JP5866669B2 - 乳がん発症感受性の判定方法 - Google Patents
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Description
マイクロアレイ法に用いた検体数よりも6倍以上多い検体数を用いて定量PCR法を行い、乳がん発症体質との関連性を検証したところ、例えばプライマーセット(Hs03899300_cn)を用いて検出した染色体領域(15q26.3 [99,845,920−99,846,025])のDNAコピー数減少(コピー数1.5未満)の頻度は健常者群では25.9%であるのに対して、乳がん患者群では76.7%であり、オッズ比9.4であることがわかった。すなわち、この領域にDNAコピー数減少がある場合、乳がんになりやすいことを見出した。同様に、プライマーセット(Hs03908783_cn)を用いて検出した染色体領域(15q26.3 [99,847,947−99,848,043])のDNAコピー数減少(コピー数0.5未満)の頻度は健常者群では10.2%であるのに対して、乳がん患者群では23.8%であり、オッズ比2.8であることもわかった。すなわち、この領域にDNAコピー数減少がある場合、乳がんになりやすいことを見出した。さらに、かかる2つの領域の定量PCR法による結果を基にした判別分析を行うと、乳がん患者群の中で「乳がん」と判定されるのは83.9%(感度)であるのに対して、健常者群の中で「乳がんではない」と判定されるのは81.0%(特異度)であった。すなわち、乳がん発症感受性の高精度な判定方法を見出し、本発明を完成するに至った。
配列番号3で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,845,920−99,846,025)
配列番号4で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,847,947−99,848,043)
本発明のその他の態様としては、乳がん発症感受性を判定するためのデータを収集する方法や、乳がん治療の予後を予測するためのデータを収集する方法を挙げることができる。
配列番号3で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,845,920−99,846,025)
配列番号4で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,847,947−99,848,043)
[A−1群]
1q44 (246,855,947−246,857,101)
1q44 (246,857,101−246,858,266)
22q12.3 (35,474,202−35,477,701)
[A−2群]
2p16.3 (52,603,488−52,605,502)
2p16.3 (52,605,502−52,606,645)
2p16.3 (52,606,645−52,625,528)
2p16.3 (52,625,528−52,634,972)
2p16.3 (52,636,079−52,636,901)
3q26.1 (163,698,399−163,714,957)
3q26.1 (163,714,957−163,716,880)
3q26.1 (163,716,880−163,718,292)
6p25.3 (256,364−307,220)
6p25.3 (307,220−324,877)
7p13 (43,968,813−43,969,989)
7p13 (43,969,989−43,973,917)
7p13 (44,033,292−44,046,944)
7p13 (44,965,401−44,966,288)
8p11.23−p11.22 (39,351,598−39,352,968)
8p11.23−p11.22 (39,352,968−39,505,316)
8p11.23−p11.22 (39,505,316−39,506,703)
15q25.2 (80,700,012−80,703,055)
15q25.2 (80,703,055−80,704,239)
16p13.3 (1,374,245−1,386,928)
16p13.3 (1,409,635−1,451,145)
16p13.3 (2,530,856−2,531,917)
16p13.3 (4,688,278−4,689,410)
17p11.2 (18,864,114−18,866,684)
17q12 (33,593,624−33,606,100)
22q11.21 (18,698,449−18,701,734)
22q11.21 (18,708,863−18,718,104)
22q11.21 (18,744,485−18,751,648)
22q11.21 (18,751,648−18,757,015)
22q11.21 (18,763,247−18,764,375)
22q11.21 (18,764,375−18,766,608)
22q11.21 (18,766,608−18,767,909)
22q11.21 (18,767,909−18,803,304)
22q11.21 (18,851,650−18,854,853)
22q11.21 (18,861,035−18,862,757)
22q11.21 (20,129,733−20,132,553)
22q11.21 (20,139,367−20,140,478)
22q11.21 (20,142,316−20,143,929)
22q11.21 (20,157,427−20,158,507)
22q11.21 (20,158,507−20,163,759)
22q11.21 (20,163,759−20,166,938)
22q11.21 (20,166,938−20,189,915)
22q11.21 (20,189,915−20,194,583)
22q11.21 (20,194,583−20,198,780)
22q11.21 (20,198,780−20,206,030)
22q11.21 (20,206,030−20,233,462)
22q11.21 (20,233,462−20,239,367)
22q11.21 (20,239,367−20,243,220)
22q11.21 (20,243,220−20,244,301)
Xq26.3 (134,686,768−134,710,721)
Xq26.3 (134,715,826−134,718,277)
[A−3群]
2p16.3 (52,603,488−52,605,502)
2p16.3 (52,605,502−52,606,645)
2p16.3 (52,606,645−52,611,965)
2p16.3 (52,611,965−52,620,153)
2p16.3 (52,620,153−52,622,543)
2p16.3 (52,622,543−52,636,901)
2p16.3 (52,636,901−52,638,223)
2q24.3 (165,544,576−165,563,420)
3q26.1 (163,701,862−163,705,223)
7q31.1 (109,240,145−109,241,260)
9p11.2 (43,752,248−43,754,446)
9q12−q13 (69,950,626−70,000,416)
9q12−q13 (70,000,416−70,026,246)
15q11.2 (19,054,967−19,055,863)
15q11.2 (20,081,406−20,091,581)
15q11.2 (20,091,581−20,146,200)
22q11.1 (14,529,177−14,551,306)
[A−4群]
1p36.12 (21,373,559−21,374,437)
1p36.12 (21,374,437−21,376,929)
1p36.12 (21,376,929−21,378,068)
8p23.1 (7,331,151−7,366,894)
8p23.1 (7,384,482−7,385,717)
8p23.1 (7,385,717−7,675,644)
8p23.1 (7,675,644−7,677,003)
8p23.1 (7,729,310−7,756,222)
8p23.1 (7,766,308−7,785,964)
8p23.1 (7,789,316−7,796,881)
8p23.1 (7,796,881−7,804,843)
8p23.1 (7,804,843−7,812,725)
10p12.31 (22,644,992−22,646,132)
10p12.31 (22,646,132−22,647,050)
10p12.31 (22,648,356−22,654,917)
10p12.31 (22,654,917−22,656,057)
10q21.3 (66,977,059−66,982,379)
11q13.1 (64,298,883−64,299,791)
11q13.1 (64,299,791−64,300,705)
11q13.1 (64,300,705−64,303,775)
11q13.1 (64,303,775−64,305,075)
11q13.1 (64,305,075−64,309,752)
11q13.1 (64,309,752−64,310,507)
15q26.3 (99,847,229−99,848,361)
15q26.3 (99,848,361−99,851,910)
16p12.1 (22,587,790−22,590,317)
16p12.1 (22,602,200−22,605,904)
16p12.1 (22,605,904−22,610,525)
16p12.1 (22,612,746−22,614,711)
17q21.31 (39,786,143−39,789,781)
17q21.31 (39,789,781−39,791,475)
19q13.33 (55,769,626−55,774,306)
19q13.42 (60,579,276−60,581,130)
19q13.42 (60,581,130−60,582,666)
19q13.42 (60,582,666−60,588,237)
19q13.42 (60,588,237−60,589,160)
19q13.42 (60,589,160−60,589,969)
19q13.42 (60,597,122−60,598,638)
19q13.42 (60,598,638−60,599,772)
19q13.42 (60,599,772−60,601,009)
22q12.3 (35,472,904−35,474,202)
1−1 材料
〔1〕30名の健常女性末梢血より抽出したDNA30検体(健常者群)
〔2〕30名の孤発性乳がん患者末梢血より抽出したDNA30検体(乳がん患者群)
〔3〕30名の健常女性末梢血より抽出したDNAを1本のチューブにまとめたプールDNA(リファレンスDNA)
1−2−1 DNAの蛍光標識(Nimblegen Dual-Color DNA Labeling Kit[Roche社]を製品プルトコルに準拠し使用)
あらかじめ、Cy3-Random Nonamer及びCy5-Random Nonamer中に、それぞれRandom Primer Buffer998.25μl並びにβメルカプトエタノール1.75μlを入れて希釈する。
〔1〕2本の0.5mlチューブを用意し、各チューブ内に以下を入れる。
テストDNA1μg(乳がん患者あるいは健常女性末梢血由来DNA)
希釈済みCy-3-Random Nonamers 40μl
Nuclease-free水を加えて全量80μlとする。
〔2〕98℃10分インキュベーション後、氷上で2分インキュベーションする。
〔3〕各チューブに以下の試薬類を加える。
10mM dNTP Mix 10μl
Nuclease-free水 8μl
50U/μl Klenow Fragment 2μl
〔4〕37℃で一晩インキュベーション。
〔5〕各チューブにStop Solution(0.5M EDTA)10μlを加える。
〔6〕各チューブに5M NaCl11.5μlを加える。
〔7〕各チューブにイソプロパノール110μlを加える。
〔8〕2本のチューブ内容物を1本の1.5mlチューブ内にまとめる。
〔9〕よく混ぜた後、室温で10分間インキュベーション。
〔10〕12,000gで10分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔11〕各チューブに冷やした80%エタノール500μlを加えて、12,000gで2分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔12〕遮光下で自然乾燥させDNAをペレット化する。
〔13〕−20℃で保存。
〔1〕2本の0.5mlチューブを用意し、各チューブ内に以下を入れる。
リファレンスDNA1μg(30名の健常女性末梢血由来プールDNA)
希釈済みCy-5-Random Nonamers40μl
Nuclease-free水を加えて全量80μlとする。
〔2〕98℃10分インキュベーション後、氷上で2分インキュベーション。
〔3〕各チューブに以下の試薬を加える。
10mM dNTP Mix 10μl
Nuclease-free水 8μl
50U/μl Klenow Fragment 2μl
〔4〕37℃で一晩インキュベーション。
〔5〕各チューブにStop Solution(0.5M EDTA)10μlを加える。
〔6〕各チューブに5M NaCl11.5μlを加える。
〔7〕各チューブにイソプロパノール110μlを加える。
〔8〕2本のチューブ内容物を1本の1.5mlチューブ内にまとめる。
〔9〕よく混ぜた後、室温で10分間インキュベーション。
〔10〕12,000gで10分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔11〕各チューブに冷やした80%エタノール500μlを加えて、12,000gで2分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔12〕遮光下で自然乾燥させDNAをペレット化する。
〔13〕−20℃で保存。
〔1〕各ペレットに20μlの精製水を加えて20分間静置後、ボルテックスをかける。
〔2〕DNA濃度を測定する。
〔3〕以下を0.5mlチューブ内に入れる。
蛍光標識されたテストDNA 34μg
蛍光標識されたリファレンスDNA 34μg
精製水を加えて全量を12.3μlとする。
〔4〕NimbleGen Hybridization Kit(Roche社製)の以下の試薬を0.5mlチューブ内に入れる。
2X Hybridization Buffer 29.5μl
Hybridization Component A 11.8μl
Alignment Oligo 1.2μl
〔5〕〔3〕の溶液中に、〔4〕の溶液31.7μlを加える。
〔6〕95℃5分インキュベーションの後、42℃で5分以上インキュベーションする。
〔7〕2.1M array(Roche社製)にNimblegen HX1 Mixer(Roche社製)をセットし、42℃のヒートブロック上に静置。
〔8〕〔5〕の溶液41μlを2.1M arrayに注入する。
〔9〕Nimblegen hybridization system(Roche社製)に2.1M arrayスライドをセットし、72時間ハイブリダイゼーションを行う。
〔1〕洗浄液1、2及び3を作製する。
1)洗浄液1(2セット)
水(VWR社製) 225ml
10X Wash Buffer I 25ml
1M DTT 25μl
2)洗浄液2(1セット)
水(VWR社製)225ml
10X Wash Buffer II 25ml
1M DTT 25μl
3)洗浄液3(1セット)
水(VWR社製) 225ml
10X Wash Buffer III 25ml
1M DTT 25μl
〔2〕40℃に温めた洗浄液1に2.1M arrayを浸し、Nimblegen HX1 Mixerを取り除く。
〔3〕2.1M arrayを洗浄液1中で10〜15秒間揺らして、hybridization bufferを除去する。
〔4〕2.1M arrayを洗浄液1(室温)中で2分間しっかり揺らして洗浄する。
〔5〕2.1M arrayを洗浄液2(室温)中で1分間しっかり揺らして洗浄する。
〔6〕2.1M arrayを洗浄液3(室温)中で15秒間しっかり揺らして洗浄する。
〔7〕遠心器にてスライドを乾燥させる。
〔1〕マイクロアレイスキャナGenePix 4000B(Axon instruments社製)に2.1M arrayをセットしアレイの蛍光スキャニングを行う。
〔2〕取得した蛍光画像ファイルをNimbleScan v2.5ソフトウェア(Roche社製)にて解析を行い、2.1M arrayにおける各プローブの蛍光強度情報を得る。
〔3〕Nexus copy numberソフトウェア(version5、BioDiscovery社製)にて健常者及び乳がん患者におけるコピー数多型領域を比較し、乳がん発症に関わるCNP領域を同定する。
マイクロアレイで得られたデータを基に、定量PCRにて1p36.12、3q26.1,15q26.3及び22q12.3領域のCNPを評価した。なお、コントロールとして、14番染色体のリボヌクレアーゼP(RNase P)(配列番号8)遺伝子領域のコピー数を定量した。
〔1〕:健常女性末梢血より抽出したDNA216検体(健常者群)
〔2〕:乳がん患者(女性)末梢血より抽出したDNA193検体(乳がん患者群)
〔3〕:1−1〔3〕の30名の健常女性末梢血由来プールDNA(リファレンスDNA)
〔1〕以下の試薬類を加える。
5ng/μl DNA 2μl
TaqMan Genotyping Master Mix(Applied Biopsystems社製) 5μl
TaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセット(Applied Biopsystems社製) 0.5μl
TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P(Applied Biopsystems社製) 0.5μl
精製水 2μl
7900HT FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biopsystems社製)を用いて以下の表2に示すPCR反応を行った。
CopyCallerソフトウェア(Applied Biopsystems社製)にてTaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセットのコピー数を解析した。リファレンスDNA(RNaseP、配列番号8)における当該TaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセットのコピー数を2と仮設定し、テストサンプルにおける相対的コピー数を算出した。定量PCRにより増幅したPCR産物の塩基配列を同定するために、PCR産物をpGEM(登録商標)−T Easy vector(プロメガ社製)へクローニングした後、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いて塩基配列検出用サンプルを調製し、DNAシークエンサー(Applied Biosystems社製)にてPCR産物の塩基配列を決定した。
3−1 マイクロアレイ結果
乳がん患者群と健常者群において、〔1〕いずれかの群におけるコピー数変化の頻度が25%以上であり〔2〕両群間のコピー数変化頻度に統計学的有意差があった(Fisher検定でP値が0.05未満)CNP領域を以下の表3〜6に示す。
(1)定量PCR法
マイクロアレイ法より同定した表3〜6に示した染色体領域や、その近傍の領域を用いて、上記「2−2 方法」の項目で示した方法で定量PCR法を行った。具体的に用いた領域は、「1p36.12 21,375,430−21,375,511」、「3q26.1 163,706,172−163,706,287」、「15q26.3 99,845,920−99,846,025」、「15q26.3 99,847,947−99,848,043」、「15q26.3 99,848,547−99,848,623」、「22q12.3 35,473,730−35,473,804」、及び「22q12.3 35,475,937−35,476,043」の、計7領域である。
定量PCR法によりDNAコピー数を測定した上記7つの領域の中から様々な組合せパターンの2つの領域を選択し、判別分析を行った。結果を図12〜32及び表8に示す。
Claims (3)
- ヒトから得られた試料において、以下の2箇所のヒト染色体領域のDNAコピー数の減少を検出することを特徴とする乳がん発症感受性の判定方法。
配列番号3で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,845,920−99,846,025)
配列番号4で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,847,947−99,848,043) - DNAコピー数を定量PCR法によって検出することを特徴とする請求項1記載の判定方法。
- 以下の2箇所のヒト染色体領域のDNAコピー数多型を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん発症感受性の判定用キット。
配列番号3で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,845,920−99,846,025)
配列番号4で示される塩基配列からなる、
15q26.3 (99,847,947−99,848,043)
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