JP5879667B2 - 核酸の検出および同定のための一体型デバイス - Google Patents
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- C12Q2527/101—Temperature
Description
本願は、参照により本明細書に組み入れられている、2011年4月20日に出願された「核酸の検出および同定のための一体型デバイス(Integrated Device for Nucleic Acid Detection and Identification)」という表題の、米国仮出願第61/477,357号および2011年4月20日に出願された「核酸のための振動増幅反応(Oscillating Amplification Reaction for Nucleic Acids)」という表題の米国仮出願第61/477,437号の出願の優先権と利益を主張する。
配列記載書、表またはコンピュータプログラムへの参照
流体サブアセンブリの実施形態の構成要素は、好ましくはプラスチック、たとえばアクリル、ポリカーボネート、PETG、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレンおよび/または他の同様の材料を含む。これらの材料は、ただちに入手可能であり、標準方法によって製造できる。図3および図7に示すように、流体サブアセンブリは、チャンバおよびチャネルの両方を含む。流体チャンバは、壁、2つの面160から成り、1個以上のチャネル、たとえば入口、出口またはベントに連結されている。チャネルは、2個の流体チャンバを連結可能であり、壁および2つの面から成る。流体チャンバ設計によって、加熱および冷却を促進するために、好ましく表面積対体積比が最大化される。チャンバの内部体積は、好ましくはおよそ1μLからおよそ50μLの間である。溶液と接触したチャンバ面160の面積は、好ましくは、加熱中の流体温度を均一にするために加熱素子がインタフェースする面積と一致する。流体チャンバの形状は、加熱素子と適合するようにおよび溶液の進入または退出に好ましい形態を提供するように選択してよい。いくつかの実施形態において、チャンバの体積は、デバイス動作の途中に発生する気泡にスペースを提供するために、流体体積より大きくてよい。流体チャンバは、流体を毛管作用によってチャネルに進入させないために、またはさもなければベント機構を遮断するために、ベントチャネルに達する拡大延長部を有してよい。ベントチャネルが連通しているこれらのチャンバの部分は、場合により、ベントチャネル中への流体の侵入をさらに減少させる1つ以上の非湿潤性または疎水性面を含む。
上記のように、複数のさらなる構成要素は、好ましくは最終積層および密閉の前に本発明の流体層内に組み込まれる。デバイスアセンブリの前に、緩衝剤、塩、dNTP、オリゴヌクレオチドプライマを含む試薬ならびに酵素、たとえばDNAポリメラーゼおよび逆転写酵素を凍結乾燥またはフリーズドライしてペレットまたはケーキにしてよい。試薬凍結乾燥は、当分野で周知であり、凍結試薬の一定分量を真空印加の下での昇華による脱水を包含する。リオプロテクタント、たとえば糖(二糖類および多糖類)およびポリアルコールの特定の処方を凍結前に試薬に添加することにより、酵素の活性が保存されることがあり、再水和速度が上昇することがある。凍結乾燥試薬ペレットまたはケーキは、標準方法によって製造され、いったん生成されると、合理的に耐久性であり、最終面を積層する前に、流体層の特定のチャンバ中に容易に配置することができる。
いくつかの実施形態において、プリント回路基板(PCB)は、標準0.062インチ厚FR4銅クラッド積層材料を含むが、標準の基板材料および厚さを使用してよい。電子構成要素、たとえば抵抗器、サーミスタ、LEDおよびマイクロコントローラは、好ましくは既製の表面実装デバイス(SMD)を備え、業界標準の方法に従って配置されている。
流体、電子およびハウジング構成要素の完成デバイスへの最終組み立ては好ましくは、PCA加熱素子と流体層に存在するチャンバおよび/またはポケットとの間の熱的接触を良好にするために、流体層250および電子層75の積層によって開始する。図9に示すように、接着シム222は両方の2つの層を共に結合して、平坦な流体層とPCA上に存在する局所的に隆起した電子構成要素との間で水平接触がなされるようにする。熱的接触をさらに改善するために、積層前にサーマルコンパウンドまたはグリースを加熱素子上に配置してよい。流体層および電子層の組み立て後に、最終デバイスを得るために、保護プラスチックハウジングを貼付してよい。
いくつかの実施形態において、図7に示すように、流体サブアセンブリは3枚の積層プラスチックシートを備えてよく、1枚のシートは流体チャンバの壁を形成し、他の2枚の構成要素は第1のシートに積層されて面を形成している。別の実施形態において、流体サブアセンブリは2個のプラスチック構成要素を含んでよく、一方の構成要素は壁および1つの面を形成して、他方の構成要素は第1の構成要素に積層されてチャンバを密閉して、第2面を形成する。本発明の実施形態において、流体サブアセンブリのプラスチック構成要素は、工業用レーザまたはウォータージェット切断、パンチまたはスタンプ工程および射出成形の手段によって製造してよい。他の別の実施形態において、流体サブアセンブリは、検出チャンバがデバイスの別個の層に位置して、検出チャンバが増幅チャンバおよび標識チャンバを備える層の前に配置されるように積層された層を備えてよい。この物理的配置によりデバイスの幅が縮小され、同時にさらなる機能性も付与される。特にこの実施形態によって、検出ストリップは検出チャンバ中に標識チャンバを覆って位置するように配置されて、(アッセイの検出ステップ中に)使用される標識チャンバの下にあるヒータ素子が検出チャンバ中の温度を制御できるようにする。検出チャンバ温度の制御により、検出ストリップのハイブリダイゼーション中に高温が使用できる。ハイブリダイゼーションベースの検出中にハイブリダイゼーションの厳密性の温度介在調節を使用することによって、ハイブリダイゼーション特異性を向上させることができ、このことはたとえば、密接に関連した核酸配列(たとえば一塩基変異多型)の識別において有用である。
使い捨て構成要素が再使用可能なドックとインタフェースする本発明の実施形態を用いて、柑橘グリーニングの病原因子であるカンジダツス・リベリバクタ・アシアティカスの存在について柑橘葉組織の試験を行った。
9.4μL 水
2.0μL 10×増幅緩衝剤
2.0μL DMSO
0.4μL 塩化カリウム(2M)
0.5μL 塩化マグネシウム(100mM)
0.5μL ジチオトレイトール(100mM)
0.5μL dNTP(10mM)
2.0μL プライマセットhyvl_Forおよびhyvl_Rev(各8μΜ)
0.5μL VentR(エキソ)DNAポリメラーゼ(2U/μL)*
0.2μL EtSSB、エクストリーム(Extreme)熱安定性一本鎖結合タンパク質(500μg/mL)*
2.0μL 健常またはC.リベリバクタ感染組織から抽出したDNA(17.2ng/μL)
*溶解して含まれていたか、または凍結乾燥酵素を使用した場合は、水で置換した。
hyvl_For
ggccgtttta acacaaaaga tgaatatcat agatggggta gtcaa(配列番号1)
hyvl_Rev
cggccatttt agataaatca atttgttcta gtttagatac atcaatttgt t(配列番号2)
使用した捕捉および検出オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった:
捕捉
tcgtttgagt agctagatcc nnnnnnnnnn nt(配列番号3)
検出
/5AmMC12/aattgatgga tgacgtgata gtttacgacc aacatctt/3Phos/(配列番号4)
上記のような部分使い捨てデバイスを作製した。再使用可能なユニットは、標準1.5オンス銅クラッドPCBで構成された。回路構成要素は、ATmega328マイクロコントローラ、0.5アンペアN−チャネルMOSFET、SMD抵抗器および電力調整構成要素を含んだ。ステレオリソグラフィー(SLA)により形成したプラスチックシェルにより、基板およびタクタイルスイッチを覆う。メスピンコネクタを上面に取り付けて、使い捨てPCAに垂直連結できるようにした。使い捨てPCAは、厚膜抵抗器、0402サーミスタおよび0603LEDと共に、同様のPCBで構成された。直角オスピンコネクタを基板の一端に配置して、再使用可能ユニットのメスソケットへの挿入時に垂直の向きを与えた。
12.1μL 水
2.0μL 10×増幅緩衝剤
2.0μL DMSO
0.4μL 塩化カリウム(2M)
0.5μL 塩化マグネシウム(100mM)
0.5μL ジチオトレイトール(100mM)
0.5μL dNTP(10mM)
2.0μL プライマセットhyvl_Forおよびhyvl_Rev(各8μΜ)
デバイスに通電する前に、以下の酵素をサンプルチャンバ中の溶離した核酸サンプルに添加して、ゲル添加ピペットチップを使用して短時間混合する。
1.0μL ベントR(エキソ)DNAポリメラーゼ(2U/μL)
0.4μL Et SSB、エクストリーム(Extreme)熱安定性一本鎖結合タンパク質(500μg/mL)
増幅チャンバのベントならびに増幅および検出プログラムの開始は、再使用可能ユニットのスタートボタンとして作用するタクタイルスイッチを押すことによって行った。ベント後、反応溶液は増幅チャンバに入り、ここで溶液を85℃まで2分間加熱して、続いて76℃にて10秒および60℃にて25秒を40サイクル行った。熱サイクルが完了した後、マイクロコントローラでベントを開始することにより、反応物を標識チャンバ中に流入させた。標識チャンバは、500mMスクロースの存在下で、標識チャンバの1つの内面に乾燥した青色染色ポリスチレン検出ミクロスフェアを含有した。染色ミクロスフェアにコンジュゲートされた検出オリゴヌクレオチドは、核酸増幅生成物のセンス鎖に相補的であった。標識チャンバを105℃まで2分間加熱して、次に90℃にて30秒間維持して、ポリスチレンビーズの沸騰および完全な混合ならびに二本鎖DNA生成物の変性を誘起させた。加熱後、標識チャンバ中の反応溶液を2分間冷却させた。検出チャンバをベントして、溶液を標識チャンバから検出チャンバにおよび検出ストリップアセンブリ上へ流入させた。ラテラル・フロー・メンブレン上に3つの捕捉ラインを固定化した。これらはデバイスの底部から、いずれのアッセイ標的にも相補的でない負の対照オリゴヌクレオチド、増幅生成物に相補的な捕捉プローブ、および検出プローブに相補的な正の対照オリゴヌクレオチドであった。図14に明瞭に示されているように、完全一体型デバイスにより、標的核酸の核酸単離、増幅および検出が成功した。
使い捨て構成要素が再使用可能なドックとインタフェースする本発明の実施形態を用いて、先行する核酸単離ステップなしで、柑橘グリーニングの病原因子であるカンジダツス・リベリバクタ・アシアティカスの存在について粗柑橘葉組織抽出物の試験を行った。
18.8μL 水
4.0μL 10×増幅緩衝剤
4.0μL DMSO
0.8μL 塩化カリウム(2M)
1.0μL 塩化マグネシウム(100mM)
1.0μL ジチオトレイトール(100mM)
1.0μL dNTP(10mM)
4.0μL プライマセットhyvl_Forおよびhyvl_Rev(各8μΜ)
1.0μL ベントR(エキソ)DNAポリメラーゼ(2U/μL)*
0.4μL Et SSB、エクストリーム(Extreme)熱安定性一本鎖結合タンパク質(500μg/mL)*
4.0μL ヌクレアーゼを含まない水500μL中で5個の生検パンチ(健常またはC.リベリバクタ感染柑橘樹のどちらかの柑橘葉葉柄または葉柄に近い中央脈から得た直径1.5mm)または約4mm長の葉柄組織を短時間粉砕することによって産生された、柑橘組織抽出物
*溶解して含まれていたか、または凍結乾燥酵素を使用した場合は、水で置換した。
使い捨て構成要素が再使用可能なドックとインタフェースする本発明の実施形態を実施例3に記載したように作製して、先行する核酸単離ステップなしで、シトラスグリーニングの病原因子であるカンジダツス・リベリバクタ・アシアティカスの存在について、ジアフォリナ・シトリ・クワヤマから調製した粗昆虫全体抽出物を試験するのに用いた。
18.8μL 水
4.0μL 10×増幅緩衝剤
4.0μL DMSO
0.8μL 塩化カリウム(2M)
1.0μL 塩化マグネシウム(100mM)
1.0μL ジチオトレイトール(100mM)
1.0μL dNTP(10mM)
4.0μL プライマセットhyvl_Forおよびhyvl_Rev(各8μΜ)
1.0μL ベントR(エキソ)DNAポリメラーゼ(2U/μL)*
0.4μL Et SSB、エクストリーム(Extreme)熱安定性一本鎖結合タンパク質(500μg/mL)*
4.0μL ヌクレアーゼを含まない水500μL中で5匹の昆虫全体を短時間粉砕することによって産生した、ジアフォリナ・シトリ・クワヤマ全体の抽出物
*溶解して含まれていたか、または凍結乾燥酵素を使用した場合は、水で置換した。
使い捨て構成要素が再使用可能なドックとインタフェースする本発明の実施形態を実施例3に記載したように作製して、先行する核酸単離ステップなしで、シトラスグリーニングの病原因子であるカンジダツス・リベリバクタ・アシアティカスの存在について、ツルニチニチソウ(カンタランツス・ロセウス)組織粗抽出物を試験するのに用いた。
18.8μL 水
4.0μL 10×増幅緩衝剤
4.0μL DMSO
0.8μL 塩化カリウム(2M)
1.0μL 塩化マグネシウム(100mM)
1.0μL ジチオトレイトール(100mM)
1.0μL dNTP(10mM)
4.0μL プライマセットhyvl_Forおよびhyvl_Rev(各8μΜ)
1.0μL ベントR(エキソ)DNAポリメラーゼ(2U/μL)*
0.4μL Et SSB、エクストリーム(Extreme)熱安定性一本鎖結合タンパク質(500pg/mL)*
4.0μL ヌクレアーゼを含まない水500μL中で直径1.5mmの生検パンチ5個(ツルニチニチソウ葉の葉柄から採取)を短時間粉砕することによって産生したツルニチニチソウ組織抽出物
*溶解して含まれていたか、または凍結乾燥酵素を使用した場合は、水で置換した。
使い捨て構成要素が再使用可能なドックとインタフェースする本発明の実施形態を実施例3に記載したように作製して、先行する核酸単離ステップなしで、シトラスグリーニングの病原因子であるカンジダツス・リベリバクタ・アシアティカスの存在について、ツルニチニチソウ(カンタランツス・ロセウス)組織粗抽出物を試験するのに用いた。
18.8μL 水
4.0μL 10×増幅緩衝剤
4.0μL DMSO
0.8μL 塩化カリウム(2M)
1.0μL 塩化マグネシウム(100mM)
1.0μL ジチオトレイトール(100mM)
1.0μL dNTP(10mM)
4.0μL プライマセットhyvl_Forおよびhyvl_Rev(各8μΜ)
1.0μL ベントR(エキソ)DNAポリメラーゼ(2U/μL)*
0.4μL Et SSB、エクストリーム(Extreme)熱安定性一本鎖結合タンパク質(500μg/mL)*
4.0μL ヌクレアーゼを含まない水500μL中で長さ1cmのつるを短時間粉砕することによって産生されたクスクタ・ペンタゴナ抽出物。
Claims (17)
- 標的核酸を検出するための使い捨てプラットフォームであって、
標的核酸を含むサンプルを収容するためのサンプルチャンバと、
第1チャネルを介して前記サンプルチャンバに連結され、第2チャネルを介して第1ベントポケットに連結された増幅チャンバと、
第3チャネルを介して前記増幅チャンバに連結され、第4チャネルを介して第2ベントポケットに連結された標識チャンバと、
前記標識チャンバに第5チャネルを介して連結され、第6チャネルを介して第3ベントポケットに連結された検出サブシステムと、
複数の抵抗加熱素子と、
1個以上の温度測定デバイスと、を備え
前記ベントポケットは、前記抵抗加熱素子のうち1個の付近に位置する非耐熱性メンブレンによって大気からそれぞれ密閉されている、使い捨てプラットフォーム。 - 前記サンプルチャンバの入口と直接流体連結した出口を備えるサンプル調製ステージをさらに備える、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記増幅チャンバの実質的平面の寸法が前記増幅チャンバと熱的に接触している抵抗加熱素子の実質的平面の寸法とほぼ同じである、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記増幅チャンバが能動的冷却デバイスによって冷却されない、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記増幅チャンバが増幅溶液を含有し、前記サンプルチャンバが液体増幅試薬ミックスもしくは凍結乾燥増幅試薬ミックスを含み、および/または前記標識チャンバが検出粒子を含む、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記標識チャンバが前記抵抗加熱素子の1個を使用して加熱可能である、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記検出サブシステムが検出粒子を含まないラテラル・フロー・ストリップを含む、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記チャンバ、前記チャネルおよび前記ベントポケットが流体アセンブリ層上に位置して、前記電子素子がプリント回路基板を含む別個の層上に位置し、前記別個の層が流体アセンブリ層に結合されている、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記検出サブシステムが前記流体アセンブリ層上または第2流体アセンブリ層上に位置している、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 少なくとも1個の前記チャンバの体積がおよそ1マイクロリットルからおよそ50マイクロリットルの間である、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 前記使い捨てプラットフォームを、外部機器ではなく、使い捨てプラットフォームを垂直のまたは傾斜した向きで保持するベースユニットと連結するためのコネクタをさらに備える、請求項1に記載の使い捨てプラットフォーム。
- 標的核酸を検出するための方法であって、
使い捨てプラットフォームのサンプルチャンバに標的核酸を含むサンプルを配置することと、
前記使い捨てプラットフォームを垂直にまたは傾斜して向けることと、
前記サンプルを液体または先に凍結乾燥させた増幅試薬ミックスと反応させることと、
増幅チャンバに連結された第1ベントポケットを大気に開放することにより、反応したサンプルが前記増幅チャンバ中に流入できるようにすることと、
前記増幅チャンバにて標的核酸を増幅することと、
標識チャンバに連結された第2ベントポケットを大気に開放することにより、増幅した標的核酸が前記標識チャンバ中に流入できるようにすることと、
前記標識チャンバにて検出粒子を使用して、増幅した標的核酸に標識することと、
検出サブシステムに連結されている第3ベントポケットを大気に開放することにより、標識した標的核酸が前記検出サブシステム中に流入できるようにすることと、
増幅した標的核酸を検出することと、を含み、
前記ベントポケットは、抵抗加熱素子の付近に位置する非耐熱性メンブレンによって大気からそれぞれ密閉されていることを特徴とする方法。 - 増幅ステップが、使い捨てプラットフォーム内で増幅チャンバ付近に位置する抵抗加熱素子を使用して、標的核酸を増幅することを含む、請求項12に記載の方法。
- 増幅チャンバを受動冷却することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 標識ステップの間に、使い捨てプラットフォーム内の標識チャンバ付近に位置する抵抗加熱素子を使用して標識チャンバを加熱することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 検出サブシステムが検出粒子を含んでいない、請求項12に記載の方法。
- 外部機器ではないドッキングステーションを使用することにより使い捨てプラットフォームの動作を制御することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
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