JP5531367B2 - 標的配列の濃縮 - Google Patents

Description

本出願は、米国仮出願第６０／９６２，８３８号（２００７年８月１日出願）の利益を主張するものである。上述の出願の全開示は、引用することにより本願に援用する。

遺伝分析でよく遭遇する状況として、大過剰な非変異配列（「参照配列」）の存在下で低い割合の変異ＤＮＡ配列（「標的配列」）を同定する必要性が存在する。このような状況の例は、（ａ）大過剰な正常対立遺伝子の存在下における少数の変異対立遺伝子の同定及びシークエンシング、（ｂ）エピジェネティックアッセイで、大過剰な非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子（逆もまた同様）の同定、（ｃ）大過剰の母親ＤＮＡ配列が同時に存在する母親の血液中に循環する少量の胎児ＤＮＡ配列の同定及び遺伝子型決定、及び（ｄ）大過剰な野生型対立遺伝子の存在下における癌患者（又は癌の疑いがある人々）の血中循環腫瘍ＤＮＡの同定を含む。

Thomas, R.K., et al. (2007) Nat Genet, 39, 347-351 Chou, L.S., et al. (2005) Am J Clin Pathol, 124; 330-338 Thomas, R.K., et al. (2006) Nat Med, 12; 852-855 Paez, J.G.,. et al. (2004) Science, 304; 1497-1500 Janne, P.A., et al. (2006) Clin Cancer Res, 12; 751-758 Diehl, F., et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A, 102; 16368-16373 Kimura, T., et al. (2004) Ann N Y Acad Sci, 1022; 55-60

生殖細胞又は高普及率の体細胞変異に対して信頼性のあるハイスループットスクリーニング方法が最近開示されてきているが（非特許文献１、２及び３）、異質及び間質汚染を有する腫瘍又は体液中において、低普及率の体細胞変異を検出することにはまだ問題がある。とはいえ、これら変異を同定する臨床的意義は、様々な状況下で重要である。例えば、（ａ）肺腺癌において、標準のシークエンシングで同定不可能な低レベルのＥＧＦＲ変異は、チロシンキナーゼインヒビター（非特許文献４）又は薬剤耐性（非特許文献５）に対して陽性反応をもたらす；（ｂ）早期検出（非特許文献６）又は治療への腫瘍反応（非特許文献７）用のバイオマーカーとして有用な血漿内の変異は、従来の方法を用いてシークエンシングできない；及び（ｃ）膵臓又は前立腺等の頻繁な間質汚染を含む腫瘍中の変異は、野生型対立遺伝子の存在により「マスク」されることが可能であるために、面倒な顕微解剖が必要となるか、又は変異を完全に見逃すことになる。

本発明は、サンプルから少量の対立遺伝子を濃縮するための方法、組成物、ソフトウェア、及び装置を対象とする。本方法は、部分的には、反応混合物を臨界変性温度又は「Ｔｃ」で培養する工程を含む修飾核酸増幅プロトコルに基づくものである。本発明を用いることにより、全てのＰＣＲベース技術の現在の検出限界は、非常に改善されることになる。

「臨界温度」又は「Ｔｃ」は、参照配列の融解温度「Ｔｍ」よりも低い温度を示す。ある実施形態では、Ｔｃは、参照及び標的配列の両方のＴｍよりも低い。臨界温度は、二重鎖標的配列又は標的−参照クロスハイブリダイゼーションされた二重鎖ＤＮＡの二本鎖が有する、より低いＴｍを上手く利用することにより、これら二本鎖を、参照／参照ホモ二本鎖よりも優先的に変性させる。標的配列及び参照配列がクロスハイブリダイズする時、短い（例えば＜２００ｂｐ）二重鎖ＤＮＡ配列に沿った範囲における１以上の単一ヌクレオチドのミスマッチによる小規模な配列の差異は、配列の融解温度（Ｔｍ）において小さいけれども予測可能な変化を生じさせることになる（Lipsky, R.H., et al. (2001) Clin Chem, 47, 635-644; Liew, M., et al. (2004) Clin Chem, 50, 1156-1164）。ミスマッチの正確な配列内容と位置に応じて、０．１−２０℃の融解温度の変化が考慮される。

臨界変性温度（Ｔｃ）は、それを下回ると、ＰＣＲの効率性が参照配列に対して急に減少するという温度である。例えば、１６７ｂｐのｐ５３配列は、ＰＣＲ変性温度が８７℃に設定された時によく増幅し、８６．５℃の時に穏やかに増幅し、ＰＣＲ変性が８６℃以下に設定された場合には検出可能な産物が産生されない。したがって、本例では、Ｔｃ〜８６．５℃である。

第１態様では、本発明は、標的及び参照配列を含むと考えられる核酸サンプル中の標的配列を濃縮する方法を対象とする。本方法は、増幅反応混合物を、参照配列の融解温度「Ｔｍ」よりも高い第１変性温度にする工程を含む。次に、増幅反応混合物の温度は、下げられ、一本鎖の標的配列と参照配列がハイブリダイズすることにより、二重鎖分子が形成される。したがって、反応物は、標的−標的、参照−参照のハイブリダイゼーションホモ二本鎖、及び標的−参照鎖のハイブリダイゼーションヘテロ二本鎖を含む。ヘテロ二本鎖は、定義によると、不十分にマッチした二本鎖であるにもかかわらず、鎖間の十分な相同性を有しており、反応混合物中で二本鎖形態を維持することができるものである。ホモ二本鎖は、定義によると、完全にマッチした二本鎖である。その後、反応混合物の温度をＴｃまで上げる。この結果、標的−参照配列ハイブリダイゼーション二本鎖の優先的な変性が生じる。Ｔｃ又は臨界温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載される方法によって決定されることができる。Ｔｃにおいて、標的−参照配列二本鎖（及び、参照配列よりも低いＴｍを有している場合においてのみ標的−標的配列二本鎖）は、実質的に変性され、この一方で、標的−標的二本鎖（参照配列のＴｍと同じ又はそれ以上のＴｍを有している場合）及び参照−参照配列二本鎖は実質的に変性されない。「実質的に」とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％が、既定の変性又は非変性形態であることを意味する。標的−参照二本鎖及び標的−標的二本鎖（参照配列よりも低いＴｍを有するもの）の優先的変性の後、反応混合物を低い温度にすることにより、プライマー対が標的配列にアニーリング可能となる。その後、アニーリングされたプライマーが伸長されることにより、サンプル内の参照配列と比較して標的配列が濃縮されることになる。

その他の態様では、本発明は、標的配列を濃縮するその他の方法を対象とする。本方法では、標的配列と参照配列を夫々含むと考えられる核酸サンプルが、参照配列のＴｍよりも高い第１変性温度にすることによって変性される。次に、標的及び参照鎖は、互いにアニーリングされることにより、二重鎖標的−参照配列の二本鎖を形成する。標的−参照配列二本鎖が、二重鎖標的−標的及び参照−参照配列の二本鎖とともに反応混合物中に生じて存在する。二重鎖標的−参照及び標的−参照配列の二本鎖は、サンプルをＴｃにすることにより優先的に変性される。Ｔｃにおいて、標的−参照配列の二本鎖（及び参照配列よりも低いＴｍを有している場合のみ標的−標的配列二本鎖）が実質的に変性され、この一方で、標的−標的二本鎖（参照配列のＴｍと同じ又はそれ以上のＴｍを有している場合）及び参照−参照配列二本鎖は実質的に変性されない。「実質的に」とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％が、既定の変性又は非変性形態であることを意味する。その後、プライマー対が標的配列にアニーリングされ、伸長されることにより、サンプル内の参照配列と比較して標的配列の濃度を高めることになる。

さらにその他の態様では、本発明は、核酸増幅反応プロトコルを実施することにより標的配列を濃縮するための方法を対象とする。増幅反応プロトコルは、第１変性温度と第２変性温度を含む。第１変性温度は、参照配列のＴｍよりも高く、第２変性温度は、参照配列のＴｍよりも低い。

その他の態様では、本発明は、対応する参照配列よりも低いＴｍを有する標的配列を濃縮するための方法を対象とし、増幅反応混合物をＴｃとする工程と、反応混合物の温度を下げる工程と、プライマー対を伸長させる工程により実現される。増幅反応混合物は、標的配列及び参照配列の夫々を含むと考えられているものである。Ｔｃは参照配列のＴｍよりも低く、これによって、より低いＴｍを有する標的配列の優先的な変性が可能となる。Ｔｃでは、標的−参照配列の二本鎖及び標的−標的配列の二本鎖は、実質的に変性され、この一方で、参照−参照配列の二本鎖は実質的に変性されない。「実質的に」とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％が、既定の変性又は非変性形態であることを意味する。反応混合物の温度を下げる工程は、プライマー対が標的配列とアニーリングすることを可能とする。その後、これらアニーリングされたプライマーは、ポリメラーゼによって伸張され、参照配列と比較してサンプル内の標的配列の量を増加させる。

さらにその他の態様では、本発明は、標的配列を濃縮するための方法を対象とし、増幅反応混合物を、アニーリング条件とＴｃの複数サイクルにおくことによって実現される。増幅反応混合物は、標的及び参照配列の夫々を含むと考えられているものであり、まず、参照配列のＴｍよりも高い第１変性温度にする。次に、サンプルは、２つの異なる温度の培養工程間を循環（サイクル）される。第１培養工程では、温度を下げることにより、標的配列と参照配列とのハイブリダイゼーションが可能となり、二本鎖が形成される。第２培養工程では、温度は、参照配列のＴｍよりも低いＴｃまで上げられる。Ｔｃにおいて、標的−参照配列の二本鎖（及び、参照配列よりも低いＴｍを有している場合においてのみ標的−標的配列の二本鎖）は、実質的に変性され、この一方で、標的−標的二本鎖（参照配列のＴｍと同じ又はそれ以上のＴｍを有している場合）及び参照−参照配列の二本鎖は実質的に変性されない。「実質的に」とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％が、既定の変性又は非変性形態であることを意味する。その後、これら第１及び第２工程は１回以上繰り返される。サイクルの培養工程が完了すると、反応混合物の温度を下げることにより、プライマー対が標的配列にアニーリングすることが可能となる。その後、これらプライマーは、ポリメラーゼによって伸長されることにより、サンプル内の参照配列に対して標的配列が濃縮されることになる。

第１変性温度及びＴｃを利用した、本発明の標的配列濃縮手順の一実施形態を図示する。 周期的なアニーリング／Ｔｃ工程を利用した、本発明の標的配列濃縮手順の一実施形態を図示する。 標的配列濃縮プロトコルを用いて濃縮について検査されたｐ５３とＫｒａｓ変異を図示する。 標的配列濃縮プロトコルを用いたｐ５３変異対立遺伝子の濃縮を図示する。 標的配列濃縮プロトコルを用いたＫｒａｓ変異対立遺伝子の濃縮を図示する。 肺及び結腸腫瘍からの臨床サンプルにおける変異対立遺伝子の濃縮を図示する。 ミスマッチ形成工程を含まない濃縮プロトコルの実施形態による変異対立遺伝子の濃縮を図示する。 図８Ａ乃至８Ｄは、標準リアルタイムＰＣＲ、又はリアルタイム形式に適用された本発明の濃縮方法を用いて、野生型及び変異ｐ５３エクソン８に関する増幅プロットを図示する。（ａ）は、ｐ５３エクソン８変異において変異を有する連続希釈細胞株に関し、標準リアルタイムＰＣＲによる増幅プロットを示す。（ｂ）は、ｐ５３エクソン８変異において変異を有する連続希釈細胞株に関し、リアルタイムＰＣＲ形態に適用された本発明の濃縮手順による増幅プロットを示す。（ｃ）は、４つの臨床腫瘍サンプル（この内の１つは、ｐ５３エクソン８変異を含むことが知られている（ＣＴ２０））の標準リアルタイムＰＣＲによる増幅プロットを示す。（ｄ）は、４つの臨床腫瘍サンプルに関し、リアルタイムＰＣＲ形態に適用された本発明の濃縮手順による増幅プロットを示す。 図９Ａ乃至９Ｄは、野生型及び変異ｐ５３のエクソン８に関する標準及び濃縮リアルタイムＰＣＲ増幅プロットであり、ＤＮＡ検出染料（ＬＣｇｒｅｅｎ）を使用した。（ａ）は、変異（ＳＷ４８０、ＴＬ６、ＣＴ２０）及び野生型（Ｒ２７、ＴＬ８、ＴＬ１８、ＴＬ８１、ＴＬ８２）ｐ５３のエクソン８含有サンプルの標準リアルタイムＰＣＲに関し、増幅プロットを示す。（ｂ）は、変異（ＳＷ４８０、ＴＬ６、ＣＴ２０）及び野生型（Ｒ２７、ＴＬ８、ＴＬ１８、ＴＬ８１、ＴＬ８２）ｐ５３のエクソン８含有サンプルに関し、リアルタイム形態に適用された本発明の濃縮手順による増幅プロットを示す。（ｃ）は、変異（ＳＷ４８０、ＣＴ７、ＨＣＣ、ＣＴ２０）及び野生型ｐ５３のエクソン８含有サンプルに関し、標準リアルタイムＰＣＲによる増幅プロットを示す。（ｄ）は、変異（ＳＷ４８０、ＣＴ７、ＨＣＣ、ＣＴ２０）及び野生型ｐ５３のエクソン８含有サンプルに関し、リアルタイム形態に適用された本発明の濃縮手順による増幅プロットを示す。 図１０Ａ−Ｂは、標的濃縮への有機溶媒（例えば、３％ＤＭＳＯ）の影響を図示する。（ａ）は、野生型及び変異ｐ５３エクソン８に関するリアルタイムＰＣＲにおける増幅プロットである。（ｂ）は、変異及び野生型ｐ５３エクソン８に関し、リアルタイム形態に適用された本発明の濃縮手順の増幅プロットを示す。 ＡＡ７６１ＥＧＦＲ変異のＴａｑＩ消化後に本発明の濃縮手順を用い、向上した制限断片長多型（ＲＦＬＰ;Restriction Fragment Length Polymorphism）検出を図示する。（ａ）は、標準ＰＣＲ又は濃縮手順を実施した後、１：１０，０００（変異：ゲノム）で希釈した時の、野生型及び変異（ＡＡ７６１）ＥＧＦＲの検出を図示する。（ｂ）は、標準ＰＣＲによって分析された野生型ＥＧＦＲの検出を図示する。

本発明は、サンプルから少量の対立遺伝子（例えば、標的配列）を濃縮するための方法、組成物、ソフトウェア、及び装置を対象とする。本方法は、部分的には、反応混合物を臨界変性温度にすることによって標的配列を選択的に濃縮することを対象とする。臨界変性温度又はＴｃは、参照配列の融解温度Ｔｍよりも低い温度である。臨界温度は、二重鎖標的配列又は標的−参照クロスハイブリダイゼーションされた二重鎖ＤＮＡの二本鎖が有する、より低いＴｍを上手く利用することにより、これら二本鎖を参照／参照ホモ二本鎖よりも優先的に変性させる。

多くの既知の変異検出方法は、標的配列を選択的に濃縮する増幅プロトコルを用いる本発明から利益を得ることになる。遺伝子検査の初期工程としてＰＣＲを使用することは、大抵の変異及びシークエンシング反応において行われる。一般的に、核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡ）は、第１工程として増幅された後、ジデオキシ・シークエンシング又は変異スクリーニング方法（例えば、ＳＳＣＰ、ｄＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ピロシークエンシング、高分解能融解曲線分析（High Resolution Melting））が続けられる。したがって、本質的に全ての変異検出法の限界は、変異含有配列（例えば、標的配列）の濃縮が、スクリーニングに先行するＰＣＲ工程中に実施される場合において、一様に利益を得ることになる。

＜定義＞
本明細書で用いられる際、用語「標的配列の濃縮」は、サンプルにおいて、標的配列の量を増やし、対応する参照配列と比べて標的配列の比率を高めることを意味する。例えば、サンプル内の標的配列と参照配列との比率が開始時に５％対９５％である場合、標的配列が増幅反応中に優先的に増幅可能であるために、７０％標的配列対３０％参照配列という比率を産生することになる。したがって、参照配列に対して標的配列の濃縮は１４倍である。標的配列の濃縮は、濃縮前と比較して参照配列に対する標的配列を２倍乃至２００倍増加させるという結果をもたらす。標的の濃縮は、参照配列に対し、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又はそれ以上の濃縮である。標的配列の濃縮により、参照配列と比較して標的配列を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上を有するサンプルとなる（例えば、１０％標的配列：９０％参照配列乃至９５％標的配列：５％参照配列）。

本明細書で用いられる際、用語「標的配列」は、対応する参照配列よりも核酸サンプル内により少なく見られる核酸を意味する。標的配列は、サンプル中の参照配列＋標的配列の全量の５０％未満を構成する。好ましくは、標的配列は、参照配列と比較して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡレベルで１：１０、１：１５、１：２０、１：２５倍、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１５０、１：２００倍又はそれ未満で発現する。一実施形態では、標的配列は、変異対立遺伝子である。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は、多数の正常細胞とほんの少しの癌性細胞を含むことがある。正常細胞は非変異又は野生型の対立遺伝子を含む一方、少量の癌性細胞は体細胞変異を含む。この場合、変異が標的配列であって、野生型配列が参照配列である。その他の実施形態では、本発明は、胎児のＤＮＡを、母親から入手した核酸サンプル内において検出することを対象とする。この実施形態では、標的配列は胎児のＤＮＡ内に存在する一方、より多く見られる母親のＤＮＡは参照配列を含む。本明細書で用いられる際、標的配列は妊娠した母親から得られる胎児ＤＮＡを含むことを意味する。本明細書で用いられる際、「標的鎖」は、標的配列の一本の核酸鎖を意味する。

標的配列は、約１７−２０００ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的配列は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又はそれ以上のヌクレオチド長である。標的配列は、対応する参照配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を共有するが、参照配列とは少なくとも１ヌクレオチドの違いを有する。本発明に係る標的配列は、参照配列に用いられるプライマー対と同じプライマー対を用いて、ＰＣＲによって増幅されることが可能である。

本明細書で用いられる際、用語「参照配列」は、対応する標的配列よりも核酸サンプル内により多く見られる核酸を意味する（例えば、同じ遺伝子であるが、異なる核酸配列を有する）。参照配列は、サンプル中の参照配列＋標的配列の全量の５０％を超えて構成する。好ましくは、参照配列は、標的配列と比較して、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡレベルで１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又はそれ以上で発現する。一実施形態では、参照配列は、野生型対立遺伝子である。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は、多数の正常細胞とほんの少しの癌性細胞を含むことがある。正常細胞は非変異又は野生型の対立遺伝子を含む一方、少量の癌性細胞は体細胞変異を含む。この場合、野生型配列が参照配列であって、変異配列が標的配列である（例えば、変異対立遺伝子）。本明細書で用いられる際、「参照鎖」は、参照配列の一本の核酸鎖を意味する。

参照配列は、約１７−２０００ヌクレオチド長である。一実施形態では、参照配列は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又はそれ以上のヌクレオチド長である。参照配列は、対応する標的配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を共有するが、標的配列とは少なくとも１ヌクレオチドの違いを有する。本発明に係る参照配列は、参照配列に用いられるプライマー対と同じプライマー対を用いて、ＰＣＲによって増幅されることが可能である。

用語「対立遺伝子」は、ヌクレオチド配列において少なくとも１つの差異を有する相同染色体上で同じ遺伝子座又は位置を占める遺伝子、遺伝子の一部、又はＤＮＡの非コード領域の代替形態を意味する。用語「対立遺伝子」は、任意の有機体由来のＤＮＡを示すのに用いられることができる。この有機体は、バクテリア、ウイルス、菌類、原虫類、かび、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物、及び古細菌を含むが、これらに限定されない。対立遺伝子は、単一細胞（例えば、２つの対立遺伝子で、１つは父親から受け継ぎ、１つは母親から受け継いだもの）、又は細胞集団（例えば、正常組織から得た野生型対立遺伝子、及び病変組織から得た体細胞変異対立遺伝子）において発見することができる。

対立遺伝子は、１７−２０００ヌクレオチド長であることができる。一実施形態では、対立遺伝子は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又はそれ以上のヌクレオチド長である。対立遺伝子は、一般的に、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を互いに共有する。本発明に係る対立遺伝子は、同じプライマー対を用いて、ＰＣＲによって増幅されることが可能である。

一実施形態では、本発明は、多型を濃縮するのに用いられる。いかなる遺伝子も、ひとつもない、１つの、又は多数の対立遺伝子型（多型）を有することができる。対立遺伝子に生じる一般的な変異変化は、自然の又は人工的な（例えば化学発癌物質）ヌクレオチドの欠失、付加、又は置換の結果によるものである可能性がある。これらの種類の変化の夫々は、単独で、又はその他と組み合わせて、任意配列において１回又はそれ以上生じる可能性がある。

幾つかの異なる種類の多型が、報告されている。制限断片長多型（ＲＦＬＰ:restriction fragment length polymorphism）は、制限断片の長さを変えるＤＮＡ配列のばらつきである (Botstein et al. , Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 (1980))。制限断片長多型は、制限部位の作成又は削除が可能であるために、制限断片の長さを変えることになる。ＲＦＬＰは、ヒト及び動物の遺伝分析に広く用いられてきた(WO第90/13668号; WO第90/11369号; Donis-Keller, Cell 51:319-337 (1987); Lander et al., Genetics 121:85-99 (1989)を参照)。遺伝形質が特定のＲＦＬＰにリンク付け可能である場合、個体におけるＲＦＬＰの存在は、その個体が形質も示すか否かの可能性を予測するのに用いられることができる。ＲＦＬＰは、本明細書に記載される濃縮方法と組み合わせて用いられることができ、これにより、多型の検出を高めることができる。このような方法は、実施例９に記載される。

その他の多型は、短いタンデム反復（ＳＴＲｓ：short tandem repeats）の形態であり、タンデムのジ−、トリ−、及びテトラ−ヌクレオチド反復モチーフを含む。また、これらのタンデム反復は、タンデム反復数（ＶＮＴＲ：variable number tandem repeat）多型とも称される。ＶＮＴＲは、同定及び起源分析に用いられ(米国特許第5,075,217号; Armour et al., FEBS Lett. 307:113-115 (1992); Horn et al., WO第91/14003号; Jeffreys, EP第370,719号)、多数の遺伝子マッピング研究に用いられてきた。

その他の多型は、同種の個体間の単一ヌクレオチドの差異となって現れる。このような多型は、ＲＦＬＰｓ、ＳＴＲｓ（短いタンデム反復）、及びＶＮＴＲｓ（タンデム反復数）よりもはるかに頻繁である。ある単一ヌクレオチド多型は、タンパク質コード配列において生じる。この場合、多型形態のうちの１つは、欠陥のある又は他の変異タンパク質の発現、そして潜在的には遺伝病を生じさせる可能性がある。その他の単一ヌクレオチド多型は、非コード領域において生じる。これらの多型は、欠陥のあるタンパク質発現（例えば、不完全なスプライシングの結果によるもの）を引き起こすものもある。単一ヌクレオチド多型は、表現型の影響を有さないものもある。

その他の変異は、体細胞変異を含む。体細胞変異は、受胎後に生じるＤＮＡの変化である。体細胞変異は、生体内の細胞のいずれにおいても生じうるが、生殖細胞（精子と卵子）を除くため、子供には受け継がれないものである。これらの変化は、（必ずしもというわけではないが）癌又はその他の病気を引き起こす可能性がある。

本明細書で用いられる際、用語「野生型」は、集団内の特定遺伝子に関して最も一般的なポリヌクレオチド配列又は対立遺伝子を意味する。一般的には、野生型の対立遺伝子は、正常細胞から得られる。

本明細書で用いられる際、用語「変異」は、核酸配列におけるヌクレオチドの変化（例えば、単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入）を意味する。変異を伴う核酸は、対応する野生型のポリヌクレオチド配列の核酸配列とは配列が異なる核酸配列（変異対立遺伝子）を有する。本発明の方法は、特に、１乃至５００の間のヌクレオチド配列の変化を含む変異対立遺伝子を選択的に濃縮するのに有用である。変異対立遺伝子は、対応する野生型対立遺伝子と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、又は５００のヌクレオチド配列の変化を有することができる。好ましくは、変異対立遺伝子における変異は、１乃至１０ヌクレオチド配列の変化を含み、より好ましくは、１乃至５ヌクレオチド配列の変化を含む。変異対立遺伝子は、野生型対立遺伝子に対し、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有する。一般的には、変異対立遺伝子は、病変組織又は細胞から得られ、病状に関連するものである。

本明細書で用いられる際、用語「融解温度」又は「Ｔｍ」は、ポリヌクレオチドが、その相補配列から分離する温度を意味する。一般的には、Ｔｍは、二本鎖の核酸分子におけるワトソン・クリック塩基対の半分が切断される又は分離する（即ち、「溶解する」）一方で、ワトソン・クリック塩基対の残りの半分が二重鎖構造のまま損傷を受けていない温度として定義されることができる。言い換えると、Ｔｍは、２つの相補配列のヌクレオチドの５０％がアニーリングされ（二重鎖）、ヌクレオチドの５０％が変性される（一本鎖）温度として定義される。したがって、Ｔｍは、二重鎖から一本鎖の核酸分子への推移における（又は、反対に、一本鎖から二重鎖の核酸分子への推移における）中間点を定義する。

Ｔｍは、多数の方法、例えば、Wetmur1991による最近隣法の計算（Wetmur, J. G. 1991. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol 26: 227-259。引用することにより本願に援用する）によって、そして、オリゴ（商標）プライマーデザインを含む市販プログラム及びインターネット上利用可能なプログラムを使用することにより、推定可能である。あるいは、Ｔｍは、実際の実験を通じて決定されることも可能である。例えば、二重鎖ＤＮＡ結合又は挿入染料（例えばエチジウムブロマイド又はＳＹＢＲ−グリーン（Molecular Probes）等）が融解曲線分析に使用されることにより、核酸の実際のＴｍを決定することができる。核酸のＴｍを決定する更なる方法は、技術的に公知であり、本明細書に記載される。

本明細書で用いられる際、用語「臨界温度」又は「Ｔｃ」は、参照配列のＴｍよりも低い温度を意味する。Ｔｃは、二重鎖標的配列の二本鎖、又は標的配列／参照配列の二重鎖二本鎖を優先的に変性させるために適用され、これにより、増幅反応中の標的配列の選択的な濃縮が可能となる。臨界変性温度（Ｔｃ）は、それを下回ると、ＰＣＲの効率性が任意の核酸配列に対して急に減少する温度である。例えば、１６７ｂｐのｐ５３配列は、ＰＣＲ変性温度が８７℃に設定された時によく増幅し、８６．５℃の時に穏やかに増幅し、ＰＣＲ変性が８６℃以下に設定された場合には、検出可能な産物が産生されない。したがって、本例では、Ｔｃ〜８６．５℃である。Ｔｃは、参照配列のＴｍより約０．１−２０℃低い。より好ましくは、Ｔｃは、参照配列のＴｍより約０．１−１０℃、０．１−９℃、０．１−８℃、０．１−７℃、０．１−６℃、０．２−５℃、０．３−４．５℃、０．４−４℃、０．５−３．５℃、０．５−３℃、０．５−３℃、０．５−２．５℃、０．５−２℃、０．５−１．５℃、０．５−１℃低い。ある実施形態では、Ｔｃは、参照及び標的配列両方のＴｍより低い。例えば、Ｔｃは、標的配列のＴｍより約０．１−１０℃、０．１−９℃、０．１−８℃、０．１−７℃、０．１−６℃、０．２−５℃、０．３−４．５℃、０．４−４℃、０．５−３．５℃、０．５−３℃、０．５−３℃、０．５−２．５℃、０．５−２℃、０．５−１．５℃、０．５−１℃低いことができる。

本明細書で用いられる際、用語「選択的変性」又は「優先的変性」は、標的配列又は標的／参照配列二本鎖の二重鎖核酸分子における塩基対間の水素結合を優先的に切断することを意味し、これにより、一本鎖標的配列が産生される。標的配列の選択的変性は、標的及び参照配列を含むサンプルを臨界温度にすることによって、実現される。

本明細書で用いられる際、「プライマー対」は、標的及び参照配列の逆鎖にアニールする２つのプライマーを意味し、これによりＰＣＲ反応中に増幅産物が形成される。プライマー対は、反応物のＴｃよりも低いＴｍを有するように設計される。

本明細書で用いられる際、「クロスハイブリダイゼーション」は、１つ以上のヌクレオチドが異なる２つの核酸配列間に形成された二重鎖の二本鎖を意味し、これは、相補的なＧとＣ塩基との間、及び相補的なＡとＴ又はＡとＵ塩基との間の水素結合の形成に基づくものである。２つの相補的な核酸配列は、逆平行構造において水素結合を有する。好適な実施形態では、２つの核酸配列は、標的配列と参照配列である。クロスハイブリダイズしたＤＮＡは、参照及び標的配列間の差異の位置においてミスマッチを含むことになる。このミスマッチは、多型、変異、挿入、欠失、及びこのような差異を引き起こすその他の変化を含み、例えば、メチル化である。例えば、１以上のヌクレオチドのループ及び／又は一本鎖領域は、欠失／挿入部位において生じる。

クロスハイブリダイゼーションは、典型的には、標的及び参照配列の変性に関与し、例えば、加熱後、ハイブリダイゼーション及び二本鎖形成が可能な条件下（例えば、温度等）における再変性を行うことによって実現される。

本明細書で用いられる際、「反応混合物」は、標的配列二本鎖を含むと考えられる混合物であり、標的配列の変性を可能にする好適なバッファーを含む。

本明細書で用いられる際、「同一性」「相同性」は、２つの高分子（例えば、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド）間のサブユニット配列の類似性を意味する。２分子両方における１つのサブユニットの位置が、同じ単量体サブユニットで占有されている場合（例えば、２つのペプチドの夫々における１つの位置がセリンによって占有されている）には、それら２分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性は、合致する（マッチする）又は同一である位置の数の直接的関数である。例えば、２つのペプチド又は化合物配列における位置の半分（例えば、ポリマー１０ユニット長において５つの位置）が同一である場合には、２つの配列は５０％同一であるといえる。その位置が９０％であれば（例えば、１０のうち９がマッチしていれば）、２つの配列は９０％の配列同一性を有する。

パーセントヌクレオチド同一性は、ＢＬＡＳＴの初期設定パラメータによって決定される。配列の比較において、典型的には、１つの配列は参照配列として作用し、これと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを用いる時、試験及び参照配列がコンピュータ内に入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。初期設定プログラムパラメータが使用可能であり、また代替パラメータも指定可能である。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較ウィンドウは、２０乃至６００、通常は約５０乃至約２００、より一般的には約１００−約１５０からなる群から選択される連続位置数の任意の領域を意味し、配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ連続位置数の参照配列と比較されることが可能である。比較のための配列アラインメントの方法は、技術的に公知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2: 482, (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48: 443, (1970) の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, (1988) の類似法の調査によって、これらアルゴリズムのコンピューター化実装 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)によって、又は、手動アラインメントと目視検査 (例えば Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)参照)によって実施可能である。

パーセント配列同一性と配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, (1977)、及び Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, (1990)に、それぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて好適に利用可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワード（word）とアラインメントした時に、ある正の値の閾値スコアＴに一致する又は満たすＷ長の短いワードをクエリー配列内に同定することによって、ハイスコアリング配列ペア（ＨＳＰｓ；high scoring sequence pairs）を同定することに関与する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）(Altschul et al. supra)を意味する。これらの初期隣接ワードヒット（wordhit）は、これらを含むより長いＨＳＰｓを検索するための検査を開始する際に種となるものである。ワードヒットは、累計的なアラインメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両側に伸ばされる。累計スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチング残基ペアへのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基のペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを用いて、累計スコアを計算する。ワードヒットの両側への伸長は、累計アラインメントスコアが得られている最大値からＸ分だけ低下した時；累計スコアが、一つ以上の負のスコア化残基アライメントの蓄積によってゼロ以下になった時；又は、どちらかの配列端部に到達した時、に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列対象）は、初期設定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）又は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定値としてワード長３、及び期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, （1989） 参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ=５、Ｎ=−４、および両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:58735787 (1993)を参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の表示を提供する最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最少合計確率が、約０．２未満、より好ましくは０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合には、核酸配列は、参照配列と類似しているとみなされる。

第一態様では、本発明は、標的及び参照配列を含むと考えられる核酸サンプルにおいて標的配列を濃縮する方法を対象とする。参照及び標的配列は、本方法で使用される前に増幅されることができる。即ち、関心のある参照及び標的配列は、本方法で使用される前にＰＣＲ反応においてゲノム鋳型から増幅されることができる。このＰＣＲ反応からのアリコート（分割量）は、その後、選択的濃縮方法で使用するために移動される。あるいは、参照及び標的配列は、選択的濃縮方法において、第１のＰＣＲ反応を受ける必要はなく、それらの天然型（例えば、ゲノムＤＮＡ）で使用可能である。標的及び参照配列は、任意の核酸配列から得ることができる。この核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、又はバクテリアＤＮＡを含む。参照配列は一般的に野生型対立遺伝子であり且つ標的配列は変異対立遺伝子であり、一方で、この逆もまた可能である。変異対立遺伝子は、任意の１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は変化を含むことができる。ある実施形態では、変異対立遺伝子は、体細胞変異である。その他の実施形態では、標的配列がメチル化ＤＮＡである一方、参照配列が非メチル化ＤＮＡである。あるいは、標的配列が非メチル化ＤＮＡである一方、参照配列がメチル化ＤＮＡである。本方法で使用されるプライマーは、一般的には、約１７乃至１０００塩基、より好ましくは、約２０乃至５００塩基、最も好ましくは、約５０乃至１００塩基の大きさの参照及び標的配列増幅産物を産生するように設計されている。

本方法は、増幅反応混合物を、参照配列の融解温度「Ｔｍ」よりも高い第１変性温度にする工程を含む。核酸のＴｍは、実験によって決定される又は計算によって推定されることができる。当業者であれば、核酸のＴｍを決定するためには多数の公知の方法があることを十分理解でき、それらのうち幾つかを本明細書中に記載する。第１変性温度は、ＰＣＲで使用される標準手順に基づき設定される。したがって、第１変性温度は、標的及び参照配列の完全な変性が可能となる程、十分に高い（例えば９６℃）べきである。一実施形態では、第１変性温度は、参照配列のＴｍよりも約１℃乃至３０℃高く、より好ましくは、参照配列のＴｍは、参照配列のＴｍよりも約５℃乃至２０℃高い。

次に、増幅反応混合物の温度を下げることにより、標的配列及び参照配列をハイブリダイズすることが可能となる。好適な実施形態では、このハイブリダイゼーションの温度又は中間温度（第１変性温度とＴｃよりも低いが、プライマーアニーリング／伸長温度よりは高い温度（例えば、約６０℃乃至８０℃））は、プライマー対のＴｍよりも高い。これにより、標的及び参照配列がハイブリダイズすることが可能となる一方、プライマー対が標的及び／又は参照配列に結合することを防ぐことも可能となる。このアニーリング工程は、二重鎖標的−標的、参照−参照、及び標的−参照配列のハイブリダイゼーション二本鎖の形成を引き起こす。標的−参照ハイブリダイゼーション二本鎖は、その後、反応混合物の温度をＴｃまで上げることによって、優先的に変性される。Ｔｃ又は臨界温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載の方法によって決定可能である。一実施形態では、Ｔｃは、参照配列のＴｍよりも約０．３℃−５℃低く、より好ましくは、約０．５℃−１．５℃低い。一般的には、Ｔｃは、約７０−９０℃である。標的−標的ハイブリダイゼーション二本鎖もまた、標的配列が参照配列と比較してより低いＴｍとなるヌクレオチド配列を有している場合には、優先的に変性される可能性がある。Ｔｃにおいて、標的−参照配列二本鎖（及び、参照配列よりも低いＴｍを有している場合においてのみ標的−標的配列二本鎖）は、実質的に変性され、この一方で、標的−標的二本鎖（参照配列のＴｍと同じ又はそれ以上のＴｍを有している場合のみ）及び参照−参照配列二本鎖は、実質的に変性されない。「実質的に」とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％が、既定の変性又は非変性形態であることを意味する。Ｔｃは、一般的には、約１秒乃至５分間、より好ましくは２秒乃至１分間、最も好ましくは５秒乃至３０秒間適応される。

標的−参照二本鎖及び／又は標的−標的配列ハイブリダイゼーション二本鎖の優先的な変性の後、反応混合物の温度を下げることにより、プライマー対が標的配列にアニールすることが可能となる。アニールされたプライマーは、その後、核酸ポリメラーゼで伸長されることにより、サンプル内の参照配列と比較して標的配列が濃縮される。

本方法の工程は、一般的には、複数サイクル繰り返されることにより、標的及び参照配列を十分に増幅させる。一実施形態では、本方法の工程は、５−４０サイクル、より好ましくは１０−３０サイクル繰り返される。サイクルの最適数は、当業者によって決定可能である。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置において使用され、より好ましくは、リアルタイム検出ＰＣＲ装置においてリアルタイム反応条件下で使用される。リアルタイム検出ＰＣＲ装置とは、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲリアルタイムＰＣＲ装置(Cepheid、サニーベール、カリフォルニア州)及び Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置(Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)等である。本実施形態では、反応混合物は、核酸検出剤（例えば、ＳＹＢＲグリーン染料又はＬＣ−グリーン染料等の核酸検出染料、又は蛍光染料に操作的に結合可能なプローブ）を含むことができ、これにより、反応の増幅産物を定量化及び／又は監視することが可能となる。標的配列の濃縮が完了すると、サンプルは、さらに処理される（例えば、本方法によって濃縮された任意の遺伝的変化を同定するための処理（例えば、シークエンシング反応を受ける））。濃縮された参照配列は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−メルティング、ジデオキシ・シークエンシング、単一分子シークエンシング、ピロシークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、及び定量ＰＣＲを含む各種の手順によって、さらに処理されることが可能である。

さらにその他の態様では、本発明は、核酸増幅反応プロトコルを実施することによって、標的配列を濃縮するための方法を対象とする。増幅反応プロトコルは、第１変性温度と第２変性温度を含む。第１変性温度は、参照配列のＴｍよりも高く、第２変性温度は、参照配列のＴｍよりも低い。本方法は、増幅反応混合物を、参照配列の融解温度「Ｔｍ」よりも高い第１変性温度にする工程を含む。核酸のＴｍは、実験によって決定される又は計算によって推定されることができる。当業者であれば、核酸のＴｍを決定するためには多数の公知の方法があることを十分理解できる。第１変性温度は、一般的には、ＰＣＲ反応の変性温度を通常選択するように選択され、標的及び参照配列の変性を可能とする程度まで十分高くあるべきである。一実施形態では、第１変性温度は、参照配列のＴｍよりも約１℃乃至３０℃高く、より好ましくは、参照配列のＴｍは、参照配列のＴｍよりも５℃乃至２０℃高い。

第２変性温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載の方法によって決定されることができる。一実施形態では、Ｔｃは、参照配列のＴｍよりも約０．３℃−５℃低く、より好ましくは、参照配列のＴｍよりも約０．５℃−１．５℃低い。一般的には、Ｔｃは、約７０−９０℃である。第２変性温度は、一般的には、約１秒乃至５分間、より好ましくは２秒乃至１分間、最も好ましくは５秒乃至３０秒間が適用される。

その他の態様において、本発明は、増幅反応混合物をＴｃにする工程と、反応混合物の温度を下げる工程と、プライマー対を伸長させる工程とを含む標的配列を濃縮する方法を対象とする。増幅反応混合物は、標的及び参照配列を含むと考えられているものである。本態様では、標的配列は、参照配列のＴｍよりも低いＴｍを有する。Ｔｃは、参照配列のＴｍより低く、これにより、そのヌクレオチド組成（例えば欠失）の結果として参照配列よりも低いＴｍを有する標的配列の優先的な変性が可能となる。本発明のその他の態様によると、参照及び標的配列は、本方法で使用される前に増幅されることが可能である。即ち、関心のある参照及び標的配列は、本発明の使用前にＰＣＲ反応におけるゲノム鋳型から増幅されることができる。このＰＣＲ反応からのアリコート（分割量）は、その後、選択的濃縮方法で使用するために移動される。あるいは、参照及び標的配列は、選択的濃縮方法において、第１のＰＣＲ反応を受ける必要はなく、それらの天然型（例えば、ゲノムＤＮＡ）で使用可能である。標的及び参照配列は、任意の核酸配列から得ることができる。この核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、又はバクテリアＤＮＡを含む。参照配列は一般的に野生型対立遺伝子であり且つ標的配列は変異対立遺伝子であり、一方で、この逆もまた可能である。変異対立遺伝子は、任意の１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は変化を含むことができる。ある実施形態では、変異対立遺伝子は、体細胞変異である。本方法で使用されるプライマーは、一般的には、約１５乃至１０００塩基、より好ましくは、約２５乃至５００塩基、最も好ましくは、約５０乃至１００塩基の大きさの参照及び標的配列の増幅産物を産生するように設計されている。

標的−標的ハイブリダイゼーション二本鎖は、反応混合物の温度をＴｃまで上げることによって、優先的に変性される。Ｔｃ又は臨界温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載の方法によって決定可能である。一実施形態では、Ｔｃは、参照配列のＴｍより約０．３℃−５℃低く、より好ましくは、参照配列のＴｍより約０．５℃乃至１．５℃低い。一般的には、Ｔｃは、約７０−９０である。Ｔｃは、一般的には、約１秒乃至５分間、より好ましくは２秒乃至１分間、最も好ましくは５秒乃至３０秒間が適用される。Ｔｃにおいて、標的−参照配列二本鎖及び標的−標的配列二本鎖は、実質的に変性され、この一方で、参照−参照配列二本鎖は、実質的に変性されない。「実質的に」とは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９８％が、既定の変性又は非変性形態であることを意味する。

反応混合物の温度を下げる工程は、プライマー対が標的配列にアニールすることを可能にする。これらのアニールされたプライマーは、その後、ポリメラーゼによって伸長され、サンプル内の標的配列の量を増加させる。本方法の工程は、一般的には、複数サイクル繰り返されることにより、標的及び参照配列を十分に増幅させる。一実施形態では、本方法の工程は、５−４０サイクル、より好ましくは１０−３０サイクル繰り返される。サイクルの最適数は、当業者によって決定可能である。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置において使用され、より好ましくは、リアルタイム検出ＰＣＲ装置においてリアルタイム反応条件下で使用される。リアルタイム検出ＰＣＲ装置とは、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲリアルタイムＰＣＲ装置(Cepheid、サニーベール、カリフォルニア州)及びＭｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置(Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)等である。本実施形態では、反応混合物は、核酸検出剤（例えば、ＳＹＢＲグリーン染料又はＬＣ−グリーン染料等の核酸検出染料、又は蛍光染料に操作的に結合可能なプローブ）を含むことができ、これにより、反応の増幅産物を定量化及び／又は監視することが可能となる。標的配列の濃縮が完了すると、サンプルは、追加的な処理、例えばシークエンシング反応を受ける。濃縮された対立遺伝子は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−メルティング、ジデオキシ・シークエンシング、単一分子シークエンシング、ピロシークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、及び定量ＰＣＲを含む各種の手順によって、さらに処理されることが可能である。

さらにその他の態様において、本発明は、増幅反応混合物を、Ｔｃの適用によってアニーリング条件と変性条件の交互の工程下におくことによって、標的配列を濃縮する方法を対象とする。標的及び参照配列を有する増幅反応混合物は、まず、参照配列のＴｍよりも高い第１変性温度にする。その他の態様と同様に、参照及び標的配列は、本発明の使用前に増幅されることができる。即ち、関心のある参照及び標的配列は、本発明の使用前にＰＣＲ反応におけるゲノム鋳型から増幅されることができる。このＰＣＲ反応からのアリコート（分割量）は、その後、選択的濃縮方法で使用するために移動される。あるいは、参照及び標的配列は、選択的濃縮方法において、第１のＰＣＲ反応を受ける必要はなく、それらの天然型（例えば、ゲノムＤＮＡ）で使用可能である。標的及び参照配列は、任意の核酸配列から得ることができる。この核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、又はバクテリアＤＮＡを含む。参照配列は一般的に対立遺伝子であり且つ標的配列は変異対立遺伝子であり、一方で、この逆もまた可能である。変異対立遺伝子は、任意の１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は変化を含むことができる。ある実施形態では、変異対立遺伝子は、体細胞変異である。その他の実施形態では、標的配列がメチル化ＤＮＡである一方、参照配列が非メチル化ＤＮＡである。あるいは、標的配列が非メチル化ＤＮＡである一方、参照配列がメチル化ＤＮＡである。本方法で使用されるプライマーは、一般的には、約１５乃至１０００塩基、より好ましくは、約２５乃至５００塩基、最も好ましくは、約５０乃至１００塩基の大きさの参照及び標的配列増幅産物を産生するように設計されている。

核酸のＴｍは、実験を通じて決定される又は計算によって推定されることができる。当業者であれば、核酸のＴｍを決定するためには多数の公知の方法があることを十分理解できる。第１変性温度は、一般的には、ＰＣＲ反応の変性温度として通常選択するように選択され、標的及び参照配列の変性を可能とするのに十分高いべきである。一実施形態では、第１変性温度は、参照配列のＴｍより約１℃乃至３０℃高く、より好ましくは、参照配列のＴｍは、参照配列のＴｍより約５℃乃至２０℃高い。

次に、サンプルは、２つの異なる温度の培養工程間で循環（サイクル）される。第１培養工程では、温度が下げられることにより、標的配列と参照配列のハイブリダイゼーションが可能となる。第２培養工程では、温度は、参照配列のＴｍより低いＴｃまで上げられる。その後、これらの第１及び第２工程は１回以上、より好ましくは３−２０回、最も好ましくは５−１０回繰り返される。

第１培養工程は、標的−標的、参照−参照、及び標的−参照配列のハイブリダイゼーション二本鎖を形成させる。好適な実施形態では、このハイブリダイゼーションの温度又は中間温度（第１変性温度とＴｃより低いが、プライマーアニーリング／伸長温度よりは高い温度（例えば、約６０℃乃至８０℃））は、プライマー対のＴｍよりも高い。これにより、標的及び参照配列がハイブリダイズすることが可能となる一方、プライマー対が標的及び／又は参照配列に結合することを防ぐことも可能となる。標的−参照及び参照−標的（標的が参照配列よりも低いＴｍを有している限り）ハイブリダイゼーション二本鎖は、その後、第２培養工程において反応混合物の温度をＴｃまで上げることによって、優先的に変性される。Ｔｃ又は臨界温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載の方法によって決定可能である。一実施形態では、Ｔｃは、参照配列のＴｍより約０．３℃−５℃低く、より好ましくは、参照配列のＴｍより約０．５℃乃至１．５℃低い。一般的には、Ｔｃは、約７０−９０℃である。標的−標的ハイブリダイゼーション二本鎖もまた、標的配列が参照配列と比較してより低いＴｍとなるヌクレオチド配列を有している場合には、優先的に変性される。Ｔｃは、一般的には、約１秒乃至５分間、より好ましくは２秒乃至１分間、最も好ましくは５秒乃至３０秒間適応される。サイクルの培養工程が完了すると、反応混合物の温度は下げられ、これにより１以上のプライマーが標的配列にアニールすることが可能となる。その後、これらのプライマーはポリメラーゼによって伸長されることにより、標的配列が濃縮される。

各工程が完了すると、標的及び参照配列の十分な増幅を得るために、反応を複数サイクル繰り返すことができる。一実施形態では、本方法の工程は、５−４０サイクル、より好ましくは１０−３０サイクル繰り返される。サイクルの最適数は、当業者によって決定可能である。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置において使用され、より好ましくは、リアルタイム検出ＰＣＲ装置においてリアルタイム反応条件下で使用される。リアルタイム検出ＰＣＲ装置とは、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲリアルタイムＰＣＲ装置(Cepheid、サニーベール、カリフォルニア州)及び Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置(Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)等である。本実施形態では、反応混合物は、核酸検出剤（例えば、ＳＹＢＲグリーン染料又はＬＣ−グリーン染料等の核酸検出染料、又は蛍光染料に操作的に結合可能なプローブ）を含むことができ、これにより、反応の増幅産物を定量化及び／又は監視することが可能となる。標的配列の濃縮が完了すると、サンプルは、さらに処理される。この更なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−メルティング、ジデオキシ・シークエンシング、単一分子シークエンシング、ピロシークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、及び定量ＰＣＲを含む。

その他の実施形態では、本発明の方法は、標的配列又は参照配列にメチル化が生じたか否かを検出するのに使用されることができる。更なる実施形態では、本方法は、メチル化を分析するためにゲノムＤＮＡを利用する。

メチル化検出方法は、ＤＮＡのメチル化感度処理に関する化学的又は酵素的研究を含む。化学的処理は、ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで培養することを含み、非メチル化シトシンをウラシルに選択的に変換する。まず、ＤＮＡは熱変性され、その後、５ＭのｐＨ５−７の亜硫酸水素塩で処理されることができる。既に存在するウラシルを除去するためのゲノムＤＮＡの前処理は、亜硫酸水素塩処理の前になされる。この前処理は、ｐＨ７の５ｍＭヒドロキシルアミンの存在下におけるウラシルグリコシラーゼ処理から構成される。修飾ＤＮＡは、本発明の方法に使用可能である。

参照又は標的配列のメチル化シトシンは、ウラシルに変換されるので、反応のクロスハイブリダイゼーション工程中、メチル化されていない逆鎖（標的又は参照）と二本鎖を作る際にミスマッチを形成することになる。

その他の態様では、本発明の任意の方法は、多重反応において複数の異なる標的配列を濃縮するのに用いられる。本実施形態において、本方法は、追加的な標的配列に対する追加的な一連のプライマー対を含む。

その他の態様では、本発明は、本発明の任意の方法を実施するためのプログラム命令を有するコンピュータ可読媒体を対象とする。更なる態様では、本発明は、標的配列を濃縮するためのＰＣＲシステムを対象とする。システムは、コンピュータ可読媒体のプログラム命令を実装するためのメモリを含む。

図１及び２は、本発明の２つの異なる態様を図示する。図１は、第１変性温度及び臨界変性温度又はＴｃを有する増幅反応を利用する方法における本発明の一態様を図示する。図２は、第１変性温度及びＴｃを有する増幅反応を図示するが、さらに、反応のプライマー・アニーリングと伸長段階の前に、アニーリング及び臨界変性温度工程を複数回周期的に変動させること又は繰り返すことを含む。

図１は、標的及び参照配列を含む核酸サンプル内で標的配列を濃縮するための手順を示す。標的及び参照配列は、任意の核酸配列から得ることができる。この核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、又はバクテリアＤＮＡを含む。参照配列は一般的に対立遺伝子であり且つ標的配列は変異対立遺伝子であり、この逆もまた可能である。変異対立遺伝子は、任意の１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は変化を含むことができる。ある実施形態では、変異対立遺伝子は、体細胞変異である。その他の実施形態では、標的配列はメチル化ＤＮＡである一方、参照配列は非メチル化ＤＮＡである。あるいは、標的配列は非メチル化ＤＮＡである一方、参照配列はメチル化ＤＮＡである。

本方法は、増幅反応混合物を、参照配列の融解温度「Ｔｍ」よりも高い第１変性温度にする工程を含む（図１Ａ）。核酸のＴｍは、実験を通じて決定される又は計算によって推定されることができる。当業者であれば、核酸のＴｍを決定するためには多数の公知の方法があることを十分理解でき、それらのうち幾つかを本明細書中に記載する。第１変性温度は、一般的には、ＰＣＲ反応の変性温度として通常選択するように選択され、標的及び参照配列の完全な変性を可能とするのに十分高いべきである（例えば９４℃）。一実施形態では、第１変性温度は、参照配列のＴｍより約１℃乃至３０℃高く、より好ましくは、参照配列のＴｍは、参照配列のＴｍより約５℃乃至２０℃高い。

次に、増幅反応混合物の温度を下げることにより、標的配列と参照配列がハイブリダイズすることが可能となる（図１Ｂ）。このアニーリング工程は、標的−標的、参照−参照、及び標的−参照配列のハイブリダイゼーション二本鎖の形成をもたらす。アニーリングの温度を決定することは、当業者にとってよく知られている。本方法で用いられるＰＣＲプライマーは、この中間温度においてＰＣＲプライマーが標的及び参照配列に結合しないように設計されている。これにより、ＰＣＲプライマーは、変異（標的）及び野生型（参照）配列のクロスハイブリダイゼーションを干渉しない。標的配列内の変異のために、大抵の標的配列は、結局、参照配列に対してミスマッチ構造となるため、参照配列とヘテロ二本鎖となった時、完全にマッチした参照／参照ホモ二本鎖よりも低い融解温度を有する。

その後、標的−参照ハイブリダイゼーション二本鎖は、反応混合物の温度をＴｃに上げることによって、優先的に変性される（図１Ｃ）。Ｔｃ又は臨界温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載される方法によって決定されることができる。一実施形態では、Ｔｃは、参照配列のＴｍよりも約３℃−５℃低く、より好ましくは、参照配列のＴｍよりも約０．５℃−１．５℃低い。一般的には、Ｔｃは、約７０−９０℃である。標的−標的ハイブリダイゼーション二本鎖は、標的配列が参照配列と比較してより低いＴｍとなるヌクレオチド配列を有する場合には、優先的に変性されることができる。Ｔｃは、一般的に、約１秒乃至５分間、より好ましくは２秒乃至１分間、最も好ましくは５秒乃至３０秒間が適用される。

標的−参照及び／又は標的−標的配列ハイブリダイゼーション二本鎖の優先的な変性後、反応混合物の温度は下げられることにより、１以上のプライマーが標的配列にアニールすることが可能となる（図１Ｄ）。その後、アニールされたプライマーは、核酸ポリメラーゼによって伸長され、これにより、サンプル内に含まれる核酸集団内の標的配列を濃縮することになる。

本方法の工程は、一般的には、複数サイクル繰り返すことにより、標的及び参照配列を十分に増幅させる。一実施形態では、本方法の工程は、５−４０サイクル、より好ましくは１０−３０サイクル繰り返される。サイクルの最適数は、当業者によって決定可能である。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置において使用され、より好ましくは、リアルタイム検出ＰＣＲ装置においてリアルタイム反応条件下で使用される。リアルタイム検出ＰＣＲ装置とは、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲリアルタイムＰＣＲ装置(Cepheid、サニーベール、カリフォルニア州)及びＭｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置(Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)等である。本実施形態では、反応混合物は、核酸検出剤（例えば、ＳＹＢＲグリーン染料又はＬＣ−グリーン染料等の核酸検出染料、又は蛍光染料に操作的に結合可能なプローブ）を含むことができ、これにより、反応の増幅産物を定量化及び／又は監視することが可能となる。標的配列の濃縮が完了すると、サンプルは、さらに処理される（例えば、シークエンシング反応を受ける）ことができる。濃縮された対立遺伝子は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−メルティング、ジデオキシ・シークエンシング、単一分子シークエンシング、ピロシークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、及び定量ＰＣＲを含む各種の手順によって、さらに処理されることが可能である。

各ＰＣＲサイクルにおいて濃縮方法を実施することにより、変異配列（標的配列）の量は配列（参照配列）に対して徐々に濃縮されることになる。ホモ接合変異及びヘテロ接合変異のどちらもが、この方法によって濃縮される。通例として、標準ＰＣＲを変性温度９４℃で実施する場合と比較して、変異含有配列が１０−６０倍濃縮される。既定の臨界変性温度（Ｔｃ）において、変異濃縮は、ＰＣＲアンプリコンの配列内容及び全体的なサイズに依存して異なる効率性になるが、全ての配列位置において同時に生じる。任意位置における臨界変性温度Ｔｃ及び予測される濃縮はいずれも、好適なＤＮＡ融解（メルティング）ソフトウェアを用いて推定可能であり、実験的に実証可能である。このようにして、変異の位置に応じて若干異なる濃縮が予測されるが、全ての事例において実質的な濃縮が実現される。これにより、下流分析の検出限度、例えばシークエンシング反応の改善が可能となる。

図２は、増幅反応混合物を、アニーリング及び臨界変性温度の交互の工程下に複数回おくことによって、標的配列を濃縮するための方法の実施形態を図示する。この実施形態は、臨界温度における優先的変性と、ハイブリダイゼーション温度における優先的クロスハイブリダイゼーションの両方の利点を有する。

増幅反応混合物は、標的及び参照配列を有しており、まず、参照配列のＴｍより高い第１変性温度にする（図２Ａ）。

次に、サンプルは２つの異なる温度の培養工程間で循環（サイクル）される。第１培養工程では、温度が下げられることにより、標的配列と参照配列との優先的なハイブリダイゼーションが可能となる（図２Ｂ）。第２培養工程では、温度は、Ｔｃに上げられる（図２Ｃ）。その後、これらの第１及び第２工程は、１回以上、より好ましくは３−２０回、最も好ましくは５−１０回繰り返される。

任意の配列に対する優先的なハイブリダイゼーション温度は、野生型対立遺伝子が、変異含有対立遺伝子とハイブリダイズするよりも速い速度で野生型対立遺伝子自身にハイブリダイズして戻る温度である。変異対立遺伝子は、野生型対立遺伝子よりも非常に少ない率で存在するために、野生型対立遺伝子とそれ自身とのクロスハイブリダイゼーションは、変異対立遺伝子と変異対立遺伝子、又は変異対立遺伝子と対立遺伝子（後者はミスマッチを形成する）のハイブリダイゼーションよりも早く進むことになる。結果として、ＰＣＲ温度をクロスハイブリダイゼーション温度まで下げた時に、変異対立遺伝子は、野生型対立遺伝子がクロスハイブリダイゼーションをするのと同程度までクロスハイブリダイゼーションしない。好適な実施形態では、このハイブリダイゼーション温度又は中間温度（第１変性温度とＴｃよりも低いが、プライマーアニーリング／伸長温度よりは高い温度（例えば、約６０℃乃至８０℃））は、プライマー対のＴｍより高い。これにより、標的及び参照配列がハイブリダイズすることが可能となる一方、プライマー対が標的及び／又は参照配列に結合することを防ぐことも可能となる。

次に、反応温度をＴｃまで上げることにより、標的−参照及び標的−標的ハイブリダイゼーション二本鎖を優先的に変性させる（図２Ｃ）。Ｔｃ又は臨界温度は、参照配列のＴｍよりも低く、本明細書に記載の方法によって決定されることができる。一実施形態では、Ｔｃは、参照配列のＴｍより約０．３℃−５℃低く、より好ましくは、参照配列のＴｍより約０．５℃乃至１．５℃低い。一般的には、Ｔｃは、約７０−９０℃である。標的−標的ハイブリダイゼーション二本鎖もまた、標的配列が参照配列と比較してより低いＴｍとなるヌクレオチド配列を有している場合には、優先的に変性される可能性がある。Ｔｃは、一般的には、約１秒乃至５分間、より好ましくは２秒乃至１分間、最も好ましくは５秒乃至３０秒間適応される。本工程は、数回繰り返され、アニーリング温度（図２Ｂ）及び臨界温度（図２Ｃ）との間を周期的に変動する。各回において、一本鎖形態における配列よりも一本鎖形態における変異配列を選択的に生じさせる。

サイクル形態の培養工程が完了すると、反応混合物の温度を下げることにより、１以上のプライマーが標的配列にアニールすることが可能となる（図２Ｄ）。その後、これらのプライマーはポリメラーゼによって伸長され、標的配列を濃縮することになる。本方法の工程は、標的及び参照配列の十分な増幅を得るために、一般的には複数サイクル繰り返される。一実施形態では、本方法の工程は、５−４０サイクル、より好ましくは１０−３０サイクル繰り返される。サイクルの最適数は、当業者によって決定可能である。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置において使用され、より好ましくは、リアルタイム検出ＰＣＲ装置においてリアルタイム反応条件下で使用される。

標的配列の濃縮が完了すると、サンプルは、追加的な処理を受けることも可能である。追加的な処理は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−メルティング、ジデオキシ・シークエンシング、単一分子シークエンシング、ピロシークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、及び定量ＰＣＲを含む。

デジタルＰＣＲは、濃縮手順と組み合わせて用いて、極微量の変異を検出するのに用いられることができる。デジタルＰＣＲでは、ＤＮＡサンプルは単一分子まで希釈されるために、各ＰＣＲ反応において出発物質は野生型又は変異のいずれかである。同じ出発物質からの多数のＰＣＲ反応を実施した後、変異分子が単離及び検出される。Fluidigm（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）は、本発明とともに使用可能な各種デジタルＰＣＲベースのシステムを販売している。したがって、リアルタイム濃縮は、単一分子から実施され、何千もの平行濃縮反応を同時に行うことにより、変異ＤＮＡを生じるＰＣＲ反応物の同定が可能となる。このようなシステムは、癌ゲノムにおける極微量の変異を検出するのに特に有用である。デジタルＰＣＲを濃縮手順と組み合わせることにより、単一分子のシークエンシング応用の利益を同様に得ることができる。

＜核酸増幅反応＞
一実施形態では、本発明の方法で使用される核酸サンプルは、標的及び参照配列を有するゲノムＤＮＡを含む。その他の実施形態では、本発明の方法の核酸サンプルは、核酸増幅反応において既に増幅された標的及び参照配列を含む。当業者であれば、核酸を増幅するのに利用される様々な方法が存在することは理解できることである。おそらく、最も良く知られている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；例えば、米国特許第4,683,195号、及び第4,683,202号、そして、Saiki et al., Science 230:1350-1354 (1985) 及び Gyllensten et al., PNAS (USA) 85:7652-7656 (1985))を参照）である。ＰＣＲ法が好適に変化したものは、非対称ＰＣＲ法（例えば、Mao et al., Biotechniques 27(4):674-678 (1999); Lehbein et al., Electrophoresis 19(8-9):1381-1384 (1998); Lazaro et al., Molec. Cell. Probes 6(5):357-359 (1992); 及び米国特許第6,197,499号を参照）である。その他の増幅方法は、鎖置換増幅法（ＳＤＡ：strand displacement amplification）(Walker et al., Nuc. Acids Res. 20(7):1691-1696 (1992), 及び 米国特許第5,744,311号, 第5,648,211号 及び第5,631,147号)、ローリング・サークル増幅法（ＲＣＡ：rolling circle amplification）(ＰＣＴ公報WO第97/19193号を参照)、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence-based amplification）(Compton, Nature 350:91-92 (1991); 及び米国特許第5,409,818号及び第5,554,527号を参照)、転写媒介性増幅法（ＴＭＡ：transcript mediated amplification）(Kwoh et al., PNAS (USA) 86:1173-1177 (1989), 及び米国特許第5,399,491号を参照)、自家持続配列複製法（３ＳＲ：self sustained sequence replication）（Guatelli et al., PNAS (USA) 87:1874-1879 (1990) を参照）、及びリガーゼ連鎖反応法（ＬＣＡ：ligase chain reaction）（米国特許第5,427,930号 及び第5,792,607号を参照)を含むが、これらに限定されない。

本方法は、改良型ＰＣＲを用いる。ＰＣＲは、Mullis及びFaloonaによる, 1987, Methods Enzymol., 155: 335に記載される如く実施され、これを引用することにより本願に援用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、及び第4,800,159号に開示されている。最も単純な形態において、ＰＣＲは特定のＤＮＡ配列を酵素的に合成するためのインビトロ方法であって、逆鎖にハイブリダイズするとともに標的ＤＮＡ内の関心領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。反復的な一連の反応工程は、鋳型変性、プライマーのアニーリング、及びアニールされたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長を含み、これにより、終端がプライマーの５’端によって定義される特異的断片が指数関数的に蓄積されることになる。ＰＣＲは、特異的ＤＮＡ配列の選択的濃縮を１０^９倍産生することが可能であるとして報告されている。ＰＣＲ法は、Saiki et al., 1985, Science 230:1350にも記載されている。

ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（標的及び参照配列）（少なくとも１ｆｇ；より有用には１−１０００ｎｇ）、及び少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。典型的な反応混合物は、２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの好適なバッファー、０．４μｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）、及び脱イオン水を全量２５μｌとなるように含む。ＰＣＲは、プログラム可能なサーマル・サイクラーを用いて実施される。

ＰＣＲサイクルの各工程の長さと温度、そしてサイクル数は、実際にはストリンジェンシーの要件に基づき調節される。アニーリング温度及びタイミングは、プライマーが鋳型にアニールすると予測される効率性、及び許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、当業者の技量のうちの１つの知識に含まれる。３０℃と７２℃の間のアニーリング温度が使用される。鋳型分子の初期変性は、通常９２℃と９９℃の間で４分間の間に生じ、その後、変性（９４−９９℃、１５秒乃至１分）、アニーリング（上述の如く決定される温度；１−２分）、及び伸長（７２℃で１分）からなるサイクルが２０−４０サイクル行われる。最後の伸長工程は、一般的には４分間７２℃で実施され、その後、４℃で不確定（０−２４時間）な工程を続けることができる。

ＰＣＲは、核酸ポリメラーゼ、又はヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を利用する。一般的には、酵素は、標的配列にアニールしたプライマーの３’端において合成を開始し、鋳型に沿って５’方向に進めることになる。既知のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Tth）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Taq）ＤＮＡポリメラーゼ、及びパイロコッカス・フリオサス（Pfu）ＤＮＡポリメラーゼを含む。用語「核酸ポリメラーゼ」は、ＲＮＡポリメラーゼも包含する。核酸鋳型がＲＮＡである場合には、「核酸ポリメラーゼ」は、ＲＮＡ依存性重合活性を意味し、例えば、逆転写酵素である。

本発明の方法では、ＰＣＲプロトコルは、さらに臨界変性工程を含む。これらのプロトコルは、本明細書に完全に記載され、図１及び２に図示される。

好ましくは、濃縮手順は、ＰＣＲ装置において、より好ましくは、リアルタイムＰＣＲ装置においてリアルタイム反応条件下で実施される。リアルタイム反応条件は、さらに核酸検出剤（例えば、染料又はプローブ）を利用することにより、ＰＣＲ産物が作り出された際にＰＣＲ産物を測定／検出可能となる。

一実施形態では、濃縮方法は多重形態で実施される。多重ＰＣＲは、１以上の標的配列を検出するために１対以上のプライマーをＰＣＲ反応に用いる際に、実施される。多重ＰＣＲの目的は、１以上の標的配列を同時に増幅することによって、時間を節約し且つ費用を最小限にすることである。これにより、複数の標的配列の増幅を１度に実施することが可能となる。一般的には、全ての同時に増幅された配列内における微量の対立遺伝子を濃縮することを目的として多重ＰＣＲを本発明と併用して用いるには、結果として得られるＰＣＲアンプリコンが全て略同じＴｃ（臨界変性温度）を共有するようにプライマーが設計される。

＜Ｔｍ及びＴｃの決定＞
Ｔｍは、二本鎖核酸分子におけるワトソン・クリック塩基対の半分が切断又は分離する（即ち、「溶解する」）一方で、ワトソン・クリック塩基対の残りの半分が二重鎖構造のまま損傷を受けていない温度として定義されることができる。この一方、「臨界温度」「臨界変性温度」又は「Ｔｃ」は、参照配列のＴｍよりも低い温度を意味する。Ｔｃは、核酸サンプルにおいて二重鎖標的配列又は標的配列／参照配列二重鎖の二本鎖を選択的に変性させるために適用され、これにより増幅反応中の標的配列の選択的濃縮が可能となる。

核酸鎖の任意対のＴｍは、鎖と鎖の結合安定性を示し、鎖の相補性、配列長さ、ＧＣ含有量、二重鎖領域内のミスマッチの有無、及びその他のそれ程重要ではない要因、例えば、サンプルの塩濃度に依存する（Lewin, Genes V, Chapter 5, Oxford University Press and Cell Press: New York, (1994) pp. 109-126; SantaLucia, 1998）。

融点温度は、通常、サンプルの温度を本質的に高め、ハイブリダイゼーション二本鎖から一本鎖への解離を継続的に測定することによって実験的に決定される。解離は、各種の異なる方法、例えば、ＵＶ吸光度の変化や二重鎖ＤＮＡ結合染料の蛍光性によって、また、表面プラズモン共鳴法、又は好ましくは蛍光手段によって、検出可能である。後者の事例では、ハイブリダイゼーションのプローブは、通常、蛍光実体（fluorescent entity）で標識付けられ、蛍光シグナルの発生は、ハイブリダイゼーション二本鎖の形成に何らかの方法で依存する。

Ｔｍは、実験的に決定される又は当業者に公知の確定した方法に基づき推測される。核酸変性の推移を観察及び分析する方法は、変性に伴うサンプル内のエンタルピー変化を示差走査熱量計（ＤＳＣ：differential scanning calorimetry）によって測定する方法(Kulinski et al., Nucleic Acids Res. 19(9):2449-2455 (1991); Paner et al., Biopolymers 29:1715-1734 (1990); Volker et al., Biopolymers 50:303-318 (1999))と、フルオロフォアの共有結合対の蛍光性を測定する方法(Vamosi and Clegg, Biochemistry 37:14300-14316 (1998))と、核酸のハイパークロミシティの変化を監視する方法(Haugland, 「In Vitro Applications for Nucleic Acid Stains and Probes」, in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第6版, Molecular Probes Inc, Eugene OR (1996) pp. 161-174)とを含む。

二重鎖核酸のＴｍ値は、核酸に結合する二重鎖ＤＮＡ特異的染料を監視することによって観察可能である(Wittwer et al., 1996)。二重鎖特異的染料は、核酸結合フルオロフォアである。典型的には、これら染料の蛍光性は、二本鎖核酸と結合した時に増加する(Wittwer et al., BioTechniques 22:176-181 (1997))。Ririe et al. (1997)は、ポストＰＣＲ産物が、二重鎖核酸結合染料であるＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩを用いた融解曲線分析によって識別可能であることを示した。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩは、二重鎖核酸に優先的に結合する(Haugland, 1996)。二重鎖核酸のＴｍを決定するその他の好適な染料は、ＳＹＢＲ（登録商標）ゴールド、エチジウム・ブロマイド、アクリジン・オレンジ、プロピジウム・ブロマイド、ピコグリーン（登録商標）、Hoechst33258、Hoechst33342、Hoechst34580、YO−PRO（登録商標）-1及びYOYO（登録商標）-1を含む。これら染料の夫々は、市販されている。例えば、Molecular Probes(Eugene, Oreg.) catalog Handbook of Fluorescent Probes and Research Products第８版の８章(CD-ROM上,2001年5月; 引用することにより本願に援用する)は、本発明で使用可能な多数の染料を一覧にしている。

当業者であれば理解できることであるが、任意の二重鎖核酸構造の融解は、一般的には限られた温度範囲にわたって類似核酸集団のかなりの割合において生じ、典型的には、その核酸のＴｍ前後において溶解のピーク（最も推移が速い）を有する。したがって、蛍光放射におけるこのような変化のピークは、二重鎖核酸用のＴｍを計算するのに用いられることが可能である。

融解温度プロファイルは、Ｔに対するｄＦ／ｄＴをプロットすることによって、図式的に示すことができる。ここで、ｄＦは測定された蛍光放射における変化であり、ｄＴは、核酸の温度における変化であり、Ｔは核酸の温度である。このような図式的な描写は、蛍光性が最速に変化する温度においてピークを示し、これは融解温度である。

二重鎖核酸のＴｍを決定するためのその他の方法は、従来から公知であり、米国特許第7,226,736号及び第6,030,115号に開示されている。これら夫々は、引用することによりその全体を本願に援用する。

Ｔｍは、経験式から推測可能である。Ｔｍは、サンプル溶液中における、相補的塩基対を形成する核酸配列の長さ（ｎ）、配列中のＧ及びＣの含有量、塩濃度（μ）、及び変性剤（％ＦＡ）に依存することが知られている。そして、一般的には、経験式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ(μ)＋０．４１(％ＧＣ)−５００／ｎ−０．６１(％ＦＡ)となる。Ｔｍは、多数の方法、例えば、Wetmur 1991による最近隣法の計算(Wetmur, J. G. 1991. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol 26: 227-259, 引用することにより本願に援用する)によって、そして、オリゴ（商標）プライマーデザインを含む市販のプログラム及びインターネット上で利用可能なプログラムを使用することにより、推定可能である。

「臨界温度」又は「Ｔｃ」は、参照配列のＴｍよりも低い温度を意味する。Ｔｃは、参照／参照配列二本鎖よりも、二重鎖標的配列二本鎖又は標的配列／参照配列二重鎖二本鎖を優先的に変性させるために適用され、これにより、増幅反応中の標的配列の選択的濃縮が可能となる。臨界変性温度は、二重鎖標的配列又は標的−参照クロスハイブリダイズされた二重鎖ＤＮＡの二本鎖のより低いＴｍを上手く利用する。標的配列及び参照配列がクロスハイブリダイズする時、短い（例えば＜２００ｂｐ）二重鎖ＤＮＡ配列に沿った任意の場所の１以上の単一ヌクレオチドのミスマッチの小さい配列の差異により、その配列の融解温度（Ｔｍ）において、小さいけれども予測可能な変化が生まれることになる（Lipsky, R.H., et al. (2001) Clin Chem, 47, 635-644; Liew, M., et al. (2004) Clin Chem, 50, 1156-1164）。このミスマッチの完全な配列内容と位置に応じて、０．５−１．５℃の融解温度の変化が、２００ｂｐまでの配列ではよく見られる。このようにして、標的−参照配列のアニーリングは、ミスマッチのために、既知の対立遺伝子（例えば、参照配列）よりも低いＴｍを本質的に有することになる。少なくとも部分的に、本発明は、完全にマッチした及びミスマッチした配列間の小さなＴｍの差異を有効に利用する。臨界的変性は各ＰＣＲサイクルで実施されるために、変異含有対立遺伝子の差異を有する濃縮は指数関数的に度合いが増加し、サイクル終了時には、変異と野生型対立遺伝子間の全体的な増幅効率において大きな差異をもたらすことになる。Ｔｃは、参照配列のＴｍよりも約０．１−２０℃低い。より好ましくは、Ｔｃは、参照配列のＴｍよりも約０．１−１５℃、０．１−１０℃、０．１−９℃、０．１−８℃、０．１−７℃、０．１−６℃、０．２−５℃、０．３−４．５℃、０．４−４℃、０．５−３．５℃、０．５−３℃、０．５−３℃、０．５−２．５℃、０．５−２℃、０．５−１．５℃、０．５−１℃低い。

ある実施形態では、Ｔｃは、参照配列及び標的配列の両方のＴｍよりも低いことができる。例えば、一例では、野生型配列のＴｍは８４℃であり、変異配列のＴｍは８３．８℃であった。濃縮手順が最速となる時に使用された最適Ｔｃは８３．５℃であった。

ある好ましい実施形態では、Ｔｃは、参照配列と全ての可能な標的配列の両方のＴｍよりも低くなるように選択される。例えば、一例では、野生型配列のＴｍは８４℃であり、異なる位置で変異した配列（単一点突然変異）のＴｍは８３．８℃、８３．７℃、８３．９℃、８３．６℃、８３．７５℃であった。濃縮手順が最速となる時に使用された最適Ｔｃは８３．５℃であった。

臨界変性温度（Ｔｃ）は、それを下回ると、ＰＣＲの効率性が任意の核酸配列に対して急に減少するという温度である。例えば、１６７ｂｐ ｐ５３の配列は、ＰＣＲ変性温度が８７℃に設定された時によく増幅し、８６．５℃の時に穏やかに増幅し、ＰＣＲ変性が８６℃以下に設定された場合には、検出可能な産物が産生されない。

Ｔｍと同様に、任意の核酸配列のＴｃは、実験的又は計算のいずれかによって同定可能である。任意のＰＣＲ産物に対して実験的にＴｃを同定するためには、挿入染料（ＬＣ−グリーン又はＳＹＢＲ−グリーン）の存在下でリアルタイム融解曲線を実施することによって、配列の平均融解温度Ｔｍを得る（Ｔｍの決定については上記参照）。Ｔｍよりも約０．５−１．５℃低い温度は、通常、標的配列の濃縮を導くための適切な臨界変性温度Ｔｃである。

塩基対のミスマッチに起因するＤＮＡ配列のΔＴｍを決定することによって、Ｔｃを推定することも可能であり、これは、塩基対のミスマッチが、クロスハイブリダイズされた標的−参照二本鎖において存在すると考えられるためである。この差異は、完全な参照／参照配列のマッチングと比較して、約０．１℃乃至約１２．５℃である。したがって、一実施形態では、Ｔｃは、方程式Ｔｃ＝Ｔｍ−ΔＴｍによって示すことができる。ここで、Ｔｍは参照／参照配列二本鎖の融解温度であり、ΔＴｍは、標的／参照配列のクロスハイブリダイゼーション中に形成される可能性のある１以上の塩基対ミスマッチに起因する参照配列のＴｍの変化である。ΔＴｍは、標的／参照配列二本鎖の長さ、グアニン−シトシン含有パーセント（％ＧＣ）、及び二本鎖における点突然変異又は塩基対ミスマッチの位置に依存することが発見されてきた。例えば、ミスマッチが二本鎖のどちらかの端部に向かって位置する場合、ΔＴｍは、一般的にはより低くなり、典型的には、約０．１℃乃至約８℃の範囲で低くなる。ミスマッチが二本鎖の中心に向かって存在する場合、ΔＴｍは比較的高くなり、典型的には、約０．２℃乃至約１１℃の範囲で高くなる。ΔＴｍは、一般的に、標的−参照クロスハイブリダイズされた二本鎖における塩基ミスマッチのパーセントあたり、一般的には約０．５℃乃至約１．５℃に相当する。ΔＴｍは、二本鎖の長さ及び変異位置に応じて変動するのみではなく、配列の特異的順序に応じて変動することが高く評価される点である。その結果、全てのこのような変化形態は、本開示の範囲内である。

＜本発明の核酸＞
本発明において有用な核酸配列
本発明は、核酸サンプル内の標的配列を濃縮するための方法を提供し、また、鋳型核酸配列を増幅させるためのプライマーを利用する。

本明細書で記載される際、用語「核酸」「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、検出されるべきプライマー、プローブ、及びオリゴマー断片を意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボース含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース含有）、プリンもしくはピリミジン塩基又は修飾プリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位含有）のＮ−グリコシドである任意のその他の種類のポリヌクレオチドを総称する。用語「核酸」「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」の間で、長さにおいて意図された区別はなく、これら用語は交換可能に用いられる。これら用語は、分子の一次構造のみを意味する。したがって、これら用語は、二重鎖及び一本鎖ＤＮＡ、そして二重鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。

オリゴヌクレオチドは、必ずしも既存又は天然配列から物理的に由来するものである必要はなく、任意の方法によって作り出されることができる。この方法とは、化学的合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はこれらの組み合わせを含む。用語「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」は、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成由来物のポリヌクレオチドを意味し、これは、その合成由来又は操作のおかげで、（１）天然において関連するポリヌクレオチドの全て又は一部分とは関連せず、；及び／又は（２）天然において連結する以外のポリヌクレオチドに連結される。

一実施形態では、本明細書で使用される核酸は、修飾ヌクレオチドを含むことにより、参照／参照配列ホモ二本鎖及び標的／参照配列へテロ二本鎖との間の変性温度の差異を増大させる。このような修飾は、標的配列の濃縮を高めることになる。修飾された又は非天然のヌクレオチドは、濃縮手順の前又は中に組み込まれることができる。本発明の方法の使用において考慮される修飾ヌクレオチドは、ジアミノ−プリン類似体（例えば、２’−Ｏ−メチル−２,６−ジアミノプリン）、ウラシル、ペプチド核酸類似体、上述物のビオチン修飾類似体、上述物のフルオロフォア修飾類似体、イノシン、７−デアザグアニン、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノ核酸（２’Ｆ−ＡＮＡ）ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡｓ）、ＥＮＡｓ：２’−Ｏ,４’−Ｃ−エチレン架橋核酸等を含む。修飾ヌクレオチドは、鋳型、プライマー、プローブ核酸を含む本発明の任意の核酸に組み込まれることができる。

これらの修飾は、マッチ及びミスマッチした塩基間のＴｍの差異を増大させることが可能であり、本方法で得られる濃縮を高める。例えば、ロックド核酸は、立体構造的に制限されたヌクレオチド類似体のクラスを意味し（例えば、WO99/14226号に記載され、引用することにより本願に援用する）、核酸の融解温度を高める。ロックド核酸を含むオリゴヌクレオチドは、Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630 及びObika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404に記載され、これら両方を引用することにより援用する。ロックド核酸をオリゴヌクレオチドに導入することは、相補配列の親和性を向上させ、融解温度を何段階か増加させる（Braasch, D.A. and D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7)。本発明は、公知の任意のＬＮＡを用いて実施することが可能であり、例えば、WO第99/14226号 及び Latorra D, et al., 2003. Hum. Mutat. 22: 79-85に記載されており、これら両方を引用することにより本願に援用する。

相補性は、完全である必要はない。安定した二本鎖は、ミスマッチ（mismatched）塩基対又はアンマッチ（unmatched）塩基対を含むことができる。核酸技術における当業者であれば、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を考慮して、二本鎖安定性を経験的に決定することができる。核酸二本鎖の安定性は、融解温度又は「Ｔｍ」によって測定される。

本発明は、鋳型核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。

用語「プライマー」は、１以上のプライマーを意味することができ、また、精製された制限酵素の消化により自然に発生するか又は合成的に生成されるかのいずれかであるオリゴヌクレオチドを意味することができ、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた時に、相補鎖に沿って合成を開始する点として作用することが可能なものである。このような条件は、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素等の重合誘発剤が、好適なバッファー（「バッファー」とは、補因子である置換基を含み、又はｐＨやイオン強度等に影響を及ぼすものである）において、好適な温度で存在することを含む。プライマーは、増幅に最大限の効率性を付与するために一本鎖であることが好ましい。

本発明に基づく有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であって、これらは、鋳型核酸配列とハイブリダイズ可能であり、核酸鎖の酵素的合成に刺激を与える。プライマーは、核酸分子のプール中に存在する標的分子の一部に相補的である。本発明に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、化学的又は酵素的いずれかの合成方法によって調製されることが検討される。あるいは、このような分子又はその断片は、天然に生じるものであり、その天然源から単離されるか、市販の供給業者から購入される。オリゴヌクレオチドプライマーは５乃至１００のヌクレオチド長であり、理想的には１７乃至４０のヌクレオチドであるが、異なる長さのプライマーも使用される。増幅のためのプライマーは好ましくは１７−２５ヌクレオチドである。本発明に基づく有用なプライマーは、融解温度推定の方法を用いることにより、特定の融解温度（Ｔｍ）を有するようにも設計されている。オリゴ□、プライマーデザイン（Primer Design）を含む市販プログラム、及びプライマー３、及びオリゴカリキュレーターを含むインターネット上利用可能なプログラムは、本発明に基づき有用な核酸配列のＴｍを計算するのに用いることができる。好ましくは、本発明に基づき有用な増幅プライマーのＴｍは、例えばオリゴカリキュレーターで計算された場合、好ましくは約４５乃至６５℃の間であり、より好ましくは、約５０乃至６０℃の間である。

典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が実質的に相補的である場合（少なくとも１４乃至２５ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補性）に生じる。Kanehisa, M., 1984, Nucleic Acids Res. 12: 203を参照し、引用することにより本願に援用する。結果として、プライミング部位においてある程度のミスマッチが許容されることが予測される。このようなミスマッチは、小さいものであり、例えば、モノ−、ジ−、又はトリ−ヌクレオチドである可能性がある。あるいは、ミスマッチの領域は、ループを含有し、連続した一連の４以上のヌクレオチドにおいてミスマッチが存在する領域として定義されることもできる。

一実施形態では、濃縮手順は、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Peptide nucleic acid）プライマーと併用して使用可能であることにより、変異濃縮の感度を増大させる。ＰＮＡｓは、野生型（参照）配列のみの増幅を抑制するために使用される。本実施形態では、プライマーは、標的（変異）配列及び参照配列との間を識別できるように合成されることが可能である。ＰＮＡベースのプライマーは、相補的な野生型配列を認識して結合し、変異配列と結合するプライマーよりも高い熱安定性及び特異性を有する。このことは、単にＰＮＡプライマー−参照核酸と標準プライマー−標的核酸との間のＴｍの差異を増大させるだけではなく、ＰＮＡベースのプライマーがＤＮＡポリメラーゼによって伸長されることを防ぎ、これにより、標的配列がさらに濃縮されることになる。このようなアッセイは、技術的に公知であり、Orum et al. Nucleic Acids Research, 21(23): 5332-5336 (1993)に記載されている。

オリゴヌクレオチドプライマーは、これらの考慮事項を念頭において設計され、以下の方法に基づき合成されることが可能である。

＜オリゴヌクレオチドプライマー設計の戦略＞
シークエンシング又はＰＣＲを目的とした特定のオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、標的配列を認識可能な配列を選択することを含むが、最小限の予測される二次構造を有する。オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸の単一部位（single site）のみに結合する又は結合しないことができる。さらに、オリゴヌクレオチドのＴｍは、オリゴヌクレオチドの長さとＧＣ含有量の分析によって最適化される。さらに、ゲノムＤＮＡの増幅に有用なＰＣＲプライマーを設計する際、選択されたプライマー配列は、GenBankデータベース（又はその他の利用可能なデータベース）における配列と有意な一致を示さない。

本発明に基づく有用なプライマーの設計は、容易に利用可能なコンピュータープログラムを使用することによって促進される。これらプログラムは、上述された幾つかのパラメータの評価及びプライマー配列の最適化に役立てるために開発されたものである。このようなプログラムの例は、DNAStar(商標)ソフトウェアパッケージの「PrimerSelect」(DNAStar, Inc.; マディソン、ウィスコンシン州)、オリゴ4.0 (National Biosciences, Inc.)、プライマー、オリゴヌクレオチド・セレクション・プログラム、ＰＧＥＮ及びＡｍｐｌｉｆｙ(Ausubel et al., 1995, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, John Wiley & Sonsに記載)である。

好適な実施形態では、本発明のプライマーは、標的／参照配列クロスハイブリダイゼーション工程中に適用される温度より低いＴｍを有するように設計される。したがって、本実施形態において、プライマーは、このハイブリダイゼーション工程中、標的又は参照配列にアニールしない（図１を参照）。一実施形態では、プライマーのＴｍは、クロスハイブリダイゼーションのアニーリング工程の温度よりも５−１０℃低い。

＜合成＞
プライマー自体は、技術的に公知である技術を用いて合成される。特定配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、技術的に公知であり、例えば、好適な配列のクローニング及び制限酵素消化分析、及び直接的な化学的合成を含む。一旦設計がなされると、オリゴヌクレオチドは、好適な化学的合成方法によって調製され、例えば、Narang et al., 1979, Methods in Enzymology, 68:90によって記載されるホスホトリエステル法、Brown et al., 1979, Methods in Enzymology, 68:109によって記載されるホスホジエステル法、Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters, 22:1859によって記載されるホスホロアミド酸ジエチル法、及び、米国特許第4,458,066号に記載される固体担体法、又は商業用自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザー（市販のもの）又はVLSIPS（商標）技術のどちらかを用いたその他の化学的方法が挙げられる。プライマーは、技術的に公知である方法を用いて、修飾核酸で合成されることもできる。

＜サンプル＞
本明細書で使用される際、「サンプル」は、関心のある核酸（標的及び参照配列）を含む又は含むと推定される任意物質、又は関心のある標的核酸を含む又は含むと推定される核酸自体を意味する。したがって、用語「サンプル」は、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）サンプル、細胞、有機体、組織、液体、又は物質を含み、この物質とは、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、排せつ物、皮膚の外分泌物、気道、腸管、尿生殖路、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織、インビトロ細胞培養構成成分のサンプル、自然分離物（例えば、飲料水、海水、固形物等）、微生物試料、及び核酸トレーサー分子で「マーク」された物体又は試料を含むが、これらに限定されない。

本発明の核酸配列は、ゲノムＤＮＡから増幅されることが可能である。ゲノムＤＮＡは、以下の方法に基づき、組織又は細胞から単離されることができる。あるいは、本発明の核酸配列は、技術的に公知である方法によって血液から単離されることができる。

特定組織から遺伝子の異型を検出することを促進するために、組織が単離される。哺乳類組織からゲノムＤＮＡを単離するために、組織が液体窒素内で細分化及び冷凍される。冷凍された組織は、予め冷却された乳鉢と乳棒で挽いて微粉末にされ、消化バッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）内に、１００ｍｇ組織あたり１．２ｍｌの消化バッファーとなるように、懸濁される。ゲノムＤＮＡを哺乳類組織培養細胞から単離するためには、細胞は、遠心分離により５分間５００ｘｇでペレット状にされ、１−１０ｍｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁され、５分間５００ｘｇで再度ペレット状にされ、１容量の消化バッファーに再懸濁される。

消化バッファー内のサンプルは、１２−１８時間５０℃で（振動とともに）培養される。その後、同等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出される。相が、遠心分離工程（１７００ｘｇで１０分）後に溶解されない場合には、加えてもう１容量の消化バッファー（プロテイナーゼＫを含まず）が添加され、遠心分離工程が繰り返される。厚みのある白い物質が２相の界面にはっきりと現れる場合には、有機物抽出工程が繰り返される。抽出後、上の水層は新しいチューブに移され、このチューブには、１／２容量の７．５Ｍの酢酸アンモニウムと２容量の１００％エタノールが加えられる。核酸は、遠心分離によって１７００ｘｇで２分間ペレット状にされ、７０％エタノールで洗浄され、風乾され、ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）内で１ｍｇ／ｍｌで再懸濁される。残留ＲＮＡは、サンプルを、０．１％ＳＤＳと１μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ非含有リボヌクレアーゼの存在下、３７℃で１時間培養し、抽出とエタノール沈殿工程を繰り返すことによって除去される。本方法によれば、ゲノムＤＮＡ収率は、約２ｍｇＤＮＡ／１ｇ細胞又は組織であることが期待される(Ausubel et al., supra)。本方法によって単離されたゲノムＤＮＡは、本発明に基づき使用されることができる。

標的ＤＮＡは、全血から抽出することもできる。例えば、血液は、標準的な方法によって採血管（好ましくは、シリコン処理ガラスを含む）に採血されることができ、また、血清調製用の抗凝血剤を含まないか、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、又は類似の抗凝血剤を含むかのいずれかであり、最も好ましくは、血漿調製用にＥＤＴＡを含む。好適な方法は、必ずしも必要とされるわけではないが、全血から分画された血漿又は血清である。血漿又は血清は、好ましくは緩やかな遠心分離である３００乃至８００ｘｇで５ １０分間の遠心分離によって全血から分画される、又はその他の標準的な方法によって分画されることができる。ヘパリンはＰＣＲを干渉する可能性があるため、ヘパリン化血液を使用する際は、へパリナーゼによる前処理が必要である可能性がある。したがって、ＥＤＴＡは、血液試料に対する好適な抗凝血剤である。新たに採取された血液の血漿もしくは血清、又は凍結（保存）されたものを解凍した血漿もしくは血清が、本発明の方法に使用可能である。保存された血漿又は血清は、−２０℃乃至−７０℃で維持されるべきであり、新たに採取された血漿又は血清は、使用まで冷蔵庫に置かれるか氷上に維持される。その後、ＤＮＡは、当業者によって公知の方法、及び本明細書に記載される方法によって抽出される。

＜診断検査＞
本発明は、病気の診断、検出、監視、評価、又は治療を対象とし、患者サンプルから標的配列を濃縮する方法に関し、これら病気とは、特に、動物又はヒトにおける腫瘍性又は増殖性の病気である。好適な実施形態において、核酸は、癌遺伝子又はその他の腫瘍関連ＤＮＡをコードする核酸由来である。

標的配列の優先的な濃縮により、ＤＮＡの更なる分析又は操作が可能となる。例えば、濃縮された対立遺伝子は、分析により、そのＤＮＡが由来する細胞の特性が定義可能となる。任意の幾つかの方法が、核酸配列シークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、プロトン核磁気共鳴分光法（NMR spectroscopy）を含む分光法、生化学的分析、及び免疫学的分析を含む所望の情報に応じて、使用可能である。一実施形態では、増幅されたＤＮＡは、アガロースゲルから変異ＤＮＡバンドを取り出すことによって単離され、再増幅され、プラスミドベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔベクタープラスミド（Promega）内にクローンされ、Sequenase 2.0 (USB)等の市販キットを用いることによって配列が決定される。標的ＤＮＡ、ひいては例えば腫瘍の特性を定義するための分析は、細胞（例えば腫瘍）の記述説明、特性、又は分類を含む幅広い臨床的有用性を提供する（周知又は潜在のどちらか）。これは、例えば、器官の組織によって、タイプ（例えば前癌状態又は悪性等）、表現型、及び遺伝子型によって、並びに腫瘍動態、生理学及び生化学の記述説明又は特性によって得られる。これにより、腫瘍の侵襲性、転移傾向、及び様々な治療に対する感度又は耐性の理解が得られることになる。したがって、進行中又は計画中の治療への応答の予測が可能となり、さらに、予後の評価が可能となる。標的ＤＮＡの特性を前回の生検又は外科的試料と比較することにより、その試料と比較した腫瘍の非均一性又は類似性、及び腫瘍の再発の更なる評価が可能となる。

また、標的配列の選択的濃縮後、相補リボ核酸（ＲＮＡ）がＤＮＡから転写又は製造されることができる。好適な実施形態では、ＲＮＡの転写は、増幅反応（工程３）において関心のあるＤＮＡ用の標準プライマー配列に結合されるＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域を備えるプライマーを使用することにより、実施される。そして、ＤＮＡに相補的なＲＮＡは、取り付けられたプロモーター領域から転写される。代替方法では、増幅された対立遺伝子ＤＮＡが発現ベクターにクローンされ、ＤＮＡに相補的なＲＮＡが転写される。さらに、選択的な好適な実施形態として、相補ＲＮＡは、インビトロの翻訳反応内で用いられることにより、腫瘍関連又は腫瘍特異的タンパク質を製造する。

対立遺伝子の特性、腫瘍由来又は腫瘍関連ＤＮＡの増幅、及び相補ＲＮＡの特性と転写、及び腫瘍関連又は腫瘍特異的タンパク質への翻訳は、治療の割当及び腫瘍特異的治療の開発の両方において、有意な有用性を提供する。細胞外ＤＮＡのシークエンシング又は相補ＲＮＡの転写は、アンチセンス化合物の割当又は開発を可能とする。このアンチセンス化合物とは、合成オリゴヌクレオチド、及び細胞外ＤＮＡに好適に特異的なその他のアンチセンスコンストラクト（例えば、Aoki et al. （1995, Cancer Res. 55: 3810 3816）の方法を用いた発現プラスミドの構築によるもの）を含む。同様に、腫瘍特性を定義することにより、増幅されたＤＮＡに好適に特異的である特異的モノクローナル抗体又はワクチン治療の割当が可能となる。対応する免疫性タンパク質の産生は、腫瘍特異的モノクローナル抗体の開発に用いられることができる。同様に、翻訳されたタンパク質は、腫瘍特異的ワクチンの開発に用いられることができる。

特に価値が高いこととして、本発明は、これら腫瘍特異的治療又は診断の開発及び応用が、前癌状態の腫瘍又は潜伏癌のみ存在する場合であっても可能である。したがって、本発明は、腫瘍組織量が低い場合であっても治療的介入が可能であり、免疫学的機能が比較的損傷を受けず、患者が危険にさらされることがなく、治療の潜在性を全て高めるものである。

＜濃縮配列の更なる処理＞
本方法を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、高分解能融解曲線分析（HR-メルティング：High Resolution Melting）又は単一分子シークエンシング（SMS：Single Molecule Sequencing）と併用して用いることによって、変異検出における３つの明確な必要性に取り組むこととする：臨床転帰に関連すると知られている又は疑いがある体細胞変異の高速検出（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）；未知の体細胞変異のための個別の患者サンプルの高速スキャニング（ＨＲ−メルティング）、続いて、わずかなエクソンの選択的シークエンシング；「困難なサンプル」内の複数遺伝子の大量な並列シークエンシング。ここで、「困難なサンプル」とは、即ち、臨床的に関連する変異が０．５−５％のレベルで存在可能な異質間質の汚染又は体液を含む腫瘍からのサンプルのことである（単一分子シークエンシング、ＳＭＳ）。

＜質量分析法＞
一実施形態では、濃縮された標的配列は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによってシークエンシングされる。質量分析（ＭＳ：Mass spectrometry）は、ＤＮＡシーケンシングにおいて強力なツールとして現れたものである。質量分析計は、直接的な質量測定を、フェムトモルからピコモルの範囲で数秒又は数分で得ることができる。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳは、高速ＤＮＡシークエンシング及びＤＮＡ分子の効率的な大きさ決定のために成功して用いられてきた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの出現は、損傷を受けていない巨大なＤＮＡ分子をイオン化すること及びそれらの質量対電荷比を測定することを容易にした。一本鎖及び二重鎖ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（登録商標））の５００ヌクレオチド（ｎｔ）長の産物が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって検出されている。ＤＮＡ断片化を減少させる最適化マトリックス−レーザーを組み合わせて用いると、合成ＤＮＡの赤外線ＭＡＬＤＩ質量スペクトル、プラスミドＤＮＡの制限酵素断片、及び２１８０ｎｔ長までのＲＮＡ転写産物が、±０．５−１％の精度で報告された。大きいオリゴマーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって検出されてきたが、一般的に１００マー(mer)までのオリゴマーが許容されるのが現在では通例である。

幾つかの遺伝子において、臨床的に重要な変異は、ゲノム中にランダムには生じない（例えば、最も良く知られている癌遺伝子において発生する機能獲得型変異）。代わりに、比較的少ない数のコドンに影響を及ぼす変化は、大抵、体細胞変異の大部分を占める。その結果、原則的には、限られた数の良好に設計された遺伝学的分析は、臨床的関連変異の大部分を効果的に調べられるはずである。例えば、Garrawayとその同僚（Thomas, R.K., et al. (2007) Nat Genet, 39, 347-351）は、ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、及びＢＲＡＦの遺伝子につき１６−４４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイが、これまでにヒト悪性腫瘍においてこれらの遺伝子が観察されてきた変異発生の９０％−９９％を占めることを示した。したがって、ハイスループットの遺伝子型決定は、臨床試料において大規模に、臨界的及び／又は「標的可能な」癌変異を検出する効果的な手段を提供する可能性があることが提示されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、非異種腫瘍サンプル内で既に同定された変異の検出に理想的である。ここで、生殖細胞又はＳＮＰ同定のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの信頼性には疑問の余地はないが、体細胞変異を検出する実験は比較的最近のものである。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの信頼性は、＜１０％の変異細胞を含む異種サンプルを用いた時（例えば、膵臓、肺、前立腺癌）、又は体液からのＤＮＡがスクリーニングされた時に、実質的に下がる。感度を向上させることにより、本濃縮方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが低レベルの体細胞変異を検出することを可能とし、また、主流な外科的腫瘍サンプルスクリーニングに必要である要求信頼性を提供する。

＜高分解能融解曲線分析（High Resolution Melting）＞
その他の実施形態では、濃縮された標的配列は、高分解能融解曲線分析される。エクソンに沿った多くの位置において臨床的関連変異を含む遺伝子、例えばｐ５３は、個別の変異遺伝子型決定よりも変異スキャンによって容易にスクリーニングされる。ＨＲ−メルティングは、ハイスループット変異スキャン技術であり、ここ数年に導入され、ＳＮＰｓ又は生殖細胞変異を発見するための優れた能力を備えるものである（Chou, L.S., et al. (2005); Am J Clin Pathol, 124, 330-338; Wittwer, C.T., et al. (2003); Clin Chem, 49, 853-860; Reed, G.H. and Wittwer, C.T. (2004); Clin Chem, 50, 1748-1754）。

挿入蛍光染料（ＬＣグリーン又はＳｙｂｒ−グリーン)の存在下、関心のあるゲノム領域をＰＣＲ増幅した直後、変異の存在は、融解曲線分析及び野生型との入念な比較によって、いかなる増幅後処理も必要とせずリアルタイムに同定される。さらに、高分解能融解曲線分析は、チューブを閉じた状態を維持しつつ、従来の方法を用いた時に必要とされる時間の何分の１かで、遺伝子スキャン及び変異遺伝子型決定（即ち、ＳＮＰ同定）を同時に達成する。ＰＣＲは、＜３０分（毛細血管）又は１．５時間（９６又は３８４ウェルプレート）を必要とし、融解には毛細血管ごとに１−２分又はプレートごとに５分が必要である。

しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦとともに用いると、ＨＲ−メルティングを用いる利点は、約〜２０％変異−野生型比以下の体細胞変異に有利に利用されることができない。したがって、臨床サンプルの様々なクラスは、ＨＲ−メルティングを用いて確実にスクリーニングされることができない。検出限界を上げることによって、本発明は、ＨＲ−メルティングの利便性とスループットを、主流な外科的腫瘍サンプルスクリーニングに適用可能であり、また、間質汚染又は体液からのＤＮＡを含む「困難な」臨床サンプルにおける低レベルの体細胞変異を検出するためにも適用可能である。

＜単一分子シークエンシング＞
その他の実施形態では、濃縮された標的配列は、単一分子シークエンシングを受ける（Thomas, R.K., et al. (2006); Nat Med, 12, 852-855）。単一分子シークエンシングの能力もまた、本発明を組み込むことによって利益を受けることになる。例えば、患者サンプルに関する変異スクリーニングにおいて、ゲノムＤＮＡからの標準ＰＣＲ機器内の選択エクソンをＰＣＲすることは、第２世代シークエンシングの開始前に未だ必要である。さらに、臨床サンプルにおける１−５％変異−野生型比のレベルの変異検出は、許容可能な統計値を得るために多くの「個別事例」の反復シークエンシングを必要とする。これは、最終的にはスループット能力を減少させ、１％レベルの変異において１０−２０配列のみが同時にスクリーニング可能であり、対照的に、変異が広まった場合には〜４,０００配列が同時にスクリーニング可能である（per 454 Life Sciences, Technical Service）。単一分子シークエンシングの前に本発明を実施することにより、変異の普及率は、総数又は対立遺伝子の割合に応じて１−２桁増えることになり、これにより単一分子シークエンシングのスループットが同程度まで増加する。

一実施形態では、選択的濃縮の方法は、単一分子シークエンシング反応のエマルション段階の間に適用される。この実施形態では、濃縮された標的配列は、その後、ピロシークエンシングを受ける。

＜プライマー伸長＞
その他の実施形態では、濃縮された標的配列は、プライマー伸長シークエンシング反応を受ける。プライマー伸長において、配列が既知である核酸と比較して、配列内の変動をその所定位置において評価するためにオリゴヌクレオチドが用いられる。サンプルのオリゴヌクレオチドは、一本鎖分子として提供され、誘発剤、標識ヌクレオチド、及びプライマーと混合される。このプライマーは、混合物を形成するために所定位置に隣接する範囲と同一の配列を有する。この混合物において、標識ヌクレオチドが構成された塩基以外の塩基で構成されたヌクレオチドは、本質的に欠如している。その後、混合物は、プライマーを一本鎖分子にアニーリングすること、及び標識ヌクレオチドを組み込んだプライマー伸長産物を形成することを促進させる条件下におかれる。そして、混合物は、標識ヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の存在に関して分析される（米国特許第5,846,710号）。

＜バッファー＞
本発明の増幅方法においてミスマッチ及びマッチした二本鎖の間のＴｍの差異を増加させるために、有機溶媒を含有することが検討される。特定の有機溶媒を含むことにより、標的配列の濃縮が改善される。例えば、有機溶媒を含有することは、参照及び標的ＤＮＡ配列間の変性温度差異を増大させることが可能であるために、標的配列の優先的な増幅に役立つ。有機溶媒、例えばＤＭＳＯ、ホルムアミド、ベタイン、又はグリセロール（Pomp, D. and Medrano, J.F.,Biotechniques, 10, 58-59 (1991)）は、マッチした（参照／参照）及びミスマッチした（標的／参照）配列間のＴｍの差異を増大させることができる。したがって、本発明の中間ハイブリダイゼーション工程（クロスハイブリダイゼーション）は、ミスマッチを含む標的−参照配列を形成するために、ポリメラーゼの作用を阻害しない程度の有機溶媒を含むことが有利である。したがって、ある実施形態では、反応混合物は、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ベタイン、グリセロール、又はそれらの混合物が、１−１０％v/v(volume to volume）、好ましくは３−８％v/v、最も好ましくは５−６％v/vで補充される。実施例８は、濃縮方法におけるＤＭＳＯの使用を図示する。

有機溶媒を用いるその他の実用面での利点は、任意の配列に適切なＴｃが、反応中に有機溶媒を用いることによって変動することである。これにより、ＤＭＳＯが存在する場合、配列のＴｃは８３．５℃であり、３％ＤＭＳＯが存在する場合、Ｔｃは８０．５℃である。結果として、異なる量のＤＭＳＯ又はその他の溶媒を異なる配列に加えることにより、全ての配列に対してＴｃが同じであることを確実にすることができる。これは、変性温度が全てに対して同じになるので、１つのＰＣＲ機器の稼働の際、各種配列に対して多くの濃縮反応を実施するのに有用である。

＜実施例＞
（実施例１）標的配列を濃縮するための材料及び方法
＜ＣＯＬＤ−ＰＣＲの検証に用いられる配列＞：本発明を検証するために、ｐ５３エクソン８及びＫｒａｓエクソン２（コドン１２−１３）の異なる位置で変異を含む一連のゲノムＤＮＡ及び細胞株が使用された（図３）。ｐ５３エクソン８変異は、肺癌における予後不良と関連があり、癌患者の血漿内では低普及率の変異である。同様に、Ｋｒａｓ変異は、肺腺癌において予後的意義を有する。

＜濃縮プロトコル及びプライマー＞：ＰＣＲは、０．１×ＬＣ−グリーン挿入染料の存在下で、続いてCepheid機器でリアルタイムに実施された。ＰＣＲのリアルタイムフォローアップは、必ずしも必要ではないが、利便性が高いために、全ての実験に適用された。

１６７ｂｐ ｐ５３配列の標準ＰＣＲは、濃縮プロトコルにおいて使用するのに十分な産物を得るために、まず１０サイクル実施された。Cepheid機器は、以下のサイクルパラメーターを用いてプログラムされた：９５℃、１２０秒；（９５℃、１５秒／５５℃ 蛍光読み出しＯＮ、３０秒／７２℃、１分伸長）×１０サイクル。

得られたＰＣＲ産物は、その後、１：１０００に希釈され、以下の濃縮プロトコル（図１に図示されている）を受けた：９５℃、１５秒；７０℃で１２０秒；Ｔｃ＝８６．５℃で３秒間の変性；５５℃の蛍光読み出しＯＮで３０秒間；その後、７２℃で１分間の伸長で３０サイクル。

サンガー・ジデオキシ・シークエンシングのためのＰＣＲ産物を準備するために、産物はエキソヌクレアーゼＩとエビアルカリホスファターゼを用いて処理された。以下のプライマーがシークエンシング方法において使用された：
１６７ｂｐ断片：: 5’ - GCT TCT CTT TTC CTA TCC TG - 3’フォワード（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）;
5’ - CTT ACC TCG CTT AGT GCT - 3’リバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。

８７ｂｐ及び２１０ｂｐのｐ５３断片及び１３５ｂｐのＫｒａｓ断片の濃縮プロトコルは、上述されたものを用いたが、臨界変性温度はＴｃ＝８３．５、８７．５、８０℃に夫々設定された。シークエンシング反応に用いられたプライマーは：
5’ - TGG TAA TCT ACT GGG ACG-3’ フォーワード（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）;
5’ CGG AGA TTC TCT TCC TCT - 3’ リバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）(87 bp p53 エクソン8断片)
5’ - GCT TCT CTT TTC CTA TCC TG - 3’ フォーワード（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）;
5’ - TAA CTG CAC CCT TGG TC - 3’ リバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）(210 bp p53 エクソン8断片)
5’-AACTTGTGGTAGTTGGACCT-3’ フォーワード（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）;
5’-CTCTATTGTTGGATCATATT-3’ リバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）(Kras エクソン2断片)
であった。全ての濃縮プロトコルの再現性は、３−６の独立した実験で試験された。

＜結果＞
ｐ５３エクソン８変異：臨界変性温度Ｔｃ＝８６．５℃を利用した濃縮プロトコルが、１６７ｂｐエクソン８断片に適用される時、濃縮は、検査された全ての変異に対して明らかであった。図４は、代表的な結果を示す。例えば、ＨＣＣ細胞からのＤＮＡは、初めに野生型細胞内で５％変異−野生型比となるまで希釈され、濃縮プロトコル後に〜７０％の変異−野生型比となる。これは、シークエンシング・クロマトグラムを観察することによって推定されたものである（即ち、〜１４倍の濃縮）。同様に、ＳＷ４８０細胞からのＤＮＡ（コドン２７３におけるホモ接合Ｇ＞Ａ変異）は、野生型に１０倍希釈され、濃縮手順後に〜７倍濃縮された。ＣＴ７サンプルに対する〜１２倍の濃縮（ヘテロ接合Ｃ＞Ａ変異）、及びＭＤＡ−ＭＢ２３１サンプルに対する６倍の濃縮（ヘテロ接合Ｃ＞Ｔ変異）もまた、観察された。野生型ｐ５３サンプルは、濃縮方法を用いて増幅され、変異を示さなかった（図４）。１６７ｐｂ断片が検査された全ｐ５３変異は、図２に一覧となっており、濃縮は５−１４倍変動した。このようにして、濃縮手順は、変異が存在する位置に関わりなく、全ての変異含有配列の普及率を増大させた。

Ｋｒａｓコドン１２／１３変異：図５は、Ｋｒａｓからの１３５ｂｐ断片の結果を図示する。結果は、９４℃の変性温度で実施された標準ネステッドＰＣＲを受けた後にサンガー・シークエンシングされたものと比較された。図５は、３３％変異−野生型比まで下がった変異は、サンガーシークエンシングを用いて明らかに検出可能であることを図示する。

＜実施例２＞ 臨床サンプルのサンガーシークエンシング
本発明を臨床サンプルの分析に適用するために、標準ＰＣＲ後に予めシークエンシングされた２０の結腸腫瘍及び肺腺癌の臨床サンプルが、実施例１に記載される如く濃縮プロトコル及びサンガーシークエンシングに使用された。結果は、標準ＰＣＲサンガーシークエンシングを用いて同定された全ての変異もまた、濃縮手順、続いてシークエンシングを用いて同定された。しかしながら、濃縮手順は、標準シークエンシングが見逃した変異も同定した。図６は、２つの臨床サンプル、ＴＬ６４及びＣＴ２０を示す。ここで、低普及率のＧ＞Ａ変異が、ｐ５３エクソン８、コドン２７３の濃縮プロトコル−サンガーシークエンシングを用いて検出されたが、標準ＰＣＲ後のシークエンシングによっては検出されなかった。変異の存在の独立検証は、ＲＦＬＰベースのシークエンシングを用いて実施された。

さらに、ｐ５３エクソン８（Ｇ＞Ａ）変異は、５人の結腸癌患者から、血漿循環ＤＮＡにおいて、濃縮手順−サンガーシークエンシングを用いて検出されたが、標準ＰＣＲ−サンガーシークエンシングを用いては検出されなかった。次に、標準シーケンシングが見逃したｐ５３（Ｃ＞Ｔ）変異もまた、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ：non-small-cell lung cancer）患者から得られたホルマリン固定（ＦＦＰＥ）検体からのＤＮＡを用いて明らかになった（図６）。図６の底部のクロマトグラフは、ＮＳＣＬＣ患者から得られた別のＦＦＰＥサンプルにおけるＫｒａｓコドン１２変異の検出を示す。濃縮手順を用いて同定された変異は、続いてゲノムＤＮＡからＲＦＬＰ法によって独立検証された。したがって、標準ＰＣＲ−シークエンシングが見逃した関連変異は、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ−シークエンシングを用いることにより容易に検出可能となった。

＜実施例３＞Ｔｍを下げる変異は、ミスマッチアニーリング工程なしで濃縮されることが可能である
ＰＣＲのヌクレオチド配列への依存度は、変性温度が、ＰＣＲ中にミスマッチさえ形成しない臨界温度（Ｔｃ）に設定され、Ｔｍを下げるこれら変異の濃縮が存在するときには、非常に顕著である。したがって、Ｇ及びＡの対立遺伝子が存在する場合、Ａ−対立遺伝子は、対立遺伝子のＴｍを下げるためにＣＯＬＤ−ＰＣＲ中に濃縮されることになる。この点を示すため、そして、検査された配列のサイズへの濃縮の依存度を検査するために、ｐ５３エクソン８からの１６７ｂｐ断片と同じ変異を含む８７ｂｐ断片と２１０ｂｐ断片が試験された（図３）。１６７ｂｐ断片と同様に、これら２つの断片は、初期ｐ５３エクソン８アンプリコンから、ネステッドＰＣＲを用い、続いて濃縮プロトコルによって、増幅された。しかしながら、この事例では、実施例の増幅プロトコルの短縮バージョンが使用され、７０℃におけるミスマッチ形成工程及び９４℃工程が両方省略された（８７ｂｐ断片に対し臨界変性温度Ｔｃ＝８３．５℃、及び２１０ｂｐ断片に対しＴｃ＝８７．５℃）。したがって、濃縮プロトコルの本バージョンでは、ＰＣＲサイクルは、臨界変性温度（Ｔｃ）、プライマー結合工程（例えば、５５℃）、及びプライマー合成工程（例えば、７２℃）のみの間を循環する。

図７Ａは、８７ｂｐ断片のシークエンシング・クロマトグラムを示す（８７ｂｐ配列のどの位置に変異が存在しているかに応じて、フォワード又はリバース・シークエンシングのいずれかが実施された）。データは、改良された濃縮プロトコルの本バージョンを用いると、８７ｂｐ断片を２０−５０倍に濃縮することを示す。例えば、ＳＷ４８０ＤＮＡの変異−野生型ＤＮＡ比の１％初期希釈は、濃縮後に５０％変異−野生型比を導く結果となる（即ち、〜５０倍濃縮）。次に続くサンガーシークエンシングは、「ヘテロ接合」配列を明らかに示した。短縮濃縮プロトコルを用いた濃縮へのサイズの影響は、図７Ｂに示される。データは、濃縮が、＜１００ｂｐの断片に対して最も高いが、２１０ｂｐまでの断片に対しても非常に明らかである（〜８−１０倍）ことを示す。

＜図４＞Ｔｍを上げる又は下げる変異は、完全な濃縮方法を用いて濃縮可能である。
多様な癌サンプルに見られる大抵の（〜７０％）変異は、Ｔｍを下げる。〜１５％の変異はＴｍを上げる（例えばＡ＞Ｇ）一方で、〜１５％はＴｍを保つ（例えば、Ｇ＞Ｃ）。Ｇ＞Ａ及びＡ＞Ｇ変異及び欠失の両方を含む全ての可能な変異を濃縮することを可能にするためには、完全な濃縮プログラムが好ましい（図１）。Ｔｍを上げる又は下げる変異を有する標的配列を濃縮するための能力を示すために、Ｃ又はＴヌクレオチドのいずれかを備える１６７ｂｐのｐ５３エクソン８断片（野生型対ＨＣＣ細胞株）は、図１の濃縮プロトコルを用いて増幅された。

２つの混合物が形成され、１つは少数派としてＣ対立遺伝子を含み（Ｃ：Ｔ＝１：１０）、もう１つは少数派としてＴ対立遺伝子を含む（Ｔ：Ｃ＝１：１０）。濃縮工程後、又は代替的な標準ＰＣＲ後、産物はシークエンシングされた。両方の事例において、微量の対立遺伝子（即ち、増幅前にＣ又はＴのどちらがより希釈されたかに応じたＣ又はＴのいずれか）が濃縮された。推定上、ミスマッチした配列は、Ｃ又はＴ対立遺伝子のいずれかよりも低い融解温度を有するため、図１のプロトコルを実施することによって、ミスマッチした配列は、必ず優先的に変性される。したがって、濃縮プロトコル中に中間温度（〜７０℃）でミスマッチを形成することによって、特異的なヌクレオチド変化が局所的Ｔｍを増大させる傾向がある場合であっても、微量の対立遺伝子の濃縮は必ず存在することになる。

＜実施例５＞ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦシークエンシング
本発明は、殆どのその他のＰＣＲベース技術を向上させることも期待される。それら技術は、体細胞変異検出のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む。この点を示すために、図１に適応されたものと同じモデル、即ち、変異含有細胞株の野生型サンプルへの連続希釈を用いて特定のｐ５３エクソン８変異を同定するためのサンガーシークエンシング用のモデルが、濃縮プロトコル対標準ＰＣＲ、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを行ったものを比較するのに用いられた。

濃縮プロトコル又は標準ＰＣＲ後、０．３Ｕエビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ）を用いて３７℃で２０分間培養した後、８５℃で５分間培養することにより酵素を非活性化させることによって、過剰なｄＮＴＰが反応物から除去された。ＳＮＰ又は挿入／欠失に及ぶ単一プライマー伸長法が、最終濃度：６００ｎＭ各伸長プライマー、５０μＭのｄ／ｄｄＮＴＰ及び０．１２６Ｕのサーモシーケナーゼ(Solis Biodyne)で実施され、９４℃で２分間、続いて９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、及び７２℃で５秒間の４５サイクルで培養された。使用された伸長プライマーは、検査される各ｐ５３変異に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのハーバードコア施設によって、マスアレイ・アッセイ・デザイン・ソフトウェア・バージョン3.1.2.2を用いて、設計されたものである。各変異に対して使用されたプライマーは、
p53_sw480: CAGGACAGGCACAAACA（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）;
p53_CT7: AGGACAGGCACAAACAC（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）;
p53_DU145: ACAGCTTTGAGGTGCGT（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）;
KRAS_SW480: TGTGGTAGTTGGACCTG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）;
KRAS_A549: ACTCTTGCCTACGCCAC（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
であった。

その後、陽イオン交換樹脂の追加によって反応物を脱塩させた後、混合及び遠心分離によってチューブの内容物を沈殿させた。伸長産物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Sequenom）を稼働する前に、３８４ウェルspectroCHIP上に見られた。

結果は、表１に示されている。変異濃縮倍数は、表１の第３欄に記載されている。濃縮は、標準ＰＣＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが適応された時に得られた値と比較して計算された。濃縮倍数１０−６０は、検査した変異の大部分において得られた。変異−野生型比の減少に応じた濃縮の増加は、変異の初期濃度の濃縮倍数の非線形依存性を示している。

＜実施例６＞ＴＡＱＭＡＮベースの標準リアルタイムＰＣＲと濃縮ベースリアルタイムＰＣＲの比較
標準リアルタイム及び濃縮ベースのリアルタイムＰＣＲにおけるＴＡＱＭＡＮプローブアッセイを比較するために、核酸増幅反応が実施された。２つのリアルタイム検出法を比較するためには、ｐ５３エクソン８にＧ＞Ａ変異を有するゲノムＤＮＡ及び臨床腫瘍サンプルの両方が、野生型配列の様々な希釈において分析された。ＳＷ４８０からのゲノムＤＮＡの野生型ＤＮＡへの連続希釈（１：３、１：１０、１：３０、１：１００、及び１：３００）が調製された。特に、０．２μＭのＴａｑｍａｎプローブ5’-6-Fam-TTT GAG GTG CAT GTT TGT GCC-BHQ_1-3’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の存在下で、２０ｎｇのゲノムＤＮＡから直接的にリアルタイムＰＣＲ反応が実施された。このＴａｑｍａｎプローブは、ＳＷ４８０細胞からのＤＮＡにおけるｐ５３変異含有配列に完全一致するものである。その他試薬の最終濃度は、：１×GoTaq Flexi バッファー(Promega)、１×GoTaqポリメラーゼ（Promega）０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭのフォワードプライマー、5’-TGG TAA TCT ACT GGG ACG-3’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、０．２μＭのリバースプライマー、5’-CGG AGA TTC TCT TCC TCT-3’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＭｇＣＬ_２３ｍＭ、そしてＤＮＡであった。ＰＣＲアンプリコンのサイズは、８７ｂｐであり、Ｔｃ＝８３．５℃であった。高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルは、９５℃、１２０秒；（９５℃、１５秒；５８℃蛍光リーディングＯＮ、６０秒）×２５サイクル；（８３．５℃で１５秒：５８℃蛍光リーディングＯＮ、６０秒）×２５サイクルであった。標準ＰＣＲサイクルには、同じプログラムが使用されたが、ＰＣＲ中の変性温度は、９５℃であった。実験は、独立した実験において少なくとも５回繰り返された。

結腸癌細胞株ＳＷ４８０からのゲノムＤＮＡに適用された標準及び濃縮のリアルタイムＰＣＲの感度を示す増幅プロットは、図８Ａ及び図８Ｂに示されている。図８Ｂは、濃縮リアルタイムＰＣＲが、１：３００の変異−野生型対立遺伝子比において変異を検出可能であることを示す。対照的に、Ｔｃ工程を除いて同一条件下で行われた標準リアルタイムＰＣＲは、最大希釈１：１０における変異のみを検出可能である（図８Ａ）。したがって、分析感度は、濃縮手順を用いることにより３０倍良くなる。

ｐ５３エクソン８変異（そのうちの１つは、ｐ５３エクソン８において低レベルの変異（野生型に対して５％の変異、ＣＴ２０）を含むことが分かっている）を有する臨床的腫瘍サンプルにおいて標準及び濃縮リアルタイムＰＣＲの感度を比較した増幅プロットは、図８Ｃ及び８Ｄに記載される。濃縮リアルタイムＰＣＲは変異を容易に検出可能である（図８Ｄ）一方で、標準ＰＣＲは変異を容易に検出不可能であった（図８Ｃ）。残りのサンプル（ＴＬ６、ＴＬ８、及びＴＬ１８）は、野生型サンプルとして知られており、同じ条件下で増幅しなかった（図８Ｃ）。

＜実施例７＞濃縮リアルタイムＰＣＲを用いた変異スキャニング
核酸増幅反応混合物は、標準及び濃縮リアルタイムＰＣＲの能力を比較するために調製された。この比較は、ｐ５３のエクソン８に沿った範囲にある変異を含むサンプルを検出するためのＤＮＡ検出染料を用いて実施された。本方法は、未知の変異又はヘテロ接合ＳＮＰを同定するための高速且つ便利な方法を提供する。したがって、本方法は、各種多様な用途のために生殖細胞又は体細胞変異に関して多数の遺伝子をスキャンする（例えば、胸部／卵巣ＣＡを発現する高い危険性を有するBRCA1/2変異集団をスキャニングする、変異を同定するための全遺伝経路をスキャニングする等）ために、当業者によって採択されることができる。

図９Ａ及び図９Ｂは、ＬＣ−グリーン染料を、ｐ５３のエクソン８に変異を含むことが知られている各種細胞株及び臨床的サンプルにおいて使用することにより、標準及び濃縮リアルタイムＰＣＲの両方を比較した増幅プロットを示す。データは、リアルタイム標準ＰＣＲ（図９Ａ）が、変異（ＳＷ４８０、ＴＬ６、及びＣＴ２０）及び野生型(Ｒ２７、ＴＬ８、ＴＬ１８、ＴＬ８１、及びＴＬ８２)サンプルとの間を識別することができず、その一方で、濃縮リアルタイムＰＣＲはそれを識別可能であることを示す（図９Ｂ）。濃縮方法は、野生型サンプルよりも変異含有サンプルに早期閾値検出を提供する。

図９Ｃ及び図９Ｄは、増幅反応による結果を図示し、図９Ａ及び９Ｂに記載された反応条件と同一の条件下におけるものであるが、ここでは、サンプルは全て肺腫瘍である。データは、リアルタイム標準ＰＣＲ（図９Ｃ）が変異及び野生型サンプルの間を識別できないが、リアルタイム濃縮ＰＣＲ（図９Ｄ）は識別することを示す。濃縮方法は、野生型サンプルよりも変異含有サンプルに早期閾値検出を提供する。

さらに、濃縮検出方法は、サンプルＴＬ６において今まで知られていなかったＣ＞Ｔ変異を識別することができた。

＜実施例８＞有機溶媒は、標準及び改良型リアルタイムＰＣＲ中に変異の濃縮を増大させる。
核酸増幅反応混合物は、標準及び濃縮リアルタイムＰＣＲに対する有機溶媒の影響を評価するために調製された。反応は、有機溶媒（３％ＤＭＳＯ）の存在下又は非存在下のいずれかで実施された。使用された手順は、実施例７で記載されたもの及び図９Ｃ及び図９Ｄに描かれたものと、３％ＤＭＳＯを添加したことを除いて同じであった。

有機溶媒の存在は、変異配列を含むサンプルと野生型配列を含むサンプルの増幅プロット間の識別を向上させた（図１０）。例えば、野生型サンプルと変異サンプルの間の閾値の差は、〜５サイクル（ＤＭＳＯなしのリアルタイム濃縮、図９Ａを参照）から１０サイクル以上（ＤＭＳＯありのリアルタイム濃縮、図１０Ａを参照）へと増加した。

＜実施例９＞濃縮ＰＣＲと併用してＲＦＬＰを用いた超低レベル変異の検出
ＲＦＬＰ−ＰＣＲと併用して用いた濃縮ＰＣＲは、超低レベルの変異の同定を向上させるために、例えば、非常に早期の段階（即ち、治療前）において癌サンプル内の癌ゲノム又は耐性変異におけるランダムな変異を同定するために、使用されることができる。

例えば、野生型ＥＧＦＲエクソン１９を含むサンプルは、ＴａｑＩ酵素を用いて選択的に消化された。１：１０,０００の変異−ゲノムＤＮＡ比までの希釈物は、その後濃縮型（Ｔｃ＝８１．５又は８１℃）又は標準ＰＣＲ型（９５℃）のいずれかのＰＣＲを受けた。変異の濃縮は、ＴａｑＩ消化、その後、ｄＨＰＬＣによって定量化された（図１１）。存在する変異の量は、約７分の保持時間における別個の変異ピークの存在によって定量化された。濃縮手順後、変異ピークは、標準ＰＣＲ後と比較して非常に明らかであった。結論として、濃縮手順は、ＲＦＬＰ−ＰＣＲによって同定される超微量の変異の検出を実質的に向上させた。

本明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、引用することによりその全体を本願に援用する。本発明は、その好適な実施形態を参照して記載されてきたが、当業者であれば、添付の請求の範囲に含まれる本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細事項を各種変更可能であることが理解できることである。

Claims (19)

1. 反応混合物内において標的配列の二本鎖を濃縮する方法であって、
   ａ．前記標的配列の二本鎖及び参照配列の二本鎖を含むと考えられる反応混合物を、標的配列の一本鎖と参照配列の一本鎖を形成するために前記標的配列の二本鎖及び前記参照配列の二本鎖の変性が可能となるように、前記標的配列の二本鎖と前記参照配列の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも高い第１変性温度にする工程を含み、
   前記標的配列の二本鎖は、参照配列の二本鎖に対して１以上の挿入、欠失、または、置換を含み、前記参照配列の二本鎖とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるとともに、前記参照配列の二本鎖と同じプライマー対によって増幅され、
   前記方法はさらに、
   ｂ．標的配列の一本鎖／参照配列の一本鎖の二本鎖の形成が可能となるように、前記反応混合物の温度を下げる工程と、
   ｃ．工程（ｂ）の前記二本鎖が優先的に変性され、変性された標的及び参照配列の一本鎖を形成するように、前記反応混合物を前記参照配列の二本鎖のＴｍよりも低い臨界温度（Ｔｃ）にする工程と、
   ｄ．前記プライマー対が前記標的及び参照配列の一本鎖にアニーリング可能となるように、前記反応混合物の前記温度を下げる工程と、
   ｅ．前記参照配列の二本鎖と比較して前記標的配列の二本鎖を濃縮するために、前記プライマー対を伸長させる工程とを備えることを特徴とする方法。
2. 前記標的及び参照配列の二本鎖が、反応混合物をＰＣＲにかけること、および、その後、反応混合物の少なくとも一部を請求項１の濃縮方法にかけることによってまず増幅されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記標的配列の二本鎖が、参照配列の二本鎖に対して１以上の欠失、挿入、または変化を含む変異対立遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. （ｉ）前記標的及び参照配列の二本鎖が、少なくとも２５の塩基を含み、および／又は
   （ｉｉ）前記Ｔｃが、前記参照配列の二本鎖のＴｍよりも０．３℃−５℃低く、および／又は
   （ｉｉｉ）前記Ｔｃが、前記標的配列の二本鎖のＴｍよりも低く、
   （ｉｖ）前記方法が、５−４０回の間のサイクル繰り返され、および／又は
   （ｖ）前記方法が、１０−３０回の間のサイクル繰り返される、
   ことを特徴とする請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
5. （ｉ）前記標的及び参照配列の二本鎖が、少なくとも２５の塩基を含み、および／又は
   （ｉｉ）前記Ｔｃが、前記参照配列の二本鎖のＴｍよりも０．３℃−５℃低く、および／又は
   （ｉｉｉ）前記Ｔｃが、前記標的配列の二本鎖のＴｍよりも低い、
   ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
6. ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−メルティング、ジデオキシ・シークエンシング、単一分子シークエンシング、ピロシークエンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲからなる群から選択される１以上の方法を使用して、濃縮された標的配列の二本鎖を有する前記反応混合物を分析する工程をさらに含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記Ｔｃが１秒−５分間適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記標的配列の二本鎖が前記参照配列の二本鎖から特異的にメチル化され、前記反応混合物に請求項１の方法を実施する前に、前記反応混合物を亜硫酸水素ナトリウムで任意に処理することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記反応混合物が核酸検出染料を含み、リアルタイムＰＣＲにおいて任意に実施されることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
10. 標識プローブを利用してリアルタイム反応条件下で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記方法は、２以上の異なる標的配列の二本鎖を濃縮するために使用されるとともに、前記標的配列の二本鎖に特異的な１以上の追加的なプライマー対をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記プライマー対が工程（ｂ）において適用される温度よりも低い融解温度を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 前記プライマー対が工程（ｂ）において適用される温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 前記反応混合物が、修飾核酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記工程ｂ）及びｃ）が、工程ｄ）を実施する前に１回以上繰り返す工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
16. 前記工程ａ）乃至ｅ）が、２サイクル以上繰り返されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記標的配列の二本鎖は前記参照配列の二本鎖と少なくとも７０％相同することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
18. 前記標的配列の二本鎖は前記参照配列の二本鎖と少なくとも８０％相同することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
19. 前記標的配列の二本鎖と前記参照配列の二本鎖は、１乃至９のヌクレオチドによって異なることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

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