
본 발명에서 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적 염기서열을 가진 단일 가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.
본 발명에서 용어 “길잡이 프로브(guide probe)”는 표적핵산 및 부분 프라이머와 동시에 혼성화될 수 있으며, 부분 프라이머의 3‘ 말단이 표적핵산의 표적 염기서열과 혼성화될 수 있도록 돕는 것을 특징으로 한다. 상기 길잡이 프로브는 표적핵산과 혼성화될 수 있는 모든 소재(예컨대, DNA, RNA, LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid) 등) 중 어느 하나 혹은 둘 이상의 혼합으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어 “부분 프라이머(partial primer)”는 5‘ 말단 부위 일부가 길잡이 프로브와 혼성화되고, 3’ 말단 부위가 표적핵산의 표적 염기서열과 혼성화되어 핵산중합효소(nucleic acid polymerase)를 통한 합성 신장(extension)이 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 표적핵산, 길잡이 프로브, 부분 프라이머는 상호 혼성화(표적핵산 - 길잡이 프로브, 길잡이 프로브 - 부분 프라이머, 부분 프라이머 - 표적핵산)된다. 길잡이 프로브가 표적핵산의 표적 염기서열 인근에 결합하면서, 동시에 혼성화되어 있는 부분 프라이머가 상기 표적 염기서열 인근에 위치하도록 하고, 이를 통해 부분 프라이머의 3‘ 말단이 상기 표적 염기서열에 보다 쉽게 혼성화되어 핵산중합효소를 통한 합성 신장 및 표적핵산의 표적 부위 증폭이 개시 된다.
표적핵산-길잡이 프로브 및 길잡이 프로브-부분 프라이머 사이의 혼성화는 서로 상보적인 부분이 부분 프라이머-표적핵산에 비해 길기 때문에 Tm이 높아 먼저 혼성화되고, 부분 프라이머-표적핵산은 상대적으로 Tm이 낮기 때문에 나중에 혼성화된다.
본 발명에서 용어 “특이 프라이머(specific primer)”는 상기 길잡이 프로브의 도움을 받지 않고 표적핵산에 혼성화되어 핵산중합효소를 통한 합성 신장이 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 길잡이 프로브에서 표적핵산과 혼성화하는 부위는 5‘ 말단 또는 N 말단에 존재하며, 부분 프라이머와 혼성화하는 부위는 3’ 말단 또는 C 말단에 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 표적핵산 혼성화 부위와 부분 프라이머 혼성화 부위 사이에 링커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 표적핵산 혼성화 부위와 부분 프라이머 혼성화 부위 사이에 존재하여 두 부위를 연결하는 핵산 염기를 포함하지 않는 화합물이면 제한 없이 이용 가능하며, 바람직하게는 베타-알라닌(β-Ala-OH, C3), 아미노부티르산(aminobutyric acid, C4), 아미노헥사노산(aminohexanoic acid, C6), 아미노라우르산(aminolauric acid, C12), 아세토아세톡실에틸 아크릴레이트(acetoacetoxyethyl acrylate, AAEA(O-linker)), 아미노에톡시에톡시에톡시아세트산(2-[2-[2-[2-(amino)ethoxy]ethoxy]ethoxy]acetic acid, AEEEA), AEEEEA, DL15 및 L35로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 길잡이 프로브, 부분 프라이머 및 특이 프라이머는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), LNA (locked nucleic acid) 및 PNA(peptide nucleic acid) 중 어느 하나 또는 이들의 혼합으로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 표적핵산 및 부분 프라이머와 혼성화할 수 있는 핵산이면 제한 없이 이용 가능하나, 바람직하게는 10 내지 500개의 염기서열 길이로 제작된 PNA일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20 내지 150개의 염기서열 길이로 제작된 PNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 특이 프라이머가 혼성화하는 표적핵산의 반대 가닥에 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부분 프라이머는 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열 사이에 1 내지 100개의 염기서열 길이로 제작된 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 스페이서는 부분 프라이머에 포함되어있는 길잡이 프로브에 혼성화하는 서열과 표적핵산에 혼성화하는 서열을 제외한 서열을 의미하고, 필요한 경우 상기 스페이서에 결합 가능한 프로브를 이용하여 표적핵산 염기서열이 변경되더라도 동일한 프로브로 검출을 수행하도록 하는 기능을 할 수 있다.
본 발명에서 상기 스페이서와 상기 길잡이 프로브의 링커는 길잡이 프로브에 의해 표적핵산 표적부위 인근에 위치하게 되는 부분 프라이머가 표적부위에 혼성화하는 효율을 조절하는 역할을 수행할 수 있다. 이는, 길잡이 프로브가 상기 표적부위와 조금 먼 위치의 표적핵산에 혼성화되는 경우, 상기 스페이서와 링커의 길이를 증가시키면 부분 프라이머가 표적부위에 혼성화되는 것에 도움을 줄 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 부분 프라이머의 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열은 3 내지 15개의 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭산물의 길이는 50 bp 내지 1 kbp인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭산물의 존재유무를 판별하는 단계는 상기 증폭산물에 결합 가능한 핵산 결합 염료(nucleic acids-binding dye) 또는 프로브(probe)를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 결합 염료는 인터칼레이팅(intercalating) 물질 또는 DNA 마이너 그루브(minor groove) 결합 물질이면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide), 사이버그린 1(SYBRⓡ Green I), 사이버그린 골드(SYBRⓡ Gold), 에바그린(EvaGreen), 요프로-1(YO-PRO-1), 사이토(SYTO), 베보(BEBO) 및 벡스토(BEXTO)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
PNA (Peptide nucleic acid, 펩티드핵산)는 핵산 염기가 당-인산 골격이 아닌 펩티드 골격에 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 인공적으로 합성된 유전자 인식물질의 하나로, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다.
PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산 분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적인 안정성이 높아 장기 보관이 용이한 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP (single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다.
즉, PNA-DNA 결합력이 DNA-DNA 결합력보다 매우 우수하며, 1개의 뉴클레오티드 부정합(nucleotide mismatch)에도 융해온도(Tm) 값이 보통 15~20℃ 가량 차이 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP (single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del (insertion/deletion) 등의 염기서열 변화를 검출할 수 있게 된다.
본 발명에 있어서, 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 증폭산물 내 임의의 염기서열 및 표적핵산 염기서열과 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 양 말단에 리포터(reporter)와 소광자(quencher)가 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로브는 리포터와 소광자 간 거리가 가까울 때에는 신호 발생이 억제되다가 리포터와 소광자 간 거리가 멀어지면서 신호 세기가 증가한다. 일반적으로 상기 프로브가 상보적 염기서열과 혼성화하였을 때에 리포터와 소광자 간 거리가 가장 멀어지므로 신호 발생 또는 신호 세기 증가를 통해 특정 염기서열을 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), 탐라(TAMRA), 이클립스(Eclipse), DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 핵산중합효소를 통한 증폭산물의 검출은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 이루어지며, 이때 증폭산물의 증가에 따른 증폭곡선(amplification curve)을 수득하여 Ct (cycle threshold) 값을 측정하는 방식으로 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 Ct 값을 이용하는 방식의 경우, 시료 내 표적핵산에 표적 염기서열이 존재하여 증폭산물이 일찍 생성 및 증가할수록 검출 프로브에 의한 신호 발생량이 일찍 증가하여 threshold에 도달하는 cycle 수가 줄어들고 Ct 값이 적게 측정되는 원리를 이용한다.
본 발명은 다른 관점에서, i) 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization)할 수 있는 길잡이 프로브(guide probe); ii) 상기 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer); 및 iii) 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer); 를 포함하는 표적핵산 증폭용 PCR 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biological sample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 인간, 포유류 및 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는 표적핵산 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 표적핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기, 길잡이 프로브와 프라이머를 포함하는 용기 및 상기 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인간 유전체 내 V600E 돌연변이가 발생한 BRAF 유전자의 증폭 및 검출
1.1 프라이머 및 프로브 제작
인간 BRAF 유전자는 체내 신호전달체계에서 기능하는 성장 신호 전달 단백질 키나아제(growth signal transduction protein kinase)를 암호화하고 있으며, BRAF 유전자의 특정 돌연변이는 암 발생과 관계되어 있다고 알려져 있다(Zaman, A. et al., 2019. Cancers 11:1197.). 상기 기술한 인간 BRAF 유전자의 exon 15, codon 600에 위치하는 GTG>GAG 염기서열 변이를 V600E 돌연변이라 칭한다.
본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 상기 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이를 특이적으로 증폭하고 검출하기 위하여, BRAF 유전자의 codon 600 인근 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길잡이 프로브 1, V600E 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자의 codon 600 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 1, 상기 부분 프라이머 1과 쌍(pair)을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있도록 BRAF 유전자의 exon 15 염기서열 일부와 혼성화할 수 있는 특이 프라이머 1을 설계하였으며, 이때 상기 길잡이 프로브 1의 C 말단 일부 염기서열과 상기 부분 프라이머 1의 5’ 말단 일부 염기서열이 혼성화될 수 있도록 하였다. 또한 설계된 길잡이 프로브 및 프라이머들을 통해 증폭되는 산물을 검출할 수 있도록 검출 프로브 1을 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머 및 프로브의 염기서열을 표 1과 표 2에 개시하였다.
프라이머 서열
이름 서열번호 염기서열 (5‘ 말단 --> 3’ 말단)
부분 프라이머 1 서열번호 1 GTCGTCCGTGTTTTGATTTCTCTG
특이 프라이머 1 서열번호 2 GCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGAT
프로브 서열
이름 서열번호 염기서열 (N 말단 --> C 말단)
길잡이 프로브 1 서열번호 3 [K]-GGACCCACTCCATCG-[L35 linker]
-CACGGACGAC
검출 프로브 1 서열번호 4 [Dabcyl]-GGTGATTTTGGTCTA-[O linker]
-[K]-[FAM]
상기 부분 프라이머 1은 24 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 1의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 V600E 돌연변이가 발생한 BRAF 유전자의 codon 600 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 길잡이 프로브 1은 25 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 BRAF 유전자의 codon 600 인근 부위 염기서열과 상보적이고, 밑줄로 표시된 염기서열은 상기 부분 프라이머 1의 염기서열 일부와 상보적인 특징을 가진다. 또한 상기 길잡이 프로브 1의 N 말단에는 [K (lysine)]이 부착되어 있고, 상기 BRAF 유전자 염기서열과 상보적인 부위 및 부분 프라이머 1의 염기서열 일부와 상보적인 부위 사이에 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 L35 linker가 연결되어 있도록 하였다.
상기 검출 프로브 1은 15 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자(quencher)인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터(reporter)인 [FAM]이 각각 부착되어 있고, PNA와 [FAM] 사이에는 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 [O linker] 및 [K (lysine)]이 연결되도록 제작하였다. 상기 검출 프로브 1은 상보적 염기서열을 가진 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 증폭산물을 검출할 수 있다.
상기 부분 프라이머 1은 BRAF 유전자 내 표적 부위 염기서열과 상보적인 염기서열 길이가 10에 불과하여 중합효소연쇄반응(PCR) 조건 하에서 단독으로 상기 표적 부위에 혼성화되는 것이 어려우며, 다만 상기 표적 부위의 인근에 혼성화되는 길잡이 프로브 1이 존재하는 경우, 상기 길잡이 프로브 1의 염기서열 일부와 부분 프라이머 1의 염기서열 일부가 혼성화되면서 쉽게 상기 표적 부위에 혼성화될 수 있다.
상기 부분 프라이머 1은 BRAF 유전자 표적핵산 염기서열과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 10에 불과하며, 이는 표적핵산과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 18~30개인 통상의 프라이머보다 짧다. 따라서 만약 부분 프라이머 1과 상기 표적핵산 혼성화 부위 사이에 1개 이상의 상보적이지 않은(mismatch) 염기서열이 존재한다면, 상기 상보적이지 않은 염기서열이 혼성화 효율에 미치는 영향이 통상의 프라이머 보다 더 크게 되어 결과적으로 통상의 프라이머보다 염기서열의 미세한 변화를 더 잘 검출할 수 있다.
1.2 증폭산물 생성 및 확인
약 10,000 개(copy)의 야생형(wild-type) BRAF 유전자 표적핵산이 존재하는 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600E 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600A (codon 600 GTG>GCG) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600D (codon 600 GTG>GAT) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600G (codon 600 GTG>GGG) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600K (codon 600 GTG>AAG) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600M (codon 600 GTG>ATG) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 V600R (codon 600 GTG>AGG) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 BRAF 유전자 표적핵산과 약 500개의 K601E (codon 601 AAA>GAA) 돌연변이가 일어난 BRAF 유전자 표적핵산이 혼합된 조건에서 상기 의도한 증폭산물을 형성하도록 20 pmole의 길잡이 프로브 1과 10 pmole의 부분 프라이머 1, 4 pmole의 특이 프라이머 1, 3 pmole의 검출 프로브 1을 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다.
상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산중합효소(DNA polymerase)와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.
중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 5분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [63℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 50 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - measure [50℃, 30초] - annealing & extension [60℃, 1분]으로 수행하였다. 상기 두 번째 단계의 measure step에서 매 cycle 마다 FAM channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.
그 결과, 모든 표적핵산 주입 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되었으나, 다른 조건들 대비 V600E 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 더 빠르게 나타나 더 낮은 Ct 값이 산출되었다. 즉, V600E 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 22.5의 Ct 값이 관찰된 반면, 야생형만 존재하는 경우 혹은 비표적 돌연변이(V600A, V600D, V600G, V600K, V600M, V600R, K601E) 표적핵산이 혼합된 조건에서는 평균 29 이상의 Ct 값이 관찰되었으며, 결과적으로 Ct 값 차이를 통해 V600E 돌연변이만을 특이적으로 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 2. 인간 유전체 내 G12C 돌연변이가 발생한 KRAS 유전자의 고민감도 증폭 및 검출
2.1 프라이머 및 프로브 제작
인간 KRAS 유전자는 체내 신호전달체계에서 기능하는 지티피(GTP) 기반 스위치(switch) 단백질을 암호화하고 있으며, KRAS 유전자의 특정 돌연변이는 암 발생과 관계되어 있다고 알려져 있다(Waters, A. M. and Der, C. J. 2018. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 8:a031435.). 상기 기술한 인간 KRAS 유전자의 exon 2, codon 12에 위치하는 GGT>TGT 염기서열 변이를 G12C 돌연변이라 칭한다.
본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 상기 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이를 특이적으로 증폭하고 검출하기 위하여, KRAS 유전자의 codon 12 인근 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길잡이 프로브 2, G12C 돌연변이가 일어난 KRAS 유전자의 codon 12 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 2, 상기 부분 프라이머 2와 쌍(pair)을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있도록 KRAS 유전자의 exon 2 염기서열 일부와 혼성화할 수 있는 특이 프라이머 2를 설계하였으며, 이때 상기 길잡이 프로브 2의 C 말단 일부 염기서열과 상기 부분 프라이머 2의 5’ 말단 일부 염기서열이 혼성화될 수 있도록 하였다. 또한 설계된 길잡이 프로브 및 프라이머들을 통해 증폭되는 산물을 검출할 수 있도록 검출 프로브 2를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머 및 프로브의 염기서열을 표 3과 표 4에 개시하였다.
프라이머 서열
이름 서열번호 염기서열 (5‘ 말단 --> 3’ 말단)
부분 프라이머 2 서열번호 5 GCGTGTCCAG GAGCTTGT
특이 프라이머 2 서열번호 6 TGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC
프로브 서열
이름 서열번호 염기서열 (N 말단 --> C 말단)
길잡이 프로브 2 서열번호 7 [K]-CTTGTGGTAGTTGG-[L35 linker]
-CTGGACACGC
검출 프로브 2 서열번호 8 [Dabcyl]-GTCAAGGCACTC-[O linker]
-[K]-[FAM]
상기 부분 프라이머 2는 18 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 2의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 G12C 돌연변이가 발생한 KRAS 유전자의 codon 12 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 길잡이 프로브 2는 24 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 KRAS 유전자의 codon 12 인근 부위 염기서열과 상보적이고, 밑줄로 표시된 염기서열은 상기 부분 프라이머 2의 염기서열 일부와 상보적인 특징을 가진다. 또한 상기 길잡이 프로브 2의 N 말단에는 [K (lysine)]이 부착되어 있고, 상기 KRAS 유전자 염기서열과 상보적인 부위 및 부분 프라이머 2의 염기서열 일부와 상보적인 부위 사이에 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 L35 linker가 연결되어 있도록 하였다.
상기 검출 프로브 2는 12 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자(quencher)인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터(reporter)인 [FAM]이 각각 부착되어 있고, PNA와 [FAM] 사이에는 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 [O linker] 및 [K (lysine)]이 연결되도록 제작하였다. 상기 검출 프로브 2는 상보적 염기서열을 가진 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 증폭산물을 검출할 수 있다.
상기 부분 프라이머 2는 KRAS 유전자 내 표적 부위 염기서열과 상보적인 염기서열 길이가 8에 불과하여 중합효소연쇄반응(PCR) 조건 하에서 단독으로 상기 표적 부위에 혼성화되는 것이 어려우며, 다만 상기 표적 부위의 인근에 혼성화되는 길잡이 프로브 2가 존재하는 경우, 상기 길잡이 프로브 2의 염기서열 일부와 부분 프라이머 2의 염기서열 일부가 혼성화되면서 쉽게 상기 표적 부위에 혼성화될 수 있다.
상기 부분 프라이머 2는 KRAS 유전자 표적핵산 염기서열과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 8에 불과하며, 이는 표적핵산과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 18~30개인 통상의 프라이머보다 짧다. 따라서 만약 부분 프라이머 2와 상기 표적핵산 혼성화 부위 사이에 1개 이상의 상보적이지 않은(mismatch) 염기서열이 존재한다면, 상기 상보적이지 않은 염기서열이 혼성화 효율에 미치는 영향이 통상의 프라이머 보다 더 크게 되어 결과적으로 통상의 프라이머보다 염기서열의 미세한 변화를 더 잘 검출할 수 있다.
2.2 증폭산물 생성 및 확인
약 10,000 개(copy)의 야생형(wild-type) KRAS 유전자 표적핵산이 존재하는 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 KRAS 유전자 표적핵산과 약 100개의 G12C 돌연변이가 일어난 KRAS 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 KRAS 유전자 표적핵산과 약 50개의 G12C 돌연변이가 일어난 KRAS 유전자 표적핵산이 혼합된 조건에서 상기 의도한 증폭산물을 형성하도록 20 pmole의 길잡이 프로브 2와 10 pmole의 부분 프라이머 2, 4 pmole의 특이 프라이머 2, 3 pmole의 검출 프로브 2를 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다.
상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산중합효소(DNA polymerase)와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.
중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 5분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [63℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - measure [50℃, 10초] - denaturation [95℃, 20초] - annealing [58℃, 20초] - extension [72℃, 20초]로 수행하였다. 상기 두 번째 단계의 measure step에서 매 cycle 마다 FAM channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.
그 결과, G12C 돌연변이가 발생한 KRAS 표적핵산이 혼합된 모든 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 명확하게 관찰되었고, 반면 야생형 KRAS 표적핵산만 존재하는 조건에서는 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되지 않거나 매우 약하게 관찰되었다. 즉, G12C 돌연변이 표적핵산이 약 100개 또는 약 50개 혼합된 조건에서 각각 평균 12.4 및 평균 13.6의 Ct 값이 관찰된 반면, 야생형만 존재하는 조건에서는 Ct 값이 산출되지 않아(ND; not determined), 결과적으로 Ct 값 차이를 통해 매우 미량으로 존재하는 G12C 돌연변이를 특이적으로 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 3. 인간 유전체 내 D1002N, D1002G, Y1003F, Y1003N, Y1003* 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 증폭 및 검출
3.1 프라이머 및 프로브 제작
인간 MET 유전자는 c-Met 유전자로도 불리며, 체내 신호전달체계에서 기능하는 간세포 생장인자 수용체(hepatocyte growth factor receptor)를 암호화하고, MET 유전자의 특정 돌연변이 및 발현 조절 장애는 암 발생과 관계되어 있다고 알려져 있다(Sierra, J. R. and Tsao, M.-S. 2011. Ther. Adv. Med. Oncol. 3:S21-S35.). 상기 기술한 인간 MET 유전자의 exon 14, codon 1002에 위치하는 GAC>AAC 염기서열 변이를 D1002N 돌연변이로, exon 14 codon 1002에 위치하는 GAC>GGC 염기서열 변이를 D1002G 돌연변이로, exon 14 codon 1003에 위치하는 TAC>TTC 염기서열 변이를 Y1003F 돌연변이로, exon 14 codon 1003에 위치하는 TAC>AAC 염기서열 변이를 Y1003N 돌연변이로, exon 14 codon 1003에 위치하는 TAC>TAG 또는 TAC>TAA 염기서열 변이를 각각 Y1003*(1)과 Y1003*(2) 돌연변이로 칭한다.
본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 상기 MET 유전자의 D1002N, D1002G, Y1003F, Y1003N, Y1003*(1), Y1003*(2) 돌연변이를 하나의 반응액 조성에서 특이적으로 증폭하고 검출하기 위하여, MET 유전자의 codon 1002 및 codon 1003 인근 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길잡이 프로브 3, D1002N 돌연변이가 일어난 MET 유전자의 codon 1002 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 3, D1002G 돌연변이가 일어난 MET 유전자의 codon 1002 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 4, Y1003F 돌연변이가 일어난 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 5, Y1003N 돌연변이가 일어난 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 6, Y1003*(1) 돌연변이가 일어난 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 7, Y1003*(2) 돌연변이가 일어난 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 8, 상기 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8과 쌍(pair)을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있도록 MET 유전자의 exon 14 인근 염기서열 일부와 혼성화할 수 있는 특이 프라이머 3을 설계하였으며, 이때 상기 길잡이 프로브 3의 C 말단 일부 염기서열과 상기 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8의 5’ 말단 일부 염기서열이 혼성화될 수 있도록 하였다. 또한 설계된 길잡이 프로브 및 프라이머들을 통해 증폭되는 산물을 검출할 수 있도록 검출 프로브 3을 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머 및 프로브의 염기서열을 표 5과 표 6에 개시하였다.
프라이머 서열
이름 서열번호 염기서열 (5‘ 말단 --> 3’ 말단)
부분 프라이머 3 서열번호 9 GTCGTCCGTGTTTACGGTAGTTT
부분 프라이머 4 서열번호 10 GTCGTCCGTGTTTTGTAGCCTA
부분 프라이머 5 서열번호 11 GTCGTCCGTGTTTTCTCGGAAGT
부분 프라이머 6 서열번호 12 GTCGTCCGTGTTTTCTCGGTTGT
부분 프라이머 7 서열번호 13 GTCGTCCGTGTTTTCTCGCTAGT
부분 프라이머 8 서열번호 14 GTCGTCCGTGTTTTCTCGTTAGT
특이 프라이머 3 서열번호 15 CCATGATAGCCGTCTTTAACA
프로브 서열
이름 서열번호 염기서열 (N 말단 --> C 말단)
길잡이 프로브 3 서열번호 16 [K]-CTTCTGGAAAAGTAG-[L35 linker]
-CACGGACGAC
검출 프로브 3 서열번호 17 [Dabcyl]-TACGATGCAAG-[O linker]
-[K]-[FAM]
상기 부분 프라이머 3은 23 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 D1002N 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 codon 1002 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 부분 프라이머 4는 22 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 D1002G 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 codon 1002 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 부분 프라이머 5는 23 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 Y1003F 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 부분 프라이머 6은 23 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 Y1003N 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 부분 프라이머 7은 23 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 Y1003*(1) 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 부분 프라이머 8은 23 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 Y1003*(2) 돌연변이가 발생한 MET 유전자의 codon 1003 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 길잡이 프로브 3은 25 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 MET 유전자의 codon 1002 및 codon 1003 인근 부위 염기서열과 상보적이고, 밑줄로 표시된 염기서열은 상기 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8의 염기서열 일부와 상보적인 특징을 가진다. 또한, 상기 길잡이 프로브 3의 N 말단에는 [K (lysine)]이 부착되어 있고, 상기 MET 유전자 염기서열과 상보적인 부위 및 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8의 염기서열 일부와 상보적인 부위 사이에 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 L35 linker가 연결되어 있도록 하였다.
상기 검출 프로브 3은 11 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자(quencher)인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터(reporter)인 [FAM]이 각각 부착되어 있고, PNA와 [FAM] 사이에는 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 [O linker] 및 [K (lysine)]이 연결되도록 제작하였다. 상기 검출 프로브 3은 상보적 염기서열을 가진 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 증폭산물을 검출할 수 있다.
상기 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8은 MET 유전자 내 표적 부위 염기서열과 상보적인 염기서열 길이가 8 내지 9에 불과하여 중합효소연쇄반응(PCR) 조건 하에서 단독으로 상기 표적 부위에 혼성화되는 것이 어려우며, 다만 상기 표적 부위의 인근에 혼성화되는 길잡이 프로브 3이 존재하는 경우, 상기 길잡이 프로브 3의 염기서열 일부와 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8의 염기서열 일부가 혼성화되면서 쉽게 상기 표적 부위에 혼성화될 수 있다.
상기 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8은 MET 유전자 표적핵산 염기서열과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 8 내지 9에 불과하며, 이는 표적핵산과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 18~30개인 통상의 프라이머보다 짧다. 따라서 만약 부분 프라이머 3, 4, 5, 6, 7, 8과 상기 표적핵산 혼성화 부위 사이에 1개 이상의 상보적이지 않은(mismatch) 염기서열이 존재한다면, 상기 상보적이지 않은 염기서열이 혼성화 효율에 미치는 영향이 통상의 프라이머 보다 더 크게 되어 결과적으로 통상의 프라이머보다 염기서열의 미세한 변화를 더 잘 검출할 수 있다.
3.2 증폭산물 생성 및 확인
약 10,000 개(copy)의 야생형(wild-type) MET 유전자 표적핵산이 존재하는 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 MET 유전자 표적핵산과 약 500개의 D1002N 돌연변이가 일어난 MET 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 MET 유전자 표적핵산과 약 500개의 D1002G 돌연변이가 일어난 MET 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 MET 유전자 표적핵산과 약 500개의 Y1003F 돌연변이가 일어난 MET 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 MET 유전자 표적핵산과 약 500개의 Y1003N 돌연변이가 일어난 MET 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 MET 유전자 표적핵산과 약 500개의 Y1003*(1) 돌연변이가 일어난 MET 유전자 표적핵산이 혼합된 조건, 또는 약 10,000개의 야생형 MET 유전자 표적핵산과 약 500개의 Y1003*(2) 돌연변이가 일어난 MET 유전자 표적핵산이 혼합된 조건에서 상기 의도한 증폭산물을 형성하도록 30 pmole의 길잡이 프로브 3과 8 pmole의 부분 프라이머 3, 4 pmole의 부분 프라이머 4, 4 pmole의 부분 프라이머 5, 4 pmole의 부분 프라이머 6, 4 pmole의 부분 프라이머 7, 4 pmole의 부분 프라이머 8, 3 pmole의 특이 프라이머 3, 2 pmole의 검출 프로브 3를 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다.
상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산중합효소(DNA polymerase)와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.
중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 5분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [63℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - measure [50℃, 10초] - denaturation [95℃, 20초] - annealing [58℃, 20초] - extension [72℃, 20초]로 수행하였다. 상기 두 번째 단계의 measure step에서 매 cycle 마다 FAM channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.
그 결과, 모든 표적핵산 주입 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 관찰되었으나, 야생형 MET 유전자 표적핵산만 주입된 조건 대비 D1002N, D1002G, Y1003F, Y1003N, Y1003*(1), Y1003*(2) 돌연변이 표적핵산이 혼합된 각각의 조건에서 증폭곡선 상의 형광 신호 상승이 더 빠르게 나타나 더 낮은 Ct 값이 산출되었다. 즉, D1002N 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 19.9의 Ct 값이, D1002G 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 18.6의 Ct 값이, Y1003F 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 21.2의 Ct 값이, Y1003N 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 17.5의 Ct 값이, Y1003*(1) 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 17.5의 Ct 값이, Y1003*(2) 돌연변이 표적핵산이 혼합된 조건에서 평균 20.6의 Ct 값이 관찰된 반면, 야생형 표적핵산만 존재하는 조건에서는 평균 28.0의 Ct 값이 관찰되었으며, 결과적으로 Ct 값 차이를 이용하여 검출하려고 했던 모든 돌연변이들을 하나의 반응액 조성을 통해 특이적으로 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 4. 인간 유전체 내 G12C 돌연변이가 발생한 KRAS 유전자의 검출한계 확인
4.1 프라이머 및 프로브 제작
본 발명의 신규한 표적핵산 증폭 방법을 통해 인간 KRAS 유전자의 exon 2, codon 12에 위치하는 G12C 돌연변이(GGT>TGT 염기서열 변이)를 특이적으로 증폭하고 검출하기 위하여, KRAS 유전자의 codon 12 인근 부위에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길잡이 프로브 4, G12C 돌연변이가 일어난 KRAS 유전자의 codon 12 및 인근 부위에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 2, 상기 부분 프라이머 2와 쌍(pair)을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있도록 KRAS 유전자의 exon 2 염기서열 일부와 혼성화할 수 있는 특이 프라이머 2를 설계하였으며, 이때 상기 길잡이 프로브 4의 C 말단 일부 염기서열과 상기 부분 프라이머 2의 5’ 말단 일부 염기서열이 혼성화될 수 있도록 하였다. 또한, 설계된 길잡이 프로브 및 프라이머들을 통해 증폭되는 산물을 검출할 수 있도록 검출 프로브 2를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea).
한편, KRAS 유전자의 G12C 돌연변이 존재 여부와 관계없이 시료 내 KRAS 유전자를 특이적으로 증폭하고 검출하기 위하여, KRAS 유전자의 exon 6에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길잡이 프로브 5, KRAS 유전자의 exon 6에 3‘ 말단 일부가 특이적으로 혼성화할 수 있는 부분 프라이머 9, 상기 부분 프라이머 9와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있도록 KRAS 유전자의 exon 6 염기서열 일부와 혼성화할 수 있는 특이 프라이머 4를 설계하였으며, 이때 상기 길잡이 프로브 5의 C 말단 일부 염기서열과 상기 부분 프라이머 9의 5’ 말단 일부 염기서열이 혼성화될 수 있도록 하였다. 또한, 설계된 길잡이 프로브 및 프라이머들을 통해 증폭되는 산물을 검출할 수 있도록 검출 프로브 4를 설계하여 제조하였다(PANAGENE Inc., South Korea). 각 프라이머 및 프로브의 염기서열을 표 7과 표 8에 개시하였다.
프라이머 서열
이름 서열번호 염기서열 (5‘ 말단 --> 3’ 말단)
부분 프라이머 2 서열번호 5 GCGTGTCCAG GAGCTTGT
특이 프라이머 2 서열번호 6 TGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC
부분 프라이머 9 서열번호 18 GTCGTCCGTG CCTTCCACA
특이 프라이머 4 서열번호 19 TGTAGGGCATTTCTGATGTGACTC
프로브 서열
이름 서열번호 염기서열 (N 말단 --> C 말단)
길잡이 프로브 4 서열번호 20 [K]-ACTTGTGGTAGTTG-[L35 linker]
-CTGGACACGC
검출 프로브 2 서열번호 8 [Dabcyl]-GTCAAGGCACTC-[O linker]
-[K]-[FAM]
길잡이 프로브 5 서열번호 21 [K]-AGTGTCATCTTGCCT-[L35 linker]
-CACGGACGAC
검출 프로브 4 서열번호 22 [Dabcyl]-CAGCAGTAAATCT-[O linker]
-[K]-[HEX]
상기 부분 프라이머 2는 18 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 4의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 G12C 돌연변이가 발생한 KRAS 유전자의 codon 12 및 인근 부위 염기서열과 상보적인 특성을 가진다.
상기 부분 프라이머 9는 19 염기서열 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 제작하였으며, 밑줄로 표시된 염기서열은 길잡이 프로브 5의 염기서열 일부와 상보적이고, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 KRAS 유전자의 exon 6 염기서열 일부와 상보적인 특성을 가진다.
상기 길잡이 프로브 4는 24 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 KRAS 유전자의 codon 12 인근 부위 염기서열과 상보적이고, 밑줄로 표시된 염기서열은 상기 부분 프라이머 2의 염기서열 일부와 상보적인 특징을 가진다. 또한, 상기 길잡이 프로브 4의 N 말단에는 [K (lysine)]이 부착되어 있고, 상기 KRAS 유전자 염기서열과 상보적인 부위 및 부분 프라이머 2의 염기서열 일부와 상보적인 부위 사이에 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 L35 linker가 연결되어 있도록 하였다.
상기 길잡이 프로브 5는 25 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, 이탤릭으로 표시된 염기서열은 KRAS 유전자의 exon 6 염기서열 일부와 상보적이고, 밑줄로 표시된 염기서열은 상기 부분 프라이머 9의 염기서열 일부와 상보적인 특징을 가진다. 또한 상기 길잡이 프로브 5의 N 말단에는 [K (lysine)]이 부착되어 있고, 상기 KRAS 유전자 염기서열과 상보적인 부위 및 부분 프라이머 9의 염기서열 일부와 상보적인 부위 사이에 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 L35 linker가 연결되어 있도록 하였다.
상기 검출 프로브 2는 12 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자(quencher)인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터(reporter)인 [FAM]이 각각 부착되어 있고, PNA와 [FAM] 사이에는 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 [O linker] 및 [K (lysine)]이 연결되도록 제작하였다.
상기 검출 프로브 4는 13 염기서열 길이의 PNA로 제작하였으며, N 말단에는 소광자인 [Dabcyl]이, C 말단에는 리포터인 [HEX]가 각각 부착되어 있고, PNA와 [HEX] 사이에는 제조사(PANAGENE Inc., South Korea)의 [O linker] 및 [K (lysine)]이 연결되도록 제작하였다.
상기 검출 프로브 2와 검출 프로브 4는 상보적 염기서열을 가진 각각의 증폭산물에 혼성화될 때 상기 소광자와 리포터가 가장 먼 거리로 떨어지게 되고, 이때 리포터로부터의 신호(형광)값이 최대가 되어, 상기 신호를 측정함으로써 각각의 증폭산물을 검출할 수 있다.
상기 부분 프라이머 2는 KRAS 유전자 내 표적 부위 염기서열과 상보적인 염기서열 길이가 8에 불과하여 중합효소연쇄반응(PCR) 조건 하에서 단독으로 상기 표적 부위에 혼성화되는 것이 어려우며, 다만 상기 표적 부위의 인근에 혼성화되는 길잡이 프로브 4가 존재하는 경우, 상기 길잡이 프로브 4의 염기서열 일부와 부분 프라이머 2의 염기서열 일부가 혼성화되면서 쉽게 상기 표적 부위에 혼성화될 수 있다.
상기 부분 프라이머 2는 KRAS 유전자 표적핵산 염기서열과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 8에 불과하며, 이는 표적핵산과 혼성화 가능한 염기서열 길이가 18~30개인 통상의 프라이머보다 짧다. 따라서 만약 부분 프라이머 2와 상기 표적핵산 혼성화 부위 사이에 1개 이상의 상보적이지 않은(mismatch) 염기서열이 존재한다면, 상기 상보적이지 않은 염기서열이 혼성화 효율에 미치는 영향이 통상의 프라이머보다 더 크게 되어 결과적으로 통상의 프라이머보다 염기서열의 미세한 변화를 더 잘 검출할 수 있다.
상기 부분 프라이머 9는 KRAS 유전자 내 표적 부위 염기서열과 상보적인 염기서열 길이가 9에 불과하여 중합효소연쇄반응(PCR) 조건 하에서 단독으로 상기 표적 부위에 혼성화되는 것이 어려우며, 다만 상기 표적 부위의 인근에 혼성화되는 길잡이 프로브 5가 존재하는 경우, 상기 길잡이 프로브 5의 염기서열 일부와 부분 프라이머 9의 염기서열 일부가 혼성화되면서 쉽게 상기 표적 부위에 혼성화될 수 있다.
상기 부분 프라이머 9의 3‘ 말단은 KRAS 유전자의 exon 6 염기서열 일부와 혼성화되며 이는 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이 존재 여부와 관계없이 일어날 수 있으므로, 이러한 특성을 고려하여 상기 부분 프라이머 9를 통한 증폭을 대조군(control)으로 활용할 수 있다.
즉, 만약 시료 내 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이가 존재하지 않는다면 상기 부분 프라이머 2를 통한 증폭(Target 증폭)은 억제되는 반면, 상기 부분 프라이머 9를 통한 증폭(Control 증폭)은 원활하게 나타나 두 증폭 곡선의 계산된 Ct 값 간 차이(ΔCt)가 크게 나타날 것이고, 반면 시료 내 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이가 존재한다면 상기 부분 프라이머 2와 부분 프라이머 9를 통한 증폭이 모두 원활하게 일어나 두 증폭 곡선을 통해 계산된 Ct 값 간 차이가 작게 나타나므로, 이를 이용하여 G12C 돌연변이 존재 여부를 쉽게 판단할 수 있다.
4.2 증폭산물 생성 및 확인
약 4,000 개(copy)의 야생형(wild-type) KRAS 유전자 표적핵산이 존재하는 조건, 또는 야생형 KRAS 유전자 표적핵산과 G12C 돌연변이가 일어난 KRAS 유전자 표적핵산이 각각 0:100 (100% G12C), 50:50 (50% G12C), 90:10 (10% G12C), 96:4 (4% G12C), 98:2 (2% G12C), 99:1 (1% G12C), 99.5:0.5 (0.5% G12C) 비율로 혼합되어 상기 야생형 KRAS 유전자 표적핵산과 G12C 돌연변이가 일어난 KRAS 유전자 표적핵산의 개수 합이 약 4,000개(copy)가 되도록 한 조건, 또는 야생형 KRAS 유전자 표적핵산과 비표적 돌연변이인 G12A (codon 12가 GGT>GCT로 변화), G12D (codon 12가 GGT>GAT로 변화), G12R (codon 12가 GGT>CGT로 변화), G12S (codon 12가 GGT>AGT로 변화), G12V (codon 12가 GGT>GTT로 변화), G13C (codon 13이 GGC>TGC로 변화), G13D (codon 13이 GGC>GAC로 변화)가 일어난 KRAS 유전자 표적핵산이 각각 90:10 (10% G12A, 10% G12D, 10% G12R, 10% G12S, 10% G12V, 10% G13C, 10% G13D) 비율로 혼합되어 개수 합이 약 4,000개(copy)가 되도록 한 조건에서 상기 의도한 증폭산물들을 형성하도록 30 pmole의 길잡이 프로브 4와 15 pmole의 길잡이 프로브 5, 25 pmole의 부분 프라이머 2, 7 pmole의 부분 프라이머 9, 3 pmole의 특이 프라이머 2, 2 pmole의 특이 프라이머 4, 3 pmole의 검출 프로브 2, 3 pmole의 검출 프로브 4를 포함한 중합효소연쇄반응용 조성물을 제조하였다.
상기 중합효소연쇄반응용 조성물에는 통상적으로 중합효소연쇄반응에 사용되는 핵산중합효소(DNA polymerase)와 더불어 버퍼(buffer), 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP), 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 계면활성제(detergent) 등의 요소들이 포함되었다.
중합효소연쇄반응을 위한 온도 조절은 일반적인 thermal cycler를 통해 이루어졌으며, initial denaturation [95℃, 5분] 이후, 15 cycle의 첫 번째 단계인 denaturation [95℃, 20초] - annealing [63℃, 20초] - extension [72℃, 20초]을 거쳐, 35 cycle의 두 번째 단계인 denaturation [95℃, 10초] - measure [50℃, 10초] - denaturation [95℃, 20초] - annealing [58℃, 20초] - extension [72℃, 20초]로 수행하였다. 상기 두 번째 단계의 measure step에서 매 cycle 마다 FAM 및 HEX channel의 형광값을 측정하여 증폭곡선을 도출하였다.
FAM channel로부터 도출된 증폭곡선으로부터 Ct 값을 산출하여 “Target 부위 증폭 Ct”라 칭하고, HEX channel로부터 도출된 증폭곡선으로부터 Ct 값을 산출하여 “Control 부위 증폭 Ct”라 칭한 후, 상기 Control 부위 증폭 Ct에서 Target 부위 증폭 Ct를 빼주어 ΔCt 값을 구한 결과, G12C 돌연변이가 주입된 조건과 야생형 또는 비표적 돌연변이가 주입된 조건 간 명확한 ΔCt 값 차이가 확인되었다.
즉, 상기 ΔCt 값이 -5 이상인 경우 “G12C 돌연변이 양성”으로, 상기 ΔCt 값이 -5 미만인 경우 “G12C 돌연변이 음성”으로 판정한 결과, 100% G12C, 50% G12C, 10% G12C, 4% G12C, 2% G12C, 1% G12C가 주입된 모든 반응에서 G12C 돌연변이 양성이 판정되었고, 0.5% G12C가 주입된 8회의 반응 중 6회에서 G12C 돌연변이 양성이 판정되었다. 반면 야생형 주입조건 및 비표적 돌연변이가 주입된 조건은 모두 G12C 돌연변이 음성으로 판정되었다. 이상의 결과를 통해 표적 돌연변이 핵산이 반응 당 약 20~40개(copy)만 존재해도 검출할 수 있는 수준의 높은 민감도와 함께 특이도 또한 우수함이 확인되었다(도 9).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (18)

  1. (a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
    (b) i) 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization)할 수 있는 부위; 및 표적핵산과 혼성화하지 않는 부위;를 포함하는 길잡이 프로브(guide probe);
    ii) 상기 길잡이 프로브의 표적핵산과 혼성화하지 않는 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer); 및
    iii) 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer);
    를 주입하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
    (c) 증폭산물의 존재 여부를 판별하는 단계를 포함하는 표적핵산 검출부위 증폭방법에 있어서,
    상기 부분 프라이머의 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열은 3 내지 15개의 염기서열인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 길잡이 프로브에서 표적핵산과 혼성화하는 부위는 5‘ 말단 또는 N 말단에 존재하며, 부분 프라이머와 혼성화하는 부위는 3’ 말단 또는 C 말단에 존재하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 표적핵산 혼성화 부위와 부분 프라이머 혼성화 부위 사이에 링커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커는 베타-알라닌(β-Ala-OH, C3), 아미노부티르산(aminobutyric acid, C4), 아미노헥사노산(aminohexanoic acid, C6), 아미노라우르산(aminolauric acid, C12), 아세토아세톡실에틸 아크릴레이트(acetoacetoxyethyl acrylate, AAEA(O-linker)), 아미노에톡시에톡시에톡시아세트산(2-[2-[2-[2-(amino)ethoxy]ethoxy]ethoxy]acetic acid, AEEEA), AEEEEA, DL15 및 L35로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 길잡이 프로브, 부분 프라이머 및 특이 프라이머는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), LNA (locked nucleic acid) 및 PNA(peptide nucleic acid) 중 어느 하나 또는 이들의 혼합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 10 내지 500개의 염기서열 길이로 제작된 PNA인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 20 내지 150개의 염기서열 길이로 제작된 PNA인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 길잡이 프로브는 특이 프라이머가 혼성화하는 표적핵산의 반대 가닥에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 부분 프라이머는 길잡이 프로브의 표적핵산 혼성화 부위 이외의 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열 사이에 1 내지 100개의 염기서열 길이로 제작된 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)인 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 증폭산물의 길이는 50 bp 내지 1 kbp인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭산물의 존재유무를 판별하는 단계는 상기 증폭산물에 결합 가능한 핵산 결합 염료(nucleic acids-binding dye) 또는 프로브(probe)를 사용하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 핵산 결합 염료는 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide), 사이버그린 1(SYBRⓡ Green I), 사이버그린 골드(SYBRⓡ Gold), 에바그린(EvaGreen), 요프로-1(YO-PRO-1), 사이토(SYTO), 베보(BEBO) 및 벡스토(BEXTO)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 증폭산물에 결합 가능한 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 소광자(quencher)가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), 탐라(TAMRA), 이클립스(Eclipse), DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭방법.
  18. i) 표적핵산의 검출부위 이외의 부위와 혼성화(hybridization) 할 수 있는 부위; 및 표적핵산과 혼성화하지 않는 부위;를 포함하는 길잡이 프로브(guide probe);
    ii) 상기 길잡이 프로브의 표적핵산과 혼성화하지 않는 부위와 결합하는 서열 및 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열을 포함하는 부분 프라이머(partial primer); 및
    iii) 상기 부분 프라이머와 쌍을 이루어 표적핵산을 증폭할 수 있는 특이 프라이머(specific primer);
    를 포함하는 표적핵산 검출부위 증폭용 PCR 조성물에 있어서,
    상기 부분 프라이머의 표적핵산 검출부위와 결합하는 서열은 3 내지 15개의 염기서열인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출부위 증폭용 PCR 조성물.
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