CN103608467A - 用于核酸的振荡扩增反应 - Google Patents
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Abstract
本发明的一个实施方案提供扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法。该方法包括将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物含有与核酸靶序列的模板互补的引物。所述反应的温度在高温和低温之间振荡，其中在多个温度循环期间，温度的变化不大于约20℃。核酸靶序列的模板被扩增。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年4月20日提交的名称为“用于核酸的振荡扩增反应”的美国临时专利申请号61／477,437的优先权和利益，并且其说明书和权利要求通过引用引入本文。
本申请要求于2011年4月20日提交的名称为“用于核酸检测和鉴定的集成设备”的美国临时专利申请号61／477,357的优先权和利益，并且其说明书和权利要求通过引用引入本文。
关于联邦资助的研究或开发的申明
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申请人在此递交序列表，其为文本文件，题为041812_ST25.txt，创建于2012年4月20日，具有10K千字节，符合ASCII，并且通过引用引入本文。
发明背景
发明领域(技术领域)：
本发明的实施方案涉及通过在任意给定的热聚合循环期间使反应温度在小范围内振荡，优选地在不大于20℃的范围内振荡进行核酸靶序列的依赖于模板的扩增的方法和设备。
背景技术：
注意，以下讨论引用多篇出版物和文献。本文中给出对这些文献的讨论是为了科学原理的更完全的背景，并且不被视为是承认这些出版物是用于确定专利性的现有技术。
在分子生物学中核酸的扩增是最必不可少的技术之一，其在研究、遗传测试、农业和法医学中广为使用。最常见的扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其中，特异性核酸靶序列的优势在溶液中呈指数增加(参见美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)。PCR反应采用两种寡核苷酸引物，所述引物杂交待扩增的靶序列的上游(5’)或下游(3’)的DNA双螺旋的相反链。(通常热稳定的)DNA聚合酶用于在5’→3’方向通过添加脱氧核苷三磷酸(dNTPs)使杂交的引物延伸，以便“拷贝”靶序列并且产生双链DNA产物。通过循环反应混合物的温度(典型地摄氏95℃)，DNA的两条链可以在高温分离，这允许它们充当模板以用于进一步的引物结合以及在较低温度(例如55 ℃和60 ℃)聚合。在重复该过程多次后，单个靶序列可以被扩增成数十亿的拷贝。
虽然PCR是装备精良的实验室中的金标扩增方法，但是它相当复杂，需要具有主动加热和冷却加热元件和精确温度控制的昂贵且复杂的热循环装置，并且需要训练有素的技术人员收集有意义的结果。例如，大多数PCR反应需要在至少两个温度（例如95度和57度)之间的快速且精确的循环，这典型地导致使用昂贵和效能低的Peltier发动机(热电冷却机制)和精确的温度控制元件。这样的固有限制使得PCR不适宜于开发具有成本效益的、护理位点(point-of-care)的核酸诊断(这在缺乏支持性实验室基础设施的情况中是有用的)。为了排除一些PCR的大量资源需求，在过去数十年中开发了多种“等温”扩增技术。在这样的反应中，可以在单个温度扩增核酸，不需要昂贵的热循环仪，并且使得它们更适用于低成本诊断设备。实例包括基于核酸序列的扩增(NASBA)，解旋酶介导的扩增，链置换扩增，环介导的等温扩增(LAMP)等。然而，这些等温扩增方法通常需要60-90分钟的扩增时间(由于缓慢的体外动力学酶促过程所致)和在单一温度点的精确的温度控制以适应极端严格的扩增反应，同样缺少当场诊断应用所需的稳健性和速度。
依赖模板的核酸扩增是基于核酸的分子诊断的基础。在卫生保健、农业中，以及在生物学领域和战争的情境中，急切需要稳健的、低成本的、快速的、护理位点的核酸诊断。然而，与现有的PCR或等温扩增相关的测定化学策略具有显著的工程和稳健性限制，这使得这样的扩增方法昂贵且对于资源有限的情况(其中基于核酸的分子可以最大地影响紧急疾病预防和控制)是不实用的。必须对核酸扩增进行相当大的改进以为缺少专门实验室基础设施的情况提供可负担的且稳健的诊断。
常规PCR依赖高特异性和快速热循环，通常使温度变化多达40℃。这样的扩增方法需要昂贵的仪器以便快速地加热和(尤其地)冷却PCR反应混合物，此外还要精确地保持溶液温度。等温核酸扩增方法，虽然不需要复杂的热循环装置，但是通常是缓慢的(至少60分钟的反应时间)，不可靠的，并且需要精确的温度校准。
在PCR热循环方法中，PCR循环仪必须具有良好的温度控制以保持样品内的温度均匀性和至少2℃／秒的典型的样品加热（和／或冷却)速率。温度控制典型地通过反馈回路系统实现，而温度均一性通过高导热性但是体积大的材料如铜实现。高加热速率通过执行比例积分微分(PID)控制方法实现，这受最大耗散功率和热容量的限制。高冷却速率相当难实现并且大体积系统需要借助热电元件(P.Wilding，M.A.Shoffner和L.J.Kricka，Clin.Chem.，1994，40，1815-1817.)(通常称为Peltier元件)或其他手段如水(J.B.Findlay，S.M.Atwood，L.Bergmeyer，J.Chemelli，K.Christy，T.Cummins，W.Donish，T.Ekeze，J.Falvo，D.Patterson，J.Puskas，J.Quenin，J.Shah，D.Sharkey，J.W.H.Sutherland，R.Sutton，H.Warren和J.Wellman，Clin.Chem.，1993，39，9，1927-1933)的强制冷却。这些PCR机是复杂且耗电量大的设备。因为系统体积大，所以其热时间常数是以分钟计而不是以秒计，这导致长的过渡时间和不需要的PCR副产物。高的能耗使得不可能制备电池供电的和便携的PCR系统。
在基于硅技术的显微机械加工和生物学微电机系统(bioMEMS)有最近发展的情况下，全世界很多课题组已经开始开发microPCR(μPCR)，其是芯片实验室(1ab-on-a-chip)或微型全分析系统(μTAS)的中心部分。研究者遵循两个基本途径：使温度循环的固定系统，具有处于不同温度的三个区的流动系统。这两种系统都具有其优点和缺点。固定系统使腔室的温度循环以便改变PCR溶液的温度。其不需要泵送系统或其他用于来回移动PCR样品的装置。流通系统典型地具有处于三个恒定温度的区。样品仅通过在不同温度的区之间移动来改变温度。这种PCR系统比第一种更快速，但是它需要执行机制以来回移动样品。在两种情况中，加热器与PCR系统集成，所以丢弃设备以避免在仅进行单次测试后的交叉污染是不经济的。这两种形式展现的主要优点是：与常规设备相比，循环时间减少，并且使用的样品体积减小。然而，这些PCR芯片使用需要采用昂贵和复杂制造工艺的基质材料如硅，导致非常高的单价。此外，由于获得提高的表面／体积比所需的极小的反应体积(<μl)以及用于μPCR芯片的材料的类型，与常规PCR不甚相同的一些效果变得明显，这包括生物样品的非特异性吸附、抑制、样品蒸发和形成气泡。目前的其他努力还涉及开发温度循环反应微芯片，所述微芯片集成了固定室和连续流动PCR以进行流通微通道PCR芯片的有效温度循环，同时具有改变循环数和PCR芯片中的固定室中的温度区的数目的灵活性。然而，混合PCR设备的有效性仍然正在被确认，并且与所述μPCR芯片方法相关的涉及样品抑制、吸附和气泡形成的问题仍然给所有在前面的样品制备／核酸分离方法以及扩增试剂和反应条件(例如极高的聚合酶浓度、PCR引物浓度等)施加显著的严格性。
发明概述
本发明的一个实施方案提供扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法。所述方法包括将样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含与核酸靶序列的模板互补的引物。反应温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃。核酸靶序列的模板被扩增。
本发明的一个实施方案提供在多个温度循环期间温度变化不大于约15℃。另一个实施方案提供在多个温度循环期间温度变化不大于约10℃。还一个实施方案提供在多个温度循环期间温度变化不大于约5℃。根据本发明的一个实施方案，对于给定的温度和／或范围，温度可以波动(+／-2℃)。
本发明的另一个实施方案提供一旦达到上限温度或下限温度，在温度波动内保持温度达一段时间。备选地，一旦达到温度范围内的上限或下限温度，温度变化为其它温度。在一个实施方案中，下限温度不小于约50℃。在另一个实施方案中，上限温度不大于约85℃。根据一个实施方案，上限和下限温度可以变化约+／-5℃。
根据本发明的一个实施方案，核酸靶序列的模板可以是单链DNA或RNA，双链DNA或RNA，RNA，DNA或其任意组合。靶核酸的长度可小于1000bp，小于250bp，小于150bp或小于100bp。
一个或多个实施方案可以包括引物对，所述引物对结合核酸模板的相反链。该引物对可以具有这样的长度和GC含量以致解链温度≥65℃。在另一个实施方案中，引物对具有这样的长度和GC含量以致解链温度≥70℃。例如，引物对中的每个引物独立地具有35-70个碱基对的长度。根据本发明的一个实施方案，引物对中的每个引物的解链温度为70-80℃。在优选的实施方案中，引物对包括正向引物和反向引物，其各自的长度为40-47个碱基对。
本发明的另一个实施方案提供扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法。所述方法包括将样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含长度为35-70个碱基对并且互补于核酸靶序列的模板的引物或引物对，并且其中引物对中的每个引物的解链温度为70—80℃。扩增反应混合物也包含DMSO、一价阳离子、二价阳离子、dNTPs和DNA聚合酶。反应温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃，以及扩增所述核酸靶序列的模板。在优选的实施方案中，二价阳离子选自由以下各项组成的组：镁，锰，铜，锌或其任意组合，而一价阳离子选自由以下各项组成的组：钠，钾，锂，铷，铯，铵或其任意组合。在另一个优选的实施方案中，扩增反应混合物包含核酸去稳定剂。在更优选的实施方案中，反应包含DNA聚合酶，所述DNA聚合酶可以是热稳定的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以选自由以下各项组成的组：TAQDNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和DeepVentR DNA聚合酶但是不限于此，因为可以包括本文公开的以及本领域已知的其他聚合酶。DNA聚合酶可以包括链置换活性。在另一个实施方案中，DNA聚合酶不具有3’->5’外切核酸酶活性。 在另一个实施方案中，扩增模板的方法还包括加入逆转录酶和DNA聚合酶。例如，逆转录酶是热稳定的逆转录酶。逆转录酶可以选自：AMV-RT、Superscript II逆转录酶、Superscript III逆转录酶或MMLV-RT，但是不限于此，因为可以使用本领域已知的其他逆转录酶。本发明的另一个实施方案还包括向反应混合物添加单链结合蛋白，如所公开的。例如，单链结合蛋白是热稳定的单链结合蛋白或单链结合蛋白是非热稳定的单链结合蛋白。
本发明的另一个实施方案提供混合物，所述混合物包含单链或双链核酸去稳定剂。例如二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺，但是不限于此，因为可以加入其他试剂如甘油用于相同目的。
本发明的另一个实施方案提供这样的方法，其中样品不是无醇的，和或样品不是无盐的。
本发明的另一个实施方案提供扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，其中扩增反应混合物包含单链或双链核酸去稳定剂；一价阳离子；二价阳离子；dNTPs和被缓冲在支持活性的pH的DNA聚合酶。
本发明的另一个实施方案提供扩增反应混合物缓冲剂，其包含以下一项或多项：单链或双链核酸去稳定剂；一价阳离子；二价阳离子；dNTPs；和被缓冲在支持活性的pH的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是热稳定的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以选自由以下各项组成的组：TAQ DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和DeepVentR DNA聚合酶，但是不限于此。DNA聚合酶可以具有链置换活性。可以选择不具有3’->5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。 混合物还可以包含以下一项或多项：单链结合蛋白，去稳定剂是二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺；二价阳离子，其可以是选自由镁、锰、铜、锌或其任意组合组成的组的盐；以及一价阳离子，其是选自由以下各项组成的组的盐：钠、钾、锂、铷、铯、铵或其任意组合。
本发明的目的、优点和新特征以及进一步的适用性范围将结合附图部分描述于以下详述中，并且部分地将在以下检验后对本领域技术人员来说变得明显，或者可以通过实践本发明了解到。本发明的目的和优势可以通过在所附权利要求中特别地指出的手段和组合来实现和获得。
附图简述
结合到本说明书中并且形成其部分的附图例示了本发明的实施方案并且，与说明书一起，用于说明本发明的原理。附图仅用于例示本发明的优选实施方案，并且不被认为是限制本发明。在附图中：
图1显示根据本发明的一个实施方案的振荡PCR扩增反应的示意图图A表示与常规两步PCR反应(黑线）相比的在数个OPCRar循环期间观察到的热波动的迹线(灰线)，而图B显示根据本发明的一个实施方案的核苷酸扩增方法。
图2.图A-E表示根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的一系列照片，所述照片显示用于产生153个碱基对(bp)的产物不同聚合酶。
图3.图A-B表示根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的一系列照片，所述照片显示乙醇对核酸扩增的作用。
图4是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示支持有效扩增的退火温度和引物解链温度的差异。
图5是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示热启动DNA聚合酶对引物二聚体形成的作用。
图6是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示GC和AT夹环(clamp)对引物-二聚体形成的作用。
图7是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示单链结合蛋白对产物形成的作用。
图8.图A-B表示根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示T4基因蛋白32导致引物-二聚体形成的量下降。
图9是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示存在于扩增的双链DNA中的特异性靶序列。
图10是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，其显示存在于ssDNA中的特异性靶序列的扩增。
图11是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，其显示存在于质粒DNA中的特异性靶序列的扩增。
图12是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，其显示单链RNA的扩增。
图13根据本发明的一个实施方案的是丙烯酰胺凝胶的照片，其显示细菌基因组DNA中的特异性靶序列的扩增。
图14是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，其显示存在于叶绿体NDA中的特异性靶序列的扩增。
图15是根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，其显示测序的两个靶标的扩增。
图16图A-B表示根据本发明的一个实施方案的丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示在SSB存在下在较低的解链温度的靶序列的扩增。
图17图A-B表示丙烯酰胺凝胶的照片，所述照片显示以典型的PCR热循环仪中需要的精确的温度控制和／或快速变温(ramping)参数扩增靶标。
图18是丙烯酰胺凝胶的照片，其显示在不具有变温或精确的温度控制的低成本加热器中扩增的靶标Rbcl的扩增。
发明详述
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“核酸”是指单链或双链DNA、RNA或DNA／RNA杂交分子。单链核酸可以具有二级结构如发夹、环和茎元件。双链或单链核酸可以是线性的或环形的。双链核酸可以是完整的或有切口的。双链分子可以是具有钝端的或具有单链悬垂端。核酸样品可以分离自细胞或病毒并且可以包括染色体DNA，染色体外DNA，包括质粒DNA，重组DNA，DNA片段，信使RNA，核糖体RNA，转运RNA，双链RNA或存在于细胞或病毒中的其他RNA。核酸可以分离自任意数目的源，如农业、食品、环境、发酵或生物流体如唾液、血液、鼻或肺吸出物、脑脊液、痰、大便、奶、粘膜组织的拭样、组织样品或细胞。核酸可以在体外分离、克隆或合成。在以上所述的核酸内，可以对个体核苷酸进行修饰或化学改变如甲基化。这些修饰或改变可以自然地发生或通过体外合成产生。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“靶核酸”或“模板核酸”是指意在被选择性扩增的单链或双链DNA或RNA片段或序列。要被扩增的核酸的大小由上游(5’)和下游(3’)边界限定并且可小于500 bp，优选地小于250 bp，并且更优选地小于150 bp并更优选地小于100bp。靶核酸可以是包含在较长双链或单链核酸内的片段或者可以是整个双链或单链核酸。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“双链体”是指作为完整或部分双链的DNA或RNA核酸分子。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“热循环”是指发生核酸扩增所需的重复的温度波动。热循环可以包括，但不限于，高温解链或变性步骤，以及低温退火或杂交步骤。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“解链”或“变性”是指利用高温解离核酸双链体的两条互补链的全部或部分。解链或变性温度可以受寡核苷酸引物的长度和序列，双链体去稳定剂如DMSO和甲酰胺的浓度，以及离子强度或溶液的pH影响。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“退火”或“杂交”是指寡核苷酸引物与单链核酸模板的序列-特异性结合。引物可以仅结合一个模板链上的其互补序列而不结合模板的其他区域。退火或杂交的特异性可以受寡核苷酸引物的长度和序列，进行结合的温度，双链体去稳定剂如DMSO和甲酰胺的浓度，和离子强度或溶液的pH影响。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“引物”是指能够以序列-特异性方式结合靶核酸上的单链区域的单链核酸或寡核苷酸，其允许依赖于聚合酶的靶核酸的复制。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“OPCRar”是指振荡PCR扩增反应，其是用于扩增核酸的体外技术，使用小于典型扩增技术的温度变化，例如变性温度和退火温度之间小于20℃，优选地小于15℃，并且更优选地小于10℃。
当在整个说明书和权利要求中使用时，术语“辅助蛋白”是指任何能够刺激活性的蛋白，例如，热稳定的单链结合蛋白(SSB)，例如rec A或RPA(复制蛋白A)，但不限于此。
在本发明的实施方案中，提供通过热循环指数扩增特异性核酸靶标的方法，其中温度变化优选地小于20℃，更优选地小于15℃，并且甚至更优选地小于10℃。这包括以下步骤：提供待扩增的核酸的单链模板，用于与核酸模板杂交的寡核苷酸引物，使用杂交的寡核苷酸引物通过DNA聚合酶来合成互补于模板链的双链延伸产物，并且重复以上步骤从而指数地扩增所选的核酸靶标。
现在参看图1A，显示了根据本发明的一个实施方案的振荡PCR扩增反应(OPCRar)的示意图，其中图A显示与常规两步PCR反应(黑线)相比的在数个OPCRar循环期间的观察到的热波动的代表迹线(灰线)。注意OPCRar中温度变化的显著减小。图1B显示根据本发明的一个实施方案，双链靶核酸进入解链阶段，其中，取决于温度，可以导致双链体的部分或完全变性。双链体的解旋开始于靶标的末端，并且单链结合蛋白(圆圈)结合并稳定单链核酸。反应被冷却并进入杂交／聚合阶段，其中引物以特异性方式杂交到靶标双链体的每条链的5’端。在引物杂交后，DNA聚合酶(方块)结合模板／引物双链体并且通过引入dNTPs在5’→3’方向上延伸引物，复制DNA的模板链。如果所用的聚合酶具有链置换活性，则它将能够在部分变性的复合体中置换相反的链。在产生新的双链体DNA后，多次重复热循环以导致靶核酸序列的指数扩增。
在本发明的另外的实施方案中，热循环包括两个温度间的温度振荡或循环，其中ΔT优选地不大于20℃，更优选地不大于15℃，并且甚至更优选地小于10℃。两个温度中较高的那个可以足以变性双链靶标DNA，或优选地仅导致双链DNA靶标的部分变性。一旦达到高温或低温，维持所述温度达一段时间或者，优选地，立即变为其它温度。
在本发明的另外的实施方案中，核酸靶标可以是双链核酸如双链DNA，或单链核酸如单链RNA或DNA。如果靶核酸是双链的，则必须通过加热或利用酶将它完全或部分变性以形成DNA聚合酶活性和扩增所需的单链模板或模板区域。靶核酸的长度可小于1000 bp，优选地小于250 bp，并且更优选地小于150 bp。
在本发明的另外的实施方案中，用于靶核酸扩增的寡核苷酸引物是结合特异性双链靶核酸的相反链的引物对，其中一个引物在靶标的上游在5’端处结合，一个引物在靶标的下游在3’端处结合。在多重(multiplexing)条件下，可以使用超过一对寡核苷酸引物来同时在相同的反应混合物中扩增多个核酸靶标。寡核苷酸引物可以具有这样的长度和GC含量以致在普遍接受的PCR缓冲剂条件下，解链温度大于65℃，优选地大于70℃。
在本发明的另外的实施方案中，所用的DNA聚合酶优选地选自TaqDNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、DeepVentR DNA聚合酶以及类似的热稳定的DNA聚合酶。优选地，DNA聚合酶具有链置换活性并且不具有3’→5’外切核酸酶活性(参见图1B)。此外，如果模板核酸是单链RNA，则所用的逆转录酶将选自AMV-RT、Superscript II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Superscript III逆转录酶(Invitrogen)和类似的热稳定的酶。
其他-耐热性聚合酶可能性
耐热性DNA聚合酶
聚合酶和(厂商)
(NEB)
Deep Vent(NEB)
Deep VentR(exo-)(NEB)
Tag(NEB)
Pyro Script(Lucigen)
3 173，野生型(Lucigen)
LongAmp Tag(NEB)
Bst聚合酶
Phire Hot Start II(NEB)
Phusion高保真DNA聚合酶(NEB)
Phusion(NEB)
9 Nm(NEB)
DyNAzyme II Hot Start(NEB)
DyNAzyme EXT(NEB)
DreamTag(Fermentas)
Tag(非变性)(Fermentas)
Hot Start Tag(Fementas)
Pfu(重组)，(Fermentas)
Bsm(大片段)，(Fermentas)
True StartTM Hot Start Tag(Fermentas)
Tfi(invitrogen)
AmpliTag
(Invitrogen)
在本发明的另外的实施方案中，反应混合物优选地包含单链结合蛋白(SSB)如T4基因32蛋白，或分离和克隆自嗜热生物的热稳定的SSB。
另外地，酶制剂包括单链或双链核酸去稳定剂如二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺，优选地其浓度为总反应体积的8—15％。备选地，其他试剂如甘油deaza-dGTP，3dazopurein，dITP可以单独使用或与彼此或上列试剂组合使用。
本发明的实施方案理想地适用于低成本、护理位点的核酸诊断，其中微观流动层被置于加热元件上。通过降低温度范围循环需求，具有被动冷却的相对简单的加热机制可以用于使反应溶液的温度快速循环。热循环期间较低的最大温度使得流体蒸发(这可以对整个扩增反应有消极影响)最小化。更重要地，与常规PCR方法相比，扩增的稳健性被极大提高，说明该新方法能够接纳扩增过程期间的温度波动(不精确的温度控制)。证明本发明的具体的反应化学在宽的解链（例如70—105℃，基本对起泡不敏感)和杂交温度范围内进行，从而不需要在整个反应体积内具有均匀的温度。最后，本发明的实施方案在醇和盐的存在下（例如～10％乙醇)进行良好，通过除去常规核酸提取化学涉及的基于醇的洗涤（例如乙醇或异丙醇）和核酸洗脱步骤之间的离心、热干或真空步骤，极大地降低了在前的核酸分离方法的严格性。
本发明的实施方案包括检测生物样品中的病原体，其中病原体的核酸是靶核酸。备选地，本发明可以用于检测染色体DNA的差异，其中染色体DNA的片段是靶核酸。以此方式，在来自相同或不同来源的靶核酸中可以检测到单核苷酸多态性。
本发明的扩增技术的实施方案被称为“振荡PCR扩增反应”(OPCRar)。OPCRar是基于，但不限于，组合使用降低反应解链温度的双链去稳定剂和极高解链温度(Tm)的寡核苷酸引物来提升给定热循环中的退火温度。以此方式，靶核酸的体外扩增可以通过温度间的快速热循环进行，所述温度优选地相差20℃，更优选地相差小于15℃，并且甚至更优选地相差小于10℃(图1A)。对靶核酸的上游(5’)和下游(3’)区域具有特异性的寡核苷酸引物杂交到模板，从而允许通过DNA聚合酶的延伸以扩增靶标。如果所用的DNA聚合酶是不具有外切核酸酶活性的链置换聚合酶，则双链靶核酸的完全热变性是不必要的，与双链体去稳定剂一起作用以降低所需的解链温度。温度循环过程被重复并且导致特异性核酸靶序列的指数扩增(图1B)。在OPCRar中，双链靶核酸进入解链阶段，其中，取决于温度，可以导致双链体的部分或完全变性。双链体的解旋开始于靶标的末端，并且单链结合蛋白(圆圈)结合并稳定单链核酸。反应被冷却并进入杂交／聚合阶段，其中引物以特异性方式杂交到靶标双链体的每条链的5’端。在引物杂交后，DNA聚合酶(方块)结合模板／引物双链体并且通过引入dNTPs在5’→3’方向上延伸引物，复制DNA的模板链。如果所用的聚合酶具有链置换活性，则它将能够在部分变性的复合体中置换相反的链。一旦产生新的双链体DNA，多次重复热循环以导致靶核酸序列的指数扩增。
OPCRar方法是基于，但不限于，组合使用降低反应解链温度的核酸去稳定剂和极高解链温度(Tm)的两种寡核苷酸引物来提升热循环期间的退火温度。对于给定的靶核酸，一个寡核苷酸引物优选地杂交到含有靶序列的正义链的5′-端，一个引物优选地杂交到含有反向互补靶序列的反义链的5’-端。OPCRar优选地利用，但不限于使用不具有外切核酸酶活性的链置换DNA聚合酶来进一步降低有效靶核酸扩增所需的解链或变性温度。OPCRar可以在存在或不存在辅助蛋白的情况下扩增靶核酸。可以通过添加、减少或替换混合物内的组分来优化任何特异性OPCRar系统。
在低成本、快速、护理位点的核酸诊断的情景中，该扩增技术相对于现有技术中报道的其他扩增方法具有改善的特性。与上述核酸扩增方法不同，OPCRar系统，其稳健的酶促过程使得低成本加热设备的稳健、快速且耐受温度波动成为可能，因此理想地适用于低成本、护理位点的应用。通过使热循环期间遇到的温度差异最小化，OPCRar将PCR的速度和可靠性与等温扩增方法的降低的设备需要相结合。
OPCRar系统的简化的热循环要求理想地适用于被动-冷却装置，其中热可以被施用到腔室的一个表面，并且通过散热到空气中在相对的表面上发生冷却。这样的被动-冷却极大降低了任何核酸诊断设备的成本和复杂性。之前已经报道将被动-冷却用于诊断设备，然而，这些设备采用常规PCR循环测定化学来扩增靶核酸，这限制了反应的速率(Luo等Nuc AcidsRes.2005；Wilding等，Nuc.Acids.Res.1996；Burke等，Science 1998；)。OPCRar的另一个优点在于有效核酸扩增可以在宽的解链和退火温度范围内发生并且因此需要较不严格的温度控制机制。在小型化核酸诊断的构建中，在整个反应体积中保持均匀的温度可能是有挑战性的，反应室的加热侧和不加热侧之间存在的高的温度梯度。这样的温度变化可能导致使用常规PCR或等温反应化学的低效扩增。OPCRar，通过使用稳健的聚合酶、去稳定剂和其他聚合酶辅因子的组合，被设计成使与精确的温度调控和保持相关的问题最小化；只要反应室的最冷区域遵守用于给定核酸靶标反应的最低的可能的解链温度和最高的可能的退火温度，所述反应将有效进行，即使反应体积的其他区域变化>10℃.此外，伴随最小功率／能量消耗的扩增化学的稳健的OPCRar性质使得在更大体积(例如20 μl，而不是典型的μtPCR芯片中的μl以下)的快速和有效的扩增反应成为可能，这极大地放松了在前的样品制备／核酸分离过程的严格性(就以下方面而言：获得μl以下的输入模板，所述输入模板是不含任何痕量污染物例如盐和乙醇残留物和抑制性物质的高度浓缩的和超纯核酸）和对PCR酶和生物试剂的超高浓度和超纯的要求.
溶剂试剂
已知溶剂如DMSO和甲酰胺使双链体核酸的解链温度降低～0.5—0.7℃(每加入1％体积)。这些试剂通常用于提高含有高GC含量的靶核酸的扩增效率并且，因此，高的Tm以促进难以解旋的双链模板的完全变性。通常，在将双链体去稳定剂引入到PCR反应中后保持PCR热循环温度不变。相比之下，OPCRar优选地利用添加独特地高浓度的DMSO以显著降低热循环的解链温度。在常规PCR中，极少使用高于10％v／v的DMSO，原因在于与这些试剂的高浓度以及解链阶段的高温(通常大于90℃）相关的聚合酶活性的损失。另一方面，OPCRar系统和方法优选地使用10至15％的DMSO浓度。出乎意料地，此种量的DMSO不产生显著的聚合酶活性损失。
现在参看图2，取决于条件，根据本发明的一个实施方案的扩增与多种DNA聚合酶相容。将分离自含有甲型流感病毒的鼻吸出物的核糖核酸(0.3 ng／μtL)用作核酸模板，在多重反转录-OPCRar条件下，使用VentR聚合酶。OPCRar引物FP3和RP4用于产生153 bp的产物，该产物通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳并用溴化乙锭染色来可视化。所有反应都包含Superscript III逆转录酶，其中初始cDNA生成阶段在55℃进行5分钟，之后进行热循环。凝胶道被标记以DMSO的浓度，以及所用的解链和杂交阶段温度；反应循环40次。
常规PCR酶，例如Taq DNA聚合酶反应混合物对于任何痕量的醇、例如乙醇是极端敏感的，而在本发明的一个实施方案中，新型反应混合物极端耐受乙醇的抑制。现在参看图3，显示根据本发明的一个实施方案的乙醇对核酸扩增的影响。将分离自柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus.Liberibacter asiaticus)-感染的叶组织的总核酸(3.4 ng/μL)用作启动模板。反应在OPCRar条件下使用VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，和引物hyvl_For和hyvl_Rev，在15％DMSO存在下进行(图3A)，或者在常规PCR条件下使用Taq聚合酶和引物HLBas-P2和HLBr-P1进行(图3B)。将OPCRar溶液在85℃加热2分钟以使模板变性，然后循环40次，在76℃、10秒和60℃、10秒之间进行振荡以生成139 bp的产物。将常规PCR反应加热至95℃进行2分钟然后循环40次，在95℃、10秒和58℃、40秒之间变化以生成130 bp的产物。将扩增的产物在12％丙烯酰胺凝胶上可视化，用溴化乙锭染色。显示包含在扩增反应混合物中的乙醇浓度。明显的是，与常规PCR(图3B)相比，OPCRar制剂(图3A)对乙醇所致的失活显著地更具有耐受性。
在典型的OPCRar条件下使用VentR(exo-)DNA聚合酶和Et SSB，在高达10％乙醇的情况中不产生活性损失。这是关于将OPCRar应用于低成本、护理位点的设备的显著然而惊人的发现。因为PCR和等温扩增的常规知识典型地建议使用者提供高度纯化的无醇和盐的核酸输入。结果，几乎所有研究者在他们对样品进行PCR扩增过程之前、在基于醇的洗涤和自核酸亲和性微珠、玻璃粉、基质或过滤器等洗脱靶核酸之间都采用某种类型的真空干燥、风干、旋转沉降(spin down)或加热步骤。对于集成的护理位点诊断设备的实例，除了扩增和检测核酸以外，该设备也必须快速地分离靶核酸。通常，这是通过以下方式进行：将核酸与玻璃纤维基质结合并且在显著浓度的盐和乙醇存在下进行洗涤，随后在含有最少的盐且不含乙醇的缓冲剂中洗脱。在洗脱前，将保留在结合基质上的洗涤缓冲剂除去以防止转化为洗脱体积；在商业核酸分离试剂盒中，这典型地通过离心进行。OPCRar的特异性酶混合物不需要在核酸分离期间小心的去除乙醇，使得本发明的该实施方案适合于不需要真空、离心机、风干或加热干燥组件的低成本的集成的诊断。
引物
本文所述的寡核苷酸引物可以通过本领域中的已知方法合成和纯化。(参见，例如美国专利号6,214,587)。在本实施方案中，将表示引物对的两个序列特异性引物用于指数扩增靶核酸序列。第一引物杂交到靶核酸的上游5′区，第二引物杂交到靶序列的下游、3′区。所述引物杂交到存在于靶标双链体中的一条链的5’端，并且使用靶标核苷酸序列作为模板通过聚合酶在5′至3′方向上延伸引物(图1B)。杂交的条件是如在“Molecular Cloningand Laboratory Manual(分子克隆和实验室手册)”，2nd ed.Sambrook，Richand Maniatis，pub.Cold Spring Harbor(2003)中所述的标准。为了实现给定靶序列的特异性扩增，同源引物是优选的，其中引物中的每个核苷酸互补于靶序列。然而，引物可以包括与模板核酸不同源的碱基，或与靶标核苷酸序列不互补的5′序列。可以将多对引物用于单个OPCRar实验以便在相同的反应混合物同时扩增多个核酸靶标。所谓的多重法(multiplexing)是在单核苷酸多态性分析、病原体的检测以及将内对照结合到个体反应中通常使用的技术。高水平的多重法也可以通过使用被引入到各个靶标-特异性3’区的5’通用标签序列实现，所述序列允许具有不同内部病原体序列的所有靶序列的通用扩增。
寡核苷酸引物设计涉及数个参数如解链温度和引物序列内和引物序列间比对。解链温度受控于因素如引物长度和GC含量。引物序列间互补可能导致发夹结构，这可能会阻止有效扩增，而引物内的同源性可能导致非所需的扩增产物复制引物-二聚体。在设计引物时，重要的是在靶标内选择这样的序列，其对待扩增的核酸分子具有特异性并且将最低限度地与其自身或扩增反应中存在的其他引物发生相互作用。
在大多数核酸扩增策略中，引物的解链温度优选为比发生杂交和扩增的温度高约10至30℃。在PCR反应中的退火／聚合阶段的温度为55—60℃的情况下，引物的长度典型地为1 8-30个碱基对。使该特异性寡核苷酸长度最短以允许容易的引物结合而不损失序列特异性。然而，在OPCRar系统中，引物优选地被设计成非常长的35—55个碱基对，而解链温度优选地为70-80℃以便提高退火阶段的温度。考虑到在典型的OPCRar反应中所用的双链体去稳定剂DMSO水平(～10—15％)，计算的OPCRar引物的Tm优选地仅比热循环期间所用的退火温度高<10℃。在实验中并且在极端长度的OPCRar引物的情况下，尽管引物Tm（补偿DMSO的浓度）和退火／延长温度的差异最小，但仍发生有效扩增。
现在参看图4，根据本发明的一个实施方案，OPCRar引物需要退火阶段温度和引物Tm之间的最小差异以支持有效扩增。使用引物hyvl_For和hyvl_Rev来扩增包含hyvl基因序列的质粒(12 ng／μL)以生成139 bp的产物，该产物通过在12％丙烯酰胺凝胶上电泳、用溴化乙锭染色来可视化。在初始2分钟85℃解链步骤后，所有反应循环40次，在指定的解链和杂交温度各10秒。计算的引物hyvl_For和hyvl_Rev的Tm分别为72.2℃和70.9℃。反应在10％DMSO中进行，使有效Tm降低7℃，假定每1％体积降低0.7℃。即使引物Tm和杂交温度之间具有可忽略的差异，仍观察到扩增反应进行得如同温度差异低得多那般有效。
现在参看图5，使用OPCRar，热启动DNA聚合酶对引物二聚体形成的作用。利用Superscript III RT和Taq或Platinum Taq DNA聚合酶在引物对FP3和RP4(各8μM)以及15％DMSO存在下进行不含核酸模板的对照反应。循环参数为55℃进行5分钟，85℃进行2分钟，以及80℃进行1 5秒和65℃进行1 5秒的40个循环。在12％丙烯酰胺凝胶上电泳后，OPCRar产物通过用溴化乙锭染色可视化。Platinum Taq是市售的热启动酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其与抗体缀合，所述抗体在加热反应溶液至94℃后在正常PCR条件下解离。在模板核酸存在下，该引物对将产生153bp的产物。清楚的是，该热启动制剂在减少OPCRar期间的形成的<110 bp引物二聚体方面与常规Taq一样。OPCRar反应中所用的长引物的一个并发症是它们更倾向于产生被称为引物二聚体的非特异性的且非所需的扩增产物。当在扩增反应开始时、在初始的温度增加期间引物寡核苷酸的3’端瞬时结合另一个时形成引物二聚体。在此关键时间期间，DNA聚合酶可以使这些瞬时复合物延伸从而产生在热循环期间与特异性靶标扩增竞争的产物，尤其是在初始模板核酸浓度非常低的情况下。通常用于减少PCR期间的引物二聚体形成的技术是利用所谓的“热启动”DNA聚合酶。这些市售酶非共价地结合于抑制分子如抗体。当反应温度增加到90℃以上时，抑制分子解离，释放聚合酶从而正常发挥功能。然而，惊人地，在我们的手中，热启动酶Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)未能相当地减少引物二聚体扩增的丰度，指示该常用方法对于OPCRar是不足够的，指示OPCRar方法是比常规PCR有效得多的扩增方法，其使得源于同源和异源二聚体瞬时运动碰撞的二聚体形成成为可能，这通常不发生在常规PCR方法中。
现在参看图6，呈现的是根据本发明的一个实施方案的显示OPCRar期间GC和AT夹环对引物二聚体形成的作用的凝胶。在不存在启动模板(3.5 ng／μL)的情况下使用被设计成扩增柑橘黄龙病菌亚洲种的延长因子基因的引物来确定引物二聚体形成的倾向。在存在模板的情况下，不同引物组的产物大小将为140—155 bp。引物序列可见于右侧，其中AT或GC夹环为灰色。对于“mod”引物组，每个引物包含与模板不同源的碱基(下划线)，其增加了与第二引物的同源性。使用VentR(exo-)DNA聚合酶，EtSSB，在15％DMSO存在下进行所有反应。将溶液在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环30或40次，在80℃进行1 5秒和65℃进行1 5秒之间振荡。扩增的产物在12％丙烯酰胺凝胶用溴化乙锭染色可视化。如清楚可见的，GC夹环引物组导致明显的引物二聚体形成，而AT夹环引物不导致引物二聚体形成。
为了使引物二聚体形成的可能性最小化，可以将OPCRar引物设计成采用数个区别于用于产生常规PCR引物的那些的策略。首先，PCR引物通常具有被称为“GC夹环”的富含GC的3’端，其导致与靶序列结合的较大特异性。然而，在OPCRar引物中，观察到的是，引物的3’区域中的高GC含量导致较多的引物二聚体形成，因此，将OPCRar引物制成含有富含AT的3’区域从而在能量方面减小产生这些非所需的扩增产物的3’-3’引物相互作用的亲和性(图6)。OPCRar引物设计的第二策略是设计包含至少5个连续核苷酸的互补5’或内部序列的引物。以此方式设计的寡核苷酸将反应温度的初始增加期间的任何引物杂交导向对于聚合酶延伸来说不具有竞争性的双链体结构。如果在靶核酸序列内不能发现合适的互补序列，则可以使用非同源的或突变的碱基来在OPCRar引物内产生它们。OPCRar引物的异常长度克服了在扩增反应的早期循环期间在引物和靶标之间的微小错配。引物组为
EU AT
正向
GTTCTTGTAG CGTTGCAGTC TTCTGCGGAA GATAAGGAAT TGCTTT(SEQ ID NO 21)反向
GGGCACGTTT ATTAGCAACA ATAGAAGGAT CAAGCATCTG CACAGAAAT(SEQ ID NO 22)EU GC
正向
CTTGTAGCGT TGCAGTCTTC TGCGGAAGAT AAGGAATTGC TTTCTGCG(SEQ I D NO 23)反向
CACGTTTATT AGCAACAATA GAAGGATCAA GCATCTGCAC AGAAATCACCG(SEQ ID NO 24)
EU—Atmod
正向
GGTGTTCTTG TATCGTTGCA GTCTTCTGCG GAAGATAAGG AATTGCTTT(SEQ ID NO 25)
反向
GTAATGGGCA CGTTTATTAG CAACGATAGA AGGATCAAGC AACTGCACAG AAAT(SEQ ID NO 26)
EU GCmod
正向
CTTGTATCGT TGCAGTCTTC TGCGGAAGAT AAGGAATTGC TTTCTGCG(SEQ ID NO 27)
反向
GGCACGTTTA TTAGCAACGA TAGAAGGATC AAGCATCTGC ACAGAAATCA CCG(SEQ ID NO 28)
OPCRar引物可以包括任何脱氧核糖核苷酸碱基腺嘌呤“A”，胸腺嘧啶“T”，鸟嘌呤“G”或胞嘧啶“C”和／或一种或多种核糖核苷酸碱基，A、C、尿嘧啶“U”、G。此外，OPCRar引物可以包含一种或多种修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基，其中所述修饰不阻止引物杂交到靶核酸，通过聚合酶的引物延伸，或双链体核酸的变性。OPCRar引物可以被修饰以化学基团如膦酸甲酯或硫代磷酸酯，非核苷酸接头，生物素，或荧光标记如羧基荧光素的胺反应性荧光素酯。这些修饰可以增强引物性能或促进扩增产物的检测和表征。
聚合酶
在单链模板核酸区域在OPCRar期间与引物杂交后，聚合步骤发生。如果靶核酸是DNA，则选择这样的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶作用于靶标从而在四种dNTP核苷酸碱基存在下沿核酸模板延伸杂交的引物从而形成双链产物，其中新合成的链互补于模板的核苷酸序列(图1)。如果初始靶标是RNA，则首先使用逆转录酶来将RNA模板复制到cDNA分子中，其在OPCRar期间被DNA聚合酶进一步扩增。
基于热稳定性和持续合成能力(尤其是在去稳定剂和醇存在下)可以选择多种DNA聚合酶用于OPCRar(图2)。虽然不是必需的，发现显示链置换活性且缺少外切核酸酶活性的聚合酶显著改善OPCRar反应(图2)。合适的DNA聚合酶的实例包括Taq聚合酶，KlenTaq DNA聚合酶(AB Peptides，(St Louis，MO))，Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs，Beverly，MA)，VentR或VentR(exo-)(New England BioLabs)，DeepVentR或DeepVentR(exo-)(New England BioLabs)，以及类似的酶。合适的热稳定的逆转录酶包括Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，CA)，Superscript III(Invitrogen)，和类似的酶。应当注意，公布的常规PCR扩增聚合酶混合物不能进行OPCRar，原因在于OPCRar扩增的独特的稳健性要求。在使用前，所有选择的聚合酶和生物试剂组分应当被谨慎地评估和实验检测。
单链结合蛋白
OPCRar系统优选地是解链和退火热循环阶段的温度差异最小化，其中如果双链体核酸的完全变性是不必要的，则该温度差异最低。在这点上链置换DNA聚合酶是有用的，同时可以使用辅助蛋白来进一步降低有效扩增的热需求。已知单链结合蛋白(SSB)使单链核酸稳定从而防止双链的退火双链体形成，并且已经证实其提高核酸扩增反应的效率。发现向根据本发明的实施方案的OPCRar方法加入热稳定的SSB导致提高的活性(图7)。作为一个实例的是Et SSB(BioHelix Corporation，Beverly，MA)，虽然对SSB的选择不限于特定蛋白并且可以包括分离和克隆自嗜热生物的SSB，或者工程改造自非热稳定的前体SSB的SSB。
现在参看图7，示例的是根据本发明的一个实施方案的显示单链结合蛋白对OPCRar产物形成的作用的凝胶。使用OPCRar引物FP3和RP3来扩增通用甲型流感单链DNA模板(1E6个拷贝／μL，Biosearch Technologies，Inc.，Novato，CA)从而产生133 bp的产物，该产物通过在12％丙烯酰胺凝胶上的电泳、用溴化乙锭染色来可视化。在存在或不存在热稳定的SSB的情况下，在以下条件下：i)1 5％DMSO；ii)1 5％DMSO，5％甘油；iii)1 5％DMSO，0.25 M Betaine进行根据本发明的一个实施方案的OPCRar。用于所有反应的循环参数为75℃进行1 5秒和65℃进行1 5秒，重复45次。
除了辅助OPCRar的热稳定的SSBs以外，非热稳定的SSB如T4噬菌体SSB (New England BioLabs)可以用于在OPCRar溶液的初始加热中减少引物二聚体形成(图8)。通过在摩尔过量的T4基因32蛋白存在下预温育OPCRar引物然后将它们添加到反应混合物中，已经观察到，在OPCRar期间，非所需的引物二聚体的扩增被最小化。这些SSB可能结合单链寡核苷酸引物，从而减少3’-3’配对的可能性，并且因此减少引物二聚体形成。在65℃以上加热溶液后，T4 SSB被变性并且释放引物用于热循环期间的正常的反应性。现在参看图8，凝胶显示通过将引物与T4基因32蛋白预温育，在本发明的一个实施方案期间形成的引物-二聚体量的减少。在添加到反应混合物之前，将OPCRar引物与指定化学计量的过量的活性单位的T4基因32蛋白(T4 SSB)在25℃在1X ThermoPol缓冲剂(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)存在下温育5分钟。使用引物FP3和RP3扩增合成的通用甲型流感DNA模板(1E6个拷贝／μL，Biosearch Technologies，Inc.)从而产生133 bp的产物序列。将反应保持在85℃进行2分钟，之后是75℃进行1 5秒和65℃进行1 5秒的50个循环。反应产物通过在12％丙烯酰胺凝胶电泳、用溴化乙锭染色来可视化。在不同的日子由不同的研究者重复图7中所述的实验以评估数据的再现性，并且显示在图8中。清楚可见的是，与不进行预温育(最右侧道）相比，将引物与T4 SSB预温育增加扩增的产物的量并且降低引物-二聚体带(～100 bp)的强度。
OPCRar方法尤其良好地适用于与如在与本申请同日提交的、题为“用于核酸检测和鉴别的集成设备”的共同拥有的临时专利申请中描述的设备一起使用。所述设备的一些实施方案的结构使得溶液温度能够快速循环同时溶液保持在同一室中，优选地在不进行主动冷却的情况下。例如，温度可以充分地增高或降低从而在小于或等于20秒，或更优选地小于或等于1 5秒，或更优选地小于或等于约8秒，或更优选地小于或等于约4秒内进行OPCRar。因此，可以在少至8秒内或甚至更快地进行OPCRar温度循环。
实施例1：通过OPCRar扩增DNA靶标双链体的方法
为证实OPCRar能够扩增存在于双链DNA分析物中的特异性靶序列，我们通过OPCRar系统，使用两种OPCRar引物，引物HLB(HuangLong Bing)ForSh和引物HLBRevSh，从PCR扩增的柑橘黄龙病菌亚洲种延长因子基因的片段产生140 bp序列。预先制备OPCRar缓冲剂(10X)，其含有400 mM Tris-HCl(pH 8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％Triton X-100。通过混合以下各项来制备20 μL OPCRar溶液：
8.4μL水
2.0 μL 10x OPCRar缓冲剂
3.0μLDMSO
0.4 μL氯化钾(2 M)
0.5 μL氯化镁(100 mM)
0.5 μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdNTPs(10 mM)
2.0μL引物组HLBForSh和HLBRevSh(各4μM)
0.5μLVentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
2.0μL的PCR产物稀释液(0.6至0.0006 ng／μL起始浓度)
将反应在85℃加热2分钟以使模板变性，然后循环40次，在80℃进行5秒和65℃进行5秒之间振荡。在完成反应后，将5 μL的OPCRar产物与2 μL的6X上样缓冲剂(New England BioLabs)以及1 μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并且用溴化乙锭可视化。在显示的所有稀释液中都清楚地观察到140 bp产物，并且匹配OPCRar靶序列的预计长度(图9)。
现在参看图9，扩增根据本发明的一个实施方案的存在于双链DNA中的特异性靶序列显示在凝胶中。PCR扩增的柑橘黄龙病菌亚洲种延长因子基因的片段的连续稀释液(0.6至0.0006 ng/μL)用作初始模板。在15％DMSO存在下，使用VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，以及引物HLBForSh和HLBRevSh来进行反应从而产生140 bp序列。将反应在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃进行5秒和65℃进行5秒之间振荡。OPCRar产物在12％丙烯酰胺凝胶上、用溴化乙锭染色来可视化。在显示的所有稀释液中都清楚观察到匹配靶序列的预计长度的140 bp产物。
实施例2：通过OPCRar扩增单链DNA靶标的方法
为证实OPCRar能够从单链DNA模板扩增特异性靶序列，我们通过OPCRar系统使用OPCRar引物FP3和RP4以从市售的通用甲型流感模板(Biosearch Technologies,Inc.)产生153 bp序列。10xOPCRar缓冲剂含有400mM Tris-HCl(pH 8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％TritonX-100。通过将以下各项混合来制备20 μL OPCRar溶液：
8.4μL水
2.0μL10x OPCRar缓冲剂
3.0μLDMSO
0.4μL氯化钾(2 M)
0.5μL氯化镁(100 mM)
0.5μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdNTPs(10 mM)
2.0μL引物组FP3和RP4(各8μM)
0.5μLVentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
2.0μL的单链DNA模板(1E9个1E2个拷贝／μL)。
为了比较灵敏性，使用与用于以上OPCRar的相同的模板浓度进行实时PCR反应。1 0x ThermoPol(New England BioLabs)含有200 mM Tris-HCl(pH 8.8)，100 mM硫酸铵，1 00 mM氯化钾，20 mM硫酸镁，和1％TritonX-100。通过将以下各项混合来制备15 μL RT-PCR溶液：
9.7μL水
1.5μL10x ThermoPol缓冲剂
0.4μLdNTPs(10 mM)
1.5μL引物组UniAfCDC／UniArCDC(各4 μM)，包括TaqMan探针UniApCDC(1 μM)
0.4 μL Taq聚合酶(5 U／μL)
1.5 μL单链DNA模板(1E9至1E2个拷贝／μL)
通过OPCRar在15％DMSO存在下扩增1E9至1E2个拷贝／μL的通用甲型流感单链DNA模板的连续稀释液，并且使用TaqMan探针进行实时PCR。OPCRar反应首先被加热至85℃进行2分钟，然后在80℃进行1 5秒和65℃进行1 5秒之间进行循环，重复40次。将RT-PCR反应加热至95℃进行2分钟，然后在95℃进行10秒和58℃进行40秒之间循环45次。在反应完成后，将5 μL的OPCRar产物与2μL的6X上样缓冲剂(New England BioLabs)和1 μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并用溴化乙锭可视化。对于所有样品，清楚地观察到153 bp产物(图10)，并且匹配OPCRar靶序列的预计长度。
现在参看图10，呈现的是显示根据本发明的一个实施方案扩增的存在于单链DNA模板中的靶序列的凝胶。在15％DMSO存在下通过OPCRar使用引物FP3和RP4来扩增通用甲型流感单链DNA模板(1E9至1E2个拷贝／μL，Biosearch Technologies，Inc.)的连续稀释液从而产生153 bp的产物，该产物通过在12％丙烯酰胺凝胶上电泳利用溴化乙锭染色来可视化(左图)。作为比较，将相同的稀释液用作初始模板以用于实时PCR，使用引物组UniAfCDC／UniArCDC和TaqMan探针UniApCDC(右图)。将OPCRar反应首先加热至85℃进行2分钟，然后在80℃进行1 5秒和65℃进行1 5秒之间进行循环，重复40次。将RT-PCR反应加热至95℃进行2分钟，然后在95℃进行10秒和58℃进行40秒之间循环45次。明显的是，当被适当地优化时，OPCRar具有与常规PCR反应类似的灵敏度。
实施例3：通过OPCRar扩增存在于质粒DNA上的特异性序列的方法
为证实OPCRar能够扩增存在于双链质粒DNA中的特异性靶序列，我们通过OPCRar系统使用两种OPCRar引物，引物hyvl_For和引物hyvl_Rev，从包含柑橘黄龙病菌亚洲种hyvl基因的质粒产生139 bp序列。预先制备OPCRar缓冲剂(10X)，其含有400 mM Tris-HCl(pH 8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％Triton X-100。通过将以下各项混合来制备20 μL OPCRar溶液：
9.4μL水
2.0μL10x OPCRar缓冲剂
2.0μLDMSO
0.4μL氯化钾(2 M)
0.5μL氯化镁(100 mM)
0.5μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdNTPs(10 mM)
2.0μL引物组hyvl_For和hyvl_Rev(各8μM)
0.5μLVentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
2.0μL的DNA，其提取自健康的和柑橘黄龙病菌感染的组织(17.2 ng／μL)
用DMSO(13—8％v／v)进行滴定。将反应在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃ 10秒和65℃ 10秒之间振荡。在反应完成后，将5μL的OPCRar产物与2 lL的6X上样缓冲剂(New England BioLabs)和1μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并用溴化乙锭可视化。对于所有样品，都清楚地观察到139 bp产物(图11)，并且匹配OPCRar靶序列的预计长度。
现在参看图11，呈现的是根据本发明的一个实施方案扩增的存在于质粒DNA中的特异性靶序列的凝胶。将包含柑橘黄龙病菌亚洲种hyvl基因(17.2 ng／μL)的质粒用作初始模板，并且滴定DMSO的浓度(13—8％v／v)。使用VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，和引物hyvl_For和hyvl_Rev来进行所有反应。将反应在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃ 10秒和65℃ 10秒之间振荡。OPCRar产物在12％丙烯酰胺凝胶上、用溴化乙锭染色来可视化。在测试的所有DMSO浓度，都清楚地观察到匹配靶序列的预计长度的139 bp产物。
实施例4：通过OPCRar扩增存在于鼻吸出物中的人病原性病毒的RNA靶
序列的方法
为证实OPCRar能够扩增存在于单链RNA模板中的特异性靶序列，我们使用OPCRar引物对，FP3和RP4，从分离自感染了或未感染甲型流感病毒的临床鼻吸出物的核糖核酸产生153 bp序列。预先制备OPCRar缓冲剂(10X)，其含有400 mM Tris-HCl(pH 8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％Triton X-100。通过合并以下各项制备20 μL OPCRar溶液：
9.3μL水
2.0 μL 10x OPCRar缓冲剂
3.0μLDMSO
0.4 μL氯化钾(2 M)
0.5 μL氯化镁(100 mM)
0.5 μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdNTPs(10 mM)
2.0μL引物组FP3和RP4(各8μM)
0.5μLVentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
0.1μLSuperscript III逆转录酶(200 U／μL)
2.0μL分离自临床鼻吸出物的核酸(0.3 ng/μL)
将反应在55℃温育5分钟以产生cDNA，加热至85℃进行2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃ 10秒和65℃ 10秒之间振荡。在反应完成后，将5 μL的OPCRar产物与2 μL的6X上样缓冲剂(New EnglandBioLabs)和1 μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并用溴化乙锭可视化。在阳性而非阴性的临床样品中清楚地观察到153 bp产物(图12)，并且其匹配OPCRar靶序列的预计长度。
现在参看图12，示例的是显示根据本发明的一个实施方案扩增的存在于单链RNA中的特异性靶序列的凝胶。将分离自感染了或未感染甲型流感病毒的鼻吸出物的核糖核酸(0.3 ng／μL)用作模板。使用Superscript III逆转录酶，VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，和引物FP3和RP4，在15％DMSO存在下进行所有反应。将反应在55℃温育5分钟以产生cDNA，加热至85℃进行2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃ 10秒和65℃ 10秒之间进行振荡。OPCRar产物在12％丙烯酰胺凝胶上、用溴化乙锭染色来可视化。在阳性而非阴性的临床样品中清楚地观察到匹配靶序列的预计长度的153 bp产物。
实施例5：通过OPCRar扩增来自病原性植物细菌的靶序列的方法
为证实OPCRar能够扩增存在于病原性细菌基因组中的特异性靶序列，我们使用OPCRar引物对，EU523377-F-57和EU523377-R-56，从分离自感染的植物组织的总核酸产生柑橘黄龙病菌亚洲种延长因子基因的213 bp片段。预先准备OPCRar缓冲剂(10X)，其含有400 mM Tris-HCl(pH8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％Triton X-100。通过合并以下各项来制备20 μL OPCRar溶液：
8.4μL水
2.0μL10x OPCRar缓冲剂
3.0μLDMSO
0.4μL氯化钾(2 M)
0.5μL氯化镁(100 mM)
0.5μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdNTPs(10 mM)
2.0μL引物组EU523377-F-57和EU523377-R-56(各4μM)，引物EU523377-F-57是生物素化的(5’)或非生物素化的
0.5μLVentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
2.0μL分离自柑橘黄龙病菌亚洲种感染的植物组织的总核酸(1.1 ng/μL)
为了证明引物修饰适合于OPCRar，在一些反应中将正向引物EU523377-F-57在5’端生物素化。将OPCRar溶液在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃ 1 5秒和65℃ 1 5秒之间进行振荡。在反应完成后，将5μL的OPCRar产物与2μL的6X上样缓冲剂(NewEngland BioLabs）和1μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并用溴化乙锭可视化。在所有样品中都清楚地观察到213 bp产物，并且其匹配OPCRar靶序列的预计长度(图13)。
现在参看图13，呈现的是如根据本发明的一个实施方案扩增的存在于细菌基因组DNA中的特异性靶序列。将分离自柑橘黄龙病菌亚洲种感染的叶组织(1.1 ng/μL)的总核酸用作初始模板。使用VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，和引物EU523377-F-57和EU523377-R-56，在1 5％DMSO存在下进行所有反应。引物EU523377-F-57在寡核苷酸的5’端被生物素化或不被生物素化。将OPCRar溶液在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在80℃ 1 5秒和65℃ 1 5秒之间进行振荡。扩增的产物在12％丙烯酰胺凝胶上、用溴化乙锭染色来可视化。对于所有阳性样品而非阴性样品，清楚地观察到213 bp产物，其匹配OPCRar靶序列的预计长度。
实施例6：扩增在细胞器DNA上的特异性序列的方法
为证实OPCRar能够扩增存在于细胞器DNA(在此情况中是叶绿体DNA)中的特异性靶序列，我们使用OPCRar引物对，rbcL_For和rbcL_Rev，从分离自感染了或未感染柑橘黄龙病菌亚洲种的植物组织的总核酸产生植物的rbcL基因的137 bp片段。预先准备OPCRar缓冲剂(10X)，其含有400 mM Tris-HCl(pH 8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％TritonX-100。通过合并以下各项来制备20 μL OPCRar溶液：
8.4μL水
2.0 μL 10x OPCRar缓冲剂
3.0μLDMSO
0.4 μL氯化钾(2 M)
0.5 μL氯化镁(100 mM)
0.5 μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdNTPs(10 mM)
2.0μL引物组rbcL_For和rbcL_Rev(各2或4μM)
0.5μLVentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
2.0μL分离自叶组织的总核酸(3.3 ng／μL)
使用两个不同浓度的引物对rbcL_For和rbcL_Rev来确定有效扩增rbcL基因片段所需的引物浓度的阈值。将反应在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在76℃ 10秒和60℃ 10秒之间进行振荡。在反应完成后，将5 μL的OPCRar产物与2 μL的6X上样缓冲剂(New EnglandBioLabs)和1 μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并用溴化乙锭可视化。对于感染的和未感染的样品都清楚地观察到137 bp产物，并且其匹配OPCRar靶序列的预计长度(图14)。
现在参看图14，在凝胶中显示的是根据本发明的一个实施方案的存在于叶绿体DNA中的特异性靶序列的扩增。将分离自柑橘黄龙病菌亚洲种感染的(i)或未感染的(ii)叶组织的总核酸(3.3 ng/μL)用作初始模板。使用VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，和引物rbcL_For和rbcL_Rev，在10％DMSO存在下进行所有反应。将OPCRar溶液在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在76℃ 10秒和60℃ 10秒之间进行振荡。扩增的产物在12％丙烯酰胺凝胶上、用溴化乙锭染色来可视化。所有阳性样品都清楚地观察到137 bp产物，并且其匹配OPCRar靶序列的预计长度。
实施例7：通过OPCRar多重扩增靶序列和阳性对照的方法
为证实OPCRar能够扩增多特异性靶序列，我们利用OPCRar引物对hyvl_For／hyvl_Rev和rbcL_For／rbcL_Rev扩增了提取自柑橘黄龙病菌亚洲种感染的植物组织的核酸。这些引物组分别产生139和137 bp的产物。预先准备OPCRar缓冲剂(10X)，其含有400 mM Tris-HCl(pH 8.4)，10 mM硫酸铵，100 mM氯化钾，和0.25％Triton X-100。通过合并以下各项来制备20 μL OPCRar溶液：
6.4μL水
2.0μL10x OPCRar缓冲剂
3.0μLDMSO
0.4μL氯化钾(2 M)
0.5μL氯化镁(100 mM)
0.5μL二硫苏糖醇(100 mM)
0.5μLdN TPs(10 mM)
2.0 μL引物组rbcL_For和rbcL_Rev(各2或3μM)
2.0 μ引物组hyvl_For和hyvl_Rev(各8μM)
0.5 μL VentR(exo-)DNA聚合酶(2 U／μL)
0.2μLEt SSB，极端热稳定的单链结合蛋白(500 μg/mL)
2.0μL分离自叶组织的总核酸(3.3 ng／μL)
使用两个不同浓度的引物对rbcL_For和rbcL_Rev来确定在800 nM对hyvl基因片段具有特异性的引物存在下有效扩增rbcL基因片段所需的引物浓度的阈值。将反应在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在76℃ 10秒和60℃ 10秒之间进行振荡。在反应完成后，将5μL的OPCRar产物与2μL的6X上样缓冲剂(New England BioLabs)和1μL的甲酰胺混合，在12％丙烯酰胺凝胶上电泳，并用溴化乙锭可视化。清楚地观察到139 bp和137 bp产物，其匹配OPCRar靶序列的预计长度。为了清楚，将仅使用两个引物对产生的OPCRar产物(实施例3和6)与多重反应一起运行(图15)。
现在参看图15，呈现的是显示根据本发明的一个实施方案的两个靶序列的多重扩增产物的凝胶。将分离自柑橘黄龙病菌亚洲种感染的叶组织的总核酸(3.3 ng／μL)用作初始模板。使用指定浓度的VentR(exo-)DNA聚合酶，Et SSB，和引物组hyvl_For／hyvl_Rev和rbcL_For／rbcL_Rev，在10％DMSO存在下，进行所有反应。将多重OPCRar溶液在85℃加热2分钟以使模板变性然后循环40次，在76℃ 10秒和60℃ 10秒之间进行振荡。多重产物在12％丙烯酰胺凝胶上、用溴化乙锭染色来可视化。当与产生自单独的引物组的OPCRar产物比较时(参见图11和15)，清楚地观察到139和137 bp产物两者。
现在参看图16，显示的是得自根据本发明的一个实施方案的Et SSB存在下的反应的扩增产物。使用本发明的系统和方法，SSB增加在较低的解链温度的扩增效率。我们研究了极端热稳定的单链结合蛋白“ET SSB”’的用途，并且证明在一些解链温度其有助于OPCRar的性能。利用纯化的含有HLB疾病基因的叶样品DNA，对HLB病原体靶标进行OPCRar反应。模板是纯化自柑橘黄龙病菌感染的树的柑橘叶的DNA。引物是hyvl_For／和hyvl_Rev。热循环仪条件为：初始85℃解链2分钟，之后是76℃或74℃变性10秒和60℃退火10秒的40个循环。结果指示，Et SSB的存在导致在所有测定的温度状态的柑橘黄龙病菌靶标的扩增。在ET SSB蛋变存在下以及在没有ET SSB的情况下一式两份地进行比较OPCRar实验。使用具有精确温度控制的标准PCR热循环仪以允许评估在存在和不存在SSB的情况下的扩增性能。结果指示，在ET SSB存在下，我们在74℃看到扩增的HLB，并且在没有ET SSB的情况下，扩增的HLB是看不见的。
现在参看图17，根据本发明的一个实施方案，显示使用hyvl_For和hyvl_Rev引物以及分离自感染的树的叶的纯化的柑橘黄龙病菌DNA进行的OPCRar反应的凝胶电泳，其中该反应不包括在典型的PCR热循环仪中涉及的变温参数(图17A)或者不包括到循环温度的变温时间(图17B)。当在本文中使用时，变温(Ramping)是指加热(例如在每个热循环中，将扩增反应温度从退火温度升至变性温度的加热过程被称为升温(ramping up)，或者从变性温度冷却至退火温度被称为降温(ramp down)。所有常规PCR循环仪和方法具有受控的加热设计，其中升温约为>3度／秒，并且降温速率约为>1度／秒。变温时间不包括在典型的循环特征(profile)中，仪器在变性、退火和延伸阶段期间直至达到所需的温度才开始计数持续时间。例如，变性时间为在90度10秒，仪器将在达到90度后才开始计数10秒时间。相比之下，本发明的系统和方法提供低成本的加热器设备，其被设计成例如80度10秒，意味着当加热过程开始时时间就开始计数(而不是要等到达到所需的变性温度)。图17 A：我们在低成本的热加热机(不具有主动冷却和精确的温度控制，>+2度波动，(参见例如61／477,357中公开的系统和设备)检验了HLB疾病(柑橘绿化病病原体，黄龙病(Huang Long Bing))靶标的OPCRar扩增。在微型加热器反应室中在微处理器控制下在由Mesa TechInternational，Inc.(MTI装置)开发的设备中或在常规PCR热循环仪(PCR热循环仪)中进行OPCRar 20 μL反应，从而在改变温度的指令被微处理器执行后就立即开始计算程序的每个温度区段的10秒停留时间(即无变温时间图17A)。这与在由位于反应孔处的温度传感器检测到靶标温度后立即开始计算的程序的每个温度区段的10秒停留时间不同(即变温时间图17B)。PCR热循环仪条件如下：初始解链：85℃ 2分钟，之后80℃ 10秒和60℃10秒的40个循环。MTI设备条件如下：初始解链：85℃ 2分钟，82℃ 10秒和59℃ 20秒的40个循环。
图17A：第一道，在没有分开的变温的情况下的OPCRar扩增(20 μl反应)。从左起：50 bp标准DNA大小梯状条带；第二和第三道：其中具有变温步骤和精确的温度控制的标准PCR热循环仪中的OPCRar扩增反应(一式两份，第2道和第3道)。初始解链：85℃ 2分钟，在80℃变性10秒和60℃退火10秒之间循环40轮。第4道和第5道：在不具有主动冷却和／或分开的变温控制的低成本热机中进行的OPCRar扩增。与不具有任何变性或退火温度的变温阶段相比，所述热机由环境温度(～25度)变温至80℃变性或降温至60℃退火温度。在20 μL反应中利用含有HLB疾病靶序列的纯化的植物DNA进行HLB OPCRar。我们将PCR热循环仪用于MTI设备测试的阳性对照。PCR热循环仪条件如下：无变温的MTI设备热循环仪条件如下：初始解链：85℃ 2分钟，在82℃变性10秒和59℃退火20秒之间进行循环。循环重复40次。升温阶段的MTI设备热循环仪为相同条件，除了存在<10秒的升温阶段和<20秒的降温阶段。数据表明，即使不存在升温和降温阶段，HLB OPCRar仍然可以扩增HLB扩增子。17A和17B的比较揭示了当设置变温时间时扩增产物产率的显著提高。
现在参看图18，凝胶中显示的是：根据本发明的一个实施方案的、在如上所述的MTI的基于热敏电阻的低成本扩增设备中的、包含两个引物组：1)对柑橘黄龙病菌DNA靶标具有特异性的hyvl_For和hyvl_Rev引物和2)对柑橘持家基因rbcL具有特异性的引物rbcl_(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶)For和rbcl_Rev的多重OPCRar反应的扩增产物。将所述的PCR扩增产生的以及在不具有变温(例如PCR设备中的5度／秒)且不具有精确的温度控制的低成本加热器中进行的反应产物在凝胶上电泳。我们在PCR热循环仪和MTI设备(具有变温程序或不具有变温程序)中利用HLB引物测试RbCL内部阳性对照。我们利用纯化的HLB样品进行40 uL反应。PCR热循环仪条件如下：初始解链：85℃ 2分钟，在80℃变性10秒和60℃退火10秒之间循环。MTI设备扩增条件如下：初始解链：90℃ 2分钟，在82℃变性10秒和59℃退火20秒之间循环。我们发现，在没有变温的情况下，它仍然能够扩增HLB和RbCL引物序列。HLB产物约为～147bp和RbCL产物～140 bp。用于两种条件的MTI设备比得上PCR热循环仪扩增的产物。该反应的正向引物为ccagccttga tcgttacaaa gggcgatgct acaacatt(SEQ ID NO 9)(Tm为约73.9C(10％DMSO，76／60C)，反向引物为catgttagtaacagaacctt cttcaaaaag gtctaacggg taa(SEQ ID NO 1 0)(Tm为约7 1.2C(1 0％DMSO，76／60 C)。在温度停留时间中包含或不包含变温时间的情况下进行OPCRar反应（如对于图16和1 7所述的)，如指示的。使用来自柑橘黄龙病菌感染的树的纯化的柑橘叶DNA进行40 μL反应。PCR热循环仪控制条件如下：初始解链：85℃ 2分钟，80℃ 10秒和60℃ 10秒的40个循环。MTI设备扩增条件如下：初始解链：90℃ 2分钟，82℃ 10秒和59℃20秒的40个循环。结果揭示：当在停留时间计算中不包含变温时间时，MTI设备能够扩增柑橘黄龙病菌和rbcL序列两者。柑橘黄龙病菌产物约为147 bp(HLB)，rbcL(RbCL)产物约为140 bp。
使用IDT OligoAnalyzer 3.1(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)，使用其中考虑到了盐、dNTP、Mg、引物浓度参数的Primer3 Tm计算软件，使用以下参数，计算所有引物解链温度(Tm)：
寡核苷酸浓度：0.25μM；Na+浓度：50mM；Mg++浓度=2.5 mM；dNTPs浓度=0.25μM。符号“a”是指腺嘌呤，“g”是指鸟嘌呤，“c”是指胞嘧啶，“t”是指胸腺嘧啶，“u”是指尿嘧啶，“r”是指嘌呤，“v”是指嘧啶，“m”是指氨基，“k”是指酮，“n”是指a或g或c或t/u中任一，未知的，或其他。
(SEQ ID NO 1)
登记号：CY087034
类型：病毒RNA
长度：987
生物体：甲型流感病毒(H1N1)
其他信息：基质蛋白2(M2)和基质蛋息1(M1)基因
(SEQ ID NO 2)
类型：正向引物
名称：FP3
长度：46
Tm：平均75℃
(SEQ ID NO 3)
类型：反向引物
名称：RP3
长度：45
Tm：平均77.8℃
(SEQ ID NO 4)
类型：反向引物
名称：RP4
长度：46
Tm：平均74.7℃
(SEQ ID NO 5)
类型：正向引物
名称：UniAfCDC
长度：22
Tm：平均65.0℃
(SEQ ID NO 6)
类型：反向引物
名称：UniArCDC
长度：24
Tm：平均66.6℃
(SEQ ID NO 7)FAM-tgcagtcctc gctcactggg cacg-BHQ
类型：TaqMan Probe
名称：UniApCDC
长度：24
Tm：73.4℃
(SEQ ID NO 8)
登记号：AB505957
类型：叶绿体DNA
长度：1326
生物体：甜橙(Citrus sinensis)
其他信息：rbcL，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基
(SEQ ID NO 9)
类型：正向引物
名称：rbcL_For
长度：38
Tm：73.9℃
(SEQ ID NO 10)
类型：反向引物
名称：rbcL_Rev
长度：43
Tm：71.2℃
(SEQ ID NO 11)
登记号：From EU523377
类型：细菌1 DNA
长度：890
生物体：柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)
其他信息：延长因子Ts
(SEQ ID NO 12)
类型：正向引物
名称：NBEU523377-F-57
长度：57
Tm：75.8℃
(SEQ ID NO 13)[生物素-5]tcttcgtatc ttcatgcttc tccttctgag ggtttaggatcgattggtgt tcttgta
类型：生物素化的正向引物
名称：EU523377-F-57
长度：57
Tm：75.8 ℃
(SEQ ID NO 14)
类型：正向引物
名称：HLBForSh
长度：47
Tm：75.6℃
(SEQ ID NO 1 5)
类型：反向引物
名称：EU523377-R-56
长度：56
Tm：75.8℃
(SEQ ID NO 16)
类型：反向引物
名称：HLBRevSh
长度：49
Tm：75.5℃
(SEQ ID NO 17)
靶标：柑橘黄龙病菌亚洲种16S核糖体RNA
类型：正向引物(下划线)，含有5’检测序列
名称：HLBas-P2
长度：39
Tm：62.7℃
(SEQ ID NO 1 8)
靶标：柑橘黄龙病菌亚洲种16S核糖体RNA
类型：反向引物(下划线)，含有5’T7启动子
名称：HLBr-P1
长度：56
Tm：64.5℃
(SEQ ID NO 19)
类型：正向引物
名称：hyvl_For
长度：45
Tm：72.2℃
(SEQ ID NO 20)
类型：反向引物
名称：hyvl_Rev
长度：51
Tm：70.9℃
虽然已经具体参考所述实施方案详细描述了本发明，其他实施方案可以实现相同的结果。本发明的变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的，并且有意的是涵盖所有这样的修改和等同物。以上引用的所有专利和出版物的全部公开内容通过引用并入。
Claims (50)
1.扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：
将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含与所述核酸靶序列的模板互补的引物；
使所述反应的温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃；以及
扩增所述核酸靶序列的模板。
2.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于约1 5℃。
3.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于约10℃。
4.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于约5℃。
5.权利要求1的方法，其中一旦达到所述上限温度或所述下限温度，将所述温度保持在温度波动内一段时间。
6.权利要求1的方法，其中一旦达到所述温度范围内的上限或下限温度，将所述温度变化为其它温度。
7.权利要求1的方法，其中所述下限温度不小于约50℃。
8.权利要求1的方法，其中所述上限温度不大于约85℃。
9.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是单链DNA或RNA。
10.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是双链DNA或RNA。
11.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是RNA。
12.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是DNA。
13.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于1000bp。
14.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于250bp。
15.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于150bp。
16.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于约100bp。
17.权利要求1—16的方法，其中所述扩增反应混合物包含结合所述核酸的模板的相反链的引物对。
18.权利要求17的方法，其中所述引物对具有长度和GC含量以致解链温度≥65℃。
19.权利要求17的方法，其中所述引物对具有长度和GC含量以致解链温度≥70°。
20.权利要求17的方法，其中所述引物对具有35—70个碱基对的长度。
21.权利要求17的方法，其中所述引物对中每个引物的解链温度为70-80℃。
22.权利要求17的方法，其中所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各自具有40-47个碱基对的长度。
23.扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：
将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含
引物或引物对，所述引物或引物对具有35-70个碱基对的长度并且与所述核酸靶序列的模板互补，并且其中所述引物对中每个引物的解链温度为70-80℃；
DMSO；
一价阳离子；
二价阳离子；
dNTPs；和
DNA聚合酶；
使所述反应的温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃；以及
扩增所述核酸靶序列的模板。
24.权利要求23的方法，其中所述二价阳离子是选自由以下各项组成的组的盐：镁、锰、铜、锌或其任意组合。
25.权利要求23的方法，其中所述一价阳离子是选自由以下各项组成的组的盐：钠、钾、锂、铷、铯、铵或其任意组合。
26.权利要求1的方法，其中所述扩增反应混合物包含核酸去稳定剂。
27.权利要求1的方法，其中所述扩增反应包含DNA聚合酶。
28.权利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。
29.权利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶选自由以下各项组成的组：TAQ DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和DeepVentR DNA聚合酶。
30.权利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶包含链置换活性。
31.权利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶不具有3’->5’外切核酸酶活性。
32.权利要求11的方法，其中所述扩增反应混合物包含逆转录酶和DNA聚合酶。
33.权利要求32的方法，其中所述逆转录酶是热稳定的逆转录酶。
34.权利要求32的方法，其中所述逆转录酶选自：AMV-RT、SuperscriptII逆转录酶、Superscript III逆转录酶或MMLV-RT。
35.权利要求1或23的方法，其中所述扩增反应混合物包含单链结合蛋白。
36.权利要求35的方法，其中所述单链结合蛋白是热稳定的单链结合蛋白。
37.权利要求35的方法，其中所述单链结合蛋白是非热稳定的单链结合蛋白。
38.权利要求1的方法，其中所述去稳定剂是二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺。
39.权利要求1或23的方法，其中所述样品不是无醇的。
40.权利要求1或23的方法，其中所述样品不是无盐的。
41.权利要求1的方法，其中所述扩增反应混合物包含权利要求42的扩增反应混合物缓冲剂。
42.扩增反应混合物缓冲剂，其包含：
单链或双链核酸去稳定剂；
一价阳离子；
二价阳离子；
dNTPs；和
DNA聚合酶，其被缓冲在支持活性的pH。
43.权利要求42的扩增反应混合物，其还包含单链结合蛋白。
44.权利要求42的方法，其中所述去稳定剂是二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺。
45.权利要求42的方法，其中所述二价阳离子是选自由以下各项组成的组的盐：镁，锰，铜，锌或其任意组合。
46.权利要求42的方法，其中所述一价阳离子是选自由以下各项组成的组的盐：钠，钾，锂，铷，铯，铵或其任意组合。
47.权利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。
48.权利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶选自由以下各项组成的组：TAQ DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和DeepVentR DNA聚合酶。
49.权利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶包含链置换活性。
50.权利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶不具有3’->5’外切核酸酶活性。
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