ES2725003T3 - Sistema y método de análisis de alta resolución de ácidos nucleicos para detectar variaciones de secuencia - Google Patents

Abstract

Un método para amplificar un ácido nucleico diana mediante PCR en tiempo real, en donde: a. los cebadores de oligonucleótidos se hibridan en el ácido nucleico diana; y b. el ácido nucleico diana se amplifica y desnaturaliza; en donde los cebadores de oligonucleótidos están diseñados para tener una Tm de cebador que está dentro de 15 ºC de la temperatura de fusión del ácido nucleico diana y en donde el método se lleva a cabo a una temperatura entre 75 ºC y 90 ºC.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema y método de análisis de alta resolución de ácidos nucleicos para detectar variaciones de secuencia Campo

La presente divulgación se refiere generalmente a sistemas y métodos de preparación y análisis de muestras biológicas para detectar variaciones de secuencias de ácidos nucleicos asociadas a fenotipos de interés. En ciertos ejemplos, los métodos y sistemas se proporcionan para amplificar ácidos nucleicos de microorganismos de una muestra biológica, y detectar variaciones de secuencias asociadas a resistencia y/o sensibilidad a fármacos.

Antecedentes

Muy pocos desarrollos en la historia de la ciencia han tenido un impacto tan profundo en la vida humana como los avances en controlar los microorganismos patógenos. No fue hasta finales del siglo XIX y principios del XX que el trabajo de Pasteur y Koch estableció a los microorganismos como la causa de enfermedades infecciosas y proporcionó estrategias que condujeron a la prevención racional y estrategias de control. Las sulfonamidas estuvieron entre los primeros grupos de compuestos descubiertos para suprimir infecciones por microorganismos, y aunque se sabía poco sobre su mecanismo de acción, el descubrimiento estimuló una enorme búsqueda de compuestos antibióticos más eficaces. El aislamiento de una preparación impura, pero altamente activa, de penicilina por Florey y Chain en 1940, y el posterior éxito de la penicilina, desvió el esfuerzo científico adicional hacia la búsqueda de antibióticos, que condujo al descubrimiento de aproximadamente 3.000 antibióticos identificados. Sin embargo, a pesar del rápido progreso en el descubrimiento de nuevos compuestos, solo 50 de los antibióticos identificados han cumplido el uso clínico, e incluso menos se usan comúnmente en el tratamiento de enfermedades por microorganismos.

La eficacia inicial de los antibióticos contra infecciones por microorganismos se ha compensado parcialmente por la emergencia de cepas de microorganismos que son resistentes a diversos antibióticos. La resistencia a antibióticos ha demostrado ser difícil de vencer debido a la acelerada adaptabilidad evolutiva de los microorganismos, el uso excesivo cada vez mayor de antibióticos en la clínica, y la ausencia de cumplimiento del paciente en completar las pautas de dosificación prescritas. Los problemas de resistencia han hecho que muchas enfermedades de otro modo curables, tales como la gonorrea y la tifoidea, sean difíciles de tratar. Además, los microorganismos resistentes a la vancomicina, uno de los últimos antibióticos ampliamente eficaces, están siendo cada vez más predominantes en los hospitales.

Constantemente están siendo desarrollados nuevos compuestos antibióticos para mantener a los microorganismos infecciosos a raya, y un entendimiento de los mecanismos de resistencia a antibióticos ha demostrado ser valioso en el proceso de desarrollo. Los avances en la genómica permiten que los investigadores identifiquen vías bioquímicas que son susceptibles a la inhibición o modificación, y a diseñar racionalmente fármacos dirigidos hacia esas vías. Muchos fármacos ejercen un efecto terapéutico uniéndose a una proteína de microorganismo y modificando su estructura y/o función. En tales casos, los microorganismos pueden desarrollar inmunidad por modificación física de la proteína diana de un modo que interfiere con la unión del fármaco o actividad. Por ejemplo, la resistencia al antibiótico eritromicina en varios microorganismos resulta de una variación de la subunidad ribosómica 50S que produce una afinidad reducida de los ribosomas por la eritromicina. Como la estructura/función de la proteína se determina por su secuencia primaria, que a su vez se determina por la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína, variaciones de las secuencias de ácidos nucleicos asociadas a fenotipos resistentes a fármacos son indicadores de diagnóstico útiles de resistencia al fármaco.

Aunque se han establecido métodos para identificar variaciones de secuencia de ácido nucleico en microorganismos, las técnicas existentes están limitadas por el requisito de conocimiento previo de las mutaciones particulares u otras variaciones que se utilizan como indicadores de diagnóstico. Como resultado, los procedimientos de detección conocidos a menudo pasan por alto las variaciones de secuencia recientemente desarrolladas y/o no caracterizadas asociadas con la resistencia al fármaco u otras características de interés.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de métodos rápidos, asequibles y fiables para detectar tanto las variaciones conocidas como desconocidas de la secuencia de ácidos nucleicos que tengan utilidad diagnóstica, incluidas las mutaciones asociadas con la sensibilidad al fármaco y / o los patrones de resistencia al fármaco en una amplia variedad de organismos. tales como levaduras, virus, hongos, bacterias, parásitos e incluso humanos. Masny Aleksander et al. discute el uso de bajas temperaturas de desnaturalización (80-88 °C) durante la PCR mediada por ligación (LM PCR) del ADN bacteriano, para la amplificación de conjuntos limitados de los fragmentos de ADN menos estables. Los autores de este estudio creen que el método descrito se puede usar para amplificar y aislar los fragmentos de ADN menos estables en un genoma. (Masny Aleksander et al.; Ligation mediated PCR performed at low denaturation temperatures - PCR melting profiles"; Nucleic Acids Research; Vol.31; No.18; E114; 15 September 2003). Daniel Sullivan et al., discuten consideraciones generales para lograr PCR rápida sin un ciclador térmico especializado. El método de PCR rápida de este documento se lleva a cabo a una temperatura entre 70 °C y 98 °C (Daniel Sullivan et al.; Fast PCR: General Considerations for Minimizing Run Times and Maximizing Throughput; 7 March 2007; URL: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5362.pdf).

Anónimo; Realización de PCR rápida utilizando cicladores térmicos Bio-Rad; 1 de enero de 2005; URL: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2005/05-0739/fast_pcr.pdf; discute un método de PCR rápido que se realiza entre 70 °C y 98 °C.

Sumario

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para amplificar un ácido nucleico diana mediante PCR en tiempo real, en donde: a) los cebadores de oligonucleótidos se hibridan con el ácido nucleico diana; y b) el ácido nucleico diana está amplificado y desnaturalizado; en donde los cebadores de oligonucleótidos están diseñados para tener una Tm de cebador que está dentro de 15 °C de la temperatura de fusión del ácido nucleico diana y en donde el método se lleva a cabo a una temperatura entre 75 °C y 90 °C.

Se proporcionan métodos para determinar la capacidad de respuesta de un microorganismo a un fármaco, comprendiendo los métodos obtener una muestra biológica de un paciente, conteniendo la muestra un microorganismo infeccioso; amplificar uno o más segmentos de ADN del microorganismo, incluyendo el uno o más segmentos al menos un polimorfismo asociado con la capacidad de respuesta del microorganismo a un fármaco de interés; y ensayar uno o más segmentos de ADN amplificado para determinar las variaciones de secuencia con respecto a una secuencia de referencia, en donde una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificado indica la capacidad de respuesta del microorganismo al fármaco.

En algunas realizaciones preferidas, el ADN amplificado se ensaya para variaciones de secuencias usando análisis de las curvas de fusión de alta resolución. En diversos ejemplos, el análisis de las curvas de fusión implica incubar el ADN amplificado (ADN diana) con una secuencia de referencia complementaria, tal como una secuencia de tipo silvestre, en presencia de un colorante fluorescente que se une a ADN que emite un nivel de fluorescencia sustancialmente diferente en presencia de ADN bicatenario (ADNbc) con respecto a ADN monocatenario (ADNmc). En algunas realizaciones preferidas, el colorante que se une al ADN es un colorantes específico de ADNbc, tal como SYBR Green I o SYBR Green II, y el análisis de las curvas de fusión implica monitorizar el nivel de fluorescencia como una función del tiempo a medida que la disolución de ensayo se calienta lentamente a una velocidad constante. Ventajosamente, el análisis de las curvas de fusión según los métodos proporcionados en el presente documento puede detectar con exactitud desapareamientos de pares de bases individuales entre una secuencia de ADN diana y una secuencia de referencia, y/o los desapareamientos en dos, tres, cuatro, cinco, o más bases.

En algunos ejemplos, la secuencia de referencia usada en los análisis de las curvas de fusión de los métodos proporcionados en el presente documento incluye al menos un polimorfismo asociado a reactividad a fármacos, tal como resistencia a fármacos o sensibilidad a fármacos, y el análisis detecta uno o más polimorfismos adicionales en el segmento de ADN que incluye el polimorfismo asociado a la reactividad a fármacos.

Se describen métodos para determinar si un paciente es susceptible a tratamiento con un fármaco, comprendiendo los métodos obtener una muestra biológica de un paciente, en los que la muestra contiene Mycobacterium tuberculosis (MTb); amplificar uno o más segmentos de ADN de MTb de SEQ ID NOS: 142-204, incluyendo cada uno del uno o más segmentos al menos un polimorfismo asociado a sensibilidad de MTb a un fármaco antibiótico; y ensayar el uno o más fragmentos de ADN amplificados para variaciones de secuencias con respecto a la secuencia correspondiente entre SEQ ID NOS: 142-204, en los que una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb al fármaco antibiótico. En algunos de los métodos descritos, variaciones en dos o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb al fármaco antibiótico.

En algunos ejemplos, el ADN de MTb de SEQ ID NOS: 142-204 se amplifica por PCR usando los cebadores correspondientes de SEQ ID NOS: 11-136.

En diversos ejemplos, el ADN de MTb amplificado comprende una o más de las SEQ ID NOS: 142-145, y una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificado indica la sensibilidad de MTb a la rifampicina; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de las SEQ ID NOS: 146-151, y una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificado indica la sensibilidad de MTb a pirazinamida; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de las SEQ ID NOS: 152-154, y una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificado indica la sensibilidad de MTb a la estreptomicina; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 155­ 176, y una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificado indica la sensibilidad de MTb a la isoniacida; el ADN de MTb amplificado comprende unA o más de las SEQ ID NOS: 177-198, y una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificados indica la sensibilidad de MTb al etambutol; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de las SEQ ID NOS: 199-203, y una variación en uno o más de los segmentos de ADN amplificados indica la sensibilidad de MTb a uno o ambos de capreomicina y viomicina; y/o el ADN de MTb amplificado comprende la SEQ ID NO: 204; y una variación en el segmento de ADN amplificado indica la sensibilidad de MTb a uno o más de oxifloxacina, moxifloxicano, gatifloxicano, sitafloxacina, ofloxacina, levofloxacina y esparfloxacina.

Se proporcionan kits para determinar si un paciente es susceptible de ser tratado con un fármaco, donde los kits comprenden al menos un par de cebadores de las SEQ ID NOS: 1-136; al menos una sonda de nucleótidos complementaria a un amplicón de las SEQ ID NOS: 137-204; e instrucciones para usar el al menos un par de cebadores para amplificar el ADN de una muestra biológica de un paciente infectado con Myobacterium tuberculosis (MTb), y usar la al menos una sonda de nucleótidos para detectar variaciones de secuencia dentro del ADN amplificado utilizando el análisis de curva de fusión de alta resolución .

Realizaciones preferidas de la invención en cualquiera de sus diversos aspectos son como se describen a continuación o como se define en las sub-reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Una representación gráfica de un diseño para solapar las temperaturas de hibridación de cebadores y las temperaturas de desnaturalización de moldes.

Figura 2: Una ilustración de productos de amplificación convencionales por PCR en tiempo real.

Figura 3: Una gráfica que muestra la amplificación por PCR a alta temperatura del mismo molde usado en la Figura 2.

Figura 4: Gráfico que muestra la amplificación por HTPCR del mismo material de molde usando diferentes concentraciones de material de partida

Figura 5: A - Comparación de productos de HTPCR del gen CFP32 de M. tuberculosis en agua y MycoBuffer. B -Comparación de productos de HTPCR de la región del gen IS6110 de M. tuberculosis en agua y MycoBuffer. C -Comparación de productos de HTPCR de la región del gen btMTb de M. tuberculosis en agua y MycoBuffer. D -Comparación de productos de HTPCR de la región del gen diana IS6110 de transposasa de M. tuberculosis en agua y MycoBuffer. E - Comparación de productos de HTPCR de la región del gen BTTb de M. tuberculosis en agua y MycoBuffer.

Figura 6: Representaciones gráficas de los productos de amplificación de un cribado de resistencia a rifampicina. A ­ Productos de amplificación de homodúplex y heterodúplex. B - Curvas de fusión de los productos de homo- y heterodúplex. C - Representación de diferencias entre las curvas de fusión en B.

Figura 7: Representación gráfica del análisis de las curvas y curvas de diferencias de muestras de control y sensibles.

Figura 8: Representación gráfica que muestran diferentes curvas fluorescentes para diferentes ácidos nucleicos. Figura 9: Representación gráfica del análisis de las curvas de diferencias entre muestras de control, resistentes y sensibles.

Figura 10A: Análisis de curvas de diferencias de muestras sensibles y resistentes a rifampicina de M. tuberculosis. B. Análisis de curvas de diferencias de muestras sensibles y resistentes a estreptomicina de M. tuberculosis.

Figura 11: Análisis de curvas de diferencias de muestras resistentes a terbinafina de S. cerevisiae.

Figura 12: Análisis de curvas de diferencias de muestras sensibles y resistentes a taxano de seres humanos.

Figura 13: Análisis de curvas de diferencias de muestras resistentes a cloroquina de infecciones de malaria.

Figura 14: Análisis de curvas de diferencias de muestras sensibles y resistentes a zidovudina del VIH.

Figura 15: Análisis de curvas de diferencias de muestras sensibles y resistentes a vancomicina de S. aureus.

Figura 16: Análisis en gel de agarosa de productos ADN de M. tuberculosis amplificados por simulación por amplificación de flujo dinámico.

Figura 17: Análisis en tiempo real de productos de amplificación de ADN de S. typhimurium por amplificación de flujo dinámico.

Descripción detallada de aspectos ilustrativos

En el presente documento se describen métodos fiables de bajo coste para detectar variaciones de secuencias de ácidos nucleicos asociadas a una o más características fenotípicas que tienen utilidad de diagnóstico en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección. En algunos aspectos, los métodos descritos en el presente documento son útiles para detectar variaciones de secuencias de ácidos nucleicos asociadas a la reactividad de un microorganismo a uno o más fármacos. En el presente documento también se describen composiciones, sistemas y kits relacionados con los presentes métodos. Aunque varios aspectos y ventajas de la presente invención se describen en el presente documento con respecto a diversos métodos, los expertos en la materia reconocerán que tales aspectos y ventajas también son aplicables a composiciones relacionadas, sistemas, kits y similares.

El término “microorganismo”, como se usa en el presente documento, puede referirse a bacterias, hongos, protozoos, parásitos y/o virus. En diversas realizaciones preferidas, el microorganismo es un patógeno bacteriano. En algunos ejemplos preferidos, el microorganismo es Mycobacterium tuberculosis. Sin embargo, aunque varios aspectos y ventajas de la presente invención se describen en el presente documento en relación a Mycobacterium tuberculosis, los expertos en la materia reconocerán que tales aspectos y ventajas también son aplicables a otros microorganismos, y para una variedad de enfermedades y afecciones. Ejemplos no limitantes de microorganismos útiles en los métodos de diagnóstico proporcionados en el presente documento se exponen en la Tabla I, junto con elementos de secuencias variables relacionados con la reactividad a fármacos de tales microorganismos.

El “sujeto” al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier organismo capaz de alojar un microorganismo, que incluye, pero no se limita a, animales experimentales (por ejemplo, ratones, ratas, conejos y similares) y seres humanos. En diversos ejemplos, el sujeto es un paciente humano que padece una enfermedad infecciosa. En algunos ejemplos, el paciente padece tuberculosis.

Una “muestra biológica” descrita en el presente documento puede incluir cualquier material biológico tomado de un sujeto, que incluye, pero no se limita a, expectoraciones (por ejemplo, esputo), sangre, glóbulos sanguíneos (por ejemplo, linfocitos), tejido, biopsias, células cultivadas, líquido pleural, peritoneal, o cefalorraquídeo, sudor, heces y orina. En algunos ejemplos, una muestra biológica de un sujeto se trata, por ejemplo, para cultivar un microorganismo infeccioso y/o amplificar su material genético, antes de ser ensayada según métodos proporcionados en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término “fármaco” puede referirse a cualquier compuesto, agente, modalidad de tratamiento, o combinación de los mismos. En algunos ejemplos preferidos, el fármaco es un compuesto antibiótico.

El término “diana(s) de ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, se refiere a ácidos nucleicos derivados de un microorganismo infeccioso, como se distingue de ácidos nucleicos del sujeto y/o ácidos nucleicos extraños no relacionados con la enfermedad, trastorno o afección prevista para el tratamiento. En algunos ejemplos, un ácido nucleico diana es un ácido nucleico de un microorganismo que se ensaya según un método proporcionado en el presente documento.

El término “ácido nucleico de referencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico correspondiente a un ácido nucleico diana (por ejemplo, que representa la misma porción de ADN genómico), que se diferencia del ácido nucleico diana por una o más variaciones de secuencias. Por ejemplo, en algunos ejemplos, un ácido nucleico de referencia tiene la secuencia de un microorganismo de tipo silvestre (por ejemplo, con respecto a reactividad a un fármaco de interés). En ejemplos adicionales, un ácido nucleico de referencia tiene la secuencia de una célula humana de tipo silvestre, tal como una célula enferma, que incluye, por ejemplo, una célula cancerosa humana.

El término “variación de secuencia”, como se usa en el presente documento en relación con ácidos nucleicos, se refiere a una diferencia en la secuencia de un ácido nucleico con respecto a la secuencia de un ácido nucleico correspondiente (por ejemplo, una secuencia que representa el mismo gen u otra porción de ADN genómico). En algunos ejemplos preferidos, las variaciones de secuencias detectadas según diversos métodos en el presente documento proporcionan “polimorfismos de un solo nucleótido” (“SNP”), resultantes de una diferencia en la identidad de un único nucleótido entre un ácido nucleico diana y un ácido nucleico de referencia. En ejemplos adicionales, las variaciones de secuencias detectadas según diversos métodos proporcionados en el presente documento incluyen “polimorfismos de múltiples nucleótidos” (“MNP”). En algunos ejemplos, el ácido nucleico de referencia se corresponde con un fenotipo no resistente a fármacos y se detecta un fenotipo resistente a fármacos según un método proporcionado en el presente documento identificando una variación de secuencia entre el ácido nucleico de referencia y un ácido nucleico diana de una muestra biológica de un sujeto infectado con el microorganismo o célula enferma, tal como una célula cancerosa resistente a fármacos.

Los términos “reactividad” y “reactividad a fármacos”, como se usan en el presente documento, pueden referirse a resistencia, sensibilidad, susceptibilidad, tolerancia y/u otras características fenotípicas de un microorganismo o célula enferma, tal como una célula cancerosa, relacionadas con el efecto terapéutico de un fármaco, que incluye no reactividad. La reactividad a fármacos puede evaluarse directamente, según el efecto del fármaco sobre un microorganismo o célula enferma elegido como diana, tal como una célula cancerosa (por ejemplo, una mortalidad bacteriana o una mortalidad celular), y/o indirectamente, según el efecto del fármaco sobre uno o más aspectos de una enfermedad infecciosa producida por el microorganismo (por ejemplo, prevención, mejora, alivio y/o eliminación de la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad). En algunos ejemplos preferidos, en el presente documento se proporcionan sistemas y métodos para detectar resistencia a uno o más fármacos, en los que la resistencia se refiere a resistencia heredable (genética).

El término “elemento de secuencia variable” se refiere a una región de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) comprendida de una serie de nucleótidos adyacentes - por ejemplo, 2, 3, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100 o más bases consecutivas - que incluye al menos una variación de secuencia conocida por estar asociada a una característica fenotípica de interés, tal como resistencia, sensibilidad y/u otros aspectos de reactividad a fármacos. Sin quedar ligado a teoría particular, se cree que es probable que las variaciones de secuencias asociadas a reactividad a fármacos, tales como resistencia y/o sensibilidad a fármacos, se produzcan en regiones del ácido nucleico que son importantes en la determinación del fenotipo receptivo, de forma que es sustancialmente más probable que un elemento de secuencia variable que incluye la variación (y nucleótidos de alrededor) contenga variaciones no caracterizadas adicionales asociadas al fenotipo receptivo (por ejemplo, resistente o sensible). Por ejemplo, una variación de secuencia asociada a resistencia a fármacos se producirá frecuentemente en una región de un ácido nucleico que codifica un sitio de la proteína correspondiente que es un determinante estructural y/o funcional de reactividad a fármacos, tal como un sitio de unión a fármaco. Un elemento de secuencia variable que incluye la variación conocida (y nucleótidos de alrededor) probablemente codificará porciones estructuralmente y/o funcionalmente relacionadas de la proteína (por ejemplo, un bolsillo, pliegue u otra estructura que comprende el sitio de unión a fármaco), y variaciones no caracterizadas adicionales dentro del elemento de secuencia variable probablemente se asociarán al mismo fenotipo que la variación conocida.

Así, en el presente documento se proporcionan métodos de ensayo de fenotipos receptivos a fármaco asociados a variaciones de secuencias conocidas y/o desconocidas. Ventajosamente, tales métodos son capaces de detectar reactividad a fármacos sin conocimiento previo de variaciones de secuencias de ácidos nucleicos específicas, permitiendo la rápida identificación de nuevas mutaciones genéticas asociadas a resistencia a fármacos, sensibilidad a fármacos y/u otros fenotipos receptivos a fármacos. Como tales, los métodos proporcionados en el presente documento pueden lograr mayor sensibilidad y utilidad de diagnóstico que los métodos existentes basados en mutaciones caracterizadas.

Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan elementos de secuencia variable que incluyen una o más variaciones de secuencias conocidas por asociarse a un fenotipo resistente a fármacos, y ensayar tales elementos de secuencias variables como se describe en el presente documento permite la detección del fenotipo resistente a fármacos debido a variaciones conocidas y/o una variación no caracterizada adicional. Ventajosamente, en el presente documento se proporcionan elementos de secuencias variables de un tamaño que permite un alto grado de sensibilidad junto con un bajo nivel de positivos falsos (por ejemplo, un tamaño suficiente para codificar la porción de la proteína alterada por la(s) variación (variaciones) conocida(s) y regiones estructuralmente y/o funcionalmente relacionadas sin que incluya porciones no relacionadas significativas de la proteína). En algunos ejemplos, la detección de una variación de secuencia dentro de un elemento de secuencia variable proporcionada en el presente documento es indicativa de resistencia a fármacos con una tasa de positivos falsos inferior a aproximadamente el 25 %, inferior a aproximadamente el 20 %, inferior a aproximadamente el 15 %, o más preferentemente inferior a aproximadamente el 10 %, 5 %, o el 1 %.

Se describen métodos de diagnóstico para determinar si un sujeto infectado por un microorganismo es susceptible a tratamiento con un fármaco midiendo la reactividad del microorganismo al fármaco. En algunos ejemplos, la reactividad se mide obteniendo una muestra biológica de un sujeto, y ensayando la muestra para una o más variaciones de secuencias dentro de un elemento de secuencia variable asociado a reactividad al fármaco. En algunos ejemplos preferidos, el elemento de secuencia variable está asociado a resistencia al fármaco. En ejemplos preferidos adicionales, el elemento de secuencia variable está asociado a sensibilidad al fármaco.

En algunos ejemplos preferidos, se proporcionan métodos para detectar si un sujeto se infecta por Tb resistente a fármacos, en los que el método comprende obtener una muestra biológica del sujeto y ensayar la muestra para una o más variaciones de secuencias de ácidos nucleicos dentro de un elemento de secuencia variable de ADN elegido como diana seleccionado de los elementos de secuencias variables expuestos en la Tabla 1. En algunos ejemplos preferidos, los métodos comprenden además amplificar elementos de secuencias variables elegidos como diana usando los cebadores expuestos en la Tabla 3.

En el presente documento se proporcionan métodos que implican una etapa de preparación de una muestra biológica para facilitar la detección y/o el análisis de ácidos nucleicos diana. Se proporcionan sistemas y métodos para preparar una muestra biológica para análisis de secuencias de alta resolución. En algunos ejemplos preferidos, las muestras biológicas se tratan para amplificar elementos de secuencias variables de ADN elegido como diana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o por otros métodos conocidos en la técnica.

La amplificación por PCR generalmente comprende las etapas de desnaturalización inicial, hibridación, polimerización y extensión final. La amplificación por PCR se realiza generalmente en una cámara de reacción, que está provista de reactivos de PCR necesarios, que incluyen la muestra biológica que contiene el ADN diana, una ADN polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa), trifosfatos de nucleósido, un primer y segundo cebador (que comprende un par de cebadores) que se hibridan con el ADN diana y flanquean la secuencia del producto de ADN amplificado (el “amplicón”). Un aparato de PCR normalmente incluirá medios para el ciclo de temperatura de la cámara de reacción según se requiera para cada etapa del ciclo de amplificación, que incluye, por ejemplo, “fundir” el ADN bicatenario para producir ADN monocatenario; hibridar los cebadores con moldes de ADN monocatenario; y extensión del ADN amplificado mediante polimerasa.

Las condiciones precisas usadas para amplificar una secuencia de ADN diana específica pueden variar según varios factores que están dentro del conocimiento de los expertos en la materia. En algunos ejemplos, la desnaturalización se realiza a entre aproximadamente 90-95 °C durante aproximadamente 10-30 segundos, la hibridación se realiza a aproximadamente 45-65 °C durante aproximadamente 10-30 segundos; la extensión se realiza a aproximadamente 70-75 °C durante aproximadamente 10-90 segundos; y una extensión final se realiza a 72 °C durante aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende ADN genómico, MgCh y otras sales fisiológicas (por ejemplo, MnCh), tampón de PCR, dNTP 0,1-1,0 mM, 0,04-1,5 pM de cada cebador y 0,5­ 5,0 unidades de polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa).

También pueden utilizarse otros métodos de amplificación conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA); amplificación de ^a Dⁿ de “cadena ramificada” (Chiron Corp.); reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por QB replicasa (QBR), transcripción activada por ligación (LAT), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), reacción de reparación en cadena (RCR) y reacción de ciclado con sonda (CPR) (revisado, por ejemplo, en The Genesis Report, DX; Vol.3(4), pp.2-7 (Febrero de 1994)).

Se describen cebadores novedosos para su uso en amplificar ácidos nucleicos diana para el análisis según métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, en diversas realizaciones, los pares de cebadores expuestos en la Tabla 2 pueden usarse para amplificar los amplicones correspondientes expuestos en la Tabla 3, que pueden usarse en diversos métodos descritos en el presente documento para detectar variaciones de secuencias indicativas de resistencia a fármacos.

Las variaciones de secuencias se pueden detectar dentro de ácidos nucleicos diana según métodos proporcionados en el presente documento usando el análisis de las curvas de fusión (MCA). En diversos ejemplos, el MCA implica calentar lentamente fragmentos de ADN en presencia de un colorante que permite la medición de las cantidades relativas de ADN bicatenario (ADNbc) y ADN monocatenario (ADNmc) en función del tiempo y la temperatura, como se describe, por ejemplo, en Morrison y Stols, Biochemistry, 32: 3095-3104 (1993). Colorantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, colorantes específicos de ADNbc tales como bromuro de etidio, SYBR Green I y SYBR Green II (Molecular Probes, Eugene, Oreg.), Eva Green (GENTAUR EUROPE) y colorantes específicos de ADNmc. En algunos ejemplos preferidos, el colorante es un colorante fluorescente, tal como SYBR Green I, SYBR Green II, Eva Green, ^lC Green I y LC Green Plus. En diversos ejemplos, los colorantes pueden ser de saturación o no de saturación.

El MCA usado para detectar las variaciones de secuencias en métodos proporcionados en el presente documento implica incubar una muestra que contiene un ácido nucleico diana con una sonda de nucleótido en presencia de un colorante de unión a ADN fluorescente, y monitorizar el grado de hibridación (indicado por el nivel de fluorescencia) en función del tiempo y la temperatura. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un elemento de secuencia variable de la Tabla 3 se amplifica en una muestra biológica, y la muestra amplificada se incuba con una sonda de nucleótido complementaria a la secuencia de tipo silvestre expuesta en la Tabla 3 en presencia de un colorante de unión a ADNbc. La muestra se calienta entonces lentamente a una velocidad constante (por ejemplo, aproximadamente 0,05 a 10,0 °C por minuto) mientras que se mide el nivel de fluorescencia con el tiempo. En diversos ejemplos preferidos se realiza un MCA de control paralelo, en el que se sabe que el ADN diana tiene la secuencia de tipo silvestre expuesta en la Tabla 3. El ADN diana se hibrida con las sondas de nucleótido complementarias para formar ADNbc a las bajas temperaturas iniciales, mientras que el ADNbc se desnaturaliza a medida que aumenta la temperatura, convirtiendo el ADNbc en ADNmc. La conversión de ADNbc a ADNmc va acompañada de cambios en la fluorescencia que son característicos del colorante particular usado. Ventajosamente, pueden detectarse variaciones de secuencias en la muestra biológica analizando el cambio en la fluorescencia con el tiempo con respecto al de la muestra de control.

En diversos ejemplos preferidos, el MCA usado en los métodos proporcionados en el presente documento permite detección de “alta resolución” de variaciones de secuencias dentro de una secuencia diana, que se detectan como cambios en uno o más aspectos de los datos de fluorescencia. En algunos ejemplos preferidos, el MCA de alta resolución según los métodos proporcionados en el presente documento puede distinguir entre especies de muestrasonda y control-ADNbc de sonda que difieren por una única base, y/o por 2, 3, 4, 5, o más bases.

En algunos ejemplos, los datos de fluorescencia pueden representarse en función del tiempo para determinar fluorescencia máxima, fluorescencia mínima, el tiempo a fluorescencia mínima, y una constante de velocidad de segundo orden para la concentración conocida de producto amplificado usando la siguiente ecuación:

en la que F es la fluorescencia, Fmáx es la máxima fluorescencia, Fmín es la mínima fluorescencia, k es la constante de velocidad de segundo orden, tü es el tiempo a Fmín y [ADN] es la concentración conocida del producto amplificado. En algunos ejemplos se usan múltiples variables de los datos de fluorescencia frente al tiempo para definir un grupo de criterios que sirve de “huella de MCA” que identifica inequívocamente una o más secuencias asociadas a un fenotipo de interés, tal como resistencia a fármacos. Por ejemplo, en algunos ejemplos, un fenotipo resistente a fármacos puede ensayarse realizando MCA usando ADN amplificado de una muestra biológica, y comparando los datos de fluorescencia frente al tiempo con una huella de MCA establecida.

Se proporcionan métodos de ensayo de una muestra biológica para tuberculosis resistente a fármacos, en los que los métodos comprenden amplificar uno o más elementos de secuencias variables seleccionados de la Tabla 3 usando uno o más de los pares de cebadores correspondientes expuestos en la Tabla 2, y ensayar la muestra para variaciones de secuencias dentro del uno o más elementos de secuencias variables amplificados usando MCA. En diversos ejemplos, la detección de una o más variaciones dentro de un elemento de secuencia variable en la muestra biológica con respecto al elemento de secuencia variable correspondiente en una muestra de control o un patrón conocido es indicativa de resistencia a fármacos.

En diversos ejemplos, el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 142-145, y una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb a rifampicina; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 146-151, y una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb a pirazinamida; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 152-154, y una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb a estreptomicina; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 155-176, y una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb a isoniazida; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 177-198, y una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb a etambutol; el ADN de MTb amplificado comprende una o más de SEQ ID NOS: 199-203, y una variación en uno o más de los fragmentos de ADN amplificados indica sensibilidad de MTb a uno o ambos de capreomicina y viomicina; y/o el ADN de MTb amplificado comprende SEQ ID NO: 204; y una variación en el segmento de ^a Dⁿ amplificado indica sensibilidad de MTb a uno o más de oxifloxacino, moxifloxican, gatifloxican, sitafloxacino, ofloxacino, levofloxacino y esparfloxacino.

Se proporcionan métodos para ensayar una muestra biológica para VIH resistente a fármacos, en los que los métodos comprenden amplificar el elemento de secuencia variable de SEQ ID NO: 1 usando el par de cebadores correspondiente de SEQ ID NOS: 1 y 2, y ensayar la muestra para variaciones de secuencias dentro de la secuencia amplificada usando MCA, y en los que la detección de una o más variaciones dentro del amplicón de la muestra biológica con respecto a una muestra de control o un patrón conocido es indicativa de VIH resistente a fármacos. En algunos ejemplos, la detección de una o más variaciones dentro del amplicón es indicativa de VIH resistente a zidovudina y/o nevirapina.

Se proporcionan métodos para ensayar una muestra biológica para malaria resistente a fármacos, en los que los métodos comprenden amplificar el elemento de secuencia variable de SEQ ID NO: 2 usando el par de cebadores correspondiente de SEQ ID NOS: 1 y 2, y ensayar la muestra para variaciones de secuencias dentro de la secuencia amplificada usando MCA, y en los que la detección de una o más variaciones dentro del amplicón de la muestra biológica con respecto a una muestra de control o un patrón conocido es indicativa de malaria resistente a fármacos. En algunos ejemplos, la detección de una o más variaciones dentro del amplicón es indicativa de malaria resistente a cloroquina.

Se proporcionan métodos para ensayar una muestra biológica para células cancerosas resistentes a fármacos, en los que los métodos comprenden amplificar el elemento de secuencia variable de SEQ ID NO: 1 usando el par de cebadores correspondiente de SEQ ID NOS: 1 y 2 y/o el elemento de secuencia variable de SEQ ID NO: 2 usando el par de cebadores de SEQ ID NOS: 3 y 4, y ensayar la muestra para variaciones de secuencias dentro de una o ambas de las secuencias amplificadas usando MCA, y en los que la detección de una o más variaciones dentro de uno o ambos de los amplicones de la muestra biológica con respecto a una muestra de control o un patrón conocido es indicativa de células cancerosas resistentes a fármacos. En algunos ejemplos preferidos, la detección de una o más variaciones dentro de los amplicones de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 es indicativa de células cancerosas resistentes a epitilona y/o taxano.

Se proporcionan métodos para ensayar una muestra biológica para S. cerevisiae resistente a fármacos, en los que los métodos comprenden amplificar el elemento de secuencia variable de SEQ ID NO: 1 usando el par de cebadores correspondiente de SEQ ID NOS: 1 y 2, y ensayar la muestra para variaciones de secuencias dentro de la secuencia amplificada usando MCA, y en los que la detección de una o más variaciones dentro del amplicón de la muestra biológica con respecto a una muestra de control o un patrón conocido es indicativa de S. cerevisiae resistente a fármacos. En algunos ejemplos preferidos, la detección de una o más variaciones dentro del amplicón es indicativa de S. cerevisiae resistente a terbinafina.

Se proporcionan métodos para ensayar una muestra biológica para S. aureus resistente a fármacos, en los que los métodos comprenden amplificar el elemento de secuencia variable de SEQ ID NO: 1 usando el par de cebadores correspondiente de SEQ ID NOS: 1 y 2, y ensayar la muestra para variaciones de secuencias dentro de la secuencia amplificada usando MCA, y en los que la detección de una o más variaciones dentro del amplicón de la muestra biológica con respecto a una muestra de control o un patrón conocido es indicativa de S. aureus resistente a fármacos. En algunos ejemplos preferidos, la detección de una o más variaciones dentro del amplicón es indicativa de S. aureus resistente a vancomicina y/o p-lactama.

Tabla 1A: Regiones de ácido nucleico de MTb asociadas a resistencia a fármacos

El aislamiento de cantidades adecuadas de Mycobacterium tuberculosis de muestras de esputo plantea un reto significativo a la comunidad de diagnóstico molecular. Las muestras de esputo frecuentemente contienen cantidades tan bajas de MTb vivo que deben cultivarse cepas aisladas durante hasta 2 meses para garantizar cantidades suficientes de material genético para su uso en aplicaciones de diagnóstico molecular. Aunque muchas técnicas de diagnóstico molecular pueden permitir la detección de cantidades muy pequeñas de materiales de partida, de tan solo una única copia, frecuentemente es difícil garantizar que una muestra particular contenga de hecho la cantidad deseada de material de partida.

Para permitir el uso de muestras muy raras o preciadas en los procedimientos de diagnóstico molecular, se ha empleado una técnica conocida como amplificación del genoma completo para enriquecer el material de partida para su uso en los procedimientos de diagnóstico molecular aguas abajo. Como tales, algunos ejemplos de métodos descritos en el presente documento aplican métodos de amplificación del genoma completo al problema de cribar muestras de esputo que contienen MTb. También pueden usarse diversos métodos proporcionados en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de una o más secuencias de ácidos nucleicos en una muestra que contiene un ácido nucleico o mezcla de ácidos nucleicos, o para distinguir entre dos secuencias diferentes en una muestra tal.

En diversos ejemplos, se proporcionan métodos para mejorar la detección de secuencias de ácidos nucleicos en muestras biológicas usando PCR en tiempo real, colorantes de unión a ADNbc y enfoques basados en sonda fluorescente.

En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para preparar ácidos nucleicos de microorganismos para la amplificación y el análisis de alta resolución. Pueden aislarse microorganismos, tales como Mycobacterium tuberculosis (MTb), usando protocolos de fraccionamiento de muestras convencionales, y los ácidos nucleicos del microorganismo pueden extraerse y amplificarse usando métodos bien conocidos, novedosos o aún por establecer. Tras el enriquecimiento y la amplificación molecular, los ácidos nucleicos se criban en diversos aspectos para la presencia de cualquiera de una variedad de marcadores genéticos usando un método cuantitativo tal como PCR. También pueden cuantificarse ácidos nucleicos para análisis aguas abajo. Puede usarse cualquier método de cuantificación, que incluye, pero no se limita a, análisis por qPCR, análisis UV, análisis en gel y kits de cuantificación de ácidos nucleicos. En algunos ejemplos se realiza una amplificación final de los ácidos nucleicos para amplificar ácidos nucleicos y segmentos de los mismos de interés, tales como dianas de susceptibilidad a fármacos (por ejemplo, antibiótico). Pueden usarse colorantes de saturación para seguir la amplificación, hibridación y desnaturalización de ácidos nucleicos.

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos diana amplificados pueden monitorizarse durante la hibridación y/o la desnaturalización usando técnicas de monitorización de alta resolución, tales como aquellas que miden cambios en la fluorescencia asociados a cambios en la estructura y/o la conformación de los ácidos nucleicos, tales como aquellos que acompañan a la hibridación y fusión. Similarmente pueden monitorizarse en paralelo ácidos nucleicos diana de control. Las variaciones detectadas entre los ácidos nucleicos diana (por ejemplo, región de susceptibilidad a fármacos) y los ácidos nucleicos de control pueden ser indicativas de susceptibilidad reducida (por ejemplo, resistencia) a fármacos que se dirigen a regiones particulares de los productos génicos formados a partir de los ácidos nucleicos diana.

En diversos ejempos, se proporcionan métodos de aislamiento, amplificación y análisis de ácidos nucleicos diana de un microorganismo, tal como MTb, como se describen más adelante y en toda la memoria descriptiva. En otros ejemplos pueden aislarse ácidos nucleicos diana, tales como aquellos expuestos en la Tabla 1, de muestras celulares o clínicas por métodos establecidos en la materia.

En algunos ejemplos, MTb aislado se fracciona de una muestra de esputo usando un método de preparación de organismos vivos convencional, tal como el método de Petroff, que deja pequeñas cantidades del organismo MTb en una suspensión acuosa. Los ácidos nucleicos de MTb se aíslan de la muestra usando el kit comercialmente disponible MycoBuffer (RAOGene; Milford, PA) según instrucciones del fabricante, de forma que al menos pequeñas cantidades de ADN de MTb se aíslan en el material residual del producto de MycoBuffer. Pueden aislarse cantidades mayores de ADN.

Las muestras de ADN obtenidas del uso de la disolución de lisis se someten a un cribado primario para ADN de MTb usando cualquier método de amplificación de ADN que inhiba o elimine la formación de productos de ácido nucleico no específicos. Por tanto, el método de amplificación puede realizarse durante periodos de tiempo prolongados para explicar la baja cantidad de ADN normalmente presente en los lisados primarios. Cebadores a modo de ejemplo que cubren estas regiones de interés se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2: Cebadores a modo de ejemplo para la amplificación de regiones diana

En ejemplos adicionales, las muestras de ADN obtenidas del uso de la disolución de lisis se combinan, tanto tras los resultados del cribado primario como simultáneamente al cribado, con componentes de reacción similares a aquellos usados en los procedimientos de amplificación del genoma completo.

Sin embargo, pueden utilizarse otros procedimientos de amplificación adecuados que permitan que las muestras de ADN se amplifiquen a una cantidad adecuada de ácido nucleico genómico. Los procedimientos de amplificación del genoma completo pueden proporcionar el enriquecimiento molecular de las muestras de ADN con aumentos en las cantidades del genoma de MTb superiores a 30 veces en menos de 16 horas de tiempo de incubación. La amplificación del genoma completo solo necesita usarse si no hay molde suficiente para obtener una amplificación primaria.

El ADN enriquecido se purifica posteriormente usando cualquiera de una variedad de métodos para purificar ADN. Por ejemplo, puede usarse un sistema de placa filtrante capaz de acomodar 96 o más muestras simultáneas para purificar una matriz de muestras de ADN enriquecido. El ADN enriquecido y purificado se somete a un protocolo de amplificación por PCR de MTb o específico de Mycobacterium general, y se determina la cantidad o concentración de ADN. Por ejemplo, puede usarse PCR cuantitativa en tiempo real para amplificar y determinar la cantidad de ADN de MTb en la muestra. La purificación no es necesaria si no se usa amplificación del genoma completo.

La concentración de la muestra se ajusta con el fin de hacer coincidir la concentración del ADN de MTb enriquecido con el ADN de MTb de control para lograr una relación de aproximadamente 1:1 u otra relación predeterminada y fija. Esto permite una relación casi equivalente del ADN de MTb enriquecido con la del ADN de control que va a usarse en etapas de detección posteriores. El ADN de MTb enriquecido que se ha normalizado para la concentración se co-amplifica con el ADN de MTb de control que contiene la secuencia de genes de referencia para la región del ácido nucleico diana. Es decir, el ADN de MTb de control contiene una región de gen (por ejemplo, secuencia) que si es variante, es indicativa de una susceptibilidad reducida (por ejemplo, resistencia) del organismo MTb a fármacos (por ejemplo, fármacos antibióticos o antimicóticos) que se dirigen a la región del gen. Regiones del gen a modo de ejemplo y sensibilidades a fármacos correspondientes amplificadas por los pares de cebadores presentados en la Tabla 2 se proporcionan en la Tabla 3. Estas regiones permitieron la determinación de resistencia a fármacos o sensibilidad en infección por Mycobacterium tuberculosis, además de para ejemplos de sensibilidad a zidovudina en VIH, sensibilidad a taxano en cánceres humanos, sensibilidad a cloroquina en malaria, sensibilidad a terbinafina en S. cerevisiae y sensibilidad a vancomicina en S. aureus.

Tabla 3: Regiones a modo de ejemplo para pruebas de sensibilidad a fármacos de MTb

Las secuencias co-amplificadas de ADN de MTb enriquecido y ADN de MTb de control se desnaturalizan simultáneamente, y a continuación se hibridan para producir homodúplex de ADN de MTb de control amplificado y ADN de MTb enriquecido, y también producen heterodúplex de ADN de Mtb de control y enriquecido. Un colorante de saturación de unión a ADN bicatenario, tal como un colorante que fluoresce cuando interacciona con un ácido nucleico del dúplex, se incluye en la mezcla de amplificación para permitir la generación de datos de curvas de fusión de alta resolución de estos homodúplex y heterodúplex. Como tales, las muestras hibridadas de homodúplex y heterodúplex, además del ADN de MTb de control, se someten a análisis de las curvas de fusión de alta resolución que se monitoriza usando fluorescencia u otros métodos de detección del colorante de unión.

Los datos obtenidos de la monitorización de la fusión de alta resolución de los homodúplex, heterodúplex y ADN de MTb de control se introducen en un sistema de cálculo para analizar los datos. Entonces se calcula una comparación matemática de los datos de la muestra de ADN de MTb de control sin ADN de muestra enriquecido añadido con la muestra que contiene los homodúplex y heterodúplex co-amplificados. La comparación matemática, después de la normalización de las curvas por temperatura y puntos iniciales y finales, permite la resta de cada punto de datos a lo largo de la curva de fusión de la muestra que contiene el producto co-amplificado de los datos de la muestra de ADN de Mtb de control. El gráfico resultante para muestras invariables que tienen secuencias que no son sustancialmente diferentes del ADN de MTb de control es esencialmente una línea recta con variación menor de aproximadamente cero. Una gráfica para muestras que tienen ADN de heterodúplex (por ejemplo, ADN de control con ADN de muestra enriquecido) que contiene apareamientos erróneos del apareamiento de bases mostrará un cambio en la curva de fusión, y cuando se someta al algoritmo de resta producirá un gráfico claramente diferente del gráfico plano de secuencias de control e invariables.

Las muestras que contienen gráficos variables de los gráficos de muestra de control se puntúan como variables en la región diana de fármaco (por ejemplo, diana de ácido nucleico), y es probable que los microorganismos sean menos susceptibles (por ejemplo, resistentes) a la acción del fármaco para esta región genética. Por tanto, varias regiones del ácido nucleico diana de fármaco pueden amplificarse simultáneamente en diferentes cámaras de reacción para un único paciente o para múltiples pacientes.

Los sistemas y métodos divulgados permiten el rápido cribado para fármacos adecuados para el tratamiento de casos individuales de MTb. Usando un enfoque tal puede prescribirse una pauta farmacéutica personalizada rápida a un paciente con MTb, que puede conllevar a menos fármacos por paciente, mayores tasas de cumplimiento de las pautas de tratamiento, y/o una reducción definitiva en la tasa de generación de MDR-MTb.

II. Cebadores novedosos

En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para mejorar la detección de secuencias de ácidos nucleicos utilizando diseños de cebadores de oligonucleótidos racionales y diseños de secuencias diana racionales en combinación para producir estrechos intervalos de temperatura para tanto la hibridación de cebadores con el ácido nucleico diana, amplificación del ácido nucleico diana, como la desnaturalización del producto de ácido nucleico diana amplificado. Como tales, intervalos de temperatura estrechos en comparación con el intervalo de temperatura normalmente empleado pueden producir un producto de ácido nucleico diana amplificado que contiene menos productos no específicos. Así, los productos de ácidos nucleicos diana amplificados pueden ser en general más específicos y sensibles para aplicaciones de detección de dianas por PCR cuantitativa y genotipificación como se describe en el presente documento.

El diseño racional de cebadores de oligonucleótidos puede incluir la selección mediante cálculo, experimento o computación de cebadores que tienen la temperatura de fusión deseada (Tm). El diseño racional puede incluir la selección de secuencias de cebadores específicas con el % de CG apropiado para obtener la Tm deseada. Por tanto, el diseño racional puede incluir modificaciones a los cebadores que incluyen modificaciones internucleotídicas, modificaciones de bases y modificaciones de nucleótidos.

En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para seleccionar cebadores para PCR que flanquean un elemento de secuencia variable de interés en un ácido nucleico diana. En algunos ejemplos, los cebadores se seleccionan para tener una Tm con el ácido nucleico diana (Tm de cebador:diana) que está dentro de un estrecho intervalo de Tm del ácido nucleico diana (Tm de diana:diana). El estrecho intervalo de temperatura específico usado para una amplificación tal de los ácidos nucleicos diana depende del perfil de fusión del ácido nucleico diana, y así la secuencia del ácido nucleico diana que se amplifica. Como tal, el estrecho intervalo de temperatura puede usarse como un intervalo de temperatura diana con el fin de identificar y/o generar cebadores específicos que tienen valores de Tm suficientemente altos cuando se hibridan con el ácido nucleico diana. Por consiguiente, los valores de Tm de los cebadores pueden estar solapándose dentro del intervalo de temperatura de hibridación y/o desnaturalización del ácido nucleico diana (véase la Figura 1).

La Figura 1 puede contrastarse con la Figura 2 para ilustrar el diseño de los cebadores que tienen la Tm dentro de un intervalo de la Tm del ácido nucleico diana. La Figura 2 muestra que la amplificación convencional con cebadores y un ácido nucleico diana carecen de un solapamiento de temperatura (como se muestra en la Figura 1) y requiere variaciones de temperatura extremas durante la amplificación, correspondientes a los ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión, para producir un producto amplificado. Tales intervalos de temperatura extremos permiten la formación de productos no deseados.

En algunos ejemplos, se proporciona un proceso de diseño iterativo para seleccionar y/u optimizar cebadores para las secuencias de ácidos nucleicos diana específicas que van a amplificarse y/o detectarse. Ventajosamente, el método iterativo permite la formación de un ácido nucleico diana específico usando un estrecho intervalo de condiciones térmicas en el que tanto el ácido nucleico diana como los cebadores de oligonucleótidos hibridados con el ácido nucleico diana están en un flujo dinámico de hibridación y desnaturalización. Un flujo dinámico tal de hibridación y desnaturalización puede producir una amplificación del ácido nucleico diana específico con una disminución proporcional en la formación de productos de amplificación no específicos.

Las implicaciones de tales métodos iterativos para seleccionar y/u optimizar cebadores proporciona el uso de colorantes de bajo coste en vez de sondas de oligonucleótidos personalizadas más caras, tales como aquellas que tienen marcas fluorescentes, pueden permitir PCR cuantitativa o desnaturalización de alta resolución que va a usarse en analizar la secuencia del ácido nucleico diana. Por tanto, el método iterativo puede proporcionar cebadores que funcionan en ausencia de instrumentos térmicamente controlados exquisitos para la formación de productos de amplificación. Es decir, los cebadores pueden operar dentro de un estrecho intervalo de temperatura con el fin de amplificar el ácido nucleico diana, permitiendo la amplificación del ácido nucleico que va a usarse en un intervalo de usos mucho más amplio.

Se han descrito varios métodos en la materia para calcular la Tm teórica del ADN de secuencia conocida, que incluyen, por ejemplo, los métodos descritos por Rychlik y Rhoads, Nucleic Acids Res. 17:8543-8551 (1989); Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y Breslauer et al., Proc Natl Acad Sci.83: 3746-3750 (1986).

En algunos ejemplos, los cebadores pueden configurarse para tener una Tm con el ácido nucleico diana que está dentro de un estrecho intervalo de la Tm del ácido nucleico diana modificando químicamente los oligonucleótidos. Pueden usarse químicas de síntesis de oligonucleótidos muy conocidas para aumentar los valores de Tm de los cebadores de manera que se correspondan con el intervalo de temperatura de la Tm del ácido nucleico diana. Tales químicas pueden usar bases modificadas (por ejemplo, Super G, A, T, C), LNA, o PNA, u otras químicas estabilizantes de oligonucleótidos tales. Por tanto, pueden desarrollarse químicas estabilizantes de la hibridación de oligonucleótidos adicionales que pueden usarse para la presente solicitud.

Por ejemplo, se han usado cebadores sintetizados con tanto química de enlace fosfodiéster convencional como químicas de LNA para proporcionar valores de Tm del cebador próximas a los valores de Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Sin embargo, es posible que ciertos ácidos nucleicos diana puedan tener valores de Tm más bajos que los de los cebadores, y puede necesitarse incluir una química desestabilizante de la hibridación para reducir los valores de Tm del cebador de manera que el valor de Tm del cebador esté dentro de un intervalo de los valores de Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana.

En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para refinar el diseño de los cebadores para minimizar el intervalo de temperatura para la amplificación específica de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Como tal, el ácido nucleico diana se amplifica con condiciones de ciclos térmicos de reacción estándar para garantizar que se amplifique la secuencia de ácidos nucleicos diana. La amplificación se monitoriza usando PCR en tiempo real con un colorante de unión a ADN bicatenario, tal como SYBR, LCGreen, LCGreen+, colorante Eva, o similares. El ácido nucleico diana amplificado se somete a un análisis de las curvas de fusión para determinar el valor de Tm real de la secuencia de ácidos nucleicos diana. El pico de fusión, que puede expresarse como -dF/dT, se genera a partir de la fusión del ácido nucleico diana amplificado y puede tener un intervalo similar a una curva de distribución a través de un intervalo de temperatura definido. En el extremo de temperatura baja, el molde de ácido nucleico diana amplificado está parcialmente desnaturalizado. A la temperatura más alta, la muestra completa de ácido nucleico diana amplificado está desnaturalizada. La temperatura necesaria para desnaturalizar el ácido nucleico diana durante el procedimiento de amplificación está dentro de esta distribución de temperatura. Inicialmente, se recomienda la temperatura más alta para garantizar la desnaturalización más completa. Posteriormente, puede usarse la temperatura más baja de la distribución como Tm inicial para un conjunto de cebadores diseñados para su uso en la amplificación antes de hacer cualquier cambio iterativo a los cebadores. La confirmación del estrecho intervalo de temperatura en el que pueden usarse los cebadores iniciales puede realizarse tanto en experimentos en serie como en paralelo de temperaturas de hibridación cada vez mayores. Alternativamente, los cebadores individuales pueden añadirse al molde amplificado y puede realizarse análisis de las curvas de fusión adicional en las curvas de fusión combinadas de cebador y molde. En cualquier caso, la Tm de los cebadores puede configurarse para solaparse con un estrecho intervalo de temperatura que contiene la Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana.

La mayor temperatura de hibridación de estos experimentos en los que la secuencia de ácidos nucleicos diana se amplifica específicamente y eficazmente puede considerarse la temperatura que define la temperatura de hibridación óptima para los cebadores existentes (por ejemplo, cebadores que se probaron). Estos mismos cebadores o cebadores ligeramente modificados pueden entonces volver a sintetizarse con químicas estabilizantes de la hibridación adicionales. Modificaciones a los cebadores para cambiar la Tm en la dirección deseada de manera que la Tm del cebador se solape con un estrecho intervalo de temperatura que contiene la Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Esto puede llevarse a cabo usando herramientas de diseño en línea, tales como la herramienta de diseño LNA disponible de Integrated DNA Technologies. Tales herramientas de diseño pueden usarse para estimar el número de modificaciones de LNA necesarias requeridas para aumentar la Tm del cebador para solaparse mejor con la curva de fusión de la secuencia de ácidos nucleicos diana.

En el caso de que los valores de Tm del cebador sean mayores que la mayor temperatura de fusión de la secuencia de ácidos nucleicos diana, puede ser necesario rediseñar los cebadores para que tengan una Tm más baja. Alternativamente, la cantidad de sales de catión divalente y/o monovalente u otros agentes desestabilizantes (por ejemplo, AgCl, DMSO, etc.) que se usan en el protocolo de amplificación (por ejemplo, PCR) puede reducirse para desestabilizar la hibridación de estos oligonucleótidos con el molde. En cualquier caso, en algunos casos puede ser necesaria una reducción en la Tm del cebador.

En algunos ejemplos, los cebadores pueden prepararse de manera que los protocolos de amplificación o enriquecimiento de los ácidos nucleicos diana puedan realizarse a diferencias de temperatura minimizadas durante los ciclos térmicos. Esto permite hacer los ciclos térmicos dentro de un estrecho intervalo de temperatura para promover la formación de un producto específico. Un intervalo de ciclos térmicos puede estar dentro de 15 °C de la Tm del ácido nucleico diana, más preferentemente dentro de 10 °C, incluso más preferentemente dentro de 5 °C, todavía más preferente dentro de 2,5 °C, y lo más preferente sustancialmente la misma Tm que la Tm del ácido nucleico diana. Por ejemplo, las condiciones de los ciclos térmicos para la amplificación del ácido nucleico diana abarcan el intervalo del pico de Tm /- aproximadamente 5 a 10 °C de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Tales estrechos intervalos de temperatura hacen posible amplificar ácidos nucleicos diana específicos sin ciclos térmicos entre temperaturas correspondientes a las etapas normales de amplificación por PCR (desnaturalización, hibridación y extensión). Por tanto, hace posible realizar amplificaciones y enriquecimientos en instrumentos de temperatura controlada comerciales que pueden establecerse a temperaturas seleccionadas o variarse dentro de estrechos intervalos de temperatura, tales como un horno, bloque térmico, o similares. La Figura 3 ilustra el gráfico de una amplificación por PCR de estrecho intervalo de temperatura con la misma secuencia de ácidos nucleicos diana que se muestra en la Figura 2, que muestra formación de producto más específica y se forman menos productos no deseados.

En algunos ejemplos, las temperaturas del ciclado térmico pueden seleccionarse en un estrecho intervalo de temperatura para limitar sustancialmente la amplificación para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana. Como tales, las condiciones de los ciclos térmicos pueden modificarse para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana modificando la temperatura de hibridación para que sea sustancialmente la misma que la base de temperatura más baja del pico de fusión para el amplicón. Por tanto, las condiciones de los ciclos térmicos pueden modificarse para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana modificando la temperatura de hibridación para que sea sustancialmente la misma que la base de temperatura más alta para el pico de fusión del amplicón.

En algunos ejemplos, la Tm del cebador puede seleccionarse de manera que la amplificación del ácido nucleico diana pueda realizarse a una temperatura que oscile entre aproximadamente 75 y aproximadamente 90 °C. Un intervalo de temperatura tal, o intervalo de 5 a 10 °C reducido en él, puede usarse para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos diana de ADN y/o de ARN para reducir la formación de productos no específicos durante el proceso de amplificación (por ejemplo, PCR).

En algunos ejemplos, la Tm del cebador puede seleccionarse de manera que la amplificación se realice a condiciones de amplificación isotermas en el intervalo de Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana para garantizar la formación de productos apropiada.

La presente divulgación incluye un método de diseño de un conjunto de cebadores que tiene una Tm con un ácido nucleico diana que está dentro de un estrecho intervalo de la Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Como tal, el conjunto de cebadores se diseña de manera que la Tm del cebador se solape con la curva de distribución de la Tm de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, el conjunto de cebadores puede usarse en ensayos de PCR en tiempo real de manera que la Tm del cebador se solape con la curva de distribución de la Tm para la secuencia de ácidos nucleicos diana de manera que pueda usarse un estrecho intervalo de temperatura para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, el cebador se puede diseñar de manera que tenga una Tm del cebador que esté dentro de aproximadamente 15 °C de la Tm del ácido nucleico diana, más preferentemente dentro de 10 °C, incluso más preferentemente dentro de 5 °C, todavía más preferentemente dentro de 2,5 °C, y lo más preferentemente sustancialmente la misma Tm que la Tm del ácido nucleico diana. Por tanto, esto puede incluir valores de Tm del cebador que se solapan con la curva de Tm del amplicón.

La presente divulgación incluye un proceso iterativo para diseñar cebadores. Un proceso iterativo tal puede incluir identificar una secuencia de ácidos nucleicos diana inicial como el amplicón diana, en el que la secuencia de ácidos nucleicos diana puede asociarse a una actividad biológica particular, tal como posible resistencia a fármacos. La secuencia de ácidos nucleicos diana se amplifica entonces con el fin de producir un producto amplificado, y el valor de Tm del producto amplificado (por ejemplo, amplicón) se determina usando análisis de las curvas de fusión convencional. El análisis de las curvas de fusión se utiliza entonces para determinar o calcular nuevos cebadores o conjuntos de cebadores para su uso en la amplificación del ácido nucleico diana. Los cebadores determinados o calculados se diseñan entonces con valores de Tm del cebador dentro del intervalo del pico de fusión generado por la fusión del producto amplificado. Los cebadores se preparan o sintetizan entonces para tener los valores de Tm del cebador diseñado.

En algunos ejemplos, las condiciones del protocolo para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana pueden modificarse a un pH apropiado para aumentar la especificidad de amplificar selectivamente el ácido nucleico diana con respecto a otros ácidos nucleicos. Como tal, el uso de un pH apropiado puede aumentar la capacidad para amplificar selectivamente la secuencia de ácidos nucleicos diana. Esto puede incluir el uso de un tampón de amplificación que puede permitir la activación de ADN polimerasas estables térmicas químicamente inactivadas. Por tanto, el ajustar el pH con tampones de amplificación seleccionados puede permitir que el protocolo de amplificación se realice a temperaturas reducidas, tales como aquellos intervalos de temperaturas que se han citado en el presente documento.

En algunos ejemplos, el pH del tampón de amplificación puede ajustarse para permitir la conversión de una enzima químicamente inactivada en el estado activado. Como tal, una enzima puede activarse en una condición ligeramente ácida; sin embargo, pueden usarse valores de pH básico para algunas enzimas. Para las enzimas activadas con ácido, tampones de PCR basados en Tris estándar pueden tener una dependencia significativa de la temperatura (por ejemplo, reduciendo 0,028 unidades de pH por grado C). La activación completa de la enzima (por ejemplo, ADN polimerasas estables térmicas químicamente inactivadas) desde el estado inactivado puede requerir que el pH sea inferior a aproximadamente 7, más preferentemente inferior a aproximadamente 6,75, y lo más preferentemente inferior a 6,5.

En algunos ejemplos, el protocolo de amplificación incluye el uso de tampones de pH más bajo de manera que la amplificación pueda realizarse a temperaturas de activación más bajas. Por ejemplo, para cada 10 °C por debajo de 95 °C, la temperatura de activación de la enzima puede reducirse 0,3 unidades de pH. Sin embargo, los límites a este enfoque son completamente una función de la química del colorante usado para la detección en tiempo real del molde amplificado (por ejemplo, la detección basada en fluoresceína ha reducido significativamente la fluorescencia por debajo de pH 7,3).

En algunos ejemplos, la Tm del cebador puede modificarse alterando el % de GC de la secuencia del cebador. Cambiando el % de GC, la Tm del cebador puede cambiarse selectivamente. Normalmente, el aumentar el % de GC puede aumentar la Tm, y el disminuir el % de GC puede disminuir la Tm. Sin embargo, hay casos en los que se desea un alto % de GC % que aumentará excesivamente la Tm. En tales casos pueden usarse desestabilizadores para permitir la inclusión de cebadores de alto contenido de % de GC o para el uso de secuencias de ácidos nucleicos diana de alto % de GC. Los desestabilizadores pueden disminuir selectivamente la temperatura del procedimiento de amplificación. Ejemplos de desestabilizadores incluyen DMSO, AgCl, y otros.

En algunos ejemplos, el diseño de los cebadores y/o las condiciones de amplificación pueden modularse para modular el tamaño de la secuencia de ácidos nucleicos diana que se amplifica. Esto puede incluir modular el diseño de los cebadores y/o las condiciones de amplificación de manera que el tamaño del amplicón sea significativamente mayor que el de los cebadores combinados solos. Esto puede incluir el amplicón que es 1-3 nucleótidos más largo que los cebadores, o 2 veces más grande que los cebadores, o 5 veces más grande que los cebadores, y más preferentemente 10 veces más grande que los cebadores.

En algunos ejemplos, los cebadores diseñados como se describe en el presente documento pueden emplearse en una matriz de procedimientos de amplificación con diferentes concentraciones de material de partida. Es decir, el material de partida puede repartirse en una matriz a concentraciones variables, y los cebadores pueden usarse con ella para el protocolo de amplificación de estrecha temperatura como se describe en el presente documento. El uso de los cebadores y el protocolo de amplificación de estrecha temperatura con una matriz de concentraciones variables de material de partida pueden usarse para la cuantificación de la cantidad de ácido nucleico diana en el material de partida. La Figura 4 es una gráfica que muestra el uso de los cebadores y el protocolo con una matriz de concentraciones variables de material de partida de manera que pueda cuantificarse la cantidad de material diana. III. Amplificación/enriquecimiento de ácidos nucleicos diana

En algunos ejemplos, métodos proporcionados en el presente documento incluyen una etapa de amplificar o enriquecer el ácido nucleico diana. Un método tal puede incluir un procedimiento sustancialmente similar a los métodos muy conocidos de amplificación del genoma completo y amplificación del transcriptoma completo. Esto puede incluir amplificar un genoma con una etapa de generación de bibliotecas de genoma, que puede ir seguido de una etapa de amplificación de bibliotecas. Por tanto, la etapa de generación de bibliotecas puede utilizar los cebadores específicos o mezclas de los cebadores específicos descritos en el presente documento con una ADN polimerasa o transcriptasa inversa. Pueden diseñarse mezclas de cebadores específicos con los cebadores para eliminar la capacidad de auto-hibridación y/o hibridación con otros cebadores dentro de una mezcla, pero que permitan que los cebadores ceben eficaz y frecuentemente la secuencia de ácidos nucleicos diana, en los que los cebadores pueden diseñarse como se describe en el presente documento.

En algunos ejemplos, se proporcionan métodos para determinar simultáneamente un perfil de expresión genética para un miembro individual de una especie con respecto a un genoma estándar entero para la especie. Los métodos pueden comprender distribuir una muestra de líquido de material genómico en una matriz de cámaras de reacción de un sustrato. La matriz puede comprender un conjunto de cebadores y una sonda para cada secuencia de ácidos nucleicos diana a lo largo del genoma estándar entero. La muestra de líquido puede comprender sustancialmente todo el material genético del miembro. Cada una de las cámaras de reacción puede comprender el conjunto de cebadores y la sonda para al menos una de las secuencias de ácidos nucleicos diana y una polimerasa. Los métodos pueden comprender además amplificar la muestra de líquido en la matriz, detectar una señal emitida por al menos una de las sondas, e identificar el perfil de expresión genética en respuesta a la señal.

Como el aislamiento de cantidades adecuadas de microorganismos, tales como MTb, de muestras de esputo puede ser un reto significativo, pueden usarse técnicas de amplificación del genoma descritas en el presente documento en lugar de protocolos de cultivo y purificación tradicionales. Aunque muchas técnicas de diagnóstico molecular permiten la detección de cantidades muy pequeñas de material de partida genético (por ejemplo, de tan solo una única copia de una secuencia de ácidos nucleicos diana), frecuentemente es difícil garantizar que una muestra particular contenga en realidad la copia única deseada de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Para permitir probar con exactitud muestras muy raras o preciadas en procedimientos de diagnóstico molecular, se ha empleado una técnica conocida como amplificación del genoma completo para enriquecer el material de partida para su uso en los procedimientos de diagnóstico molecular aguas abajo. El método descrito aquí aplica el método de amplificación del genoma completo al problema del cribado de MTb de muestras de esputo que frecuentemente contienen tales bajas cantidades de organismo vivo. De otro modo, procedimientos convencionales pueden usar cepas aisladas de MTb, que deben cultivarse durante hasta 2 meses para garantizar que puedan obtenerse cantidades suficientes de material genético de la muestra para aplicaciones de diagnóstico molecular.

Usando técnicas de amplificación del genoma completo desarrolladas para el enriquecimiento in vitro de muestras de ADN y/o ARN raras y preciadas, se ha desarrollado un método de enriquecimiento de material genético novedoso para enriquecer muestras que contienen un ADN de microorganismo, tal como ADN de MTb. Esta técnica permite evitar métodos de cultivo convencionales que hasta la fecha han sido usados para aumentar concentraciones de microorganismos, que frecuentemente se requieren para diagnósticos moleculares aguas abajo. Una técnica de amplificación del genoma completo tal usa pequeñas cantidades de ADN genómico de muestras de microorganismo directamente lisadas. Las muestras que contienen microorganismo vivo que han sido aisladas usando el método de Petroff pueden lisarse directamente por un producto comercialmente disponible, y las pequeñas cantidades resultantes de ADN de microorganismo pueden someterse a técnicas de amplificación del genoma completo para proporcionar un amplicón para su uso en aplicaciones de diagnóstico molecular aguas abajo. Aunque el procedimiento para emplear la técnica de amplificación del genoma completo se describe con respecto a MTb, se reconoce que una técnica tal puede aplicarse a cualquier microorganismo.

Usando un método de preparación de organismos vivos convencional, el método de Petroff, el MTb aislado se fracciona de la muestra de esputo dejando pequeñas cantidades del organismo en una suspensión de agua. Siguiendo el protocolo del fabricante de la disolución de lisis de Mycobacterium, MycoBuffer (RAOGene; Milford, PA), pequeñas cantidades de ADN de MTb se aíslan en el material residual del producto de MycoBuffer. El uso de esta muestra de ADN directamente lisada y combinándola con componentes de reacción similares a aquellos usados en procedimientos de amplificación del genoma completo permite el enriquecimiento molecular de la muestra ADN. Un procedimiento tal puede proporcionar elevadas cantidades del genoma de MTb, por ejemplo, superiores a 30 veces en menos de 16 horas de tiempo de incubación. Este nivel de enriquecimiento de muestras puede producir cantidades suficientes de material genómico de MTb para permitir el uso de este material enriquecido en procedimientos de diagnóstico molecular aguas abajo en menos de un día en comparación con los actuales métodos que pueden durar más de 2 meses de cultivo de MTb de las cepas aisladas de MTb antes de las pruebas de diagnóstico.

La técnica de amplificación del genoma completo puede usarse con una o muchas ADN polimerasas con el fin de mejorar los resultados de enriquecimiento tanto reduciendo el tiempo requerido para el enriquecimiento como aumentando la cantidad de material enriquecido resultante. Esto puede usarse para amplificar ARN y/o ADN. Por tanto, la técnica de amplificación puede usarse con enzimas transcriptasa inversa tanto solas como en combinación con enzimas ADN polimerasa para enriquecer muestras para componentes de ARN del material lisado. Adicionalmente, la técnica de amplificación puede usarse con uno o muchos parámetros de cebado de ácidos nucleicos diana diferentes. Ejemplos de los parámetros de cebado que pueden modularse incluyen los siguientes: los cebadores de tamaño; cebadores aleatorios; cantidad de cebadores aleatorios; cebadores diana específicos; cebadores específicos de región; y combinaciones de los mismos. La modulación de tales parámetros de cebado puede mejorar la amplificación del genoma completo o la amplificación específica de región dentro de las muestras. Además, la técnica de amplificación puede usarse con diversas mezclas de tampón para mejorar el enriquecimiento de la muestra. Además, la técnica de amplificación puede usarse con diversas concentraciones de elementos estructurales de ácido nucleico, que pueden proceder de fuentes naturales o sintéticas. Todavía más, la técnica de amplificación puede realizarse en cualquier instrumento capaz de mantener una temperatura constante o temperatura variable durante un estrecho intervalo de temperatura (por ejemplo, un instrumento capaz de mantener una temperatura establecida, tanto establemente como con perfiles térmicos programables). Las condiciones de reacción pueden incluir alguna variación de temperatura dentro del intervalo de temperatura durante el proceso de enriquecimiento con el fin de mejorar la cantidad de material genético enriquecido o para especificar el enriquecimiento de regiones específicas del material genético, tal como la secuencia de ácidos nucleicos diana.

Por ejemplo, el material genómico de la muestra puede aislarse usando cualquier método que liberará los ácidos nucleicos de microorganismo (por ejemplo, MTb) en disolución o en un colector de fase sólida. El material genómico de la muestra puede aislarse de muestras distintas de esputo, tales como, pero no se limitan a, sangre, líquido cefalorraquídeo cerebral, lesiones de piel, lesiones de órgano, o de muestras ambientales. El material genómico de la muestra puede enriquecerse usando un método de enriquecimiento similar a la amplificación del genoma completo o amplificación por PCR anidada. Éste puede permitir que regiones que rodean la secuencia de ácidos nucleicos diana se amplifiquen usando un método de ciclos térmicos en combinación con cebadores específicos (por ejemplo, cebadores que tienen una Tm como se describe en el presente documento) para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana. Por tanto, pueden usarse cebadores no específicos para amplificar el genoma en un tipo de PCR anidada de amplio genoma.

La muestra de ácido nucleico de Mycobacterium tuberculosis en la disolución de Mycobuffer puede prepararse a partir del protocolo de extracción de ácido nucleico proporcionado por el comerciante o por cualquier método convencional. El ácido nucleico puede ser tanto ADN como ARN de la muestra de microorganismo que va a enriquecerse, en la que el ácido nucleico puede estar intacto, fragmentado, o porciones del ácido nucleico de organismos enteros. La mezcla de enriquecimiento puede incluir tampones de ADN y/o ARN polimerasa adecuados, trifosfatos de desoxinucleótido, sales apropiadas para la enzima específica y sistema tampón, y cebadores de oligonucleótidos aleatorios. Ejemplos de la longitud del cebador pueden incluir cebadores de 6 bases, 11 bases y 22 bases (¿Deberían los presentes inventores ampliar esto?). Los cebadores pueden ser oligonucleótidos de fosfodiéster, oligonucleótidos de LNA, oligonucleótidos de PNA, o cualquier combinación de los mismos; sin embargo, también se espera que futuras químicas que pueden producir la amplificación o un enriquecimiento del ADN o ARN diana interrogado funcionen apropiadamente en esta técnica. También puede estar incluida en la mezcla una proteína de unión a ADN o ARN monocatenario para mejorar el rendimiento global de la etapa de enriquecimiento.

Puede realizarse una técnica de amplificación a modo de ejemplo del siguiente modo: los ácidos nucleicos diana de la muestra de prueba se combinan en un tampón de polimerización adecuado con sales apropiadas, con un cebador de oligonucleótidos aleatorio (por ejemplo, 6, 11 o 22 bases, o cualquiera de los cebadores o longitudes de cebadores presentados en la Tabla 2), y los ácidos nucleicos se desnaturalizan a una temperatura suficientemente alta para garantizar que la desnaturalización sea al menos sustancialmente completa, preferentemente completa; las muestras desnaturalizadas se mantienen a casi condiciones desnaturalizantes, o en un entorno de temperatura que permitirá que la secuencia de ácidos nucleicos diana de la muestra experimente condiciones de hibridación desestabilizadas; las muestras se enfrían entonces suficientemente para permitir que los cebadores se hibriden con la secuencia diana, en el que la secuencia diana está contenida dentro de cualquiera del genoma completo o fragmentos del mismo; elementos estructurales de ácido nucleico apropiados se añaden a la mezcla, que son tanto trifosfatos de desoxinucleótido, o trifosfatos de ribonucleótido, como bases de ácido nucleico posiblemente no naturales o artificiales que pueden incorporarse con los productos formados; enzimas apropiadas (por ejemplo, ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, cualquier combinación de las mismas, o similares) para los objetivos de enriquecimiento se combinan entonces; y la amplificación se realiza a la estrecha temperatura con el fin de amplificar selectivamente la secuencia de ácidos nucleicos diana.

IV. Cribado de ácidos nucleicos diana para determinar la resistencia a fármacos

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos amplificados descritos en el presente documento pueden emplearse en un método para cribar la secuencia de ácidos nucleicos diana para la presencia y/o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos o cambio en la secuencia de ácidos nucleicos indicativo de resistencia a fármacos. Es decir, los ácidos nucleicos amplificados pueden cribarse para una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada usando desnaturalización de alta resolución con el fin de determinar si el microorganismo puede ser resistente a fármacos a un fármaco seleccionado. Como tales, pueden usarse diagnósticos moleculares de ácidos nucleicos para detectar cambios genéticos en secuencias de ácidos nucleicos diana, en los que los cambios en la secuencia pueden ser una indicación de que el microorganismo es resistente a un fármaco. Por consiguiente, pueden analizarse secuencias genéticas conocidas que están alteradas en cepas resistentes a fármacos para determinar si hay alguna de tales alteraciones en las secuencias del gen. Tales alteraciones genéticas son frecuentemente indicativas de susceptibilidad alterada del patógeno al tratamiento por fármacos, que frecuentemente se manifiesta por ser resistente a fármacos.

Típicamente, las técnicas existentes requieren un conocimiento previo de las mutaciones específicas en los ácidos nucleicos genéticos que están relacionadas con las dianas de fármaco (por ejemplo, el ácido nucleico es tanto la diana de fármaco como produce un producto génico que es la diana de fármaco). Esta información se usa para cribar para resistencia a fármacos, y cualquier cambio en el material genético del patógeno que no esté siendo probado puede omitirse específicamente durante el proceso de cribado. El método descrito en el presente documento no requiere ningún conocimiento previo de los cambios específicos. Como tal, se estudia una región general de los ácidos nucleicos genéticos del patógeno (por ejemplo, ADN, ARN, etc.) para ver si hay alguna variación en la secuencia que sea tanto la diana directa del fármaco como codifique la diana directa del fármaco. Por tanto, cambios en el material genético en una región tal de los ácidos nucleicos genéticos del patógeno puede hacer que los fármacos terapéuticos individuales sean ineficaces o reduzcan su eficacia. Esta técnica permite la rápida identificación de cualquier cambio genético a secuencias de ácidos nucleicos diana de fármaco, y puede proporcionar mayor sensibilidad a ser capaz de detectar cambios esperados, además de inesperados, en las secuencias de ácidos nucleicos diana del fármaco. Por consiguiente, los métodos de la presente divulgación pueden usarse para generar perfiles de sensibilidad a fármacos de cualquier cepa aislada de microorganismo particular de manera que pueda establecerse la verosimilitud de la resistencia a fármacos.

En algunos ejemplos, el método de cribado incluye determinar si un microorganismo específico está presente en una muestra. Por tanto, puede determinarse la cantidad de material genético del microorganismo. Cualquier muestra positiva se procesa entonces en el presente documento con el fin de amplificar la cantidad de material genético. Esto puede incluir combinar la muestra con cebadores o conjuntos de cebadores que se hibridan con un ácido nucleico diana en condiciones que amplifican la secuencia diana. Por tanto, el material genético de la muestra puede combinarse con una secuencia de ácidos nucleicos diana normal o un control de sonda de secuencia normal (por ejemplo, fluorescente o no fluorescente) que no tiene ninguna variación genética para preparar una relación de ~1:1, que es material genético de prueba y de control casi equivalente. Sin embargo, es posible variar esta relación sustancialmente, tal como de 1:10a 10:1.

Se combinan la secuencia de ácidos nucleicos diana normal o secuencia de sonda normal (por ejemplo, ácido nucleico de control) con el material genético de la muestra (por ejemplo, ácido nucleico de muestra), y entonces se aplica en un único tubo de reacción. Alternativamente, el ácido nucleico de control y el ácido nucleico de muestra pueden mezclarse después de procedimientos de amplificación separados. Un ácido nucleico de control del ácido nucleico diana normal solo también se amplifica simultáneamente (sin embargo, con mejoras para distinguir hebras individuales de ácidos nucleicos, puede ser posible ejecutar el control dentro de la misma reacción como la muestra que está siendo interrogada). Los perfiles de desnaturalización del ácido nucleico de control y el ácido nucleico de muestra pueden entonces determinarse por análisis de las curvas de fusión de alta resolución de los ácidos nucleicos de control y de la muestra. Regiones de ácido nucleico normal, o de tipo silvestre, a modo de ejemplo con mutaciones conocidas que se corresponden con un cambio en la resistencia a fármacos se enumeran en la Tabla 3.

Los datos del perfil de desnaturalización para estas pruebas pueden almacenarse electrónicamente. Como tales, los datos de control o de la muestra pueden recuperarse de un análisis previo de manera que pueden usarse para una comparación de los resultados. La capacidad de guardar los datos del perfil de desnaturalización puede eliminar la necesidad de realizar siempre una reacción de control con cada serie de la muestra de prueba. Los datos para las muestras se comparan con los datos para el control de diana normal, y cualquier diferencia o variación entre los dos conjuntos de datos se puntúa como una variación en la región diana para la muestra desconocida. Cuando la muestra incluye una variación, la muestra (es decir, el microorganismo) se clasifica como que es posiblemente resistente al fármaco que se dirige a la región genética (por ejemplo, secuencia de ácidos nucleicos diana) que es el objeto de la prueba.

En algunos ejemplos, un ácido nucleico diana de la muestra (por ejemplo ADN o ARN) se prepara con ácido nucleico diana de control para obtener una mezcla de ácido nucleico diana de la muestra y de control a aproximadamente una relación 1:1. Esto puede lograrse mezclando los ácidos nucleicos de la muestra y de control, o co-amplificando los ácidos nucleicos de la muestra y de control (por ejemplo, por PCR) a aproximadamente una relación 1:1 de material de partida. Estos ácidos nucleicos de la muestra y de control se desnaturalizan inicialmente a una temperatura suficientemente alta para garantizar que los ácidos nucleicos diana de la muestra y los ácidos nucleicos diana de control normales estén todos desnaturalizados. Los ácidos nucleicos en la mezcla (por ejemplo, muestra y control) se hibridan entonces a alguna temperatura por debajo de la temperatura de fusión a la que empiezan a desnaturalizarse (por ejemplo, Tm). Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede estar 10 °C o más por debajo de la Tm del ácido nucleico de control diana. La mezcla se somete entonces a calentamiento lento, y se monitoriza la cantidad de ácidos nucleicos de la muestra y de control hibridados presentes en el tubo. La monitorización puede realizarse por fluorescencia del producto de ácido nucleico bicatenario, en el que la fluorescencia se genera por la inclusión de un colorante que se une solo a ácidos nucleicos bicatenarios. El colorante puede incluirse en una cantidad que sature el molde. La señal fluorescente se pierde a medida que los ácidos nucleicos bicatenarios empiezan a desnaturalizarse, y están disponibles menos sitios para unirse al colorante de saturación. El procedimiento de desnaturalización continúa hasta que no está presente ácido nucleico bicatenario, y la fluorescencia es casi cero. Los datos fluorescentes obtenidos durante el procedimiento de desnaturalización se guardan entonces para el cálculo y se comparan con los datos de desnaturalización de control que se preparan con un protocolo similar usando solo el ácido nucleico de control diana. Como tal, puede realizarse un análisis de las curvas de fusión de alta resolución con la mezcla de la ácidos nucleicos de la muestra y de control y la composición que tiene solo los ácidos nucleicos de control, y puede hacerse una comparación entre las dos curvas de fusión. Una diferencia entre las curvas de fusión puede ser una indicación de que los ácidos nucleicos de la muestra son de un microorganismo que tiene resistencia a fármacos al fármaco que interacciona con el ácido nucleico diana o producto génico del mismo.

En algunos ejemplos, puede usarse cualquier protocolo o instrumento que pueda distinguir entre los ácidos nucleicos de la muestra y de control hibridados de los ácidos nucleicos de la muestra y de control desnaturalizados. Los datos de desnaturalización obtenidos de las curvas de desnaturalización de muestras que se generaron a partir de la mezcla que tiene los ácidos nucleicos de la muestra y de control se comparan con los datos de desnaturalización del ácido nucleico de control. Los datos de desnaturalización del ácido nucleico de control pueden ser tanto datos de desnaturalización de control guardados como el ácido nucleico de control puede desnaturalizarse y monitorizarse en una cámara de reacción separada junto con la muestra experimental. Los perfiles de fusión de la diana de control normal se comparan con la muestra experimental de manera que cualquier diferencia en estos perfiles de fusión pueda indicar la presencia de una variación en la región diana. Cuando el control es un ácido nucleico diana de control normal, las variaciones en las secuencias pueden indicar que el microorganismo es resistente al fármaco que interacciona con el ácido nucleico diana o producto génico del mismo.

En algunos ejemplos, las secuencias co-amplificadas de ADN de MTb enriquecido y ADN de MTb de control se desnaturalizan simultáneamente, y entonces se hibridan para producir homodúplex de ADN de MTb de control y ADN de MTb enriquecido amplificados, y también producen heterodúplex de ADN de Mtb de control y enriquecido. Un colorante de saturación de unión a ^a Dⁿ bicatenario, tal como un colorante que fluoresce cuando interacciona con un ácido nucleico de dúplex, se incluye en la mezcla de amplificación para permitir la generación de datos de curvas de fusión de alta resolución de estos homodúplex y heterodúplex. Como tales, las muestras hibridadas de homodúplex y heterodúplex, además del ADN de MTb de control, se someten a análisis de las curvas de fusión de alta resolución que se monitoriza usando fluorescencia u otro método de detección del colorante de unión.

Los datos obtenidos de la monitorización de la fusión de alta resolución de los homodúplex, heterodúplex y ADN de MTb de control se introducen en un sistema de cálculo de manera que puedan emplearse métodos de cálculo para analizar los datos. Entonces se calcula una comparación matemática de los datos de la muestra de ADN de MTb de control sin ADN de muestra enriquecido añadido con la muestra que contiene los homodúplex y heterodúplex co­ amplificados. La comparación matemática, después de la normalización de las curvas por temperatura y puntos iniciales y finales, permite la resta de cada punto de datos a lo largo de la curva de fusión de la muestra que contiene el producto co-amplificado de los datos de la muestra de ADN de Mtb de control. El gráfico resultante para muestras invariables que tienen secuencias que no son sustancialmente diferentes del ADN de MTb de control es esencialmente una línea recta con variación menor de aproximadamente cero. Una gráfica para muestras que tienen ADN de heterodúplex (por ejemplo, ADN de control con ADN de muestra enriquecido) que contiene apareamientos erróneos del apareamiento de bases mostrará un cambio en la curva de fusión, y cuando se someta al algoritmo de resta producirá un gráfico claramente diferente del gráfico plano de secuencias de control e invariables.

Las muestras que contienen gráficos variables de los gráficos de muestra de control se puntúan como variables en la región diana de fármaco (por ejemplo, diana de ácido nucleico), y es probable que los microorganismos sean menos susceptibles (por ejemplo, resistentes) a la acción del fármaco para esta región genética. Por tanto, varias regiones del ácido nucleico diana de fármaco pueden amplificarse simultáneamente en diferentes cámaras de reacción para un único paciente o para múltiples pacientes.

Las Figuras 6A-6C proporcionan ilustraciones que muestran los resultados de métodos de perfiles de las curvas de fusión de alta resolución para determinar la presencia de una variación en una secuencia de ácidos nucleicos diana de muestra de una secuencia de ácidos nucleicos diana normales. La presencia de variación es una indicación de que el microorganismo es resistente a un fármaco, tal como rifampicina. Más particularmente, la Figura 6A representa los productos de hibridación, tanto por amplificación por PCR como por método de enriquecimiento de molde alternativo, de cepas normales (por ejemplo, ácidos nucleicos de cepas no resistentes) y resistentes. El molde normal (por ejemplo, ácido nucleico diana de control) se incluye en la mezcla con el ácido nucleico diana de la muestra para producir un apareamiento imperfecto entre los ácidos nucleicos que van a hibridarse. La Figura 6B muestra curvas de fusión que tienen ligeras diferencias entre las dos curvas de fusión, que son diferencias en los perfiles de fusión del ácido nucleico diana de control y la mezcla con el ácido nucleico diana de la muestra. La Figura 6C muestra una diferencia en las curvas de fusión entre el control y la muestra. El perfil de ácido nucleico diana de control normal se representa como la muestra en línea continua, que no tiene diferencia del ácido nucleico “normal” de microorganismos que son sensibles al fármaco. La línea discontinua muestra una diferencia distinta entre la muestra “normal” y la muestra erróneamente apareada, que indica que el microorganismo es una cepa resistente. La Figura 7 es una representación gráfica del análisis de las curvas de fusión de alta resolución entre /- ácido nucleico de control, ácidos nucleicos de una cepa resistente y ácidos nucleicos de una cepa que es sensible al fármaco. El gráfico se preparó usando un software de llamada de diferencias de curvas automatizadas (Idaho Technology, LightScanner), y muestra la capacidad para distinguir muestras resistentes de muestras sensibles. Cualquier muestra que se llame, por el software, como la misma que el control negativo es sensible al fármaco, y cualquier muestra llamada como diferente del control negativo se clasifica como resistente al fármaco. El paquete de análisis puede configurarse en cualquier disposición deseada. Alternativamente, cualquier método que pueda representar gráficamente la diferencia entre las formas de las curvas, especialmente en la región superior de la curva, puede usarse para diferenciar entre la secuencia 'normal' y la secuencia de prueba que posiblemente contiene un apareamiento erróneo. Además, pueden observarse diferencias directamente de las curvas de fusión sin análisis adicional.

En algunos ejemplos, el análisis de las curvas de fusión de alta resolución puede usarse en cualquier prueba genética para la detección de variación o similitudes entre ácidos nucleicos de la muestra y ácidos nucleicos de control normales.

En algunos ejemplos, la amplificación y/o desnaturalización puede usarse para cribar muestras normales usando diversas sondas alteradas en lugar de sondas de una secuencia normal.

En algunos ejemplos, la amplificación y/o desnaturalización puede ser para cribar ácidos nucleicos mutados, no normales, diana usando sondas alteradas apropiadamente diseñadas.

En algunos ejemplos, la amplificación y/o desnaturalización puede usarse para detectar cosas en común entre muestras, tales como pruebas de identificación forense.

En algunos ejemplos, la amplificación y/o desnaturalización puede usarse para la inspección epidemiológica de diferentes muestras.

En algunos ejemplos, las sondas usadas en la amplificación pueden ser tanto ADN como ARN (por ejemplo, natural, o sintético, o de fuentes amplificadas).

En algunos ejemplos, la amplificación y/o desnaturalización puede usarse para confirmar la presencia de secuencias de tipo silvestres.

En algunos ejemplos, la amplificación y/o desnaturalización puede usarse para confirmar la presencia de secuencias de tipo silvestres para demostrar adicionalmente que la muestra de prueba procede de un organismo que será sensible al fármaco representado por esa región.

En algunos ejemplos, la amplificación puede realizarse con métodos de PCR en tiempo real o convencional. Por tanto, puede usarse cualquier método de amplificación que producirá cantidades suficientes de ácidos nucleicos de control normales y/o material genético de la región diana para permitir la detección por un instrumento con capacidades de detección adecuadas.

En algunos ejemplos, el sistema de detección de la desnaturalización o del análisis de las curvas de fusión puede ser cualquier instrumento de fusión de alta resolución o un instrumento apropiadamente adaptado capaz de generar resolución suficiente con capacidades de calentamiento y de detección de muestras básicas.

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos normales y de la muestra pueden amplificarse por PCR en un único tubo. Alternativamente, los ácidos nucleicos normales y de la muestra pueden amplificarse en tubos separados y entonces mezclarse antes del análisis de las curvas de fusión de alta resolución.

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos normales pueden recuperarse de disoluciones madre, y entonces mezclarse con los ácidos nucleicos de la muestra amplificados en relaciones apropiadas para generar resultados similares.

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos normales que se usan como control pueden distinguirse de las mezclas con los ácidos nucleicos de la muestra usando una variedad de químicas con el fin de producir un control interno. Esto puede incluir el uso de diferentes químicas, tales como el uso de ácidos nucleicos de control normales fluorescentemente marcados. Como tales, solo dúplex que se forman a partir de los ácidos nucleicos de control marcados pueden generar una señal de fusión fluorescente, que es específica para el molde de control normal. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos de la muestra y los ácidos nucleicos de control pueden compararse después de que tanto la muestra como el control se amplifiquen y/o desnaturalicen en diferentes series, que podrían ser en diferentes días.

En algunos ejemplos, el análisis de las curvas de fusión de alta resolución puede realizarse en cualquier instrumento capaz de desnaturalizar y/o hibridar ácidos nucleicos, y capaz de detectar la cantidad de ácidos nucleicos hibridados en comparación con los ácidos nucleicos desnaturalizados.

En algunos ejemplos, sensibilidad del instrumento suficiente puede permitir el análisis de las muestras como se describe en el presente documento sin tener que amplificar los ácidos nucleicos de la muestra. Es decir, el instrumento tiene sensibilidad suficiente de manera que los ácidos nucleicos de la muestra sean detectables sin amplificación.

En algunos ejemplos, el análisis de los ácidos nucleicos de la muestra se realiza con hibridación de alta resolución que monitoriza los ácidos nucleicos a medida que se hibridan. En parte, esto es posible debido a que la hibridación de los ácidos nucleicos diana de la muestra y el control pueden usarse como medio para identificar diferencias entre el molde de control y las muestras de prueba en vez de solo usando el análisis de las curvas de fusión o desnaturalización.

Se divulgan en el presente documento métodos para estudiar ADN y/o ARN de una muestra microbiológica u otra muestra biológica para variaciones genéticas. Los ácidos nucleicos pueden ser intactos, fragmentados, o porciones del ácido nucleico del organismo entero o la región diana del ácido nucleico. Los cebadores pueden seleccionarse de una región de o adyacente a la porción del ácido nucleico diana que va a interrogarse. Los cebadores pueden ser no fluorescentes, fluorescentes, o capaces de producir tanto una señal electrostática como electroquímica.

Las composiciones de amplificación pueden incluir las siguientes: componentes de reacción en cadena de la polimerasa, incluyen transcriptasa inversa, y/o ADN polimerasa; tampones apropiados, sales y trifosfatos de desoxinucleótido y/o desoxirribonucleótido para amplificar la secuencia diana; un colorante de unión a ADN bicatenario fluorescente, sonda fluorescente, sondas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, o puede usarse otra sonda similar para detectar la formación del ARN hibridado frente al desnaturalizado, o homodúplex y/o heterodúplex de ADN/ARN; cebadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar específicamente la región diana del ácido nucleico de muestra y el ácido nucleico de control normal, en las que los cebadores pueden ser oligonucleótidos de fosfodiéster, oligonucleótidos LNA, oligonucleótidos PNA, o cualquier combinación de estos.

Los instrumentos que pueden usarse para el análisis del ácido nucleico de muestra pueden ser cualquier instrumento capaz de detectar la formación y disolución del dúplex de ADN/ADN, ARN/ARN, o ADN/ARN, y en ejemplos adicionales, dúplex de ADN/proteína o ARN/proteína, u homotríplex/homocuádruplex de ADN. Un instrumento tal debe ser capaz de generar fuertes señales fluorescentes cuando las dianas se hibridan y monitorizan el cambio en la fluorescencia a medida que se desnaturalizan los ácidos nucleicos diana. Los datos del instrumento pueden registrarse en un sistema de cálculo que tiene software configurado para realizar el análisis de datos. Por tanto, el instrumento puede configurarse para realizar tanto la amplificación como la hibridación/desnaturalización del ácido nucleico. Sin embargo, es posible realizar estas funciones en varios instrumentos distintos sin ningún detrimento a los resultados. Una configuración alternativa sería un instrumento que pudiera monitorizar el estado hibridado y desnaturalizado de las secuencias diana por luz ultravioleta, generación de señales electroquímicas, viscosidad en disolución, u otras técnicas no desarrolladas hasta ahora.

Los datos obtenidos del análisis de amplificación y la hibridación/desnaturalización pueden analizarse con cualquier paquete de software configurado para determinar las diferencias entre datos. Por ejemplo, puede usarse un paquete de software, actualmente disponible de Idaho Technology, o Corbett Research, y pronto de Roche Applied Science, que se diseña para comparar los perfiles de fusión de una diana normal de aquellas de las muestras en las que la diana normal se hibrida para identificar ningún cambio, o diferencias menores o mayores. El formato exacto del resultado del software no es importante, sin embargo, el software debe simplemente poder identificar aquellas muestras que tienen variaciones de los perfiles de curvas de fusión normales en comparación con aquellas que son normales.

Los siguientes Aspectos de Ejemplo de aspectos específicos para llevar a cabo la presente invención se ofrecen solo con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Aspectos de Ejemplo

EJEMPLO 1 - AMPLIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS REGIONES DE SENSIBILIDAD AL FÁRMACO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

A. Amplificación del genoma completo de ADN genómico de M. tuberculosis

Si las cantidades de ADN de la muestra son insuficientes para obtener un producto amplificado de una región sensible al fármaco, entonces puede usarse enriquecimiento del genoma completo para amplificar el ADN de la muestra antes de la amplificación de regiones específicas, o amplicones. El enriquecimiento del genoma completo en la muestra de MycoBuffer se realizó en paralelo con un número de copias de partida idéntico de ADN molde que se suspendió en agua sola. Para monitorizar el enriquecimiento del genoma completo global de Mycobacterium tuberculosis, se eligieron 3 regiones diana distintas del genoma de Mycobacterium para evaluar cada una para el enriquecimiento. Se usó un método de ensayo de PCR en tiempo real para cribar cada una de estas distintas regiones diana para el enriquecimiento en comparación con las muestras de control no enriquecidas. El punto sobre el eje x en el que la línea de muestra empieza a tender hacia arriba es indicativo de la cantidad de material de partida genético en la muestra, cuanto antes empiece a cambiar la señal en el eje x mayor es la cantidad de material de partida.

La Figura 5A es una gráfica que muestra los resultados obtenidos de la región diana CFP32 de Mycobacterium tuberculosis, que compara el cebador de aleatorio de 22 bases mezclado con muestras en agua o MycoBuffer. El gráfico muestra que la muestra enriquecida con MycoBuffer tiende hacia arriba antes e indica una mayor cantidad de material de partida.

La Figura 5B es una gráfica que muestra los resultados obtenidos de la región diana IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, que compara el cebador de aleatorio de 22 bases mezclado con muestras en agua o MycoBuffer. De nuevo, el gráfico muestra que la muestra enriquecida con MycoBuffer tiende hacia arriba antes e indica una mayor cantidad de material de partida.

La Figura 5C es una gráfica que muestra los resultados obtenidos de la región diana btMTb de Mycobacterium tuberculosis, que compara el cebador de aleatorio de 22 bases mezclado con muestras en agua o MycoBuffer. Aún de nuevo, el gráfico muestra que la muestra enriquecida con MycoBuffer tiende hacia arriba antes e indica una mayor cantidad de material de partida.

B. Preparación de muestras

Usando el método de Petroff de esterilización de muestras de esputo, se separó MTb de material celular humano. En resumen, el método de Petroff es del siguiente modo: el método de Petroff, se homogeneizó esputo durante 15 min en un agitador usando un volumen igual de 4 % de hidróxido sódico. Después de la centrifugación a 3.000 rpm durante 15 min en una Megafuge 1.0 (Heraeus), el depósito se neutralizó con aproximadamente 20 ml de agua destilada estéril. Las muestras se centrifugaron de nuevo. El 'depósito' o material sedimentado se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se lisa con Mycobuffer (RAOGene, Inc, Milford, PA) según las instrucciones del fabricante. El material de sobrenadante del protocolo de lisis contiene el ADN micobacteriano, y se transfiere a un tubo de microcentrífuga nuevo.

C. Cribado primario para la presencia de ADN de M. tuberculosis en una muestra

Se realizó cribado no cuantitativo para ADN micobacteriano en muestra usando Fluoresentric MTb Screen (método HTPCR) combinando los siguientes componentes en una reacción de 20 ul, los productos pueden detectarse por PCR en tiempo real con sondas, o detección electroquímica, o por electroforesis en gel, o cualquier otro método adecuado. Aquí los presentes inventores describen el uso de PCR en tiempo real para detectar la formación de producto:

Combinar:

10xtampón FI15: (Tris-HCl 500 mM (pH 8,0); 5 mg/ml de albúmina de suero bovino (no acetilada); MgCl210 mM, 40 % de sulfóxido de dimetilo) usar a 1x concentración final.

10 x trifosfatos de desoxinucleótido (2 mM cada uno) usar a 1x.

10x LC Green I (Idaho Technology, Inc.) usar a 0,5x.

ADN polimerasa termoestable (Tfi (exonucleasa -) (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) usar 2,5 U/reacción.

Los cebadores de oligonucleótido se diseñaron para tener solapamiento de temperatura con el gen que codifica la proteína de la familia PPE. Cebadores para el producto amplificado:

FI15-MTb FOR: CCGGAAACGTCGGCATCGCAAACTC (SEQ ID NO.205)

FI15-MTb REV: TGCCCGTGTTGTAGAAGCCCGTGTTGAA (SEQ ID NO.206)

Gen de la familia PPE

Añadir Mycobuffer/muestra de ADN a la reacción.

Amplificar según el siguiente protocolo:

Desnaturalización a 95 °C: 1 min

Activación a 75 °C: 10 minutos

90 ciclos de:

85 °C durante 30 s

75 °C durante 30 s con una adquisición fluorescente

1 ciclo de fusión:

95 °C durante 10 s

60 °C durante 10 s

Aumento hasta 95 °C tomando adquisiciones de fluorescencia a lo largo de la rampa de temperatura para generar una curva de fusión del producto.

Los productos finales pueden demostrar perfiles de fusión variables, como se muestra en la Figura 8. Aquellas reacciones que amplifican un producto específico son indicativas de la presencia de ADN de MTb en una muestra de prueba.

D. Método de detección alternativo para el producto amplificado

Alternativa a la detección por PCR en tiempo real: detección electroquímica

Usando los mismos cebadores básicos con la siguiente adenda:

FI15-MTb FOR: Biotina- CCGGAAACGTCGGCATCGCAAACTC (SEQ ID NO.205)

FI15-MTb REV: Fluoresceína-TGCCCGTGTTGTAGAAGCCCGTGTTGAA (SEQ ID NO.206)

Realizar la amplificación como antes. Sacar la muestra y realizar la detección electroquímica según las indicaciones del fabricante (AnzenBio). En resumen, disponer en el chip detector electroquímico (AnzenBio), incubar 20 minutos. El chip de neutravidina se une a la biotina sobre el cebador directo (o inverso..dependiendo del diseño definitivo) y el chip se lava con 1x solución salina tamponada con fosfato 1 % de Tween 20 (PBST), 3 veces. Añadir anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa de rábano picante, incubar 20 minutos. Lavar la placa 3x con 1x PBST, añadir TMB (tampón de detección electroquímica) e incubar 1 minuto. Medir la formación de señales con el detector PSD-8. Las señales superiores a 5 se puntúan como positivas, aquellas inferiores a 5 se puntúan como negativas. Debe incluirse una muestra negativa de referencia, y muestra positiva, para confirmar estos resultados.

Detección alternativa, los productos pueden visualizarse por electroforesis en gel, cualquier formación de producto distinta de aquella observada en la muestra de control negativo debe considerarse sospechosa de ser positiva para MTb.

Detección alternativa, usando electroforesis en gel capilar. Misma que la electroforesis en gel.

Detección alternativa, HPLC, espectroscopía de masas, espectroscopía, fluorimetría, y similares. La detección de la presencia de un producto de pCr amplificado en una muestra puede lograrse usando cualquier técnica disponible, preferentemente aquellas que pueden diferenciar productos amplificados por tamaño a diferencia de solo cantidad. La presencia de un producto amplificado, especialmente uno en el intervalo de tamaño esperado, es indicativa de la presencia de Mycobacterium tuberculosis (MTb) en una muestra de prueba.

E. Enriquecimiento molecular por amplificación del genoma completo

Protocolo de enriquecimiento molecular:

Aunque la mayoría de las muestras probadas hasta la fecha ha tenido ADN suficiente para amplificaciones directas de regiones de sensibilidad a fármacos diana, algunas muestras de ADN de MTb contendrán cantidades muy pequeñas de ADN para su uso en el cribado de resistencia a fármacos de MTb. Para superar este problema se ha empleado una técnica básica para enriquecer las muestras usando un procedimiento modificado de amplificación del genoma completo. Básicamente, las muestras se someten al siguiente protocolo:

Se añade disolución de ADN en Mycobuffer a oligonucleótidos aleatorios. La disolución se desnaturaliza y se enfría hasta temperatura ambiente (permite la unión aleatoria de oligonucleótidos a lo largo de todo el genoma de MTb). La disolución se mezcla entonces con mezcla de amplificación del genoma completo y se incuba durante 8 horas para producir un enriquecimiento del genoma completo, en promedio el genoma se enriquece 100x con respecto a la muestra en bruto.

La disolución de incubación de ADN es:

1-5 ul de ADN

1xtampón Thermopol (New England Biolabs)

Cebadores 22-meros aleatorios 100 uM (concentración final).

En un volumen total de 15 ul

Desnaturalizar durante 2 minutos a 96 °C

Enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos

Disponer sobre hielo

Añadir 35 ul de mezcla de enriquecimiento molecular (mezcla de amplificación del genoma completo)

Las concentraciones finales de componentes son:

dNTPs 400 uM

1x tampón Thermopol

0,35 U/ul de polimerasa termoestable de BST (Bacillus stearothermophilus) fragmento grande (exonucleasa -) 4 % de sulfóxido de dimetilo

Proteína del gen 32 de T4 (30 ng/ul)

Incubar 8 h a 50 °C

Incubar 15 minutos a 80 °C

Mantener a 4 °C hasta uso.

Entonces se purifican muestras por un ensayo de unión a filtro modificado. En resumen, este método puede emplearse en cualquier etapa en el proceso en el que el ADN vaya a separarse de la disolución..un método rápido para que el tampón y el cebador intercambien el ADN. Los presentes inventores han encontrado que la unión directa de la disolución de Mycobuffer la mezcla de unión funciona bien para la purificación de etapa temprana cuando se necesita o desea.

El ADN de muestra en Mycobuffer se mezcla 1:1 con la mezcla de unión (HCl de guanidio 4 M, Tris-HCl 12,5 mM, pH 6,8, 0,5 % de detergente NP40, 50 % de etanol)

Las muestras se cargan sobre una placa filtrante de goteo largo de 96 pocillos de filtro de fibra de vidrio de Whatman GF/F 1,0 um, y se incuban a temperatura ambiente durante 2 minutos. La placa filtrante se apila sobre un placa de recogida de residuos de 96 x 2 ml.

Las muestras se centrifugan (1800 rpm durante 10 minutos) o se filtran a vacío (lentamente), sacar las placas de la centrífuga o sistema de vacío.

Se añaden 200 ul de tampón de lavado I (HCl de guanidio 1,6 M, Tris-HCl 10 mM, pH 6,8, y 0,1 % de NP40, 70 % de etanol) y se centrifugan o se filtran a vacío. Las placas se sacan de la centrífuga o sistema de vacío.

Se centrifugan 400 ul de tampón de lavado II (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 60 % de etanol) o se filtran a vacío. Seguido de un segundo lavado con 200 ul de tampón de lavado II.

Se vacía el recipiente de recogida, y el sistema entero tanto se seca a vacío como se seca al aire, a TA durante 2 h, o a 56 °C durante 20 minutos.

Se apila una placa de recogida nueva con placa filtrante, y se añaden 100 ul de tampón de elución (agua estéril libre de DNasa, RNasa) a los filtros. Las muestras se incuban a TA durante 2 minutos, y se centrifugan, o se filtran a vacío.

El sistema entero es una modificación de los métodos existentes usando estas placas filtrantes de 96 pocilios.

El ADN de la muestra está en el eluato. Alternativamente, los productos del genoma amplificados pueden usarse directamente sin purificación para procedimientos de amplificación adicionales si los contenidos de la reacción genómica y los cebadores aleatorios no interfieren con las posteriores amplificaciones específicas.

Este material se usa para procesos aguas abajo.

El ADN de la muestra se evalúa entonces con QPCR para confirmar la cantidad de ADN presente en la muestra. Esto sirve para tres fines: 1 es para realizar un cribado secundario para la presencia de MTb en la muestra; 2 es para verificar el enriquecimiento molecular; y 3 es para establecer una cuantificación global de la cantidad de ADN presente en la muestra. Este método como se ha desarrollado previamente ha demostrado una coherencia del enriquecimiento de no más de 3 veces de variación en el ADN de la muestra enriquecido. El método de los presentes inventores usa tres genes para confirmar el enriquecimiento. Un resultado de los genes se usa para el procesamiento adicional aguas abajo.

F. Amplificación en tiempo real de muestras que contienen ADN de M. tuberculosis

Cada muestra se somete a cuantificación por PCR en tiempo real del ADN de la muestra enriquecido. Usando un sistema de sonda fluorigénica (ensayo de nucleasa 5', TaqMan) como unidad estructural que genera señal.

Los componentes de reacción son los siguientes:

Mezcla de reacción:

10x tampón de PCR (Tris-HCl 500 mM, pH 8,5, 5 mg/ml de BSA (no acetilado), MgCl240 mM)

10x dNTP 2mM cada uno (también puede usarse dUTP 4 mM para fines de limpieza de la contaminación) Enzima (ADN polimerasa termostable) exonucleasa Tfi (invitrogen, Carlsbad, CA)

Y cebadores de oligonucleótidos (tres posibles reacciones diferentes por muestra), usar cebadores a 0,5 uM final, y sondas fluorigénicas a 0,2 uM final.

Ensayo Pan de Mycobacterium: MTb27.3 (proteína conservada):

CFP32 FOR: TCGTTCATCACCGATCC (SEQ ID NO.207)

CFP32 REV: GTGAGCAGTTCGTTCCA (SEQ ID NO.208)

CFP32 TM: FLUORESCEÍNA-TCAACGAGACGGGCACGCT-BHQ1 (SEQ ID NO.209)

IS6110 de transposasa:

IS6110 FOR; TGCGAGCGTAGGCGTC (SEQ ID NO.210)

IS6110 REV: GTCCAGCGCCGCTTC (SEQ ID NO.211)

IS6110TM: FLUORESCEÍNA-CTGCTACCCACAGCCGGTTAGGT-BHQ1 (SEQ ID NO.212)

Gen de la proteína de la familia PPE:

BTTb FOR; GCCAGCATTGAGGAT (SEQ ID NO.213)

BTTb REV; CAATTCGGGCACCAATAA (SEQ ID NO.214)

BTTb TM; FLUORESCEÍNA-TGCGATGCCGACGTTTCCG-BHQ1 (SEQ ID NO.215)

IS6110 es una diana que no es fiable para la cuantificación ya que está presente en el genoma de MTb > 1/genoma. Los genes BTTb y cfp32 se usan para establecer el enriquecimiento en el ensayo, ambos tienen valores de cruce de señales similares en el ciclo 34, frente a las muestras no enriquecidas que son tanto 'planas' para BTTb como son 100x (>6 ciclos) después de la muestra enriquecida (cfp32).

Cada reacción tiene 1 - 5 ul de disolución de ADN purificada o preparada añadida a la mezcla de reacción final. La información de volumen debe observarse en el establecimiento de la reacción, ya que el volumen exacto se convertirá en un divisor numérico para el procesamiento en la dirección 3'. Es importante determinar la cantidad relativa de ADN de MTb en una muestra para las posteriores etapas de mezcla.

Análisis de la amplificación y fusión de muestra de ADN de MTb y controles

El ADN de la muestra enriquecido se analiza entonces con los ensayos de marcador de sensibilidad a fármacos. Este ensayo se basa en la siguiente información: el ADN hibridado que está perfectamente apareado por las reglas de apareamiento de bases de Watson/Crick generará una curva de fusión característica del ADN de fusión. Cuando la misma secuencia se hibrida con una secuencia de ADN similar que contiene 1 o más bases 'erróneamente apareadas' a lo largo de la longitud, la curva de fusión característica ya no se genera, sino que se genera una nueva curva que indica la diferencia en las características de fusión para las hebras erróneamente apareadas de ADN. Para generar las secuencias erróneamente desapareadas no es simplemente suficiente usar el ADN amplificado para la muestra en cuestión, sino que también es necesario incluir una muestra de ADN que contenga una secuencia de ADN que es el ADN 'no modificado'. De forma que, cuando los dos se mezclen en proporciones casi iguales antes de, durante, o al final de una reacción de amplificación, y se hibriden juntos un porcentaje significativo de los moldes hibridados estén en las hibridaciones 'erróneamente apareadas'. De forma que una curva de fusión pueda generarse que indicará la presencia de una 'mutación' en la secuencia de la muestra. Si estas secuencias de muestra que están siendo amplificadas se diseñan para rodear las secuencias de ácidos nucleicos de genes que tanto ellos mismos como sus productos génicos son la diana de fármacos antimicrobianos. Entonces cualquier comportamiento de fusión aberrante de las muestras hará sospechar del uso de un fármaco particular para el tratamiento de la infección microbiológica ya que el ADN de los organismos indicará, o al menos sugerirá, que el fármaco será ineficaz. Esto puede aplicarse posiblemente a quimioterapia para el cáncer, resistencia a fármacos virales y fármacos antimicrobianos.

El proceso para realizar este cribado es del siguiente modo. Usando los resultados de los tres cribados secundarios para MTb tras el enriquecimiento molecular de las muestras, los resultados de la muestra de Cfp32 se usan para calcular la cantidad de ADN presente en la muestra. Alternativamente, puede usarse cualquier amplicón de MTb para determinar la cantidad de ADN en la muestra de MTb con respecto al ADN de control en tanto que el amplicón esté presente en ambos. Además, podrían evaluarse amplicones de control y desconocidos separados para determinar las concentraciones de ADN relativas en muestras de control y de prueba. El fin de los presentes inventores para usar solo uno ha sido para facilitar el cálculo.

Se usa el umbral de cruce calculado del instrumento Roche LightCycler 480, o prácticamente cualquier máquina de PCR en tiempo real, para calcular la concentración de la diana del fármaco RPOB 'de tipo silvestre' (rifampicina) para añadir a la reacción de cribado. La disolución madre de control (dilución 1:1.000.000 de disolución maestra) se diluye 10x durante cada 4 ciclos que la muestra cruza el nivel inicial después del ciclo 18, en el caso del ejemplo anterior con un valor de CT de 32, es decir, 14 ciclos o 5000x dilución (10A3,69). Esto puede presentarse fácilmente como un diagrama para el usuario o como un simple trozo de software que calculará los volúmenes a mezclar antes de la amplificación y/o fusión.

El ADN de la muestra y una cantidad igual de 'ADN normal, de tipo silvestre, no mutado, no resistente' de RPOB se añade a la reacción. La reacción consiste en los siguientes componentes:

10xtampón de PCR (Tris-HCl 500 mM, pH 8,5, 5 mg/ml de BSA, MgCl230 mM)

10 x mezcla de dNTP (sin dUTP)

Oligonucleótidos a 0,5 uM (final) cada uno

LCGreen o colorante LCGreen (Idaho Technology, Inc)

Enzima (Tfi (exo )) u otra polimerasa termostable con actividad de corrección de lectura.

Gen RpoB de Mycobacterium, diana de rifampicina (antibiótico):

RPOB FOR: CAAGGAGTTCTTCGGCACC (SEQ ID NO. 13)

RPOB REV: GGACCTCCAGCCCGGCA (SEQ ID NO. 14)

Puede y también debe realizarse simultáneamente una reacción de control con solo la muestra de RPOB, además de 1, 2 o más controles 'resistentes', en reacciones separadas. Los presentes inventores tienen dos reacciones de control en las que han mezclado en proporciones iguales el control normal de RPOB con uno de los siguientes: 1 una única mutación puntual en la región diana, o 2 una deleción de 3 bases de la región diana. Estas tres muestras sirven para garantizar que el ensayo se está realizando como era de esperar, deben incluirse controles para cada diana de fármaco y esencialmente tendrían características similares.

Las muestras se amplifican por el siguiente protocolo, en un instrumento LightCycler 480.

95 °C durante 10 minutos

40 ciclos de:

95 °C durante 10 s

57 °C durante 10 s

72 °C durante 40 s

1 ciclo de fusión:

95 °C durante 10 s

50 °C durante 10 s

70 °C durante 30 s

95 °C durante 0 s con adquisiciones de fluorescencia establecidas a 25-35 adquisiciones/grado C (fusión de alta resolución). Los datos pueden entonces analizarse usando el módulo de curvas de fusión de alta resolución que pronto va a ser comercializado para el instrumento LC 480 o usando el software LightScanner de (Idaho Technology, Inc.). Ambos paquetes permiten establecer las muestras del nivel inicial (las muestras de control positivo, como patrones). Además, cualquier dispositivo que pueda medir la cantidad de ADN bicatenario (ADNbc) a temperaturas específicas durante la fusión puede usarse para generar curvas de fusión. Los parámetros de la curva por defecto son normalmente suficientes, aunque ocasionalmente los parámetros deben modificarse para estar seguros de que las muestras de control están siendo llamadas con exactitud. Si las muestras de control son llamadas con exactitud, entonces los resultados de la reacción pueden considerarse aceptables y puede hacerse la llamada de diagnóstico. Así, una diferencia entre la curva de fusión de tipo silvestre de control y una curva de fusión de una muestra desconocida es indicativa de una mutación puntual o polimorfismo entre las muestras. En este caso, con la región rpoB de MTb, la diferencia entre las curvas de fusión es indicativa de la presencia de ADN resistente a rifampicina en una muestra de prueba, y así puede usarse para diagnosticar la presencia de MTb resistente a rifampicina en una muestra. De una manera similar, esta técnica puede aplicarse a analizar cualquier región de ADN en la que haya mutaciones conocidas que se correlacionan con un cambio en un fenotipo, y es especialmente poderosa para la evaluación de resistencia o sensibilidad a fármacos.

EJEMPLO 2: DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA O SENSIBILIDAD A FÁRMACOS EN MUESTRAS DE MTb HUMANAS

El fin de estos experimentos era demostrar que muestras clínicas previamente probadas y confirmadas que contenían MTb podrían ser rápidamente evaluadas para la resistencia o sensibilidad a fármacos. Se obtuvieron muestras clínicas cegadas de pacientes con MTb que se habían preparado por el método de Petroff y se resuspendieron en tampón MGIT (Becton Dickinson). Las muestras se evaluaron para resistencia a rifampicina y estreptomicina usando pares de cebadores, amplicones y las temperaturas de fusión enumeradas en las Tablas 2 y 3.

Protocolo de prueba de MTb:

Ejecutar muestras contra la muestra patrón H37RV usando el ensayo Taqman de cfp32 para cuantificar las muestras.

Mezcla madre: 1x tampón Kappa sin Sybr (mezcla madre de SYBRG1 de Kappa Biosystems sin SYBR), 1 ul de oligo cfp32, MgCl 1,75 mM, c.s.p. hasta 9 ul con agua

Poner 18 ul de mezcla madre por muestra en placa de 384 pocillos.

Añadir 2 ul de muestras.

Poner una tapa de la placa sobre la placa y centrifugar la placa

Ejecutar en LC480 bajo el protocolo de ejecución de cfp32.

Desnaturalizar 10 min a 95 °C

Amplificar: 95 °C durante 10 s, 59 °C durante 40 s (50 ciclos)

A partir del ensayo de cfp32 determinar el factor de dilución necesario para las muestras usando la ecuación C=S*EAN

en la que C=10000000, E= eficiencia de la curva patrón, N= valor de Cp

Diluir las muestras a la muestra de concentración más baja en tampón Myco.

Ejecutar las muestras diluidas en ensayo de rpob de 80 pb para determinar la resistencia.

Mezcla madre: 1X Kappa sin Sybr, 0,5 ul de oligo de 80 pb, 1x colorante Eva green, c.s.p. hasta 9 ul con agua Disponer 9 ul de mezcla madre por muestra en placa de 384 pocilios.

Añadir muestras de 0,5 ul de H37RV 0,5 ul de muestras en pocillo.

Poner una tapa de la placa sobre la placa y centrifugar

Ejecutar en LC480 bajo el protocolo de ejecución de rpob.

Desnaturalizar: 10 min a 95 °C

Amplificar: 95 °C durante 10 s

57 °C durante 10 s

72 °C durante 40 s con adquisición individual

Ejecutar las muestras hasta que todas las muestras hayan alcanzado la meseta durante 2 o 3 ciclos (aprox. 30 ciclos). Protocolo de amplificación final y todas las muestras para completar el protocolo de fusión.

Sacar la placa de LC480 y centrifugar para recoger cualquier condensación de la parte superior.

Rampa del protocolo de fusión hasta 95 °C durante 1 s

50 °C durante 1 s

70 °C durante 30 s Empezar a recoger los datos de fusión continuamente a 30 adquisiciones/grado C. Recogida de datos finales a 95 °C

Fundir las muestras en el instrumento HR-1.

Mover las muestras de la placa de 384 pocillos a tubos capilares de 20 ul.

En resumen, centrifugar los capilares etiquetados en la centrífuga para recoger muestras en el fondo.

Usando el software de control del instrumento HR-1, fundir las muestras individualmente usando el protocolo de fusión FI LAB MTb Opt.

Tasa de la rampa 0,07

Inicio de la adquisición a 80 °C con fluorescencia diana del 90 %

Adquisición final a 96 °C

Enfriar a 40 °C

Nota: Ejecutar 2 muestras antes de la recogida de datos para permitir que el instrumento se caliente adecuadamente.

Análisis de datos

Abrir el software de la herramienta de análisis de fusión HR-1.

Abrir la carpeta que contiene los archivos de datos y hacer clic en “seleccionar el directorio actual” Seleccionar las muestras a analizar y hacer clic en “continuar”

En “análisis” seleccionar normalizar

Ajustar los dos cursores de la izquierda a aproximadamente un grado antes de que empiece la fusión

Ajustar los dos cursores de la izquierda a aproximadamente un grado después de que termine la fusión Hacer clic en OK

En “Análisis” seleccionar el desplazamiento de la temperatura

En muestras seleccionar una muestra de tipo silvestre a normalizar

Ajustar los cursores para ampliar la región de fusión

Seleccionar OK

En “Análisis” seleccionar gráfico de diferencias

Seleccionar muestra de tipo silvestre a normalizar.

Mover los cursores para seleccionar la región de interés

Hacer clic en OK

Las muestras que muestran picos en un gráfico de diferencias de la curva por encima o por debajo de un nivel de fluorescencia de 1,5 a 2 se consideran resistentes.

La Figura 10 muestra los resultados de este procedimiento en formatos de gráficos de diferencias de la curva usando cebadores de la Tabla 2 para la amplificación y el amplicón correspondiente de la Tabla 3 para el análisis de la hibridación y fusión. La Figura 10A muestra el análisis de 4 muestras para resistencia o sensibilidad a rifampicina junto con el control (wt1). La Figura 10B demuestra la capacidad para identificar resistencia a estreptomicina en muestras de MTb. Estos datos demuestran que esta técnica puede diferenciar satisfactoriamente entre regiones de ADN que se correlacionan con sensibilidad a fármacos y aquellas que contienen polimorfismos correlacionados con resistencia a fármacos. De una manera similar, los métodos y reactivos desvelados en el presente documento pueden usarse para evaluar la sensibilidad o resistencia a todos los antibióticos de primera línea usados para tratar infecciones por MTb.

EJEMPLO 3: DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA A AGENTES ANTIFÚNGICOS

Infecciones fúngicas y de levadura son responsables de un gran número de enfermedades en seres humanos. Algunos ejemplos breves de hongos clínicamente significativos incluyen:

Malassezia furfur y Exophiala werneckii (piel superficial)

Piedraia hortae y Trichosporon beigelii (pelo)

Especies de Microsporum (piel y pelo)

Especies de Epidermophyton (piel y uñas)

Especies de Trichophyton (piel, pelo y uñas)

Sporothrix schenckii, especies de Cladosporium, especies de Phialophora y especies de Fonsecaea (tejidos subcutáneos/linfáticos - cromoblastomicosis)

Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, especies de Fusarium, especies de Penicillium (respiratorio sistémico)

Blastomyces dermatitidis (subcutáneo/respiratorio)

Cryptococcus neoformans (respiratorio/SNC)

Especies de Aspergillus, especies de Mucor, especies de Candida y especies de Rhizopus (oportunistas que implican diversos sitios del cuerpo)

Además, los hongos son frecuentemente responsables de infecciones comunes tales como infecciones por levadura, tina inguinal, pie de atleta, y otros problemas dermatológicos. La resistencia a agentes antifúngicos hará el tratamiento ineficaz, por lo que la identificación de fármacos apropiados es útil.

Con el fin de determinar el patrón de resistencia a terbinafina, un agente antifúngico común usado para infecciones por Saccharomyces y Candida, se usaron los cebadores de la Tabla 2 para amplificar el amplicón correspondiente de la Tabla 3 usando el método presentado en el Ejemplo 2. Se usaron el ADN aislado de S. cerevisiae de tipo silvestre o un molde que contiene una mutación en el gen ERG1 que confiere resistencia a terbinafina como materiales de partida, y los resultados del análisis de diferencias de la curva de fusión se muestran en la Figura 11. La secuencia mutada se distingue fácilmente de la secuencia de tipo silvestre. Así, este método puede usarse para determinar la resistencia o sensibilidad a fármacos en infecciones fúngicas, además de otras infecciones patógenas. EJEMPLO 4: DETERMINACIÓN DE LOS PATRONES DE RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD PARA CÁNCERES HUMANOS A TAXANOS QUIMIOTERAPÉUTICOS

Taxanos tales como taxol, paclitaxel y docetaxel son potentes agentes quimioterapéuticos usados para tratar amplias variedades de cánceres. Su mecanismo de acción es compartido por epitilonas y funcionan uniendo y estabilizando polímeros de tubulina en células. Se han descrito sitios de unión para estos fármacos sobre la tubulina (Rao, S., Orr, G.A., Chaudhary, A.G., Kingston, D.G., y Horwitz, S.B. (1995) J. Biol. Chem 270:20235-20238) y mutaciones en esta región o beta tubulina pueden producir resistencia a taxanos (Tabla 3). Se purificó el molde de ADN por medios estándar y se sometió al método presentado en el Ejemplo 2, usando cebadores de la Tabla 2 para amplificar las regiones correspondientes en la Tabla 3. Dos amplicones con mutaciones que causaron resistencia a taxanos (B-tub R282Q y B-tub T247I) fueron fácilmente distinguibles de dos reacciones independientes con ADN de tipo silvestre (wt1 y wt2; FIGURA 12) usando esta metodología. Así, este método podría usarse para diagnosticar sensibilidad o resistencia a agentes quimioterapéuticos para permitir a los médicos la oportunidad de entender mejor la naturaleza del cáncer y qué tratamientos es probable que sean eficaces o ineficaces.

EJEMPLO 5:

La malaria es una enfermedad infecciosa producida por el parásito llamado Plasmodia. Hay cuatro especies identificadas de este parásito que causan la malaria humana, concretamente, Plasmodium vivax, P. falciparum, P. ovale y P. malariae. 300-500 millones de personas se infectan cada año. El tratamiento más común es la cloroquina, pero la resistencia a la cloroquina ha sido cada vez mayor. Actualmente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) utiliza un método para detectar mutaciones resistentes a la cloroquina que dura 28 días.

El método descrito en el Ejemplo 2 se aplicó similarmente para determinar su capacidad para diferenciar entre ADN resistente a cloroquina y sensible a cloroquina. Los cebadores presentados en la Tabla 2 se usaron para amplificar el amplicón presentado en la Tabla 3. La Figura 13 muestra los resultados de este ensayo, que demuestran que el método puede identificar fácilmente una mutación en esta región que produce resistencia a la cloroquina frente a una región sensible a cloroquina normal. Así, este método podría usarse para evaluar la sensibilidad a fármacos de infecciones parasíticas y permitir mejores tratamientos. Además, este ensayo puede realizarse en menos de un día, que es significativamente más rápido que los actuales métodos (http://www.malariasite.com/MALARIA/DrugResistance.htm).

EJEMPLO 6: DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA A FÁRMACOS EN INDIVIDUOS INFECTADOS POR EL VIH Zidovudina (INN) o azidotimidina (AZT) (también llamada ZDV) es un fármaco antiretroviral, el primero autorizado para el tratamiento del VIH. Su mecanismo de acción es mediante el bloqueo de la transcriptasa inversa del VIH, que previene la replicación del material genético viral. Mutaciones en regiones de la transcriptasa inversa del VIH han convertido los virus en resistentes a estos fármacos de primera línea.

La Figura 14 muestra los gráficos de diferencia de las curvas de fusión de 2 series independientes usando el método presentado en el Ejemplo 2 para discriminar entre ADN de tipo silvestre y resistente a ZDV. Los cebadores presentados en la Tabla 2 se usaron para amplificar las regiones presentadas en la Tabla 3. Este ejemplo demuestra claramente que este método es aplicable a determinar resistencia a fármacos o también sensibilidad en patógenos virales.

EJEMPLO 7: DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA A METICILINA EN INFECCIONES POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS

La infección por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) se produce por bacterias Staphylococcus aureus frecuentemente llamadas “staph.” Hace décadas, en los hospitales apareció una cepa de staph que era resistente a los antibióticos de amplio espectro comúnmente usados para tratarla. El denominado Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) fue uno de los primeros gérmenes en aventajar a todos los fármacos, pero a los más poderosos. La infección por MRSA puede ser letal. Debido a esto, es importante determinar si una infección por staph dada es multirresistente a fármacos de manera que pueda administrarse el tratamiento apropiado. Generalmente, staph se recoge de tejidos o secreciones nasales, pero también puede aislarse de muestras de garganta o heridas abiertas. Se usan métodos convencionales para extraer el ADN de la muestra clínica.

La Figura 15 demuestra que este método puede discriminar entre infecciones por staph multirresistentes e infecciones por staph normales. Usando los cebadores presentados en la Tabla 2 para amplificar la región desvelada en la Tabla 3, con el método presentado en el Ejemplo 2, este método podría distinguir entre regiones de tipo silvestres del ADN de staph y regiones con una única mutación puntual que produce multirresistencia.

EJEMPLO 8: EVALUACIÓN DE LA INFECCIÓN POR MTb POR AMPLIFICACIÓN DE FLUJO DINÁMICO

Se evaluaron muestras biológicas que se sospechaba que estaban infectadas con MTb para la presencia de ADN de MTb usando amplificación de flujo dinámico. Muestras humanas tanto positivas como negativas para infección por MTb se trataron usando el siguiente procedimiento:

Los oligos son los cebadores FI-15 MTb (Ejemplo 1)

Las condiciones de reacción son:

1: 10xtampón FI-15 (Tris-HCl 50 mM, 8,0; 0,25 mg/ml de BSA nativo (no acetilado); MgCl22 mM; 4 % de DMSO; 2 mM de cada dNTP)

2: Enzima Gene-Choice HS-Taq Polimerasa, aunque son aceptables otras ADN polimerasas termostables.

3: Cebadores a 0,5 uM final

4: Ciclos térmicos: 90 - 10 s

Cualquiera de 74, 76, 78 o 80 °C -10 s (50+ ciclos) (actualmente hecho en <1,25 h)

La Figura 16 muestra los resultados de esta reacción a diferentes temperaturas para el ciclado térmico. Este experimento se realizó en una PCR para simular las condiciones de un bloque térmico en el laboratorio, que cuando se estableció a 80 °C presentó un ciclo de temperatura de /- 5 °C. Cada par de pocillos realizado a una única temperatura contiene una primera reacción que usa un molde positivo para ADN de MTb, y la segunda un molde negativo para ADN de MTb preparado similarmente. El producto de amplificación de 150 pb esperado aparece a todas las condiciones del ciclo de temperatura probadas solo en muestras positivas para MTb, pero no se amplifica en muestras de control. Así, la prueba de amplificación de ADN en el campo podría usarse para evaluar infecciones por MTb en muestras humanas, usando solo un protocolo estándar de recogida y preparación de muestras, un bloque de calentamiento para amplificar un producto específico, y un medio para detectar dicho producto. Esto tiene el potencial de permitir el diagnóstico en el campo de la infección por MTb sin la necesidad de enviar las muestras a un centro de prueba designado. Además, puede dar un resultado rápido, que solo requiere poco más de una hora de tiempo de ciclado térmico para amplificar el producto.

EJEMPLO 9: AMPLIFICACIÓN DE FLUJO DINÁMICO PARA IDENTIFICAR LA PRESENCIA DE SALMONELLA TYPHIMURIUM EN UNA MUESTRA DE PRUEBA

El fin de este ejemplo es demostrar que la amplificación de flujo dinámico puede usarse para amplificar una región específica de ADN de una muestra biológica. Así, en lugar de usar una costosa máquina de PCR, tales reacciones podrían tener lugar en un bloque de calentamiento o cualquier dispositivo que mantenga una temperatura. Si el mantenimiento no es altamente preciso y mantiene la temperatura mediante el ciclado entre fase de calentamiento y apagado, hay un flujo natural en la temperatura. Esto es cierto para calentar bloques, calentar hornos, e incluso refrigeradores o congeladores (aunque enfriamiento en lugar de calentamiento).

Se aisló ADN de Salmonella typhimurium de muestras biológicas por métodos convencionales. Se prepararon muestras o mezclas de ADN de control (sin molde o molde de E. coli) y se sometieron a las siguientes condiciones:

Cebador directo: caccacgctcaccgatgatgccctgctttg Tm 77C

Cebador inverso: actgggagccattaaccgcatcggtgctg Tm 75C

Molde: actgggagccattaaccgcatcggtgctgtccgcggccagggtgcctgccgccagattggtgattttgctggcgcttccgttacggctggcg ctgaatgtgccagaggctgcatcccaaagcagggcatcatcggtgagcgtggtg Tm = 92C

Reactivos:

10x tampón (mismo que antes)

dNTPS (2 mM cada uno)

MgCl 3 mM

Cebadores a 0,5 uM cada uno

Colorante: LC Green (Idaho Technology, Inc Sal Lake City, UT)

Enzima: Tfi (exo -) Invitrogen

Condiciones de los ciclos térmicos: mantenimiento inicial a 79 °C durante 15 minutos (equivalente al uso de un bloque térmico establecido a 77-78 grados Celsius); 90 ciclos: 791 min; 761 min. La Figura 17 muestra que un producto específico se amplifica de forma detectable en el ciclo 62 y superiores. La amplificación solo se observa en la reacción que contiene ADN de S. typhimurium y no en muestras que no contienen ADN o ADN de E. coli (no mostrado). Así, esta tecnología podría usarse para identificar la presencia de S. typhimurium en una muestra biológica y la indicación de la presencia de infección bacteriana si la muestra es de origen no bacteriano, tal como una muestra de esputo humana o exudado faríngeo. Ventajosamente, el método anterior puede amplificar ADN sin el uso de un ciclador térmico. La detección de productos amplificados puede evaluarse por cualquier método tradicional, que incluye, pero no se limita a, análisis o electroforesis en gel, detección UV, detección fluorescente, detección de oro, captura de híbridos en un ensayo de diagnóstico de ELISA o in vitro rápido, captura de productos amplificados por flujo lateral, y similares. En algunas realizaciones, pueden marcarse cebadores, especialmente en el extremo 5' o con marcas internas, para permitir la detección de productos específicos amplificados.

Referencias

Las siguientes patentes de EE.UU. y publicaciones pre-concedidas se citan aquí; 4.683.195; 4.965.188; 6.214.587; 6.692.918; 5.219.727; 5.476.774; 5.314.809; 6.040.166; 6.197.563; 6.001.611; 6.617.137; 7.074.600; 6.977.148; 6.740.745; 6.033.881; 7.160.998; 7.081.226; 20070054311; 20050233363; 20050181394; 20040248105; y

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para amplificar un ácido nucleico diana mediante PCR en tiempo real, en donde:

   a. los cebadores de oligonucleótidos se hibridan en el ácido nucleico diana; y

   b. el ácido nucleico diana se amplifica y desnaturaliza;

   en donde los cebadores de oligonucleótidos están diseñados para tener una Tm de cebador que está dentro de 15 °C de la temperatura de fusión del ácido nucleico diana y en donde el método se lleva a cabo a una temperatura entre 75 °C y 90 °C.

   2. El método de la reivindicación 1, que comprende ensayar el producto de ácido nucleico amplificado y detectar una o más variaciones de secuencia de ácido nucleico en relación con una secuencia de referencia.

   3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las temperaturas de fusión de los cebadores de oligonucleótidos se solapan con la temperatura de fusión del ácido nucleico diana.

   4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las temperaturas de fusión de uno o ambos de los cebadores de oligonucleótidos son iguales a la temperatura de fusión del ácido nucleico diana, o está dentro de 2,5 °C, 5 °C o 10 °C de la temperatura de fusión del ácido nucleico diana.

   5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico diana y los cebadores de oligonucleótidos están en un flujo dinámico de hibridación y desnaturalización.

   6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la amplificación produce productos de amplificación específicos del ácido nucleico diana.

   7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la amplificación disminuye la formación de productos de amplificación no específicos en comparación con la amplificación dentro de un amplio intervalo de temperatura.

   8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el producto de ácido nucleico diana amplificado se detecta mediante una lectura de detección colorimétrica, opcionalmente en el que la lectura es una señal positiva o negativa, y opcionalmente en el que el producto de ácido nucleico diana amplificado se detecta mediante fluorescencia emitida desde un tinte fluorescente de unión a ADN.

   9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que el ensayo se realiza mediante un análisis de curva de fusión de alta resolución.

   10. El método de la reivindicación 9, en el que el análisis de la curva de fusión detecta uno o más apareamientos erróneos de pares de bases entre el producto de ácido nucleico diana amplificado y la secuencia de referencia. 11. El método de la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico diana es de un microorganismo infeccioso, y comprende al menos un polimorfismo asociado con la capacidad de respuesta, sensibilidad o resistencia del microorganismo a un fármaco.

   12. El método de la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico diana es de un microorganismo infeccioso y la secuencia de referencia incluye al menos un polimorfismo asociado con la capacidad de respuesta, sensibilidad o resistencia a un fármaco.

   13. El método de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que dos o más variaciones en el ácido nucleico diana indican capacidad de respuesta, sensibilidad o resistencia a el fármaco.