JP6728556B2 - 一塩基多型検出用キット及び方法 - Google Patents
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Description
法を提供することを目的とする。しかし、このような課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー;
ii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー;及び、
iii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー;を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;及び
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びa)前記第1タグオリゴヌクレオチド及びb)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー;を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー;及び
v)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第1延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー;を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー;
v)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第1延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー;及び
vi)前記第1延長ポリヌクレオチド及び前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される共通の塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー;を含む、一塩基多型検出用キットが提供される。
i)a)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、b)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー、c)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びd)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、dNTP混合物、熱安定DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ;及び
ii)PCRを実行するステップを含む一塩基多型検出方法が提供される。
i)a)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、b)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、c)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、d)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び1)前記第1タグオリゴヌクレオチド及び2)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びe)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、dNTP混合物、熱安定DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ;及び
ii)PCRを実行するステップを含む一塩基多型検出方法が提供される。
i)a)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型特異的塩基配列から構成される野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー、b)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー、c)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、d)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー、e)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第1延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー、f)前記第1延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第1延長産物増幅用フォワードプライマー、及びg)前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第2延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、dNTP混合物、熱安定DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ;及び
ii)PCRを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマーを用いて増幅対象の塩基配列を含む核酸の対立遺伝子特異的なPCR反応を行うステップ;及び
ii)前記対立遺伝子特異的なPCR反応の産物に対してPCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いてプライマー延長反応を実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、一塩基多型の対立遺伝子特異的PCR反応を実行するステップ;及び
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びa)前記第1タグオリゴヌクレオチド及びb)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いて前記一塩基多型の対立遺伝子特異的PCR反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップ;を含む一塩基多型検出方法が提供される。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に対して一塩基多型特異的PCR反応を実行するステップ;及び
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成された第1延長用プライマー;及びPCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、前記第1延長ポリヌクレオチドと、電気泳動ゲル上で、区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマーを用いて前記一塩基多型特異的PCR反応の反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
以下、本文書で使用される用語を定義する:
本文書で使用される用語「ヌクレオチド(nucleotide)」は、核酸を構成する単量体分子で、塩基、五炭糖及びリン酸から構成されており、前記塩基は、DNAの場合アデニン(adenine)、グアニン(guanine)、シトシン(cytosin
e)、及びチミン(thymine)の4つが存在し、RNAの場合には前記チミンの代わりにウラシル(uracil)が用いられる。前記五炭糖は、DNAの場合2’−デオキシリボース(2’−deoxyribose)、RNAの場合リボース(ribose)が用いられる。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー;
ii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー;及び
iii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー;を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;及び
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びa)前記第1タグオリゴヌクレオチド及びb)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー;を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー;及び
v)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第1延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー;を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
2延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第2延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含むことができる。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー;
v)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第1延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー;及び
vi)前記第1延長ポリヌクレオチド及び前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される共通の塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー;を含む、一塩基多型検出用キットが提供される。
i)a)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、b)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー、c)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びd)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、dNTP混合物、熱安定DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ;及び
ii)PCRを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
i)a)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、b)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、c)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、d)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び1)前記第1タグオリゴヌクレオチド及び2)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びe)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、dNTP混合物、熱安定DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ;及び
ii)PCRを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
i)a)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー、b)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー、c)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、d)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー、e)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第1延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー、f)前記第1延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第1延長産物増幅用フォワードプライマー;及びg)前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第2延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、dNTP混合物、熱安定DNAポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ;及び
ii)PCRを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
前記PCRを実行するステップは、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応で行うことができる。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマーを用いて増幅対象の塩基配列を含む核酸の対立遺伝子特異的なPCR反応を実行するステップ;及び
ii)前記対立遺伝子特異的なPCR反応の産物に対してPCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いてプライマー延長反応を実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
iii)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記リバースプライマーを用いて前記延長反応の産物を増幅するPCR反応を実行するステップをさらに含むことができる。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、一塩基多型の対立遺伝子特異的PCR反応を実行するステップ;及び
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びa)前記第1タグオリゴヌクレオチド及びb)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いて前記一塩基多型の対立遺伝子特異的PCR反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップ;を含む一塩基多型検出方法が提供される。
iii)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記延長反応の産物を増幅するPCR反応を実行するステップをさらに含むことができる。
i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に対して一塩基多型特異的PCR反応を実行するステップ;及び
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成された第1延長用プライマー;及びPCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、前記第1延長ポリヌクレオチドと、電気泳動ゲル上で、区分される長さを有する第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマーを用いて前記一塩基多型特異的PCR反応の反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップを含む一塩基多型検出方法が提供される。
iii)前記第1延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第1延長産物増幅用フォワードプライマー、前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第2延長産物増幅用フォワードプライマー、及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記プライマー延長反応の産物を増幅するPCR反応ステップをさらに含むことができる。
前記ステップi及びiiは、単一反応容器内で、単一ステップで実行されてもよく、 前記ステップi〜iiiは、単一反応容器内で、単一ステップで実行されてもよい。
前記一塩基多型特異的PCR反応は、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応で行うことができる。
ができる。
増幅に用いられたリバースプライマー130を用いて、延長産物を増幅する場合、前記ASBPE産物に対する増幅によって、より確実に特定の対立遺伝子特異的な延長産物を検出することができる。このとき、ASBPE反応だけで検出する場合と延長産物の増幅反応まで実行して検出する場合、用いられるプライマーの濃度を適切に調節することにより、最適な検出条件を樹立することができる。
本発明者は、上述した対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応によって、一塩基多型(SNP)の有無及び種類を迅速に判定することができるかどうか調査するために、まずSNPがあるとよく知られているBCR−ABL遺伝子を鋳型にして対立遺伝子特異的PCRがきちんと遂行されるかを調査した。
本発明者は、対立遺伝子特異的なPCRに続く対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応に用いられる延長用プライマーを製造した。具体的には、ヒトゲノムDNAと配列相同性が低い配列番号5で表されるpBR322プラスミド(Promega、USA)を鋳型にして配列番号6で表されるフォワードプライマー及び配列番号7で表されるリバースプライマーを用いて増幅することにより、117bpの増幅産物を生成した。この時、前記フォワードプライマーは、前記pBR322プラスミドDNAに存在する相同配列と、その5’末端に付加される、後述する第2タグオリゴヌクレオチドと相補的な配列である第2タグ相補オリゴヌクレオチド(配列番号8)とから構成される。
本発明者は、前記AS−PCRに使用されたフォワードプライマーの5’末端に、ヒトゲノム内のいかなる配列とも相同性が低下して偽陽性を示さない固有の塩基配列を有するタグオリゴヌクレオチドをデザインして対立遺伝子特異的なPCRを行った。前記タグオリゴヌクレオチドは、本技術分野でZIPコード(ZIP Code)配列でも知られているが、前記ZIPコード配列は、ゲノムDNAの塩基配列にない配列を有するヌクレオチドオリゴマーであり、ゲノムDNAと非特異的にハイブリダイズされないように設計された配列である。本発明が属する技術分野の当業者であれば、後述する実施例で使用されたZIPコード配列以外にも、当業界で知られている様々なコード配列を用いてプライマーを変形させられることを容易に理解するだろう(非特許文献2)。
本発明者は、抗がん剤であるイリノテカンの副作用と相関関係があることが知られているUDPグルクロノシルトランスフェラーゼ系列1メンバーA1(UGT1A1)のSNPであるUGT1A1*28の遺伝子型を、本発明の一実施例によるASBPEキットで分析した。
さらに、本発明者は、本発明の一実施例によるASBPEキットで2つの対立遺伝子の遺伝子型を同時に検出することができるマルチプレックス(multiplex)分析が可能であるかを確認するために、UGT1A1*6及びUGT1A1*28の野生型ゲノムDNAを単独又は混合して対立遺伝子特異的なPCRを単独又はマルチプレックスで実行し、UGT1A1*6及びUGT1A1*28の突然変異型ゲノムDNAを単独又は混合して、本発明の一実施例によるASBPEキットを用いたPCRをマルチプレックスで行った。
Claims (19)
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド(tag oligonucleotide)、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチド(single nucleotide polymorphism-specific oligonucleotide)から構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー;
ii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー;及び、
iii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてPCR産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー;を含み、前記延長ポリヌクレオチドの長さは20〜200ntである、一塩基多型検出用キット。 - iv)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含む、請求項1に記載の一塩基多型検出用キット。
- 前記一塩基多型は、野生型又は突然変異型である、請求項1に記載の一塩基多型検出用キット。
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;及び、
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてPCR産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及びa)前記第1タグオリゴヌクレオチド及びb)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー;を含み、前記延長ポリヌクレオチドの長さは20〜200ntである、一塩基多型検出用キット。 - v)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含む、請求項4に記載の一塩基多型検出用キット。
- 前記第1対立遺伝子は野生型であり、前記第2対立遺伝子は突然変異型である、請求項4に記載の一塩基多型検出用キット。
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型特異的塩基配列から構成される野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第1PCR産物の長さを延長するための第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー;及び、
v)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり, プライマー延長反応を通じて第2PCR産物の長さを延長するための第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー;を含み、前記第1延長ポリヌクレオチド及び前記第2延長ポリヌクレオチドの長さは共に20〜200ntであり、長さの差が20〜180ntである、一塩基多型検出用キット。 - vi)前記第1延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第1延長産物増幅用フォワードプライマー、及びvii)前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第2延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含む、請求項7に記載の一塩基多型検出用キット。
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;
iii)前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー;
iv)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第1PCR産物の長さを延長するための第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成される第1延長用プライマー;
v)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第2PCR産物の長さを延長するための第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマー;及び、
vi)前記第1延長ポリヌクレオチド及び前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される共通の塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー;を含み、前記第1延長ポリヌクレオチド及び前記第2延長ポリヌクレオチドの長さは共に20〜200ntであり、長さの差が20〜180ntである、一塩基多型検出用キット。 - 反応緩衝液、dNTP混合物、及び熱安定性DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の一塩基多型検出用キット。
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマーを用いて増幅対象の塩基配列を含む核酸の対立遺伝子特異的なPCR反応を行うステップ;及び、
ii)前記対立遺伝子特異的なPCR反応の産物に対してPCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてPCR産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いてプライマー延長反応を実行するステップを含み、
前記延長ポリヌクレオチドの長さは20〜200ntである、一塩基多型検出方法。 - iii)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記リバースプライマーを用いて前記延長反応の産物を増幅するPCR反応を実行するステップをさらに含む、請求項11に記載の一塩基多型検出方法。
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第1対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第1対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第2対立遺伝子特異的ヌクレオチドを3’末端に含む一塩基多型の第2対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、一塩基多型の対立遺伝子特異的PCR反応を実行するステップ;及び、
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第1対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第2対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてPCR産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及びa)前記第1タグオリゴヌクレオチド及びb)前記第2タグオリゴヌクレオチドのいずれか1つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いて前記一塩基多型の対立遺伝子特異的PCR反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップ;を含み、
前記延長ポリヌクレオチドの長さは20〜200ntである、一塩基多型検出方法。 - iii)前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記プライマー延長反応の産物を増幅するPCR反応を実行するステップをさらに含む、請求項13に記載の一塩基多型検出方法。
- i)PCR条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第1タグオリゴヌクレオチド、及び増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを3’末端に含む野生型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー;PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第1タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される5’末端の第2タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを3’末端に含む突然変異型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー;及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に対して一塩基多型特異的PCR反応を実行するステップ;及び、
ii)PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第1PCR産物の長さを延長するための第1延長ポリヌクレオチド、及び前記第1タグオリゴヌクレオチドから構成された第1延長用プライマー;及び、PCR条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第2PCR産物の長さを延長するための第2延長ポリヌクレオチド、及び前記第2タグオリゴヌクレオチドから構成される第2延長用プライマーを用いて、前記一塩基多型特異的PCR反応の反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップを含み、
前記第1延長ポリヌクレオチド及び前記第2延長ポリヌクレオチドの長さは共に20〜200ntであり、長さの差が20〜180ntである、一塩基多型検出方法。 - iii)前記第1延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第1延長産物増幅用フォワードプライマー、及び前記第2延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第2延長産物増幅用フォワードプライマー;及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記プライマー延長反応の産物を増幅するPCR反応ステップをさらに含む、請求項15に記載の一塩基多型検出方法。
- 前記ステップi及びiiは、単一反応容器内で実行される、請求項11、13及び15のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法。
- 前記ステップi〜iiiは、単一反応容器内で実行される、請求項12、14及び16のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法。
- 前記一塩基多型特異的PCR反応は、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応で行われる、請求項11〜16のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法。
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