KR101508670B1 - 핵산 검출 및 동정을 위한 통합 장치 - Google Patents

핵산 검출 및 동정을 위한 통합 장치 Download PDF

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Abstract

표적 핵산을 검출하기 위한 일회용 분석 플랫폼 및 상기 분석 플랫폼을 작동시키기 위한 방법. 상기 표적 핵산을 함유하는 용액은 통기구 포켓 (vent pocket)을 개방함으로써 하나의 챔버로부터 다음 챔버로 이동한다. 그 결과인 압력 변화는 상기 용액이 상기 다음 챔버로 흐르는 것을 가능하게 한다. 상기 플랫폼은 서로 결합된 전자 레이어와 하나 이상의 유체 레이어들을 포함한다. 모든 가열 작동은 플랫폼의 저항성 열 소자를 이용함으로써 수행될 수 있다. 모든 냉각 작동은 좋기로는 수동이다. 상기 플랫폼은 수직 배향의 경우로 작동되는 것이 좋고 상기 플랫폼의 작동을 제어하는 외부 도킹 스테이션에 도킹 될 수 있다.

Description

핵산 검출 및 동정을 위한 통합 장치{INTEGRATED DEVICE FOR NUCLEIC ACID DETECTION AND IDENTIFICATION}
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2011년 4월 20일에 출원된 제목 "핵산 검출 및 동정을 위한 통합 장치"인 미국 가출원 제61/477,357호 및 2011년 4월 20일 출원된 제목 "핵산용 진동 증폭 반응"인 미국 가출원 제61/477,437호의 출원에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들은 참조로서 본 발명에 포함된다.
서열목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 참조
출원인은 2012년 4월 20일 자로 ASCII에 따라 생성된 2K kbyte 크기의 042012_ST25.txt 텍스트 파일로서 서열목록을 제출하며, 이것은 참조로서 본 발명에 포함된다.
발명의 분야 (기술 분야):
본 발명의 실시 상태는 핵산을 검출 및 동정하기 위한 통합 장치 및 관련 방법에 관한 것이다. 이 장치는 온전히 일회용이거나 일회용 부분 및 재사용 가능한 부분을 포함할 수 있다.
배경 기술:
이하의 개시는 다수의 간행물들과 참고 문헌들을 참조하고 있음에 주목해야 한다. 이러한 간행물들에 대한 본 발명의 개시는 과학적 원리에 대한 보다 완전한 배경 지식을 위하여 제공되는 것이며 이러한 간행물들이 특허성 결정 목적의 선행 기술이라는 인정으로 여겨져서는 아니된다.
감염성 질환 및 신흥 질환들, 생물유해적 제제, 유전 질환 및 병원체들의 환경적 저장소에 대한 공중 보건적 관심과 인식이 증가함에 따라, 보다 많은 정보를 제공하고, 감도 있고 사용 현장 특이적인 신속한 분석에 대한 요구는 중합효소 연속 반응 (PCR) 기반 방법들에 대한 수요를 증가시켰다. 이러한 PCR계 증폭과 같은 방법들에 의한 핵산 계 분자 시험은 매우 감도 있고, 특이적이며 많은 정보를 준다. 불행히도, 현재 이용 가능한 핵산 시험들은 이들이 정교하고 비용이 많이 드는 장비, 특화된 실험실용 재료 및/또는 사용자의 작업에 의존하는 다수의 조작을 필요로 하기 때문에 사용 영역에 있어서 그 이용이 제한되거나 부적합할 수 있다. 그 결과, 분자적 시험을 위한 대부분의 시료들은 중앙의 실험실들로 보내지고 그 결과 필요로 하는 정보를 얻는 데 검사 소요 시간이 길어지게 된다.
사용 현장의 신속한 분자적 시험에 대한 요구를 해결하기 위한 종래의 노력들은 일회용 카트리지 및 비교적 값비싼 연관 장비들을 이용하는 제품 설계에 초점이 맞춰져 있었다. 유체의 이동, 증폭 온도의 제어 및 검출을 달성하기 위하여 외부 장비들을 사용하는 것은 분자적 시험에 요구되는 다수의 프로세스 통합에 내재된 다수의 공학적 문제들을 간소하게 해 준다. 불행히도, 정교한 장비에 대한 의존은 소규모 진료소, 지역 및 주 정부와 법 집행 기관에 엄청난 경제적 장벽을 만든다. 또한, 적은 수의 시험 실행 장비에 의존하는 것은 세균전 제제 방출이 의심되거나 전염병 출현이 의심되는 동안 일어나는, 수요가 증가되는 기간 중 불필요한 지연의 원인이 될 수 있다. 실제로, 상기 장비와 일회용 시약 카트리지 모델은 어떤 사건이 발생하여 사용량 급증 및 처리량을 증가시킬 것을 요구할 때 잠재적으로 심각한 병목 현상을 일으킨다. 게다가, 장치 의존은 큰 덩치의 연합 장구의 수송에 물류적 제약이 방해가 되거나 인프라구조 요건 (예컨대, 신뢰성 있는 전원)이 부재하는 때 시험 장치들의 전개 위치로의 임시 분배를 복잡하게 한다.
기존 마이크로유체 장치들에 있어서, 중력이 유체 이동의 수단으로 기술되었다. 그러나, 통상적인 장치는 이러한 유체 이동의 프로그래밍 가능한 제어 또는 전자적 제어, 또는 2 이상의 유체의 혼합을 허용하지 않는다. 또한, 몇몇 장치들은 직각으로 배향시 약한 진공을 유도하고 프로세싱 챔버 안으로 반응물을 끌어들이기 위하여 불활성 유체 또는 미리 패키징된 유체를 떨어뜨림으로써 생성되는 압력 강하를 이용하는데, 여기서 상기 미리 패키징된 유체들의 안정성을 확보하려면 저장 및 수송 복잡성이 증가된다. 다수의 개별적 단계들에서 유체의 이동을 교시하는 기존의 장치들은 챔버들 사이에 파열성 밀봉 또는 밸브를 필요로 하는데, 이것은 작동 및 준비를 복잡하게 하는 것이다. 이러한 장치들은 각 챔버에 대하여 독립적인, 원격 위치하는 통기구 (vent)의 사용을 교시하지 않는다.
일반적인 마이크로유체 장치들은 실험실 표준 방법들에서 사용되는 것보다 더 적은 반응 부피를 통상적으로 이용한다. PCR 또는 기타 핵산 증폭 반응들, 예컨대 루프 매개 증폭 (LAMP), 핵산계 서열 증폭 (NASBA) 및 다른 등온성 및 열 사이클링 (thermal cycling) 방법들은 시험 및 연구 실험실에서 통상적으로 5 내지 100 마이크로리터의 반응 부피를 이용하여 시행된다. 이들 반응 부피는 희석된 검체들에서 희소 분석 표적의 검출을 보장하기에 충분한 시험 검체 부피를 제공한다. 종래 실험실의 분자적 시험에 이용되는 것에 상당하는 반응 부피를 감소시키는 마이크로유체 시스템은 반드시 그 반응에 첨가될 수 있는 검체의 부피 역시 감소시킨다. 더 적은 반응 부피는 결과적으로, 희석 검체 중에서 또는 분석 표적이 희소한 경우, 표적의 검출 가능한 양의 존재를 보장하기 위한 충분한 검출 부피를 제공하는 용량의 감소를 가져온다.
발명의 요약
본 발명의 한 가지 실시 상태는 표적 핵산을 검출하기 위한 일회용 플랫폼이고, 상기 일회용 플랫폼은 상기 표적 핵산을 포함하는 시료를 받기 위한 시료 챔버; 제1 채널을 통하여 상기 시료 챔버와 연결되고 제2 채널을 통하여 제1 통기구 포켓과 연결되는 증폭 챔버; 제3 채널을 통하여 상기 증폭 챔버와 연결되고 제4 채널을 통하여 제2 통기구 포켓과 연결되는 표지 챔버; 제5 채널을 통하여 상기 표지 챔버와 연결되고 제6 채널을 통하여 제3 통기구 포켓과 연결되는 검출 서브시스템 (subsystem); 다수의 저항성 열 소자를 포함하고, 여기서 상기 통기구 포켓들은 각각 상기 저항성 열 소자 중 하나에 인접하여 위치하는 열에 불안정한 멤브레인에 의하여 외기로부터 밀봉된 것이다. 상기 일회용 플랫폼은 필요에 따라 상기 시료 챔버의 유입구와 직접 유체로 연결되는 배출구를 포함하는 시료 준비단을 더 포함한다. 좋기로는, 상기 증폭 챔버의 실질적으로 편평한 표면의 크기는 대략 상기 증폭 챔버와 열 접촉된 저항성 열 소자의 실질적으로 편평한 표면의 크기와 동일하다. 상기 증폭 챔버는 좋기로는 능동적 냉각 장치로 냉각되지 않는다. 상기 증폭 챔버는 필요에 따라 증폭 용액을 포함하고, 시료 챔버는 필요에 따라 액체 증폭 시약 혼합물 또는 동결건조된 증폭 시약 혼합물을 포함하고, 및/또는 상기 표지 챔버는 필요에 따라 검출 입자들을 포함한다. 상기 표지 챔버는 좋기로는 상기 저항성 열 소자 중 하나를 이용하여 가열 가능하다. 상기 검출 서브시스템은 좋기로는 검출 입자들을 포함하지 않는 측방 유동 스트립을 포함한다. 상기 챔버들, 채널들 및 통기구 포켓들은 좋기로는 유체 어셈블리 레이어 상에 위치하고 상기 전자 소자들은 좋기로는 인쇄 회로 기판을 포함하는 별개의 레이어에 위치하며, 상기 별개의 레이어는 상기 유체 어셈블리 레이어와 결합되어 있다. 상기 검출 서브시스템은 좋기로는 상기 유체 어셈블리 레이어 상에 위치하거나, 필요에 따라 제2 유체 어셈블리 레이어에 위치한다. 상기 하나 이상의 챔버들의 부피는 좋기로는 대략 1 μl 내지 대략 50 μl이다. 상기 일회용 플랫폼은 좋기로는 상기 일회용 플랫폼을 외부 장치가 아니고 상기 일회용 플랫폼을 수직 또는 결사 배향으로 유지하는 베이스 유닛과 도킹하기 위한 커넥터를 더 포함한다.
본 발명의 한 가지 실시 상태는 표적 핵산을 검출하기 위한 방법으로서, 이 방법은 일회용 플랫폼의 시료 챔버 내 상기 표적 핵산을 포함하는 시료를 배치하는 단계; 상기 일회용 플랫폼을 수직으로 또는 경사지게 배향하는 단계; 상기 시료를 액체 또는 사전에 동결건조된 증폭 시약 혼합물과 반응시키는 단계; 증폭 챔버와 연결된 제1 통기구 포켓을 외기로 개방함으로써 상기 반응한 시료가 상기 증폭 챔버로 흐르게 하는 단계; 상기 표적 핵산을 상기 증폭 챔버에서 증폭시키는 단계; 표지 챔버와 연결된 제2 통기구 포켓을 외기로 개방함으로써 상기 증폭된 표적 핵산이 상기 표지 챔버로 흐르게 하는 단계; 상기 표지 챔버 내의 검출 입자들을 이용하여 상기 증폭된 표적 핵산을 표지하는 단계; 검출 서브시스템과 연결된 제3 통기구 포켓을 외기로 개방함으로써 상기 표지된 표적 핵산이 상기 검출 서브시스템으로 흐르게 하는 단계; 및 상기 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계로 이루어진다. 상기 증폭 단계는 좋기로는 상기 증폭 챔버와 인접한 상기 일회용 플랫폼 내 위치하는 저항성 열 소자를 이용하여 상기 표적 핵산을 증폭하는 것을 포함한다. 상기 방법은 좋기로는 피동적으로 상기 증폭 챔버를 냉각하는 단계롤 더 포함한다. 상기 방법은 좋기로는 상기 표지 단계 중에 상기 표지 챔버와 인접한 상기 일회용 플랫폼 내에 위치하는 저항성 열 소자를 이용하여 상기 표지 챔버를 가열하는 단계를 더 포함한다. 상기 검출 서브시스템은 좋기로는 검출 입자들을 포함하지 않는다. 상기 방법은 좋기로는 외부 장치가 아닌 도킹 스테이션을 이용하여 상기 일회용 플랫폼의 작동을 제어하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 목적, 이점 및 신규한 특징들, 및 이용 범위가 이어지는 상세한 설명에서 동반되는 도면과 함께 일부 설명될 것이고, 일부는 심사시 이 기술 분야의 숙련자에게 자명할 것이고, 또는 본 발명의 실시에 의하여 습득될 수 있다. 본 발명의 목적과 이점은 첨부된 청구항들에 특히 지시된 조합과 방편에 의하여 실현되고 달성될 수 있다.
도면의 간단한 설명
본 명세서에 포함되노 그 일부를 형성하는 동반 도면들은 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 실시 상태를 구체화하고, 본 발명의 원리를 설명하는 데 기여한다. 도면들은 본 발명의 특정 실시 상태들을 설명하려는 목적일 뿐이고 본 발명을 제한하는 것으로 여겨져서는 아니된다. 도면에서:
도 1은 본 발명의 한 가지 실시 상태에 대한 유체 레이어 및 전자 레이어를 설명하는 도이다. 준비된 시료 유체는 좋기로는 동결건조된 시약들과 그곳에서 혼합되는 시료 챔버로 유입된다. 직각 배향으로, 유체 컬럼의 압력은 그 아래 밀봉된 공기의 부피와 평형을 이룬다. 모세관 현상은 공기의 유출을 막고 유체의 진입 또한 막는다. 해당 통기구 포켓 아래의 적절한 통기구 밀봉이 파열되면, 추후 프로세스를 위하여 유체가 출구 채널을 통하여 다음 챔버로 이동한다. 온도 및 유체 제어는 좋기로는 스탠다드 인쇄 회로 어셈블리 (PCA) 부재와 어셈블리 기술을 이용하여 달성된다.
도 2A는 유체 레이어 내에서 유체 이동 제어를 달성하기 위한 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서 사용되는 통기구 메커니즘을 도식적으로 표시한 것이다. 도 2B는 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서 통기구 위치와 구조를 보여주는 도이다. 멤브레인이 유체 컬럼의 압력을 대기압보다 높게 유지한다. 충분한 열이 가해지면, 상기 멤브레인은 파열되어 압력이 평형을 이루도록 하여 준다. 유체는 정역학적 (hydrostatic) 압력 구배를 통하여 이동한다. 압력은 수 mbar 미만일 수 있다.
도 3은 본 발명의 한 가지 실시 상태의 또 하나의 저항성 히터 상세를 보여준다. 2개의 2512 크기 후막 표면실장부품 (SMD) 레지스터 (열 소자)를 인쇄 회로 기판 (PCB) 상 0402 크기 서미스터 (온도 센서) 옆에 설치한다. 레지스터(들)과 증폭 챔버 계면의 열 화합물 박막은 상기 히터와 센서에 열전도성을 유지시킨다. 챔버의 크기는 좋기로는 상기 면적/부피 비를 최대화하도록 선택된다.
도 4는 열 사이클링 또는 등온성계 핵산 증폭 방법들 중 어느 하나를 뒷받침하는 본 발명의 실시 상태를 나타낸다. 도 4A는 4개의 레지스터/서미스터 쌍을 갖는 PCA를 보여준다. 4개의 표면 실장 레지스터들은 4개의 독립적으로 제어 가능한 히터들 (화살표)로서 작동한다. 도 4B는 도 3의 저항성 히터 상세와 일치되는 도 4A의 PCA에 부착된 유체 어셈블리를 보여준다. 유체 레이어는 PCA의 표면 실장 레지스터들과 접하여 핵산 증폭을 위한 반응 챔버를 공급한다. 도 4C는 열 사이클링에 의한 본 발명의 실시 상태 (μ히터)에 의하거나 PCR 장치 (LAB)로부터의 ~150 bp (염기쌍) 생성물을 생성하는 증폭 반응의 겔 전기영동을 보여준다. 가장 좌측의 레인은 크기 스탠다드이다. 도 4D는 본 발명의 실시 상태의 증폭 챔버 내의 유체에 대한 온도 대 시간 (초)의 그래프이다. 진한 선은 열전대 (thermocouple)로 얻은 반응 챔버 내 용액의 온도를 나타낸다. 밝은 선은 온도 제어를 위하여 마이크로컨트롤러에 의하여 사용되는 서미스터로 측정된 온도이다. 2-온도 PCR 반응 40 사이클링은 20 마치 반응 부피를 이용, 20 분 안에 이루어질 수 있다. 도 4E는 PCR 장치 (양성 대조군)으로부터 얻어지는, 또는 본 발명의 하나의 실시 상태를 사용하여 얻어지는 ~150 bp 생성물을 생성하는 등온성 핵산 서열계 증폭 (NASBA)의 겔 전기영동을 보여준다. 4개의 개별적인 반응들은 온도 센서의 세팅 및 유체 챔버의 내부로 가해지는 특정한 표면 처리 양자 모두를 보여준다.
도 5는 통기구를 사용하지 않고 유체를 이동시키는 기법을 포함하는 본 발명의 실시 상태를 보여준다. 유체 컬럼 아래의 챔버를 가열함으로써, 기체는 팽창하고 유입구 채널을 통하여 스스로 제거된다. 냉각시, 챔버 부피 내의 기체는 수축하고 제거되는 기체의 그것에 비례하는 유체의 부피 내로 들어간다. 유체는 챔버 바닥으로 적하된다. 이러한 사이클링의 성공적인 반복은 전체 반응 부피를 이동시킬 수 있다. 이러한 기법의 작동은 채널 크기, 길이, 가열 시간 및 온도, 챔버 부피 및 부재들의 표면 에너지에 의존적이다.
도 6은 본 발명의 한 가지 실시 상태의 표지 챔버의 상세 및 기능을 보여준다. 앰플리콘을 함유하는 유체는 유입구 채널을 통하여 표지 챔버로 들어가 검출 입자들과 접촉한다. 유체를 가열 또는 끓임으로써 충분한 혼합이 이루어진다. 좋기로는 가공된 특징, 예컨대 레이저 엣칭된 선 또는 일련의 선들에 의하여, 챔버의 바닥 및 측면에 집중된 거품의 생성은 좋기로는 상기 혼합물을 효과적으로 교반한다. 이러한 실시 상태에 있어서, SMD 부재는 증폭 히터에서 사용되는 그것과 동일하다.
도 7은 본 발명의 하나의 실시 상태의 유체 레이어 부재들을 보여준다. 선택된 두께의 벽 부재는 면 부재에 의하여 2개의 측면에 결합된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 벽 부재는 0.5 mm 레이저 컷 아크릴이고, 상기 면 부재는 0.004'' 폴리에스테르 (PET) 막이다. 좋기로는 이 부분들은 실리콘 전이접착제로 서로 결합된다. 내부 표면은 습기를 제어하도록 처리된다. 시약들 및 측방 유동 어셈블리는 제조 도중에 첨가된다. 접착 멤브레인은 좋기로는 통기구 포켓 전체를 밀봉한다.
도 8은 열 소자가 후막 레지스터인, 본 발명의 한 가지 실시 상태의 유체 어셈블리에 면하고 있는 PCA 측면을 보여준다. 온도 센서는 히터에 근접하여 위치하는 작은 SMD 서미스터이다. PCA는 필요에 따라 분석 진행, 가열 및 통기구 개방을 모니터링하기 위한 LED 표시기를 포함할 수 있다.
도 9는 본 발명의 한 가지 실시 상태에 따른 PCA에 결합된 접착 심 (shim)을 갖는 유체 카세트를 보여주는 도이다. 상기 심 두께는 통기구와 히터의 적절한 거리와 기능에 중요할 수 있다.
도 10A는 본 발명의 반-일회용성 (semi-disposable) 발명 형태의 실시 상태의 일회용 PCA를 보여준다. 상기 PCA는 상기 일회용 유체 어셈블리와 접하는 전자 부재만을 포함한다. 이것은 열 소자, 온도 센서 및 필요에 따라 LED 표시기를 포함한다. 커넥터는 회로망을 완성하고 필요에 따라 수직 배향으로 지지력을 가하기 위하여 존재한다.
도 10B는 도킹 스테이션에 위치하는 도 10A의 일회용 PCA/유체 어셈블리를 보여준다. 도킹 스테이션은 전자 제어부와 전원 공급부를 포함하고 필요에 따라 쉽게 이동이 가능하고 소형이다 (handheld). 상기 PCA와 유체 어셈블리를 포함하는 일회용 부분은 좋기로는 수직 배향으로 상기 커넥터에 삽입된다. LED, LCD를 포함하는 사용자 인터페이스, 및 사용자 제어는 필요에 따라 몇 가지 실시 상태에 존재할 수 있다. 도킹 스테이션은 분석에 요구되는 전자 프로세스를 개시하기 위한 버튼을 포함할 수 있다.
도 11A는 본 발명의 일회용 발명 형태 실시 상태의 PCA의 정면도이다. 이 면은 유체 어셈블리와 면하고 있다. 열 및 센서 소자 뿐 아니라 LED 표시기와 같은 사용자 인터페이스 역시 이 실시 상태에 존재한다.
도 11B는 도 11A의 상기 일회용 발명 형태의 PCA의 후면 레이아웃을 나타낸 도이다. PCB의 이 면은 제어 회로망, 예컨대 마이크로컨트롤러, MOSFET 스위치 및 보조 회로망을 보유한다. 이 실시 상태에 있어서, 단자는 9V 배터리, 및 분석 개시에 유용한 임의의 사용자 인터페이스 장치, 예컨대 푸시 스위치를 위하여 존재한다.
도 11C는 9V 배터리가 설치된 도 11B의 PCA 도이다. 플라스틱 하우징은 나타내지 않았다. 배터리 위치는 좋기로는 나타낸 바와 같이 무게 중심을 낮추고, 작동 중 장치의 티핑 (tipping) 또는 뒤집힘 방지를 보조하는 것이 좋다.
도 12는 시료 준비 서브시스템이 상기 증폭 및 검출 유체 및 전자부와 접하는, 본 발명의 한 가지 실시 상태의 반 일회용성 실시 상태를 보여주는 것이다.
도 13은 일회용 분석에 포함되는 다수의 유체 레이어의 실시 상태의 부재들을 보여준다.
도 14는 도 13의 유체 레이어를 포함하는 일회용 분석 카트리지의 분해도를 보여준다.
도 15는 도킹 스테이션에 위치하는 도 14의 집적된 일회용 PCA/유체 어셈블리를 보여준다.
도 16은 열 사이클링계 핵산 증폭 및 검출을 뒷받침하는 본 발명의 한 가지 실시 상태의 유체 레이어의 사진이다. 핵산 증폭을 뒷받침하는데 필요한 모든 시약들을 함유하는 반응 용액이 시료 챔버에 첨가되었다. 도 16A에서, 필요한 효소들은 액체형으로 상기 반응 용액에 첨가되었다. 도 16B에서, 필요한 효소들은 시료 챔버에 동결건조된 펠렛을 포함시킴으로써 공급되었다. 핵산의 증폭 및 검출은 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행되었다. 검출 스트립 어셈블리의 꼭대기 행은 양성 대조군, 검출 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 상기 양성 대조군 바로 아래 행은 캡쳐 행, 상기 검출 프로브에서와 동일한 증폭 생성물 가닥과 상보적인, 고정된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 17A 및 17B는 시료 준비 서브시스템과 본 발명을 접하게 하여 제조된 통합 시료-결과 (sample-to-result) 핵산 시험 장치의 사진이다. 본 발명의 실시 상태들은 하나의 통합된 장치에서 핵산 단리, 증폭 및 검출을 뒷받침한다. 핵산의 단리, 증폭 및 검출은 실시예 2에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 측방 유동 어셈블리의 꼭대기 행은 양성 대조군, 검출 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 상기 양성 대조군 바로 아래 행은 캡쳐 행, 상기 검출 프로브와 동일한 증폭 생성물 가닥과 상보적인, 고정된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 장치는 감귤녹화병에 걸린 감귤 나무로부터의 침연 (macerated) 잎 조직을 프로세싱하고 감귤 녹화의 병인인 칸디다투스 리베리박터 (Candidatus Liberibacter)에 대하여 상기 통합 시료 준비 시스템으로 단리된 핵산을 분석하여 완성한 후 도시되었다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 실시 상태들은, 핵산 분자 분석의 모든 필수적 단계들을 수행하는 장비 독립적인 수단을 통합하고, 현재의 면역 측방 유동 신속 분석법을 보다 많은 정보를 제공하고 감도있는 분석을 제공하는 새 세대 핵산 분석으로 보완하는, 일회용 플랫폼을 포함한다. 본 발명의 실시 상태들은 소규모 진료소와 감염성 질환, 생물유해 제제, 농업 및 환경적 시험이 가장 큰 영향을 미칠 내핍한 조건에서 신속한 핵산 시험의 광범위한 사용을 촉진한다. 본 발명의 특정 실시 상태들은 완전 내장형이고 일회용으로, 장비로 인하여 부과되는 병목 현상 없이 이루어지는 병렬 시험을 가능케 함으로써 수요가 증가되는 시기에 "막대한 용량 (surge capacity)" 제공이 가능하다. 또한, 비싸지 않은 배터리 전원 또는 AC 어댑터 에너지원 도킹 스테이션과 커플링되는 저렴한 일회용 카트리지가 선호되는 응용 영역에 있어서, 간이한 도킹 스테이션을 이용하는 본 발명의 한 가지 실시 상태는 재활용 가능한 부재를 재활용 가능하고 비싸지 않은 베이스에 위치시킴으로써 시험 비용 또한 감소시킨다. 본 발명에 개시되는 플랫폼 기술은 실험실의 핵산 증폭 기반 방법과 흡사한 감도, 최소한의 사용자 조작 및 훈련 요건, 증폭 및 검출 양자 모두에 관한 서열 특이성, 멀티플렉스 용량, 안정한 시약, 저가의 대규모 제조 호환성, 내핍한 조건에서의 사용을 가능케 하는 배터리 작동, 및 장치 재설계 없이 추가적인 바이오마커나 대체 바이오마커를 포함시킬 수 있는 유연한 플랫폼 기술을 제공한다.
본 발명의 실시 상태들은 통상적으로 시험이 수행될 수 있는, 실험실 환경에서 먼 장소에서 분석을 수행하는데 적합할 수 있는, 저가의, 사용 현장에서의 핵산 검출 및 동정 시스템과 방법을 제공한다. 좋기로는, 핵산 증폭 반응 부피는 일반적으로 관용적인 실험실 시험에서 사용되는 부피와 동일한 범위 내일 수 있다 (예컨대, 5~100 μl). 본 발명의 실시 상태에 있어서 수행되는 반응은, 따라서 실험실 분석법으로 용인되는 것과 직접 비견할만 하고, 관용적인 분자적 시험에서 통상적으로 사용되는 동일한 시료 부피의 사용을 가능하게 한다.
본 발명의 실시 상태들은 시료 중에 표적 핵산 서열 또는 서열들이 존재하는지 검출하는 데 사용될 수 있다. 표적 서열들은 DNA, 예컨대 염색체 DNA 또는 염색체 외 DNA (예컨대, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, 플라스미드 DNA 등) 또는 RNA (예컨대, rRNA, mRNA, 스몰 RNA 및 바이러스 RNA)일 수 있다. 유사하게, 본 발명의 실시 상태들은 핵산 다형, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형, 결실, 삽입, 전위 및 서열 반복을 동정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 실시 상태들은 전사 수준에서 유전자의 조절 사건, 예컨대 유전자 상향 조절 및 하향 조절을 검출하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시 상태들은 다음과 같은 활용 범위를 위하여 이용될 수 있다: 1) 농업, 임상, 식품, 환경 및 수의학 시료들에서 병원성 핵산의 검출 및 동정; 2) 질병의 유전전 바이오마커의 검출; 3) 질병 또는 대사 상태의 해당 바이오마커, 예컨대 병원체, 독소, 기타 병인성 인자, 환경적 자극 또는 대사 상태의 존재에 반응한 유전자 조절 사건들 (mRNA 상향 또는 하향 조절 또는 스몰 RNA의 유도 또는 질병 또는 대사 상태 중 생성되거나 억제되는 기타 핵산 분자들)의 검출을 통한 상기 질병 또는 대사 상태의 진단.
본 발명의 실시 상태들은 표적 핵산 시료 준비, 증폭 및 핵산 시료의 첨가에 대한 검출 수단을 포함하고, 모든 측면의 유체 제어, 온도 제어 및 시약 혼합을 포함한다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 장치는 배터리와 같은 이동 가능한 전원 공급부를 사용하여 핵산 시험을 수행하는 수단을 제공하고 완전히 일회용이다. 본 발명의 다른 실시 상태들에 있어서, 일회용 핵산 시험 카트리지는 간이한 재활용 가능한 전자 부재와 결합하여 작동하는데, 이 전자 부재는 통상적인 실험실 장비들의 기능 모두를 수행하지는 않는다.
본 발명의 실시 상태들은 하우징, 회로 기판, 및 유체나 마이크로 유체 레이어를 포함하는 핵산 증폭 및 검출 장치를 제공하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 회로 기판은 다양한 표면 실장 부재들, 예컨대 레지스터들, 서미스터들, 발광 다이오드 (LED), 광 다이오드, 마이크로컨트롤러를 포함할 수 있다. 유체 또는 마이크로유체 레이어는 이동하는 수성 반응 부피를 담당하고, 다양한 제조 기법, 예컨대 레이저 컷, 워터젯 컷 또는 사출 성형 조각의 결합, 융합 또는 적층에 의하여 다양한 플라스틱으로부터 제조될 수 있다. 유체 및 회로 기판 부재들은 서로 집적되어 그들의 열 커플링은 열 전도성 물질들이나 화합물들로 인하여 증진될 수 있다. 좋기로는 하우징은 상기 마이크로유체 및 회로 기판 레이어들의 섬세한 부재들을 감추면서, 외관적 피복 및 보호 피복으로서 일부 기능하고, 장치 기능성에 필요한 시료 유입, 완충액 방출, 핵산 용리 및 프로세스의 개시를 가능하게 하는 데 기여할 수도 있다. 예컨대, 상기 하우징은 시료 유입구, 버튼 또는 사용자 활성화, 완충액 방출, 시료 흐름 개시 및/또는 핵산 용리를 가능케하는 유사한 기계적 특성을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 유체 또는 마이크로유체 레이어는 좋기로는 4개의 챔버를 포함하는데, 이들은 시료 유입 챔버, 증폭 챔버, 핵산 표지 챔버, 및 검출 챔버이다. 용액 유입 챔버는 좋기로는, 핵산 함유 시료가 첨가될 수 있는 시료 유입 오리피스와, 증폭 챔버로 이어지는 출구 도관을 포함한다. 상기 시료 유입 챔버는 또한, 적절한 완충액들, 염, 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 DNA 중합효소와 역전사 효소와 같은 효소를 포함하는 동결건조된 시약들을 포함할 수도 있다. 이러한 동결건조된 시약들은 좋기로는 핵산 시료의 첨가시 용해된다. 증폭 챔버는 좋기로는 회로 기판 상의 레지스터와 열 소자를 갖는 열 접촉부에 위치한다. 유사하게, 회로 기판상에 존재하는 전자 부재는 유체 레이어의 통기구 또는 밸브 구조와 물리적으로 접촉하여 위치하거나 인접하여 위치하여, 전자적 제어를 가능케 한다. 회로 기판의 레이아웃은 상기 유체 또는 마이크로유체 레이어의 소자들과의 레지스트레이션 (registration)을 제공하도록 설계됨으로써, 상기 증폭 및/또는 유체 유동 제어를 위한 회로 기판의 저항성 열 소자들은 그들이 상호 작용할 유체 부재들의 소자들과 접촉을 형성하도록 위치한다.
본 발명의 다른 실시 상태들은 시료 준비 장치와 통합된 핵산 증폭 및 검출 장치를 포함한다. 상기 시료 준비 장치를 포함하는 실시 상태들은 시료 준비 서브시스템 출구 또는 밸브와 상기 장치의 유체 또는 마이크로유체 부재들의 입구 또는 입구들 간 유체의 연통 (communication)을 위한 수단을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 모든 기술 용어들, 표기 및 기타 본 발명에서 사용되는 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에게 통상 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된 것이다. 본 발명에서 개시되거나 참조된 기법들과 방법들은 이 기술 분야의 숙련자에 의하여 일반적으로 잘 이해되고 관습적인 방법들을 이용하여 통상 채용되는데, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Current Protocols in Molecular Biology (Ausbel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001]에 기재된 광범위하게 이용되는 분자 클로닝 방법론을 이용하는 것이다. 적절하게, 시판되는 키트들과 시약들을 이용하는 과정들은 달리 언급하지 않는 한 일반적으로 제조자 정의 프로토콜 및/또는 파라미터들에 따라 수행된다.
명세서 및 청구범위 전체를 통하여 사용되는 바, '표적 핵산' 또는 '주형 핵산'이라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA나 RNA 단편이나, 검출하고자 목적한 서열을 의미한다.
명세서 및 청구범위 전체를 통하여 사용되는 바, '마이크로입자' 또는 '검출 입자'라는 용어는 증폭 반응 중 생성된 핵산 생성물을 표지하는 데 사용되는 임의의 화합물을 의미하며, 예컨대 이중 가닥 핵산에 특이적인 형광 염료, 형광 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 올리고뉴클레오티드-결합 양자점 또는 고상 요소들, 예컨대 폴리스티렌, 라텍스 또는 상자성 입자들 또는 마이크로스피어를 들 수 있다.
명세서 및 청구범위 전체를 통하여 사용되는 바, '챔버'라는 용어는 유체가 다른 챔버로 향하기 전 일정 시간동안 머무르는 유체 부분을 의미한다. 예컨대, 챔버는 시료 챔버, 증폭 챔버, 표지 챔버 또는 검출 챔버일 수 있다.
명세서 및 청구범위 전체를 통하여 사용되는 바, '포켓'이라는 용어는 레지스터 또는 통기 (venting) 메커니즘으로 기능하는 다른 메커니즘 상에 덧씌워지는 부분을 의미한다. 예컨대, 전술한 유체 챔버와는 달리, 유체 레이어에서 형성된 포켓은 PCA 상의 레지스터와 정렬된 하나의 개방면을 가질 수 있다. 이 개방면은 좋기로는 얇은 멤브레인으로 덮혀 아래에 놓인 레지스터에 에너지를 가함으로써 쉽게 파열되는 밀봉된 공동을 형성한다.
명세서 및 청구범위 전체를 통하여 사용되는 바, '채널'이라는 용어는 통상 2 이상의 챔버들 및/또는 포켓들 또는 이들의 조합, 예컨대 유입구, 배출구 또는 통기구 채널 등을 연결하는, 유체 어셈블리 내의 좁은 도관을 의미한다. 통기구 채널의 경우에 있어서, 상기 도관은 유체 없이 남아 유체 챔버를 통기구 포켓으로 연결한다.
명세서 및 청구범위 전체를 통하여 사용되는 바, "외부 장치"라는 용어는 일회용 분석체를 가열 및/또는 냉각시키는 재활용 가능 장치 및/또는 일회용 분석체에 기계적 작용을 수행하는 재활용 가능 장치를 의미하고, 예컨대 피어싱 버퍼 패킷 (piercing buffer packet) 및/또는 펌핑 또는 달리 능동적으로 유체에 이송력을 제공하는 것을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시 상태들은 시험이 통상적으로 수행될 실험실 환경으로부터 떨어진 위치에서 분석 수행에 적합한 저가의, 현장 핵산 시험 장치들이다. 특정 장치들은 유체 및 전자 부재 또는 레이어들을 포함하고, 필요에 따라 보호 하우징으로 싸여 있다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 상기 유체 레이어는 플라스틱으로 이루어지고, 일련의 챔버들과, 작동 중 서로에 관하여 챔버들이 수직으로 배향되는 좁은 채널로 연결되는 포켓들로 이루어진다. 상기 유체 레이어는 전자 부재, 예컨대 규격화된 표면 실장 부품 (SMD)을 포함하는 인쇄 회로 기판과 포개어지거나 다르게는 물리적으로 접촉하여 위치하고, 마이크로컨트롤러를 통하여 제어된다. 이 장치의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 전체 어셈블리는 일회용이다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 유체 및 물리적으로 결합된 전자 레이어들은 일회용이지만, 작은 비싸지 않은 제어 유닛은 재활용 가능하다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 유체 레이어는 일회용이고 작은 제어 베이스 유닛은 재활용 가능하다. 모든 실시 상태에 대하여, 본 발명은 핵산 시료 준비 장치, 예컨대 "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control"라는 제목의 국제 공보 WO 2009/137059 A1 (참조로서 본 발명에 포함)에 개시된 것과 같은 장치와 통합될 수 있고, 및/또는 이에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 실시 상태들은 확립된 제조 공정으로 저렴하게 제조될 수 있는 핵산 시험 통합 장치를 포함한다. 본 발명은 널리 허용되는 소형 면역분석법의 최종 사용자적 관점에서의 단순성을 보유하고, 장치 내의 유체 온도를 조절하는 문제를 극복하며, 연속적인 단계에서 소부피의 시료를 이동시키고 시약을 혼합하며 핵산을 검출하는 분자적 시험 데이터를 제공한다. 본 발명의 실시 상태들은 표준 어셈블리 기법에 의하여 구성될 수 있는 규격화된 전자 소자들을 이용하도록 고유하게 적응되고, 어떠한 이동 부분을 요구하지 않는다. 또한, 유체 레이어 설계는 쉽게 이용 가능한 플라스틱과 제조 기법들을 사용할 수 있게 한다. 그 결과는 전용 실험실 인프라구조에 대한 요구 없이, 핵산 단리, 증폭, 및 검출이 가능한 저렴하고, 일회용이며 신뢰할 만한 장치이다.
기존의 핵산 시험 장치들은 일반적으로 비용이 많이 들고 및/또는 특화된 제조 방법을 요구하는 복잡한 가열 소자들, 예컨대 증착 필름 히터 및 펠티에 장치를 이용한다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 반응 용액의 가열은 좋기로는 값싸게 구입할 수 있는 간단한 저항성 표면 실장 부품들을 사용하여 이루어지고, 조립되어 통상적인 제조 스탠다드로 시험된다. 이들 저항성 소자들과, 연결된 센서 소자들 위로 유체 챔버들을 겹쳐 놓음으로써, 반응 용액의 유체 온도는 편리하게 조절될 수 있다. 전자 산업 분야에서 SMD 레지스터의 광범위한 사용은 본 발명이 잘 확립된 품질 제어 방법으로 받아들여질 것을 보장한다. 많은 핵산 증폭 기법들, 예컨대 PCR은 반응 용액의 신속한 가열 뿐 아니라 신속한 냉각 역시 필요로 한다. 본 발명의 반응 챔버는 좋기로는 한 면에서 가열되고 반대면에 걸친 외기 온도가 유체 온도를 낮추도록 돕는데 사용된다. 또한, 장치 실시 상태의 수직 배향은, 장치가 수평으로 배향되는 경우보다 수동적인 대류에 의한 신속 냉각을 가능하게 하므로, 따라서 비용이 드는 팬이나 펠티에 장치를 사용하지 않고도 열 사이클링 시간을 감소시킬 수 있다.
유체 제어는 저가의 핵산 시험 장치 설계와 관련된 또 다른 문제점이다. 이 기술 분야에 알려진 장치들은 장치 작동 중 유체를 조작하기 위하여 일반적으로 전자기계적, 동전자적 또는 압전 펌핑 메카니즘을 이용한다. 이들 펌핑 소자들은 장치의 복잡성 및 비용을 모두 증가시킨다. 유사하게, 정교한 마이크로 기계 설계를 이용한 밸브 또는 이동부는 제작 비용을 증가시키고 이동부의 고장이나 생물 오염 등 문제로 인하여 신뢰성을 떨어뜨린다. 전술한 핵산 시험 장치들과는 달리, 본 발명의 실시 상태는 유체 부피를 조작하기 위하여 모세관력과 표면 장력과 함께 마이크로컨트롤러 제어 하의 정역학적 압력을 이용한다. 본 발명의 일부 실시 상태의 수직 배향은 마이크로컨트롤러 제어 하에 반응 용액으로 하여금 챔버에서 챔버로의 폭포 단계를 가능케하여 분석에 요구되는 조작을 용이하게 한다. 유체는 채널 크기 및 표면 장력의 균형을 통하여 각 반응 챔버 내에 머물 수 있는데, 여기서 표면 장력이 기체 이동으로써 유체의 전진을 막는다. 시료는 좋기로는 마이크로컨트롤러 제어 하의 간단한 통기 메커니즘의 활성화 후에야 낮은 챔버로 전진한다. 일단 열리면, 통기구는 유체가 들어올 때 이동되는 공기에 제2 챔버로부터 빠져나갈 수 있는 길을 제공함으로써, 유체가 제1 챔버로부터 제2 챔버로 이동되도록 한다. 유체 레이어 내 각 챔버는 좋기로는 좁은 통기구 채널을 통하여 밀봉된 통기구 포켓에 연결된다. 상기 통기구 포켓은, 멤브레인 아래의 작은 표면 실장 레지스터를 가열함으로써 쉽게 파열되는 얇은 플라스틱 멤브레인으로 일면이 밀봉되는 것이 좋다. 일단 아래 챔버의 통기구가 개방되면, 낮은 정역학적 압력하에서도 유체 전진이 진행된다.
하기에 더욱 구체적으로 개시하는 바, 본 발명 일부 실시 상태들에서 사용되는 유체 또는 마이크로유체 밸브 메커니즘은 좋기로는 열에 불안정한 밀봉과 열 접촉 및 (임의로) 물리적으로 접촉하는 열 소자를 사용하여, 낮은 높이의 챔버를 통기시켜 유체를 높이가 높은 챔버로부터 낮은 챔버로 흐르게 함으로써 유체 이동의 전자적 제어가 가능하게 한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 표면 실장 레지스터는 널리 사용되고 잘 확립된 전자 제조 방법을 사용하여 인쇄 회로 기판 상에 실장되고 열에 불안정한 물질로 이루어진 채널 밀봉과 물리적으로 접하여 위치한다. 에너지가 가해지면, 이 표면 실장 레지스터는 밀봉을 파열시키기에 충분한 열을 생성하는데, 이는 챔버의 저압으로의 통기, 예컨대 대기압으로의 통기라는 결과를 낳으므로 높이가 높은 챔버로부터 낮은 높이의 챔버로의 유체의 이동을 가능하게 한다. 높이가 높고 낮은 챔버들 간의 직접적인 밀봉은 사용되지 않는 것이 좋다. 채널과 밀봉이 유체 챔버들로부터 멀리 위치할 수 있고, 따라서 배치상 유체 장치 레이아웃은 제조 효율적이 된다. 밀봉 물질은 통기구 채널을 밀봉할 수 있고 전술한 대로 열로써 파열될 수 있는, 예컨대 얇은 플라스틱 시트 등 임의의 물질을 포함할 수 있다. 기구 내 유체 이동 제어에 대한 이러한 접근은 마이크로프로세서 또는 마이크로컨트롤러와 같은 전자적 제어 회로의 제어 하에 일련의 챔버들을 통하여 유체를 이동시키는 능력을 제공하면서도 재료상 저비용, 확립된 적층 및 전자 제조 기법들을 이용하는 제조상의 적합성이라는 이점이 있다. 통기구, 상기 통기구를 밀봉할 열에 불안정한 물질 (그러나 유체 챔버 또는 유체 마이크로채널 그 자체는 밀봉하지 않는 물질) 및 열을 이용하여 상기 밀봉을 파열시킬 수단의 이용은 이 장치를 통한 유체 이동을 제어하는 수단을 제공하여 소정의 시점 또는 이후 특정 사건들의 완성 시점 (예컨대, 일정 온도에 도달, 온도 변경 또는 수회 일련의 온도 변경, 또는 반응 시간(들) 완료 또는 기타 사건들)에 유체의 이동을 가능하게 한다.
또한, 통기구라는 접근은 유체 챔버 그 자체를 밀봉하는 데 대한 여러 가지 이점을 갖는다. 통기구 포켓은 유체 레이아웃 상 어느 곳에든 위치할 수 있고, 그들이 통기구 채널을 통하여 조절하는 챔버와 간단히 연통할 수 있다. 제조 관점에서, 통기구 포켓들은, 모든 통기구 포켓들에 대하여 좋기로는 잘 확립된 방법들, 예컨대 접착, 열 적층, 초음파 용접, 레이저 용접 등으로, 오직 하나의 밀봉 멤브레인이 유체 레이어에 부착되도록 (통기구 포켓 매니폴드를 포함할 수 있음) 위치할 수 있다. 반대로, 직접적인 유체 챔버의 밀봉은 상기 밀봉 물질이 각각의 챔버 위치에 해당하는 상이한 지점들에 위치될 것을 요구하는데, 이것은 제조상 더 어렵다. 이것은 하나의 멤브레인으로 밀봉되는 하나의 통기구 포켓 매니폴드에 비하여 제조 중 해결해야 할 또 다른 시나리오를 제시한다.
또한, 챔버에 위치하는 밀봉 물질은 챔버 내에 존재하는 용액들과 접촉하게 될 것이다. 이것은 상기 물질의 사용이 (i) 챔버 내에서 이루어지는 반응과 간섭하지 않고 (ii) rm 용액에 의하여 영향받지 않아야 함을 요구한다. 화학 억제제 및 검출 이전 증폭과 표지 양자 모두에서 이용되는 온도 상승에 대한 생화학적 반응의 민감성을 고려할 때, 허용 가능한 물질의 목록은 제한적이다. 또한, 높은 온도에서 반응을 시행하기 위하여 사용되는 반응 챔버와 직접 연결되는 열 민감성 물질과 물리적으로 인접하다는 것은 상기 밸브 밀봉 물질을 반응 중 사용되는 높은 온도로부터 열적 단리될 수 있도록 보장하는 중요한 문제를 제기하고, 뿐만 아니라 그 밀봉 물질이 녹을 때의 가열로부터 그 용액을 방어하는 문제도 제기한다. 밸브가 실패하지 않기 위하여는, 열 민감성 물질은 열원으로부터 상대적으로 멀리 위치하거나, 상기 열 민감성 물질은 반응에서 사용되는 가장 높은 온도보다 훨씬 높은 온도에서활성화되어야만 한다. 미니어쳐 장치에서 챔버들과 직접 연결되는 밀봉을 멀리 위치시키는 것은, 압축된 기계적 설계의 사용을 방해하는 유체 레이아웃 상 제약을 부과한다. 그리고, 반응 챔버 자리에 위치하는 밸브를 촉발하기 위하여 높은 온도는 사용하는 것은 반응에 사용되는 온도를 약간 초과하면 안정성을 잃는 생화학적 성분들에 유해할 수 있다. 결국, 챔버들이 직접 밀봉되면, 녹는 밀봉 물질은 흐름을 차단하면서 챔버들 간의 채널에 남아있을 수 있다. 밀봉 물질의 점도는 유체 컬럼에 있어서 중력 기반의 미니어처 기구에서 얻어지는 것보다 높은 압력을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 실시 상태에 있어서, 시약 혼합은 다른 시스템들보다 가장 복잡하다. 핵산 증폭에 필요한 시약들, 예컨대, 완충액, 염, 디옥시리보뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 효소는 좋기로는 동결건조된 펠렛 또는 케익을 사용하여 안정하게 포함된다. 유체 챔버 내에 밀봉된, 이들 동결건조된 시약들은 수용액과 만나 쉽게 용해될 수 있다. 추가의 혼합이 필요한 경우에 있어서, 본 발명 실시 상태들의 수직 배향은 용액들을 혼합하는 새로운 방법을 제공한다. 상기 용액이 열에 민감한 성분들을 함유하는 경우, 유체 챔버들 아래의 히터들을 사용함으로써, 기체는 가열되어 상부의 챔버 내 반응 용액에 기포를 전달할 수 있다. 또는, 상기 용액이 어떠한 열에 민감한 성분들을 함유하지 않는 경우, 히터가 용액이 끓는 시점까지 직접 용액의 가열에 사용될 수 있다. 공기 기포의 발생은, 그들이 유체 챔버와 채널 내에서 축적되고 반응 용액을 이동시키거나 장치 내에서 유체 이동을 방해하기 때문에 종래 개시된 유체 및 마이크로유체 장치에서는 종종 바람직하지 않다. 본 발명에서 제시되는 본 발명 실시 상태의 수직 설계는 기포가 유체 표면으로 올라갈 수 있게 하는 결과, 오로지 최소한의 그리고 순간적인 유체의 이동을 일으키고, 유체 또는 마이크로유체 시스템에 대한 기포의 임의의 유해한 효과를 효과적으로 개선한다. 끓임으로써 혼합하는 것 역시 이 수직 설계에서 편리한데, 프로세스 도중 이동된 유체가 가열 소자가 꺼진 후 중력에 의하여 원래 유체 챔보러 간단히 돌아가기 때문이다.
본 발명의 실시 상태에 있어서, 증폭된 핵산을 검출하기 위하여 비색 검출 스트립이 사용된다. 측방 유동 분석법들이 그들의 이용, 신뢰성 및 저렴한 비용으로 인하여 면역 분석 시험에서 흔히 사용된다. 선행 기술은 표지 구역이나 표지 구역 근처에 있는 시료 수신 구역으로서 다공성 물질을 이용하는 핵산의 검출용 측방 유동 스트립의 사용에 대한 개시를 포함하고 있고, 표지 구역 역시 다공성 물질로 이루어지고 상기 측방 유동 분석 장치의 한 말단에 위치하거나 근처에 위치한다. 이 선행 발명에서, 표지 모이어티는 상기 표지 구역에 있다. 시료 수신 구역 및 표지 구역을 이루기 위하여 다공성 물질을 사용하는 것은 그 다공성 물질 내에 시료 용액 및 검출 입자들 일부가 잔류하게 되는 결과를 낳는다. 검출에 요구되는 가역적으로 고정된 모이어티를 갖는 다공성 물질을 포함하는 표지 구역이 본 발명의 실시 상태에 사용될 수 있다고 하여도, 본 발명 실시 상태들은 좋기로는 장치 중 측방 유동 스트립의 시료 수신 구역과 별개인 위치에 존재하고 유체 머무름 특성이 낮은 비다공성 물질을 포함하는 검출 입자들 또는 모이어티를 이용한다. 이러한 접근은 표적 핵산을 함유하는 시료가 장치의 측방 유동 부재의 시료 수신 말단 다공성 부재에 도입되기 전 표지되는 것을 가능하게 함으로써, 다공성 표지 구역에서 시료 물질 및 검출 입자들의 머무름 및/또는 손실을 제거한다. 또한, 이 방법은 검출 모이어티의 존재 하에서 시료의 다양한 처리를 가능하게 하는데, 예컨대 다공성 시료 수신 구역 또는 표지 구역의 물질이나 측방 유동 검출 스트립 물질에 영향을 미칠 우려없이 이중 가닥 표적 또는 단일 가닥 표적 내 2차 구조를 변성시키는 것을 가능하게 한다. 또한, 시료 수신 구역과 접한 측방 흐름에서 표지 구역을 이용하는 것이 아니라 유체 부재, 예컨대 통기구 또는 밸브의 제어를 받는 것은 표적과 표지로 하여금 유체 흐름 제어 시스템에 의하여 제어되는 시간 동안 접촉하여 남아있도록 한다. 따라서, 본 발명의 실시 상태는 시료 및 검출 입자 상호 작용 시간과 조건이 물질의 모세관 수송 특성에 의하여 결정되는 종래의 측방 유도 시험 스트립과는 다를 수 있다. 온도 조절된 챔버에 검출 입자들을 포함시킴으로써, 효율적인 혼성화 기반 검출을 가능하게 하면서 이중 가닥 핵산의 변성이 가능하다. 다른 실시 상태에 있어서, 형광은 LED, 광 다이오드 및 광학 필터들의 조합을 이용하여 핵산 증폭을 검출하기 위하여 사용된다. 이들 광학 검출 시스템은 실시간 핵산 검출 및 증폭 중 정량 및 증폭 후 종말점 검출을 수행하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 실시 상태는 핵산 시료가 선택적으로 증폭되고 검출될 수 있는 저가의 현장 시스템을 포함한다. 또 다른 실시 상태들은 핵산 시료 준비 장치, 예컨대 제목 "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control"의 국제 공보 WO 2009/137059 A1에 개시된 장치와의 통합을 포함한다. 상기 장치 실시 상태는 좋기로는 플라스틸 유체 부재와 인쇄 회로 어셈블리 (PCA) 양자 모두를 포함하고, 필요에 따라 활성 부재들을 보호하는 하우징에 안에 들어간다. 온도 조절, 유체 및 시약 혼합은 좋기로는 마이크로컨트롤러에 의하여 편성된다. 반응 카세트는 좋기로는 배향되어 있고 수직으로 작동하여, 마이크로컨트롤러로 촉발되는 통기구들과 결합된 정역학적 압력, 모세관력과 표면 장력이 장치 내 유체 이동을 제어한다.
도 1의 대표적인 모식을 참고하면, 핵산 시료는 시료 챔버 10에 첨가된다. 핵산 시료는 온라인 (즉, 통합 핵산 준비 서브시스템), 별개의 핵산 준비 프로세스 (예컨대 많은 시판 방법들 중 하나, 예컨대 스핀-컬럼) 후 정제된 핵산을 피펫으로 장치에 첨가, 또는 미가공 핵산 함유 시료로부터 유래할 수 있다. 시약 혼합물은 시료 챔버 내에 미리 존재하거나 또는 나중에 첨가되는 것이 좋은데, 이것은 액체 또는 건조형일 수 있고, 증폭 반응에 필요한 모든 성분들, 예컨대 완충 제제, 염, dNTPs, rNTPs, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및/또는 효소를 함유한다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 시약 혼합물은 동결건조되어 동결건조 시약 20을 형성한다. 시료 챔버에 시료를 도입하면 시약들과 시료가 혼합되도록 함으로써 상기 시약이 시료에 대하여 작용한다. 시료와 시약들을 더 혼합하거나 시약들을 현탁하는 임의의 기포-혼합 단계가 필요에 따라 수행될 수 있다. 그 후, 유체는 유입 채널 40을 통하여 상기 장치가 수직 배향인 경우 시료 챔버 아래에 존재하는 하나 이상의 증폭 챔버(들) 30로 향하는 것이 좋다. 배출 채널 45이 증폭 챔버 30를 후속하는 챔버로 연결한다. 다수의 앰플리콘이 생성되는 멀티플렉스 시험을 촉진하기 위하여, 상기 증폭 챔버 내에 다수의 프라이머 세트를 증착시켜 멀티플렉스 증폭이 달성될 수 있다. 또한, 다수의 증폭 및 검출 챔버들이 상기 장치 안에 포함된 회로 기판과 유체 설계는 싱글플렉스 (single-plex) 또는 멀티플렉스 반응일 수 있는 다수의 병렬적 증폭 반응을 뒷받침한다. 이러한 접근은, 이 기술 분야의 숙련자에게 동일한 반응에서 다수의 프라이머 쌍을 사용하는 멀티플렉스 증폭의 결과라고 알려진 복잡성을 제거하거나 감소시킨다. 게다가, 다수의 증폭 반응 챔버들을 이용하는 것은 여러 가지 온도 계획 하에서 동시 증폭을 가능하게 하여, 여러 표적 및/또는 프라이머 서열들에 맞추어 요구되는 상이한 분리 (melting) 온도 또는 어닐링 온도 등 최적의 증폭 요건을 제공하게 된다.
장치의 제1 챔버로부터 제2 챔버로의 유체 이동은 좋기로는 도 1~2에 나타낸 바와 같이 제2 챔버로 연결된 통기구의 개방으로 달성된다. 상기 통기구의 한 가지 실시 상태는 2 가지 부재를 포함하는데, 그 한 면은 폴리올레핀과 같은 멤브레인을 포함하는 것이고 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCA) 75에 실장된 레지스터에 접하는 통기구 포켓 50과, 통기구 포켓 50을 그 제어 하에 마이크로유체부와 연결시키는 통기구 채널 60을 포함한다. 시료 챔버에서, 유체가 처음 시스템으로 첨가되면, 하류 챔버와 연결된 상기 통기구는 밀봉되어 있고 유체는 두 챔버를 연결하는 채널을 통하여 이동할 수 없다. 마이크로컨트롤러가, 통기구 포켓 50의 일 면인 상기 멤브레인에 위치하고나 그 근처에 위치하는 열 소자, 예컨대 레지스터 70에 전류를 보내는 것을 담당한다. 에너지를 받은 레지스터에 의하여 생성된 열이 얇은 멤브레인 80을 파열시키고, 따라서 상기 통기구가 개방된다. 일단 개방되면, 상기 통기구는 유체가 들어오면서 이동되는 공기가 제2 챔버로부터 탈기되는 통로를 제공함으로써 제1 챔버로부터 제2 챔버로 유체를 적하시키게 된다. 상기 통기구 포켓의 다른 실시 상태들은 열 민감성 멤브레인을 제외한 밀봉을 포함할 수 있고, 그 밀봉을 파열시키는 다른 방법들, 예컨대 천공, 인열 (tearing) 또는 용해 등을 이용할 수 있다.
증폭 챔버는 핵산 증폭을 뒷받침하는 데 필요한 온도 조절 수단을 제공하는 열 소자와 접하는 것이 좋다. 본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 상기 증폭 챔버는 내부 표면의 적어도 일부에 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 도 1~3에 나타낸 바와 같이, 본 발명 장치의 한 가지 실시 상태는 시료 챔버 10으로부터 증폭 챔버 30으로 유도하는 유입구 채널 30, 좋기로는 증폭 챔버 30으로부터 표지 챔버 90으로 유도하는 배출구 채널 45, 및 전술한 바와 같이 통기구 포켓 50으로 유도하는 통기구 채널 60을 포함한다. 증폭 챔버 벽 95와 히터 소자(들) 100 사이 계면에, 열 전도성 물질, 예컨대 써멀 그리스 (thermal grease) 또는 써멀 화합물을 위치시키는 것이 유리할 수 있다. 마이크로컨트롤러는, 온도 센서 110으로부터 수집된 데이터에 기초하여, 좋기로는 간단한 온/오프 또는 비례 미분 적분 (PID) 온도 제어 방법 또는 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 다른 알고리즘 온도 제어를 사용하여, 좋기로는 금속 산화막 반도체 전계 효과 트랜지스터 (MOSFETs)의 수단으로써, 좋기로는 저항성 열 소자(들)로의 전류를 조절한다.
기존의 시스템들은 재활용 가능한 장비 내에 위치하는 능동적인 가열 및 냉각 장치들을 이용하여 일회용 카트리지에서 일어나는 핵산 증폭의 온도 제어를 달성하고, 이는 제거할 수 있는 일회용 카트리지와 함께 재생 가능한 열 수축을 신뢰성 있게 형성할 수 있는 충분히 정밀한 장비를 반드시 요구한다. 이것은 장비의 비용 및 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라, 상기 장비의 온도 제어 서브시스템과 상기 일회용 카트리지의 유체 서브시스템 사이의 열 계면의 신뢰성을 감소시킨다. 이러한 시스템들과는 달리, 본 발명의 실시 상태는 좋기로는 기구의 일회용 부분에 위치하는, 도 11에 나타내고 전술한 바와 같은 온도 제어를 위한 저항성 열 소자를 포함한다. 열 소자들과 해당 온도 센서(들)을 일회용 부재에 위치시키는 것은 온도 제어 서브시스템과, 그들이 서로 면하는 증폭 챔버와 검출 챔버들 간 재생 가능성이 높은 열 커플링의 제조를 가능하게 한다. 이러한 접근은 제조 중에 열 전도성 계면을 형성함으로써 전자적 열 제어 서브시스템에 유체 서브시스템을 커플링시키는 매우 신뢰성 있는 수단을 가능하게 한다. 그 결과인 전자ㅓㄱ 온도 제어 부재와 유체 서브시스템 사이의 우수한 열 접촉은 신속한 온도 평형이라는 결과를 낳고, 그러므로 신속한 분석이라는 결과를 낳는다.
증폭 챔버의 실시 상태는 대략 30℃ 내지 대략 110℃ 범위의 온도로 반복 가열 및 냉각하는 것을 견딜 수 있는 물질을 포함하는 것이 좋다. 더더욱 좋기로는, 상기 증폭 챔버는 대략 초당 10℃ 내지 50℃의 온도 변화율로 대략 30℃ 내지 대략 110℃ 범위의 온도로 반복 가열 및 냉각되는 것을 견딜 수 있는 물질을 포함한다. 상기 증폭 챔버는, 마이크로컨트롤러의 프로그래밍에 따라, 그 내부의 용액을 열 사이클링 (도 4A~D) 또는 등온성 증폭 프로토콜 (도 4E) 중 어느 하나에 적합한 온도로 유지할 수 있는 것이 좋다. 몇 가지 핵산 증폭 응용법에 있어서, 표적 핵산을 변성시키기 위하여, 개시 반응은 높은 온도, 예컨대 대략 37℃ 내지 대략 110℃ 사이의 온도에서, 1초 내지 5 분간 이루어지는 것이 바람직하다. 그 후, 상기 용액의 온도는 적어도 2 가지 온도 사이의 온도에서 변화하게 되는데, 예컨대 핵산 이중 가닥 변성이라는 결과를 이끌어 내는 온도와 표적에 혼성화하여 프라이머 어닐링에 적합하고 중합효소로 촉매되는 핵산 중합을 통한 프라이머의 신장에 적합한 온도를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 열 사이클링 계획 내 각각의 필요 온도에서의 반응 시간은 표적 핵산의 서열 조성과 반응 혼합물의 조성에 따라 변화할 수 있으나, 좋기로는 대략 0.1 초 내지 대략 20 초 사이이다. 반복적 가열 및 냉각은 통상적으로 대략 20 사이클 내지 대략 50 사이클로 수행된다. 등온성 증폭 방법을 수반하는 실시 상태에 있어서, 상기 반응 용액의 온도는 이용되는 증폭 기법에 따라 대략 3분 내지 대략 90 분간 일정한 온도로 유지된다 (일부 경우에는 개시 반응 이후 높은 온도로 유지). 일단 증폭 반응이 완료되면, 표지 챔버와 연통되는 통기구를 열어서 상기 증폭 반응 용액을 증폭 챔버 아래에 위치하는 표지 챔버로 이동시킨다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 증폭 반응 이전, 도중 또는 후에 상기 증폭 챔버에서 추가적인 생화학적 반응들이 수행될 수 있다. 이러한 프로세스들로는 RNA가 cDNA로 전사되는 역전사, 다수의 프라이머 쌍이 동시에 다수의 표적 핵산을 증폭하는 멀티플렉싱 및 증폭 반응 과정 도중에 증폭 산물이 검출되는 실시간 증폭 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 후자의 경우에 있어서, 증폭 oaqj는 밸브 또는 배출구 채널을 포함하지 않을 수 있고, 증폭 챔버는 좋기로는 광학적 창 (optical window)을 포함하거나 다르게는 증폭 반응 과정 중 앰플리콘 농도의 탐지가 가능하도록 설정될 것이다. 실시간 증폭 실시 상태 한 가지에 있어서, 표적 핵산에 상보적인 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 이중 가닥 DNA에 특이적인 형광 염료들은 LED 또는 다이오드 레이저(들)과 같은 여기광원과 광 다이오드와 같은 검출기를 이용하여 형광 세기가 모니터링되며, 적절한 광학 부재로는 광학 필터를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에 있어서, 유체 이동은 장치 챔버들 내에서 기체를 팽창시키는 저항성 가열을 이용하여 촉진된다 (도 5). 예컨대, 증폭 챔버 30를 가열함으로써, 챔버 내 기체가 팽창하고 통기 채널, 이 경우에는 유입구 채널 40을 통하여, 기포 120으로서 빠져나갈 것이다. 본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 이러한 하류 챔버의 가열은 상류 챔버, 예컨대 시료 챔버 10의 유체 부피에 존재하는 시약들을 혼합하기에 충분한 기포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일단 열 소자가 꺼지면, 증폭 챔버 30 내의 기체는 냉각되고 수축되어, 상부의 시료 챔버 10으로부터 증폭 챔버 30으로 유체 125를 떨어뜨린다. 상기 프로세스를 수회 반복함으로써, 전체 유체 부피는 하나의 챔버로부터 다른 챔버로 향할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시 상태에 있어서, 이러한 메커니즘은 유체 부피를 이동시키는 레지스터 통기 메커니즘과 결합하여 사용될 수 있다.
표지 챔버의 실시 상태는 증폭 챔버에서 생성되는 증폭된 표적 핵산에 대한 특이적인 표지를 제공하고 검출 챔버와 결합하여 작동, 시험의 분석적 결과를 제공한다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 표지 챔버 90은, 담체, 예컨대 폴리새커라이드, 계면활성제, 단백질 또는 기타 검출 입자들의 재현탁을 촉진하는 것으로 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 화합물 내의 건조, 동결건조된 검출 입자 130, 또는 검출 입자의 건조 혼합물로서 내부 표면의 적어도 일부에 존재하는 검출 입자 130를 포함할 수 있다. 표지 챔버는 증폭 챔버 30로부터 유도되는 유입구 채널 135, 검출 챔버로 유도하는 배출구 채널 140, 및 전술한 바와 같이 통기구 포켓으로 유도하는 통기구 채널 150과 연결되는 것이 좋다. 유입구 채널 135는 통상적으로 증폭 챔버 30의 배출구 채널 45와 동일한 채널이다. PCA와의 계면에서, 써멀 그리스와 같은 열 전도성 물질로 이루어지는 얇은 레이어는 좋기로는 상기 표지 챔버의 한 면과 저항성 열 소자 사이에 배치되는 것이 좋다.
적절한 검출 입자들로는 이중 가닥 핵산 특이적 형광 염료, 형광 변형 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드-결합 염료화 마이크로입자 또는 금 콜로이드를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 앰플리콘의 검출은 검출하고자 하는 앰플리콘과 상보적이거나 다르게는 검출하고자 하는 앰플리콘에 특이적으로 결합할 수 있는 '검출 올리고뉴클레오티드' 또는 기타 '검출 프로브'을 포함한다. 검출 올리고뉴클레오티드의 마이크로입자에 대한 결합은 스트렙타비딘 피복 입자들 및 비오티닐화 올리고뉴클레오티드를 이용하여 일어나거나, 카보디이미드 화학을 이용함으로써 카보디이미드의 존재 하에서 카복실화 입자들이 활성화되고 검출 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 1차 아민과 특이적으로 반응하는 것에 의하여 일어날 수 있다. 검출 가능한 모이어티에 대한 검출 올리고뉴클레오티드의 결합은 내부적으로 또는 5' 말단이나 3' 말단에서 일어날 수 있다. 검출 올리고뉴클레오티드는 마이크로입자에 직접 부착되거나, 더 좋기로는 에틸렌글리콜이나 폴리뉴클레오티드와 같은 스페이서 모이어티를 통하여 부착될 수 있다.
이중 가닥 DNA 증폭 산물의 경우, 반응 용액을 가열한 후 검출 챔버로 도입하는 것이 검출을 촉진한다. 이중 가닥 DNA를 분리 (melting)시키고 난 후, 검출 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 냉각하면 상기 증폭된 표적 핵산의 서열 특이적 표지라는 결과를 낳는다. 이중 가닥 DNA 분리를 개시하기 위하여 표지 챔버 아래의 저항성 소자를 이용하여 대략 1 초 내지 대략 120 초 동안 유체 부피를 가열할 수 있다. 용액을 실온까지 냉각되게 하기 때문에, 증폭된 표적 핵산은 특이적으로 검출 마이크로입자에 혼성화할 수 있다. 그 후, 반응 부피는 좋기로는 검출 챔버의 통기구가 개방됨으로써 표지 챔버 아래의 검출 챔버 부분으로 향하게 된다.
효율적인 표지가 되게 하기 위하여, 용해된 검출 입자들은 반응 용액과 잘 혼합되는 것이 좋다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 변성 이중 가닥 핵산 표적 양쪽 모두에 표지하는 도중 저항성 히터를 포함하는 제2 혼합 방법이 사용될 수 있고 반응 용액 내에서 검출 마이크로입자를 충분히 혼합한다. 표지 챔버 내에서 용액을 끓는점보다 높게 가열하는 것은 난기류를 유도하여 용액을 혼합하기 위하여 이용될 수 있다. 도 6B에 나타낸 바와 같은 레이저 엣칭된 선 132 (또는 이러한 일련의 선들)과 같은 가공된 특징에 의하여 챔버의 바닥 및 측면에 집중된 기포를 일으키는 것은 좋기로는 용액을 효과적으로 교반하는 것이다. 이러한 효과는 해당하는 끓는 점 변화와 무관하게 다양한 고도에서 기능함이 입증되었다. 끓음으로써 상부 챔버로 이동된 임의의 용액은 좋기로는 후속하는 냉각 중에 하류 표지 챔버로 다시 흐른다. 본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 내부 면 부분 또는 표지 챔버 벽은 가공될 수 있고 또는 다르게는 특정 챔버 벽 또는 면에 집중하여 끓음이 일어나게 하기 위하여 처리될 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 특정 지점(들)에 집중하여 끓음이 있게 하기 위하여 하나 이상의 끓임쪽이 표지 챔버 내에 위치할 수 있다.
본 발명 검출 챔버의 실시 상태는 표지 챔버에서 표지된 증폭된 표적 핵산의 특이적 검출을 제공한다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 검출은 선, 도트 또는 기타 시각적으로 구별 가능한 요소들로 패턴화되고, 표지된 앰플리콘과 직접 또는 간접하여 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티를 포함하는 다공성 물질 (예컨대, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리딘 플루오라이드, 나일론, 전하 변경 나일론 또는 폴리테트라플루오로에틸렌)로 이루어진 흡수 스트립을 통한, 표지된 앰플리콘을 함유하는 용액의 모세관 위킹 (wicking)에 의하여 달성된다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 장치의 상기 흡수 스트립 부재는 물리적으로 접촉하는 최대 3개의 다공성 기판들을 포함한다: 위킹을 증진시키기 위한 양쪽성 시약들을 포함하는 계면활성제 패드, 그곳에 표지된 앰플리콘과 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 모이어티가 고정화되는 다공성 물질 (예컨대, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리딘 플루오라이드, 나일론, 전하 변경 나일론 또는 폴리테트라플루오로에틸렌)을 포함하는 검출 구역, 및/또는 추가적인 흡수 용량을 제공하는 흡수 패드. 종래 개시되는 측방 유동 검출 장치들과는 달리, 검출 입자들은 좋기로는 검출 챔버 내 측방 유동 다공성 물질들 내에 포함되지 않고, 대신에 앰플리콘과 검출 입자들 간 결합 복합체의 형성을 실질적으로 증진시키는 조작, 예컨대 가열/비등 등이 상기 장치의 다공성 부재에 결과물 표지 핵산을 도입하기 이전에 수행될 수 있는 표지 챔버 상류에 존재한다.
'캡쳐 올리고뉴클레오티드' 또는 '캡쳐 프로브'는 좋기로는 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 다양한 수단 중 어느 하나, 예컨대 UV 조사에 의하여 장치의 검출 스트립 소자에 고정화된다. 캡쳐 프로브는 표지된 핵산을 함유하는 용액이 캡쳐 구역을 통하여 위킹할 때 표지된 핵산을 캡쳐하여 그 결과 캡쳐 프로브 고정화 위치에서 표지의 농도가 증가하도록 설계되고, 따라서 표지된 표적 핵산 앰플리콘(들)의 존재를 표시하는 검출 가능한 신호를 생성한다. 하나의 검출 스트립은 하나 또는 다수개의 캡쳐 프로브로 패턴화되어 다수의 앰플리콘의 멀티플렉스 검출, 앰플리콘 서열의 결정 및 분석 품질 제어 (양성 대조군 및 음성 대조군)을 가능하게 할 수 있다.
유체 서브어셈블리 ( subassembly ) 레이어
유체 서브어셈블리 실시 상태의 부재들은 좋기로는 플라스틱, 예컨대 아크릴, 폴리카보네이트, PETG, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 및/또는 기타 유사 물질들을 포함한다. 이들 물질들은 쉽게 이용이 가능하고, 표준 방법에 의하여 제조될 수 있다.. 도 3 및 7에 나타낸 바와 같이, 유체 서브어셈블리는 챔버들과 채널들 양자 모두를 포함한다. 유체 챔버는 벽들, 2개의 면 160으로 이루어지고 하나 이상의 채널들, 예컨대 유입구, 배출구 또는 통기구와 연결된다. 채널들은 2개의 유체 챔버들을 연결할 수 있고, 벽들과 2개의 면으로 이루어진다. 가열 및 냉각을 촉진하기 위하여 유체 챔버의 설계는 부피에 대한 표면적의 비를 최대화하는 것이 좋다. 챔버의 내부 부피는 좋기로는 대략 1 μl 내지 대략 50 μl이다. 용액과 접촉하는 챔버 면 160의 면적은 가열 중 일정한 유체 온도를 보장하기 위하여 열 소자가 대면하는 면적에 해당한다. 유체 챔버의 형태는 열 소자와 어울리도록 선택되고 용액의 유입과 배출을 위하여 선호되는 기하 구조를 제공하도록 선택될 수 있다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 챔버의 부피는, 장치 작동 과정 중 생기는 기포를 위한 공간을 제공하기 위하여 유체 부피보다 클 수 있다. 유체 챔버는, 유체가 모세관 작용으로 채널을 침입하지 않도록 또는 다르게는 통기 메커니즘을 막지 않도록 보장하기 위하여 통기 채널로 이어지는 확장된 익스텐션 (extension)을 가질 수 있다. 통기 채널들이 연통하는 이들 챔버들의 일부분은 유체의 상기 통기 채널로의 침입을 더 감소시키기 위하여 필요에 따라 하나 이상의 비(非)습윤 또는 소수성 면을 포함할 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 각 유체 서브어셈블리는 3개의 적층 플라스틱 시트를 포함하는데, 여기서 한 가지 부재 200은 유체 챔버의 벽들을 형성하고 2개의 다른 면 부재들 210, 220은 면을 형성한 첫번째 것에 적층된다. 면 부재 21-은 필요에 따라 LED 표시기 214를 보기 위한 홀 212를 포함한다. 면 부재 220은 좋기로는 동결건조된 시약들 20, 검출 입자들 130, 및 검출 스트립 어셈블리 230을 포함하고, 좋기로는 접착 심 222를 통하여 PCB 75와 대면하는데, 접착 심은 접착 보더 224를 갖는 멤브레인을 포함할 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 각각의 유체 서브어셈블리는 2개의 플라스틱 부재를 포함할 수 있는데, 여기서 하나의 부재는 벽들과 한 면을 형성하고, 다른 부재는 챔버를 밀봉하고 제2 면을 형성하기 위하여 첫번째 것에 적층된다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 유체 서브어셈블리의 플라스틱 부재들은 공업적 레이저 젯 컷팅 또는 워터-젯 컷팅, 펀치 또는 스탬프 스로세스, 및 사출 성형의 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 유체 챔버 및 채널 벽의 두께는 대략 0.025 mm 내지 대략 1 mm의 범위이다. 이러한 두께는 좋기로는 유체 레이어의 구조적 짜임새 요건과 고온 및 관련된 압력 하에서 닫힌 챔버의 밀봉을 뒷받침하기 위한 요건 두 가지 모두를 만족시킨다. 채널 벽의 두께, 특히 통기구 채널 벽의 두께는 좋기로는 챔버의 두께 미만이고, 대략 0.025 mm 내지 대략 0.25 mm의 범위 내이다. 유입구 및 배출구 채널의 너비는 좋기로는 모세관 현상을 증진시킬 수 있도록 선택된다. 얇은 통기구 채널은 대기 압력까지의 통기에 악영향을 미침이 없이 유체 레이어에 강성을 준다. 유체 레이어의 면을 형성하는 플라스틱은 열 전달을 최대화하기 위하여 벽을 형성하는 플라스틱보다 얇은 것이 좋다. 임의의 열 파열부 170은 온도 제어되는 챔버들의 열 단리에 기여하면서 유체 레이어의 일부 부재들을 가르고 증폭 챔버와 검출 챔버를 둘러싼다.
유체 레이어의 어셈블리에 사용되는 플라스틱, 예컨대 아크릴 및 폴리에스테르는 좋기로는 소수성 물질들을 포함한다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 유체 레이어의 부재들은 습윤성이 강화되도록 (즉, 소수성이 감소하도록) 처리될 수 있다. 이러한 처리는 유체 채널 크기와 더불어 적절한 유체 제어를 보장한다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 트리톤 X-100과 같은 생체적합성 계면활성제가 코팅되지 않은 물질들에 도포될 수 있다. 플라즈마 방전 처리는 유체 접촉 표면의 소수성을 변화시키는 또 다른 임의의 처리이다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 이중면 접착 필름은 유체 레이어의 다양한 부재들을 밀봉하는 데 사용될 수 있다. 접착 필름, 예컨대 접착 심 222 또는 멤브레인 224를 포함하는 것은 3개 부재의 유체 레이어의 경우 내부 부재의 면에, 또는 2개 부재의 유체 레이어의 경우 한 면에 적용된다. 면 부재 220이 다른 레이어에 첨가되기 전에, 유체 레이어의 추가적인 부재들, 예컨대 검출 스트립 어셈블리 230, 검출 입자들 130 및 동결건조된 시약들 20이 포함될 수 있다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 부재들은 암벽을 인가함으로써 적층되어 훌륭한 접착력을 보장할 수 있다. 핵산 증폭 반응의 성능에 부정적으로 영향을 미치는 것으로 알려지거나 밝혀진 첩착제들은 제외되어야 한다. 아크릴계 또는 실리콘계 접착제들은 본 발명에 성공적으로 사용된다. 한 가지 양호한 접착 필름은 Advanced Adhesives Research에 의하여 공급되는 SI7876이다. 장치 작동 중 나타나는 온도에 걸쳐 튼튼한 밀봉을 제공하면서 사용되는 완충액들, 플라스닉과 반응 화학물질들과 화학적으로 상용되는 것으로 밝혀진다면 다른 접착제들도 사용될 수 있다.
도 2 및 3을 참조하면, 통기구 포켓은 좋기로는 구조에 있어서 다른 챔버들과 구별된다. 전술한 바와 같이 유체 레이어의 구축 후, 통기구 포켓은 PCA 레이어 75와 만날 유체 레이어의 측면에서 개방된 면을 갖는다. 통기구 포켓을 형성하기 위하여 추가의 플라스틱 부재가 챔버를 밀봉하기 위하여 적층되는데, 좋기로는 PCA의 통기구 레지스터 70과 인접한 유체 레이어 측면에 적용하기 위한 하나의 접착 면을 갖는 얇은, 열에 불안정한 멤브레인 80을 포함한다. 다른 유사한 필름들이 사용될 수 있으나, 멤브레인 80은 대략 5μm 내지 대략 200 μm 두께의 폴리올레핀을 포함한다. 이 얇은 멤브레인은 통기구 포켓을 밀봉하고 쉽게 뚫리게 하는 양자 모두에 매우 적합하므로, 따라서 통기구 레지스터를 통하여 신속히 온도를 증가시키면서 전류가 흐를 때 대기로 통기된다.
유체 레이어의 추가적 부재
전술한 바와 같이, 최종 적층 및 밀봉 전에 본 발명의 유체 레이어 내에 몇 가지 추가적인 부재들이 포함되는 것이 좋다. 완충액, 염, dNTPs, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 효소, 예컨대 DNA 중합효소 및 역전사 효소를 포함하는 시약들이 장치 어셈블리 전에 펠렛 또는 케익으로 동결건조, 또는 동결-건조될 수 있다. 시약 동결건조는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고 동결된 시약 분주를 가진공 하에서 승화시킴으로써 탈수하는 것을 포함한다. 특정 동결건조보호제 제형, 예컨대 당 (디새커라이드 및 폴리새커라이드) 및 폴리알코올들을 동결 전에 시약에 첨가함으로써, 효소의 활성은 보존되고 재수화율은 증가할 수 있다. 동결건조 시약 펠렛 또는 케익은 표준 방법에 의하여 제조되고, 일단 형성되면 비교적 내구성이 있고 최종 면을 적층하기 이전에 유체 레이어의 특정 챔버 내로 쉽게 위치시킬 수 있다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 검출 마이크로입자들이 유체 레이어의 또 다른 추가적인 부재이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 이들 마이크로입자들은 상기 반응 시약들에 대하여 설명한 대로 동결건조될 수 있다. 다른 실시 상태들에 있어서, 액체 완충액 내의 마이크로입자들은 유체 챔버의 내부 면에 직접 적용될 수 있고 밀봉 전에 건조될 수 있다. 마이크로입자들을 함유하는 액체 완충액은 또한 재수화를 돕는 당이나 폴리알코올을 포함하는 것이 좋다. 건조 이전에 유체 레이어 내로 직접 수성 완충액 중의 마이크로입자들을 포함시키는 것은 제조를 간소화하고 그의 최종 단가를 낮출 수 있으며, 전술한 바와 같이 마이크로입자들과 반응 용액을 적절히 혼합하고, 검출 입자와의 혼성화를 위하여 이중 가닥 핵산 생성물을 변성시키기 위한 두 가지 모두를 위하여 가열 또는 집중된 비등을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 측방 유동 검출 스트립 어셈블리 역시 유체 레이어에 포함된다. 검출 스트립은 하나 이상의 다공성 부재로 이루어지는 멤브레인 어셈블리를 포함하는 것이 좋고, 필요에 따라 흡수 패드, 검출 멤브레인, 계면활성제 패드 및 지지 필름 (backing film)을 포함할 수 있다. 검출 멤브레인은 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리비닐리딘 플루오라이드, 나일론, 전하 변경 나일론, 또는 폴리테트라플루오로에틸렌으로 이루어지고 플라스틱 필름으로 지지될 수 있다. 전술한 바와 같이, 캡쳐 프로브는 인간의 육안으로 시각화될 수 있는 선, 점 또는 임의의 패턴으로 검출 멤브레인 상에 증착 및 비가역적 고정화될 수 있다. 증착되는 올리고뉴클레오티드는 캡쳐 프로브 증착 후 검출 멤브레인의 UV 조사에 의하여 영구적으로 고정화될 수 있다. 계면활성제 패드는 핵산 생성물과 검출 마이크로입자들이 방해받지 않고 진행하도록 하는, 최소한의 핵산 결합 특성 및 유체 머무름 특성을 갖는 다공성 기질을 포함하는 것이 좋을 수 있다. 계면활성제 패드는 유리 섬유, 셀룰로오스 또는 폴리에스테르와 같은 물질들을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 하나 이상의 양친매성 시약을 포함하는 제제는 계면활성제 패드 상에서 건조되어 검출 멤브레인을 통하여 시료의 일정한 이동이 가능하게 할 수 있다. 흡수 패드는 임의의 흡수 물질을 포함할 수 있고 검출 멤브레인 어셈블리를 통한 시료의 위킹 유도를 보조할 수 있다. 접착성 지지 필름, 예컨대 베이스로서 2면 접착 필름을 사용하여, 검출 멤브레인 부재는 첫째로 검출 멤브레인을 위치시킴으로써 조립되고, 다음으로 임의의 흡수 패드 및/또는 계면활성제 패드가 대략 1 mm 내지 대략 2 mm로 중첩되어 상기 검출 멤브레인과 물리적으로 접하게 된다.
전자적 서브어셈블리 레이어
몇 가지 실시 상태에 있어서, 다른 표준 기판 물질 및 두께를 사용할 수 있지만, 인쇄 회로 기판 (PCB)는 표준 0.062 인치 두께 FR4 구리 피복 적층판 물질을 포함한다. 전자적 부재들, 예컨대 레지스터, 써미스터, LED 및 마이크로컨트롤러는 규격화된 표면 실장 부품(SMD)를 포함하는 것이 좋고, 공업적 표준 방법에 따라 위치한다.
다른 실시 상태에 있어서, PCA는 카세트 벽과 통합되고 유연한 플라스틱 회로를 포함할 수 있다. PET 및 폴리이미드와 같은 유연한 회로 물질들이 사용될 수 있다. 유연한 플라스틱 회로망의 사용은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 열 소자 및 온도 센서들은 Soligie, Inc.과 같은 회사들에 의해 개발된 기술을 이용하여 플라스틱 유체 레이어 상에 스크린 인쇄될 수 있다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, PCB의 두께 및 저항성 히터를 둘러싼 부분의 구리의 양과 배치는 유체 레이어의 반응 용액의 열 조정을 위하여 맞춰진다. 이것은 이미 언급한 표준 제조 기법을 이용하여 달성될 수 있다.
예시적 레지스터 히터 어셈블리를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 레지스터는 다른 레지스터들이 사용될 수 있으나 후막 2512 패키지이다. 유체 레이어의 가열 챔버는 챔버에 걸쳐 균일한 가열을 보장하는 레지스트의 그것과 유사한 크기가 선호된다. 이 크기의 단일 레지스터는 유체 레이어 두께가 0.5 mm임을 가정, 대략 15 μl의 용액을 가열하기에 충분하다. 도 3의 모식은 유체 레이어 두께가 0.5 mm임을 가정, 대략 30 μl의 용액을 가열하는 데 충분한 히터를 형성하는 2개의 레지스터 100을 보여준다. 이 경우, 레지스터는 각 40 옴인 것이 좋고, 평행 배치로 배열된다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 온도 센서 110은 써미스터, 예컨대 2512 레지스터 패키지와 유사한 높이를 갖는 0402 NTC 장치를 포함하는 것이 좋다. 하나의 레지스터 또는 2개의 레지스터 셋업의 경우, 서미스터는 레지스터 히터와 인접하여 또는 이들 사이에 정렬되는 것이 좋다; 예컨대, 도 8 참조. 이들 전자 소자들을 가까이 정렬시킴으로써, 이들 사이에 오로지 매우 얇은 공기 갭이라는 결과가 이루어진다. 또한, 유체를 전자 레이어와 조립하기 전에 열 화합물을 도포하는 것은 유체 레이어, 레지스터 및 써미스터 간 우수한 열 접촉을 보장한다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 통기구 레지스터 70은 유사한 레지스터들이 사용될 수 있음에도 후막 0805 패키지이다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, 마이크로컨트롤러는 AVR Atmega32이다. 마이크로컨트롤러는 유체 시스템의 복잡성과 매치되는 것이 좋다. 예컨대, 멀티플렉스로, 개별적인 통기구들과 히터들의 수는 마이크로컨트롤러 I/O 회선 수와 상응한다. 메모리 크기는 프로그램 크기를 수용하도록 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 온-오프 모드로 작동하는 SOT-23 패키지에서 N-채널 MOSFET은 통기구 및 히터 레지스터에의 전류 적하를 조절하기 위하여 사용된다. 조절 신호는 마이크로컨트롤러를 통하여 전송된다. 다른 실시 상태에 있어서, 펄스 폭 변조 방식 및/또는 기타 제어 알고리즘은 더욱 발전된 유체의 열 조절을 위하여 사용될 수 있다. 이것은 통상 마이크로컨트롤러에 의하여 처리되고, 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 추가적인 하드웨어 및/또는 소프트웨어를 필요로 할 수 있다.
최종 장치 어셈블리
유체, 전자 및 하우징 부재의 완성 장치로의 최종 어셈블리는 PCA 열 소자와 챔버들 및/또는 유체 레이어에 존재하는 포켓들 간의 우수한 열 접촉을 보장하기 위하여 유체 레이어(들) 250과 전자 레이어 75의 적층으로 시작하는 것이 좋다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 접착 심 22는 2개의 레이어 모두에 함께 결합하고 편평한 유체 레이어와 PCA 상에 존재하는 지형적으로 올라온 전자 부재들 간의 높이 접촉 (level contact)을 보장한다. 열 접촉을 더 향상시키기 위하여 적층 전 열 화합물 또는 그리스가 열 소자에 위치될 수 있다. 유체 및 전자 레이어의 어셈블리 이후, 플라스틱 보호 하우징이 부착되어 최종 장치라는 결과를 낳을 수 있다.
활용 방법에 따라, 본 발명의 여러 가지 실시 상태들이 가장 유용한 것일 수 있다. 몇 가지 실시 상태는 작은 제어 베이스 유닛이 핵산 증폭 및 검출 시스템을 포함하는 더 작은 일회용 유닛을 작동시키는 장치를 포함한다. 이러한 특정 실시 상태는 개별적인 진단 시험의 비용 저감을 돕는다. 이러한 목적을 위하여 설계된 대표적인 장치를 도 10에 나타내었다. 전술한 바와 같이, 이러한 장치의 전자적 기능은 2 가지 개별적인 서브어셈블리로 나뉘는 것이 좋다. 일회용 서브어셈블리 260은, 유체 시스템 부재들과 직접 상호작용하는 부재들을 포함하는, 핀 커넥터 270 또는 기타 유사한 전자적 커넥터 및 저가의 전자적 부재들, 예컨대 증폭 챔버 열 소자 100, 표지 챔버 열 소자 265, 통기구 열 소자 70, 온도 센서, 예컨대 써미스터 및 임의의 LED 표시기 214를 포함한다. 커넥터 270은 좋기로는 저항성 히터에 전력 및 써미스터(들)로의 신호 라인과 함께 전류를 제공한다. 재활용 가능한 서브어셈블리 또는 베이스 유닛 280은 좋기로는 재활용 가능한 부재들, 예컨대 마이크로컨트롤러, MOSFETs, 스위치, 전원 공급원 또는 전원 잭 275 및/또는 배터리, 임의의 냉각 팬, 임의의 사용자 인터페이스, 및 일회용 서브어셈블리 260의 커넥터 270과 호환되는 커넥터 272를 포함한다. 상기 서브어셈블리들이 커넥터 270 및 272를 통하여 짝을 이루는 경우, 베이스 유닛 280은 좋기로는 실질적으로 수직 또는 거의 수직인 배향으로 일회용 서브어셈블리 260을 지탱한다. 본 발명에서 설명하는 몇 가지 실시 상태에서 실질적으로 수직인 배향이 좋지만, 장치가 경사지게 작동된다면, 특히 특정 경로가 코팅되어 사용되는 용액의 젖음각을 감소시킨다면 유사한 결과가 얻어질 수 있다.
또 다른 실시 상태는 도 11에 나타낸 바와 같이 모든 어셈블리가 일회용인 장치를 포함한다. 이 실시 상태에 있어서, 도 11C에 나타낸 바와 같이, 좋기로는 단자 307을 통하여 장치의 후면에 부착되는 9-볼트 배터리 305에 의하여 전원공급되는 오직 하나의 전자 어셈블리가 있다. 도 11B에 나타낸 바와 같이 마이크로컨트롤러 300, 전력 조건 회로망 302, 및 MOSFETs 310 역시 좋기로는 장치의 후면에 위치하지만, 도 11A에 보여지는 유체 레이어와 접하는 반대 면이 증폭 챔버 열 소자 100, 표지 챔버 열 소자 265, 통기구 열 소자 70 및 온도 센서를 포함한다. 도 11에 그려진 장치는 멀티플렉스 활용을 위하여 평행하게 2개의 반응들 증폭 및 표지 반응을 수행하는 데 필요로 되는 챔버들 및 다른 부재들을 포함하도록 설계된다. 이러한 특정 실시 상태는 시험이 원거리 지점에서 수행되는 활용 태양에 대하여 이상적이다. 상기 장치는 택일적으로 월 어댑터 또는 다른 배터리 또는 충분한 용량을 갖는 배터리들에 의하여 전원 공급될 수 있다.
완전한 시료-결과 분자적 시험을 제공하기 위하여, 본 발명의 상기 실시 상태들 중 하나는, 결과물로서 핵산을 채널 325를 통하여 시료 챔버 10에 제공하는 시료 준비 시스템 320과 접할 수 있다. 이것은 제목 "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control"인 국제 공보 WO 2009/137059 A1에 기재된 시료 준비 기술을 이용하여 증명되었다. 결과되어진 통합 장치의 한 가지 실시 상태가 도 12에 나타나 있다.
다수의 벽 부재들을 갖는 유체 서브어셈블리
예컨대, 도 7에 나타낸 바와 같은 몇 가지 실시 상태에 있어서, 유체 서브어셈블리는 3개의 적층된 플라스틱 시트를 포함할 수 있고, 여기서 하나의 시트는 유체 챔버의 벽을 형성하고 다른 2개의 부재는 면들을 형성하기 위하여 첫번째 것에 적층된다. 다른 실시 상태에 있어서, 유체 서브어셈블리는 2개의 플라스틱 부재들을 포함할 수 있고, 여기서 하나의 부재는 벽과 하나의 면을 형성하고, 다른 부재는 챔버를 밀봉하고 두번째 면을 형성하기 위하여 첫번째 것에 적층된다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 유체 서브어셈블리의 플라스틱 부재들은 공업적 레이저 젯 컷팅, 또는 워터 젯 컷팅, 펀치 또는 스탬프 공정, 및 사출 성형의 방법으로 제조될 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 유체 서브어셈블리는 적층된 레이어들을 포함할 수 있어서, 검출 챔버가 증폭 및 표지 챔버들을 포함하는 레이어 앞에 배치되도록 장치 중에서 별개의 레이어에 위치한다. 이러한 물리적인 배치는 장치의 너비를 감소시키는 동시에 추가적인 기능성 역시 부여한다. 구체적으로, 이러한 실시 상태는 검출 챔버 내에 검출 스트립을 위치시킴으로써 표지 챔버 위로 위치하게 하는데, 표지 챔버 아래의 열 소자가 검출 챔버에서 온도 제어를 위하여 (분석의 검출 단계 중에) 사용될 수 있도록 하여 준다. 검출 챔버 온도의 제어는 검출 스트립에 대한 혼성화 중 높은 온도의 사용을 가능하게 한다. 혼성화 기반 검출 중에 온도 매개 혼성화 스트린젠시의 조절은, 예컨대 밀접한 관련 핵산 서열 (예컨대, 단일 뉴클레오티드 다형)을 구별하는 데 있어서 유용한 혼성화 특이도 향상을 달성하는 데 사용될 수 있다.
도 13은 바로 앞서 설명한 것과 같은 본 발명 실시 상태의 멀티레이어 유체 카세트 어셈블리 290의 부재들을 보여준다. 첫번째 벽 부재 300은 검출 스트립 305를 수용하기 위한 검출 챔버 302와 시료 챔버 일부 304를 포함한다. 두번째 벽 부재 310은 시료 챔버의 또 다른 일부 306, 증폭 챔버 314, 표지 챔버 316, 통기구 포켓 318 및 대응하는 채널들을 포함한다. 3개의 면 부재들 330, 335, 340은 챔버, 포켓 및 채널을 형성한다. 면 부재 335는 벽 부재 300의 뒷면 및 벽 부재 310의 전면으로서 작용하고, 시료 챔버 형성을 위한 개구 (opening) 303과 표지 챔버 316으로부터 검출 챔버 302로 이동하는 표지된 표적 핵산을 포함하는 용액의 개구 345를 포함한다. 부재 레이어들은 좋기로는 실리콘 전사 접착제로 서로 결합된다. 내부 표면은 좋기로는 습윤도를 제어하기 위하여 처리된다. 제조 중에 좋기로는 시약들, 검출 스트립 305를 포함하는 측방 유동 어셈블리, 및 열 가용성의 열가소성 통기구 밸브 320이 첨가된다. 접착성 멤브레인은 좋기로는 통기구 포켓 전체를 밀봉한다.
도 14는 도 13의 유체 레이어 290을 포함하는 일회용 분석 카트리지 350의 분해도를 보여준다. 분석 카트리지 350은 전면 쉘, 마이크로유체 카세트 어셈블리 290, 본딩 테이프 360, 회로 기판 370, 및 후면 쉘 380을 포함한다. 도 15는 도킹 스테이션 400에 위치한 일회용 PCA/유체 어셈블리 350의 도면이다. 시료는 시료구 390을 통하여 시료 챔버로 첨가된다. 도킹 스테이션은 좋기로는 전자 제어부와 전원 공급부를 포함하고, 분석에 필요로 되는 전자적 프로세스를 개시하기 위한 버튼을 포함할 수 있다.
실시예 1: 감귤류의 칸디다투스 리베리박터 감염 진단을 위한 표적 핵산의 증폭 및 검출 방법
감귤녹화의 병인인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재에 대하여 감귤 잎 조직을 시험하기 위하여 일회용 부재가 재활용 가능한 도크와 접한 본 발명의 한 가지 실시 상태를 이용하였다.
전술한 바와 같이 일부가 일회용인 장치가 만들어졌다. 재활용 가능 유닛은 표준 1.5 oz 구리 피복 PCB를 포함하였다. 회로 부재들은 ATmega328 마이크로컨트롤러, 0.5 Amp N-채널 MOSFETs, SMD 레지스터, 및 전원 조건 부재들을 포함하였다. 스테레오리소그래피 (SLA) 형성 플라스틱 쉘이 기판 및 푸쉬 스위치를 덮었다. 암형 핀 커넥터를 최상 표면에 실장하여 일회용 PCA로 수직 연결되도록 하였다. 이 일회용 PCA는 후막 레지스터, 0402 써미스터 및 0603 LED와 함께 유사한 PCB를 포함하였다. 라이트 앵글형 수형 핀 커넥터를 기판의 한쪽 끝에 위치시켜 재활용 가능 유닛의 암형 소켓에 삽입될 때 수직 배향이 가능하도록 하였다.
유체 레이어는 2개의 면 부재들, 벽 부재, 및 얇은 멤브레인을 포함하였다. 면 부재들은 0.004 ″폴리에스테르 (PET)로 이루어졌다. 벽 부재는 Advanced Adhesives, Inc.의 0.002 ″실리콘 전자 필름과 적층되는 0.5 mm 아크릴로 만들어졌다. 통기구 멤브레인은 3M, Inc.의 0.004 ″용매 저항성 아크릴 접착제를 포함하는 0.0005 ″폴리올레핀으로 만들어졌다. 각각의 부재들은 Universal Laser Systems, Inc. VersaLaser 3.5 레이저 컷터를 이용하여 절단되어 성형되었다. 조립 전에, 멤브레인 부재를 제외한 모든 레이저 컷 플라스틱 유체 부재들을 100 mM 수산화나트륨 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트를 함유하는 소니케이터 수조에 넣고, 30 분간 소니케이션하여 핵산 또는 핵산분해효소를 오염시키는 임의의 불순물들을 제거하였다. 세척된 플라스틱 부재들을 최종적으로 핵산분해효소-프리 물로 수세하였다. 5000 psi 압력을 가하여 벽과 면 부재들 (PCA-방향)을 처음으로 적층하였다. 500 mM 슈크로오스 중의 검출 올리고뉴클레오티드 결합 폴리스티렌 비드를 표지 챔버에 증착시키고 진공하에서 건조시켰다. 건조 후, 양면 테이프 조각을 검출 챔버에 넣고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립, Accuflow-P 계면활성제 패드 및 블롯팅지를 이용하여 검출 멤브레인 부재를 조립하여 흡수 패드로 사용하였다. 몇 가지 경우에, 반응 효소들 및 첨가제들로 이루어진 동결건조 비드를 시료 챔버에 첨가하였다. 마지막으로, 유체 레이어를 다른 면 부재로 밀봉하고, 통기구 멤브레인 부재를 적층하여 통기구 포켓을 밀봉하였다. 실리콘 열 화합물 (Radio Shack, Inc.)을 증폭 및 표지 레지스터에 얇게 도포하고, 접착성 심을 이용하여 유체 및 전자 레이어들을 적층하였다.
장치 조립 완료 후, 28 μl의 반응 혼합물을 시료 챔버에 첨가하였다. 실험에 따라, 증폭에 필요한 효소들을 이 반응 혼합물에 액체형 (도 16A)으로 첨가하거나, 이들은 유체 레이어의 시료 챔버 내로 포함되는 동결건조된 케익으로 존재하였다 (도 16B). 두 가지 경우 모두에서, 사용된 핵산 주형은 QIAshredder 및 스핀 컬럼 키트 (Qiagen, Inc.)를 이용하여 감염된 식물 조직으로부터 추출되었다. 프라이머들 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 식물 병인성 박테리아 칸디다스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재 진단을 위한 139 bp 핵산 서열을 증폭시켰다. 400 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM 황산암모늄, 100 mM 염화칼륨, 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하는 미리 제조된 증폭 완충액 (10X)을 이용하여 전매의 증폭 반응 화학을 수행하였다. 20 μL의 각 반응 용액은 하기의 성분을 함유하였다:
9.4 μL 물
2.0 μL 10x 증폭 완충액
2.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨 (2 M)
0.5 μL 염화마그네슘 (100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
0.5 μL dNTPs (10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각 8 μM)
0.5 μL VentR (바깥-) DNA 중합효소 (2 U/ μL)*
0.2 μL Et SSB, 열에 극히 안정한 단일 가닥 결합 단백질 (500 μg/mL)*
2.0 μL의 건강한 C. 리베리박터 또는 감염된 C. 리베리박터 조직으로부터 추출된 DNA (17.2 ng/ μL).
* 용액에 포함시키거나, 동결건조된 효소가 사용되는 경우에는 물로 대체.
증폭 챔버를 통기시키고 증폭 및 검출 프로그램을 개시하는 것은 시작 버튼으로 사용되는 재활용 가능 유닛 상의 푸쉬 스위치를 누름으로써 이루어졌다. 통기 후, 반응 용액은 증폭 챔버로 들어가는데, 여기서 용액을 2 분간 85℃로 가열한 후, 76℃에서 10 초 및 60℃에서 25 초의 사이클 40회를 수행한다. 열 사이클링이 완료된 후 반응은, 마이크로컨트롤러 개시 통기에 의하여 표지 챔버로 흐르게 된다. 표지 챔버는 500 mM 슈크로오스의 존재 하에서 표지 챔버의 내부 한 면에 건조된 청색 염료 폴리스티렌 검출 마이크로스피어를 함유하였다. 염료화 마이크로스피어에 결합된 검출 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 생성물의 센스 가닥과 상보적이었다. 비등 및 폴리스티렌 비드의 격렬한 혼합을 유도하고 이중 가닥 DNA 생성물을 변성시키기 위하여 표지 챔버를 2 분간 105℃로 가열한 후 30 초간 90℃에서 유지시켰다. 가열 후, 표지 챔버의 반응 용액을 2 분간 냉각되도록 두었다. 검출 챔버가 통기되고, 용액이 표지 챔버로부터 검출 챔버 및 검출 스트립 어셈블리 상으로 흐르게 되었다. 3개의 캡쳐 라인이 측방 유동 멤브레인 상에 고정화되었다; 장치의 아래로부터 이들은 다음과 같다: 분석된 어떠한 표적들과도 상보적이지 않은 음성 대조군 올리고뉴클레오티드; 증폭 생성물과 상보적인 캡쳐 프로브; 및 검출 프로브와 상보적인 양성 대조군 올리고뉴클레오티드. 도 16으로부터 명확히 알 수 있듯이, 본 발명은 음성 대조군 라인에 어떠한 검출가능한 크로스-혼성화 없이 표적 핵산을 성공적으로 증폭하고 검출하였다.
사용된 증폭 프라이머의 서열은 다음과 같다:
hyvl_For
ggccgtttta acacaaaaga tgaatatcat agatggggta gtcaa (SEQ ID NO 1)
hyvl_Rev
cggccatttt agataaatca atttgttcta gtttagatac atcaatttgt t (SEQ ID NO 2)
사용된 캡쳐 및 검출 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
캡쳐
tcgtttgagt agctagatcc nnnnnnnnnn nt (SEQ ID NO 3)
검출
/5AmMC12/ aattgatgga tgacgtgata gtttacgacc aacatctt/3Phos/ (SEQ ID NO 4)
증폭 프로세스에 관한 더 온전한 설명은 본 발명에 참조로서 포함된 제목 "Oscillating Amplification Reaction for Nucleic Acids"의 미국 가출원 제61/477,437호에서 찾을 수 있다. 이러한 프로세스는 큰 부피의 용액을 고감도로 사용할 수 있게 하고 열 사이클링을 수행하는 데 능동적인 냉각을 요구하지 않는다. 이 프로세스가 오로지 수동적인 냉각만을 필요로 하기 때문에, 사이클링 온도 범위가 좁아지고 통상적으로 사용되는 PCR에서보다 온도 저항 실패 (looser temperature tolerance)에 의하여 실질적으로 영향을 받지 않으며, 간단한 저항성 열 소자를 사용할 수 있으므로 장치가 압축되고 저렴해 지도록 한다. 또한, 증폭 챔버는 좋기로는 가열 레지스터에 인접한 면에서 편평하기 때문에 우수한 열 커플링이 달성됨으로써 훌륭한 열 접촉을 제공한다. 이러한 열 계면은 열 전도성 접착 화합물을 사용함으로써 강화될 수 있다.
실시예 2: 감귤류의 칸드다투스 리베리박터 감염 진단을 위한 표적 핵산의 단리, 증폭 및 검출 방법
전술한 바와 같이 일부가 일회용인 장치가 만들어졌다. 재활용 가능 유닛은 표준 1.5 oz 구리 피복 PCB를 포함하였다. 회로 부재들은 ATmega328 마이크로컨트롤러, 0.5 Amp N-채널 MOSFETs, SMD 레지스터, 및 전원 조건 부재들을 포함하였다. 스테레오리소그래피 (SLA) 형성 플라스틱 쉘이 기판 및 푸쉬 스위치를 덮는다. 암형 핀 커넥터를 최상 표면에 실장하여 일회용 PCA로 수직 연결되도록 하였다. 이 일회용 PCA는 후막 레지스터, 0402 써미스터 및 0603 LED와 함께 유사한 PCB를 포함하였다. 라이트 앵글형 수형 핀 커넥터를 기판의 한쪽 끝에 위치시켜 재활용 가능 유닛의 암형 소켓에 삽입될 때 수직 배향을 제공하였다.
유체 레이어는 2개의 면 부재들, 벽 부재, 및 얇은 멤브레인을 포함하였다. 면 부재들은 0.004 ″폴리에스테르 (PET)를 포함하였다. 벽 부재는 Advanced Adhesives, Inc.의 0.002 ″실리콘 전자 필름과 적층되는 0.5 mm 아크릴을 포함하였다. 유체 레이어와 시료 준비 서브시스템과의 통합을 제공하기 위하여, 벽 및 면 부재들은, 시료 준비 서브시스템에 적층되는 경우 시료 준비 프로세스의 용리기 도중에 정제된 핵산이 본 발명의 시료 챔버 내로 연통되게 위치하여 개구 및 채널을 제공하도록 제조되었다. 통기구 멤브레인은 3M, Inc.의 0.004 ″용매 저항성 아크릴 접착제를 포함하는 0.0005 ″폴리올레핀으로 만들어졌다. 각각의 부재들은 Universal Laser Systems, Inc. VersaLaser 3.5 레이저 컷터를 이용하여 절단되어 성형되었다. 조립 전에, 멤브레인 부재를 제외한 모든 레이저 컷 플라스틱 유체 부재들을 100 mM 수산화나트륨 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트를 함유하는 소니케이터 수조에 넣고, 30 분간 소니케이션하여 핵산 또는 핵산분해효소를 오염시키는 임의의 불순물들을 제거하였다. 세척된 플라스틱 부재들을 최종적으로 핵산분해효소-프리 물로 수세하였다. 5000 psi 압력을 가하여 벽과 면 부재들 (PCA-방향)을 처음으로 적층하였다. 500 mM 슈크로오스 중의 검출 올리고뉴클레오티드 결합 폴리스티렌 비드를 표지 챔버에 증착시키고 진공하에서 건조시켰다. 건조 후, 양면 테이프 조각을 검출 챔버에 넣고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립, Accuflow-P 계면활성제 패드 및 블롯팅지를 이용하여 검출 멤브레인 부재를 조립하여 흡수 패드로 사용하였다. 몇 가지 경우에, 반응 효소들 및 첨가제들로 이루어진 동결건조 비드를 시료 챔버에 첨가하였다. 마지막으로, 유체 레이어를 다른 면 부재로 밀봉하고, 통기구 멤브레인 부재를 적층하여 통기구 포켓을 밀봉하였다. 실리콘 열 화합물 (Radio Shack, Inc.)을 증폭 및 표지 레지스터에 얇게 도포하고, 접착성 심을 이용하여 유체 및 전자 레이어들을 적층하였다.
본 발명의 유체 레이어가 면하게 되는 시료 준비 서브시스템은 레이저 컷 아크릴 적층판으로 제조되어 상기 서브시스템의 흡수 물질 부재들에 대한 물리적 지지체와 완충액 저장소를 형성하였다. 수동 완충액 교환 구조는, 제목 "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control"의 국제 공보 WO 2009/137059 A1에 개시된 기하학적 구조를 절단하였다. 부직포 나일론이 상기 완충액 교환 물질로서 사용되었다. 핵산 친화 기질로서는 Whatman GF/B 유리 섬유 필터가 사용되었다. 적절한 용량의 흡수 싱크를 제공하기 위하여 면 거즈를 흡수 패드로 사용하였다.
식물 조직, 구체적으로 잎 꼭지 근처 감귤잎 주맥으로부터 채취한 1.5 mm 생검 펀치 4개를 추출 완충액 (4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM 트리스, pH 6.4) 150 μl의 마이크로원심분리 튜브에서 간단히 분쇄하였다. 결과물인 크루드 추출물을 시료 준비 서브시스템의 시료 저장통에 넣고, 바로 200 μl의 수세 완충액 1 (2M 구아니디늄 티어시아네이트, 30% 에탄올, 25 mM 트리스, pH 7.4) 및 800 μl의 수세 완충액 2 (400 mM NaCl, 50% 에탄올, 50 mM 트리스, pH 6.4)를 각각의 저장통에 첨가하였다. 시료 첨가 15 분 후, 시료 준비 부재의 핵산 결합 매트릭스를 아래에 놓인 용리 챔버로 "펀치 (punched)"하고 핵산을 50 μl의 반응 완충액으로 용리하였다. 펀치된 것 (punch-through)과 반응 완충액 주입은 친화 매트릭스 위의 홀을 통하여 1 cc 튜베르큘린 시린지 (니들 없음)를 눌러 수행하였고 매트릭스를 아래에 놓인 용리 챔버로 이동시켰다. 특별히 설계된 유체 레이어에서 용리 챔버는 채널에 의하여 본 발명의 시료 챔버와 연결되었다. 시린지 플런저를 누르면, 캡쳐된 핵산의 용리가 이루어지고, 이것은 상기 채널을 통하여 시료 챔버로 흘렀다.
효소를 제외하고, 용리 완충액은 전매 증폭 기술에 의한 표적 증폭을 위하여 필요한 모든 시약들, 예컨대 프라이머 hyvl_For 및 hyvl_Rev을 함유하였고, 이것은 선택적으로 식물 병인성 박테리아 칸디다스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재 진단을 위한 139 bp 핵산 서열을 증폭시켰다. 증폭 완충액 (10X)는 미리 제조되었고 400 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM 황산암모늄, 100 mM 염화칼륨, 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하였다. 20 μL의 용리 완충액은 하기의 성분을 함유하였다:
12.1 μL 물
2.0 μL 10x 증폭 완충액
2.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨 (2 M)
0.5 μL 염화마그네슘 (100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
0.5 μL dNTPs (10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각 8 μM)
장치에 에너지를 가하기 전, 하기의 효소들을 시료 챔버의 용리된 핵산 시료에 첨가하고 겔-로딩 피펫 팁을 이용하여 간단히 혼합하였다.
1.0 μL VentR (바깥-) DNA 중합효소 (2 U/ μL)
0.4 μL Et SSB, 열에 극히 안정한 단일 가닥 결합 단백질 (500 μg/mL)
증폭 챔버를 통기시키고 증폭 및 검출 프로그램을 개시하는 것은 시작 버튼으로 사용되는 재활용 가능 유닛 상의 푸쉬 스위치를 누름으로써 이루어졌다. 통기 후, 반응 용액은 증폭 챔버로 들어가는데, 여기서 용액을 2 분간 85℃로 가열한 후, 76℃에서 10 초 및 60℃에서 25 초의 사이클 40회를 수행한다. 열 사이클링이 완료된 후 반응은, 마이크로컨트롤러 개시 통기에 의하여 표지 챔버로 흐르게 된다. 표지 챔버는 500 mM 슈크로오스의 존재 하에서 표지 챔버의 내부 한 면에 건조된 청색 염료 폴리스티렌 검출 마이크로스피어를 함유하였다. 염료화 마이크로스피어에 결합된 검출 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 생성물의 센스 가닥과 상보적이었다. 비등 및 폴리스티렌 비드의 격렬한 혼합을 유도하고 이중 가닥 DNA 생성물을 변성시키기 위하여 표지 챔버를 2 분간 105℃로 가열한 후 30 초간 90℃에서 유지시켰다. 가열 후, 표지 챔버의 반응 용액을 2 분간 냉각되도록 두었다. 검출 챔버가 통기되고, 용액이 표지 챔버로부터 검출 챔버 및 검출 스트립 어셈블리 상으로 흐르게 되었다. 3개의 캡쳐 라인이 측방 유동 멤브레인 상에 고정화되었다; 장치의 아래로부터 이들은 다음과 같다: 분석된 어떠한 표적들과도 상보적이지 않은 음성 대조군 올리고뉴클레오티드; 증폭 생성물과 상보적인 캡쳐 프로브; 및 검출 프로브와 상보적인 양성 대조군 올리고뉴클레오티드. 도 14으로부터 명확히 알 수 있듯이, 완전히 통합된 장치는 상기 표적 핵산의 성공적인 핵산 단리, 증폭 및 검출이라는 결과를 낳았다.
실시예 3: 감귤류의 칸디다투스 리베리박터 감염 진단을 위한 표적 핵산의 증폭 및 검출 방법
감귤녹화의 병인인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재에 대하여 크루드 감귤 잎 조직 추출물을 시험하기 위하여 전술한 핵산 단리 단계 없이 일회용 부재가 재활용 가능한 도크와 접한 본 발명의 한 가지 실시 상태를 이용하였다.
전술한 바와 같이 일부가 일회용인 장치가 만들어졌다. 재활용 가능 유닛은 표준 1.5 oz 구리 피복 PCB를 포함하였다. 회로 부재들은 ATmega328 마이크로컨트롤러, 0.5 Amp N-채널 MOSFETs, SMD 레지스터, 및 전원 조건 부재들을 포함하였다. 스테레오리소그래피 (SLA) 형성 플라스틱 쉘이 기판 및 푸쉬 스위치를 덮었다. 암형 핀 커넥터를 최상 표면에 실장하여 일회용 PCA로 수직 연결되도록 하였다. 이 일회용 PCA는 후막 레지스터, 0402 써미스터 및 0603 LED와 함께 유사한 PCB를 포함하였다. 라이트 앵글형 수형 핀 커넥터를 기판의 한쪽 끝에 위치시켜 재활용 가능 유닛의 암형 소켓에 삽입될 때 수직 배향이 가능하도록 하였다.
유체 레이어는 2개의 면 부재들, 벽 부재, 및 얇은 멤브레인을 포함하였다. 면 부재들은 0.004 ″폴리에스테르로 이루어졌다. 벽 부재는 Advanced Adhesives, Inc.의 0.002 ″실리콘 전자 필름과 적층되는 0.5 mm 아크릴로 만들어졌다. 통기구 멤브레인은 3M, Inc.의 0.004 ″용매 저항성 아크릴 접착제를 포함하는 0.0005 ″폴리올레핀을 포함하였다. 각각의 부재들은 Universal Laser Systems, Inc. VersaLaser 3.5 레이저 컷터를 이용하여 절단되어 성형되었다. 조립 전에, 멤브레인 부재를 제외한 모든 레이저 컷 플라스틱 유체 부재들을 100 mM 수산화나트륨 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트를 함유하는 소니케이터 수조에 넣고, 30 분간 소니케이션하여 핵산 또는 핵산분해효소를 오염시키는 임의의 불순물들을 제거하였다. 세척된 플라스틱 부재들을 최종적으로 핵산분해효소-프리 물로 수세하였다. 5000 psi 압력을 가하여 벽과 면 부재들 (PCA-방향)을 처음으로 적층하였다. 500 mM 슈크로오스 중의 검출 올리고뉴클레오티드 결합 폴리스티렌 비드를 표지 챔버에 증착시키고 진공하에서 건조시켰다. 건조 후, 양면 테이프 조각을 검출 챔버에 넣고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립, Accuflow-P 계면활성제 패드 및 블롯팅지를 이용하여 검출 멤브레인 부재를 조립하여 흡수 패드로 사용하였다. 몇 가지 경우에, 반응 효소들 및 첨가제들로 이루어진 동결건조 비드를 시료 챔버에 첨가하였다. 마지막으로, 유체 레이어를 다른 면 부재로 밀봉하고, 통기구 멤브레인 부재를 적층하여 통기구 포켓을 밀봉하였다. 실리콘 열 화합물 (Radio Shack, Inc.)을 증폭 및 표지 레지스터에 얇게 도포하고, 접착성 심을 이용하여 유체 및 전자 레이어들을 적층하였다.
장치 조립 완료 후, 40 μl의 반응 혼합물을 시료 챔버에 첨가하였다. 실험에 따라, 증폭에 필요한 효소들은 이 반응 혼합물에 유체 레이어의 시료 챔버 내로 포함되는 액체형이나, 동결건조된 케익으로 존재하였다. 두 가지 경우 모두에서, 분석된 시료는 500 μl의 핵산분해효소 프리 물에서 1.5 mm 직경의 5개 생검 펀치들을 부수어 제조한 4 μl의 크루드 감귤 조직 추출물로 이루어졌다. 프라이머들 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 식물 병인성 박테리아 칸디다스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재 진단을 위한 139 bp 핵산 서열을 증폭시켰다. 전매의 증폭 반응 화학을 수행하였다. 증폭 완충액 (10X)은 미리 제조되었고 400 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM 황산암모늄, 100 mM 염화칼륨, 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하였다. 40 μL의 각 반응 용액은 하기의 성분을 함유하였다:
18.8 μL 물
4.0 μL 10x 증폭 완충액
4.0 μL DMSO
0.8 μL 염화칼륨 (2 M)
1.0 μL 염화마그네슘 (100 mM)
1.0 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
1.0 μL dNTPs (10 mM)
4.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각 8 μM)
1.0 μL VentR (바깥-) DNA 중합효소 (2 U/ μL)*
0.4 μL Et SSB, 열에 극히 안정한 단일 가닥 결합 단백질 (500 μg/mL)*
500 μl의 핵산분해효소 프리 물에, 5개의 생검 펀치 (건강한 감귤 나무 또는 C. 리베리박터 감염된 감귤 나무의 감귤 잎 꼭지 또는 잎 꼭지에 인접한 주맥으로부터 취한 1.5 mm 직경의 것) 또는 ~4 mm 길이의 잎 꼭지 조직을 간단히 부수어 만든 감귤 조직 추출물 4.0 μl
* 용액에 포함시키거나, 동결건조된 효소가 사용되는 경우에는 물로 대체.
증폭 챔버를 통기시키고 증폭 및 검출 프로그램을 개시하는 것은 시작 버튼으로 사용되는 재활용 가능 유닛 상의 푸쉬 스위치를 누름으로써 이루어졌다. 통기 후, 반응 용액은 증폭 챔버로 들어가는데, 여기서 용액을 2 분간 85℃로 가열한 후, 76℃에서 10 초 및 60℃에서 25 초의 사이클 40회를 수행한다. 열 사이클링이 완료된 후 반응은, 마이크로컨트롤러 개시 통기에 의하여 표지 챔버로 흐르게 된다. 표지 챔버는 500 mM 슈크로오스의 존재 하에서 표지 챔버의 내부 한 면에 건조된 청색 염료 폴리스티렌 검출 마이크로스피어를 함유하였다. 염료화 마이크로스피어에 결합된 검출 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 생성물의 센스 가닥과 상보적이었다. 비등 및 폴리스티렌 비드의 격렬한 혼합을 유도하고 이중 가닥 DNA 생성물을 변성시키기 위하여 표지 챔버를 2 분간 105℃로 가열한 후 30 초간 90℃에서 유지시켰다. 가열 후, 표지 챔버의 반응 용액을 2 분간 냉각되도록 두었다. 검출 챔버가 통기되고, 용액이 표지 챔버로부터 검출 챔버 및 검출 스트립 어셈블리 상으로 흐르게 되었다. 3개의 캡쳐 라인이 측방 유동 멤브레인 상에 고정화되었다; 장치의 아래로부터 이들은 다음과 같다: 분석된 어떠한 표적들과도 상보적이지 않은 음성 대조군 올리고뉴클레오티드; 증폭 생성물과 상보적인 캡쳐 프로브; 및 검출 프로브와 상보적인 양성 대조군 올리고뉴클레오티드. 본 발명은 검출 스트립의 음성 대조군 라인에 어떠한 검출가능한 크로스-혼성화 없이 표적 핵산을 성공적으로 증폭하고 검출하였다.
실시예 4: 아시안 감귤 사일리드 디아포리나 씨트리 메뚜기 ( Asian Citrus Psyllid Diaphorina citri Kuwayama )에서 칸디다투스 리베리박터의 검출을 위한 표적 핵산 증폭 및 검출 방법
감귤녹화의 병인인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재에 대하여 디아포리나 씨트리 메뚜기로부터 준비된 크루드 곤충 전체의 추출물을 시험하기 위하여 전술한 핵산 단리 단계 없이 일회용 부재가 재활용 가능한 도크와 접한 본 발명의 한 가지 실시 상태를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 이용하였다. 몇 가지 경우에, 반응 효소들 및 첨가제들로 이루어진 동결건조 비드를 시료 챔버에 첨가하였다.
장치 조립 완료 후, 40 μl의 반응 혼합물을 시료 챔버에 첨가하였다. 실험에 따라, 증폭에 필요한 효소들은 이 반응 혼합물에 유체 레이어의 시료 챔버 내로 포함되는 액체형이나, 동결건조된 케익으로 존재하였다. 두 가지 경우 모두에서, 시료는 500 μl의 핵산분해효소 프리 물에서 살아있는 디아포리나 씨트리 메뚜기 5마리 전체를 부수어 제조한 4 μl의 용액으로 이루어졌다. 프라이머들 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 식물 병인성 박테리아 칸디다스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재 진단을 위한 139 bp 핵산 서열을 증폭시켰다. 전매의 증폭 반응 화학을 수행하였다. 증폭 완충액 (10X)은 미리 제조되었고 400 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM 황산암모늄, 100 mM 염화칼륨, 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하였다. 40 μL의 각 반응 용액은 하기의 성분을 함유하였다:
18.8 μL 물
4.0 μL 10x 증폭 완충액
4.0 μL DMSO
0.8 μL 염화칼륨 (2 M)
1.0 μL 염화마그네슘 (100 mM)
1.0 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
1.0 μL dNTPs (10 mM)
4.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각 8 μM)
1.0 μL VentR (바깥-) DNA 중합효소 (2 U/ μL)*
0.4 μL Et SSB, 열에 극히 안정한 단일 가닥 결합 단백질 (500 μg/mL)*
500 μl의 핵산분해효소 프리 물에, 5 마리의 곤충 전체를 간단히 부수어 만든 전체 디아포리나 씨트리 메뚜기 추출물 4.0 μl
* 용액에 포함시키거나, 동결건조된 효소가 사용되는 경우에는 물로 대체.
증폭 챔버를 통기시키고 증폭 및 검출 프로그램을 개시하는 것은 시작 버튼으로 사용되는 재활용 가능 유닛 상의 푸쉬 스위치를 누름으로써 이루어졌다. 통기 후, 반응 용액은 증폭 챔버로 들어가는데, 여기서 용액을 2 분간 85℃로 가열한 후, 76℃에서 10 초 및 60℃에서 25 초의 사이클 40회를 수행한다. 열 사이클링이 완료된 후 반응은, 마이크로컨트롤러 개시 통기에 의하여 표지 챔버로 흐르게 된다. 표지 챔버는 500 mM 슈크로오스의 존재 하에서 표지 챔버의 내부 한 면에 건조된 청색 염료 폴리스티렌 검출 마이크로스피어를 함유하였다. 염료화 마이크로스피어에 결합된 검출 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 생성물의 센스 가닥과 상보적이었다. 비등 및 폴리스티렌 비드의 격렬한 혼합을 유도하고 이중 가닥 DNA 생성물을 변성시키기 위하여 표지 챔버를 2 분간 105℃로 가열한 후 30 초간 90℃에서 유지시켰다. 가열 후, 표지 챔버의 반응 용액을 2 분간 냉각되도록 두었다. 검출 챔버가 통기되고, 용액이 표지 챔버로부터 검출 챔버 및 검출 스트립 어셈블리 상으로 흐르게 되었다. 3개의 캡쳐 라인이 측방 유동 멤브레인 상에 고정화되었다; 장치의 아래로부터 이들은 다음과 같다: 분석된 어떠한 표적들과도 상보적이지 않은 음성 대조군 올리고뉴클레오티드; 증폭 생성물과 상보적인 캡쳐 프로브; 및 검출 프로브와 상보적인 양성 대조군 올리고뉴클레오티드. 본 발명은 검출 스트립의 음성 대조군 라인에 어떠한 검출가능한 크로스-혼성화 없이 표적 핵산을 성공적으로 증폭하고 검출하였다.
실시예 5: 페리윙클 ( 카타란서스 로세우스 ( Catharanthus roseus ))에서 칸디 다투스 리베리박터의 검출을 위한 표적 핵산의 증폭 및 검출 방법
감귤녹화의 병인인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재에 대하여 크루드 페리윙클 (카타란서스 로세우스) 조직 추출물을 시험하기 위하여 전술한 핵산 단리 단계 없이 일회용 부재가 재활용 가능한 도크와 접한 본 발명의 한 가지 실시 상태를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 이용하였다. 몇 가지 경우에, 반응 효소들 및 첨가제들로 이루어진 동결건조 비드를 시료 챔버에 첨가하였다.
장치 조립 완료 후, 40 μl의 반응 혼합물을 시료 챔버에 첨가하였다. 실험에 따라, 증폭에 필요한 효소들은 이 반응 혼합물에 유체 레이어의 시료 챔버 내로 포함되는 액체형이나, 동결건조된 케익으로 존재하였다. 두 가지 경우 모두에서, 시료는 500 μl의 핵산분해효소 프리 물에서 각각 1.5 mm 직경의 생검 펀치 5개를 부수어 제조한 4 μl의 용액으로 이루어졌다. 생검 펀치는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 감염되거나 감염되지 않은 페리윙클 (카타란서스 로세우스)로부터 얻어졌다. 프라이머들 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 식물 병인성 박테리아 칸디다스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재 진단을 위한 139 bp 핵산 서열을 증폭시켰다. 전매의 증폭 반응 화학을 수행하였다. 증폭 완충액 (10X)은 미리 제조되었고 400 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM 황산암모늄, 100 mM 염화칼륨, 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하였다. 40 μL의 각 반응 용액은 하기의 성분을 함유하였다:
18.8 μL 물
4.0 μL 10x 증폭 완충액
4.0 μL DMSO
0.8 μL 염화칼륨 (2 M)
1.0 μL 염화마그네슘 (100 mM)
1.0 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
1.0 μL dNTPs (10 mM)
4.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각 8 μM)
1.0 μL VentR (바깥-) DNA 중합효소 (2 U/ μL)*
0.4 μL Et SSB, 열에 극히 안정한 단일 가닥 결합 단백질 (500 μg/mL)*
500 μl의 핵산분해효소 프리 물에, 5개의 1.5 mm 직경의 생검 펀치를 간단히 부수어 만든 페리윙클 조직 추출물 4.0 μl
* 용액에 포함시키거나, 동결건조된 효소가 사용되는 경우에는 물로 대체.
증폭 챔버를 통기시키고 증폭 및 검출 프로그램을 개시하는 것은 시작 버튼으로 사용되는 재활용 가능 유닛 상의 푸쉬 스위치를 누름으로써 이루어졌다. 통기 후, 반응 용액은 증폭 챔버로 들어가는데, 여기서 용액을 2 분간 85℃로 가열한 후, 76℃에서 10 초 및 60℃에서 25 초의 사이클 40회를 수행한다. 열 사이클링이 완료된 후 반응은, 마이크로컨트롤러 개시 통기에 의하여 표지 챔버로 흐르게 된다. 표지 챔버는 500 mM 슈크로오스의 존재 하에서 표지 챔버의 내부 한 면에 건조된 청색 염료 폴리스티렌 검출 마이크로스피어를 함유하였다. 염료화 마이크로스피어에 결합된 검출 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 생성물의 센스 가닥과 상보적이었다. 비등 및 폴리스티렌 비드의 격렬한 혼합을 유도하고 이중 가닥 DNA 생성물을 변성시키기 위하여 표지 챔버를 2 분간 105℃로 가열한 후 30 초간 90℃에서 유지시켰다. 가열 후, 표지 챔버의 반응 용액을 2 분간 냉각되도록 두었다. 검출 챔버가 통기되고, 용액이 표지 챔버로부터 검출 챔버 및 검출 스트립 어셈블리 상으로 흐르게 되었다. 3개의 캡쳐 라인이 측방 유동 멤브레인 상에 고정화되었다; 장치의 아래로부터 이들은 다음과 같다: 분석된 어떠한 표적들과도 상보적이지 않은 음성 대조군 올리고뉴클레오티드; 증폭 생성물과 상보적인 캡쳐 프로브; 및 검출 프로브와 상보적인 양성 대조군 올리고뉴클레오티드. 본 발명은 검출 스트립의 음성 대조군 라인에 어떠한 검출가능한 크로스-혼성화 없이 표적 핵산을 성공적으로 증폭하고 검출하였다.
실시예 6: 토사자 ( dodder )( 쿠스쿠타 펜타고나 ( Cuscuta pentagona ))에서 칸 디다투스 리베리박터 아시아티쿠스의 검출을 위한 표적 핵산의 증폭 및 검출 방법
감귤녹화의 병인인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재에 대하여 크루드 토사자 (쿠스쿠타 펜타고나) 조직 추출물을 시험하기 위하여 전술한 핵산 단리 단계 없이 일회용 부재가 재활용 가능한 도크와 접한 본 발명의 한 가지 실시 상태를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 이용하였다. 몇 가지 경우에, 반응 효소들 및 첨가제들로 이루어진 동결건조 비드를 시료 챔버에 첨가하였다.
장치 조립 완료 후, 40 μl의 반응 혼합물을 시료 챔버에 첨가하였다. 실험에 따라, 증폭에 필요한 효소들은 이 반응 혼합물에 유체 레이어의 시료 챔버 내로 포함되는 액체형이나, 동결건조된 케익으로 존재하였다. 두 가지 경우 모두에서, 시료는 500 μl의 핵산분해효소 프리 물에서 1 cm 길이의 토사자 (쿠스쿠타 펜타고나) 덩굴을 부수어 제조한 4 μl의 용액으로 이루어졌다. 프라이머들 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 식물 병인성 박테리아 칸디다스 리베리박터 아시아티쿠스의 존재 진단을 위한 139 bp 핵산 서열을 증폭시켰다. 전매의 증폭 반응 화학을 수행하였다. 증폭 완충액 (10X)은 미리 제조되었고 400 mM Tris-HCl (pH 8.4), 10 mM 황산암모늄, 100 mM 염화칼륨, 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하였다. 40 μL의 각 반응 용액은 하기의 성분을 함유하였다:
18.8 μL 물
4.0 μL 10x 증폭 완충액
4.0 μL DMSO
0.8 μL 염화칼륨 (2 M)
1.0 μL 염화마그네슘 (100 mM)
1.0 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
1.0 μL dNTPs (10 mM)
4.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각 8 μM)
1.0 μL VentR (바깥-) DNA 중합효소 (2 U/ μL)*
0.4 μL Et SSB, 열에 극히 안정한 단일 가닥 결합 단백질 (500 μg/mL)*
500 μl의 핵산분해효소 프리 물에, 1 cm 길이의 덩굴을 간단히 부수어 만든 쿠스쿠타 펜타고나 추출물 4.0 μl
* 용액에 포함시키거나, 동결건조된 효소가 사용되는 경우에는 물로 대체.
본 발명을 개시된 실시 상태를 참조하여 특히 상세히 기술하였으나, 다른 실시 상태들이 동일한 결과를 달성할 수 있다. 본 발명에 대한 변형 및 변경은 이 기술 분야의 숙련자에게 자명할 것이고, 본 발명은 이러한 모든 변경과 균등한 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 앞서 인용된 모든 특허와 간행물들의 전체 기재는 참조로서 본 발명에 포함된다.
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Claims (17)

  1. 표적 핵산을 검출하기 위한 일회용 플랫폼으로서, 상기 일회용 플랫폼은
    표적 핵산을 포함하는 시료를 수신하기 위한 시료 챔버;
    제1 채널을 통하여 상기 시료 챔버로 연결되고 제2 채널을 통하여 제1 통기구 포켓 (vent pocket)으로 연결되는 증폭 챔버;
    제3 채널을 통하여 상기 증폭 챔버와 연결되고 제4 채널을 통하여 제2 통기구 포켓으로 연결되는 표지 챔버;
    제5 채널을 통하여 상기 표지 챔버로 연결되고 제6 채널을 통하여 제3 통기구 포켓으로 연결되는 검출 서브시스템;
    상기 각각의 통기구 포켓들과 인접하여 위치하는 다수의 저항성 열 소자들; 및
    상기 저항성 열 소자들 중 하나와 인접하여 위치하는 하나 이상의 온도 측정 장치;
    를 포함하고, 상기 각각의 통기구 포켓들은 상기 저항성 열 소자들 중 하나와 인접하여 위치하는 열에 불안정한 멤브레인에 의하여 외기로부터 밀봉된 일회용 플랫폼.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료 챔버의 유입구와 직접 유체 연통된 배출구를 포함하는 시료 준비단을 더 포함하는 것인 일회용 플랫폼.
  3. 제1항에 있어서, 상기 증폭 챔버와 열 접촉하여 저항성 열 소자와의 계면을 형성하는 상기 증폭 챔버의 표면의 크기는, 상기 저항성 열 소자와 열 접촉하여 상기 증폭 챔버와 계면을 형성하는 상기 저항성 열 소자의 표면의 크기와 적어도 동일한 것인 일회용 플랫폼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 증폭 챔버는 수동적으로 냉각되는 것인 일회용 플랫폼.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 증폭 챔버는 증폭 용액을 함유하거나, 또는
    상기 시료 챔버는 액체의 증폭 시약 혼합물 또는 동결건조된 증폭 시약 혼합물을 포함하거나, 또는
    상기 표지 챔버는 검출 입자들을 포함하는 것인 일회용 플랫폼.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표지 챔버는 상기 표지 챔버와 인접하여 위치하는 저항성 열 소자들 중 하나를 이용하여 가열될 수 있는 것인 일회용 플랫폼.
  7. 제1항에 있어서, 상기 검출 서브시스템은, 검출 입자들을 포함하지 않는 측방 유동 스트립을 포함하는 것인 일회용 플랫폼.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 챔버들, 상기 채널들 및 상기 통기구 포켓들은 유체 어셈블리 레이어 상에 위치하고, 전자 소자들은 인쇄 회로 기판을 포함하는 분리된 레이어 상에 존재하며, 상기 분리된 레이어는 상기 유체 어셈블리 레이어와 결합된 것인 일회용 플랫폼.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출 서브시스템은, 상기 유체 어셈블리 레이어 또는 제2 유체 어셈블리 레이어 상에 위치하는 것인 일회용 플랫폼.
  10. 제1항에 있어서, 상기 챔버들 중 하나 이상의 부피는 1 마이크로리터 내지 50 마이크로리터인 것인 일회용 플랫폼.
  11. 제1항에 있어서, 외부 장비가 아니면서 일회용 플랫폼을 수직 배향 또는 경사진 배향으로 유지하는 베이스 유닛과, 상기 일회용 플랫폼을 도킹시키기 위한 커넥터를 더 포함하는 것인 일회용 플랫폼.
  12. 표적 핵산을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    일회용 플랫폼의 시료 챔버에 표적 핵산을 포함하는 시료를 배치시키는 단계;
    상기 일회용 플랫폼을 수직으로 또는 경사지게 배향시키는 단계;
    상기 시료를, 액체 증폭 시약 혼합물 또는 동결건조된 증폭 시약 혼합물과 반응시키는 단계;
    증폭 챔버와 연결된 제1 통기구 포켓을 외기로 개방함으로써 상기 반응된 시료가 상기 증폭 챔버로 흐르는 것을 가능하게 하는 단계;
    상기 증폭 챔버에서 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계;
    표지 챔버와 연결된 제2 통기구 포켓을 외기로 개방함으로써 상기 증폭된 표적 핵산이 상기 표지 챔버로 흐르는 것을 가능하게 하는 단계;
    상기 표지 챔버 내의 검출 입자들을 사용하여 상기 증폭된 표적 핵산을 표지하는 단계;
    검출 서브시스템과 연결된 제3 통기구 포켓을 외기로 개방함으로써 상기 표지된 표적 핵산이 상기 검출 서브시스템으로 흐르는 것을 가능하게 하는 단계; 및
    상기 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 증폭 챔버에서 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계는, 상기 증폭 챔버에 인접하여 상기 일회용 플랫폼 내에 위치하는 저항성 열 소자를 이용하여 상기 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 증폭 챔버에서 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계는, 상기 증폭 챔버를 수동으로 냉각시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 증폭된 표적 핵산을 표지하는 단계는, 상기 표지 챔버에 인접하여 상기 일회용 플랫폼 내에 위치하는 저항성 열 소자를 이용하여 상기 표지 단계 중에 상기 표지 챔버를 가열하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 검출 서브시스템은 검출 입자들을 포함하지 않는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 외부 장비가 아닌 도킹 스테이션을 이용하여 상기 방법의 단계들 중 하나 이상을 제어하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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